Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Клиническое значение определения спонтанной и индуцированной продукции фактора некроза опухолей- α мононуклеарами периферической крови больных ВИЧ - инфекцией

РГб од

2 9 ПИВ

На правах рукописи

ХАЛДЕЕВА Наталья Аркадьевна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПОНТАННОЙ И ИНДУЦИРОВАННОЙ ПРОДУКЦИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-а МОНОНУКЛЕАРАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ

Г4.00.10 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт - Петербург - 1996 г.

Работа выполнена в Санкт-Пст^.Зургской медицински академии последипломного образования.

)

Научные руководители - академик 1АЕЬР5, доктор медицинских наук, профессор А.Г. Рахманова, доктор биологических наук, профессор С.А. Кетлинский

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук, профессор

Л.В. Быстрякова;

кандидат медицинских наук, доцент В.А. Исаков

Ведущая организация - Санкт-Петербургская Военно-медицинская академия

Зашита диссертации состоится Дз-С 1996 г. в УУ часов ,

на заседании специализированного совет^ Д 074.16.05 при Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования по адресу: 193015, Санкт-Петербург, ул. Салтыкова-Щедрина, 41.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке академии.

Автореферат разослан З-НЬсс^ 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук.'доцейгр" Пригожина В.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема СПИДа сегодня является одной из важнейших во всем мире. В настоящее время количество лиц, инфицированных ВИЧ, составляет около 18 миллионов и продолжает непрерывно расти. Актуальность вопросов, связанных с клинической диагностикой, лечением, профилактикой и определением дальнейшей судьбы пациентов с ВИЧ-инфекцией возрастаете увеличением числа зараженных.

Известно, что при ВИЧ-инфекции прежде всего поражается иммунная система, и основное действие ВИЧ направлено на хелперный клон Т-лим-фоиитоп. Вслед за этим происходят множественные изменения практически во всех звеньях иммунной системы, что приводит к прогрессирующему иммунодефициту, с которым связано возникновение оппортунистических и интеркурентных инфекций, а также некоторых видов злокачественных опухолей у больных в стадии СПИД. В связи с этим изучение дефектов иммунитета при ВИЧ-инфекции имеет важное значение для понимания механизмов прогрессирования болезни и поиска эффективных способов, предупреждающих ее развитие.

В последние годы стало известно, что гиперпродукция провоспали-тельных цитокинов - фактора некроза опухолей- альфа (ФНО-а), интер-лейкина (ИЛ) - 6, ИЛ -1 является одним из основных механизмов активации ВИЧ-инфекции [Rosenberg Z.F., Fauci A.S., 1990, Matsujama Т et al., 1991 ]. Однако ФНО-а, в отличие от других цитокинов, активирует продукцию вируса на уровне транскрипции, с чем связана его особая роль в патогенезе данного заболевания. Было показано что ФНО-а через ядерный фактор вызывает активацию вирусного генома, репликацию и горизонтальное распространение ВИЧ. Поверхностный белок вируса gp-120, в свою очередь, способен индуцировать синтез ФНО-а, что приводит к усилению экспрессии вируса как при аутокринном, так и при паракринном пути ее регуляции [Fauci, 1989].

Основными продуцентами ФНО-а являются моноциты/макрофаги и лимфоциты [С. А. Кетлинский и соавт., 19921. В литературе существуют сведения о повышенной продукции ФНО-а мононуклеарами периферической крови (МНПК) у больных ВИЧ-инфекцией. Об этом свидетельствуют работы как зарубежных исследователей (Roux-Lombard P. et al., 1989, Hober D. et al., 1989), так и некоторых отечественных авторов (Габрилович Д.И., Огане-зов В.К. и соавт., 1992). Тем не менее в этих работах не исследовалась зависимость между продукцией ФНО-а МНПК и особенностями клинического

течения ВИЧ-инфекции, не достаточно изучены вопросы корреляционных взаимоотношений между спонтанной продукцией ФНО-а МН ПК, а также уровнем ФНО-а в плазме крови, и параметрами клеточного иммунитета, не в полной мере отражена прогностическая роль данного цитокина для больных ВИЧ-инфекцией и отсутствуют данные о продукции ФНО-а МНГЖ У детей с ВИЧ-инфекцией, что послужило основанием для проведения настоящей исследовательской работы.

Цель исследования.. На основании изучения уровня ФНО-а в плазме крови, спонтанной и индуцированной продукции ФНО-а МНПК in vitro у больных ВИЧ-инфекцией определить значение данных показателей для оценки тяжести ВИЧ-инфекции, ее прогноза и эффективности используемой терапии.

Задачи исследования.

1. Изучить уровни ФНО-а в плазме крови, спонтанную и индуцированную продукцию ФНО-а МНПК in vitro у больных ВИЧ-инфекцией на разных стадиях заболевания и сравнить показатели с клиническими проявлениями и тяжестью -»еченця ВИЧ-инфекции.

2. Определить параметры клеточного иммунитета у больных на разных стадиях ВИЧ-инфекции и сравнить их с показателями продукции ФНО-а МНПК in vitro и уровнем ФНО-а в плазме крови для выявления корреляционных взаимоотношений.

1 На основании полученных данных выработать критерии оценки тяжести, прогноза и эффективности используемой терапии у больных ВИЧ-инфекцией.

Основные положения, выносимые на защиту.

Установлено, что спонтанная продукция ФНО-а МНПК in vitro и содержание ФНО-а в плазме крови с развитием ВИЧ-инфекции увеличиваются, носят однонаправленный характер как у взрослых больных, так и у детей, и уровень их зависит от стадии ВИЧ-инфекции, тяжести состояния больного, наличия вторичных инфекций и сопутствующих заболеваний.

Обосновывается положение о наличии взаимосвязи между повышением уровня ФНО-а в плазме крови, спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro и снижением количества CD4+-лимфоцит ов в периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией. Увеличение показателей продукции ФНО-о. в динамике в сочетании с уменьшением количества С04+-лимфоцитов является неблагоприятным прогностическикГфактором и свидетельствует о профсссирующем течении ВИЧ-инфекции.

Прогрессивное снижение спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro, уровня ФНО-а в плазме крови и отсутствие ответа мононуклеарных клеток на индукторы у больных в стадии СПИД указывает на истощение функциональных возможностей клеток и наступлении терминальной фазы ВИЧ-инфекции.

Научная новизна. Впервые установлена взаимосвязь между клиническим течением, стадией ВИЧ-инфекции и уровнем ФНО-а в плазме крови, а также спонтанной продукцией ФНО-а мононуклеарными клетками in vitro.

Впервые выявлены возрастные особенности продукции ФНО-а: наиболее высокие показатели определялись у детей с ВИЧ-инфекцией 1- 5 лет по сравнению'с детьми 6-13 лет и взрослыми больными.

Выявлена зависимость показателей продукции ФНО-а у больных ВИЧ-инфекцией от приема специфического противовирусного препарата ретровира.

Практическая ценность работы.

Полученные результаты позволяют рекомендовать определение показателей спонтанной и индуцированной продукции ФНО-а МНПК in vitro и уровня ФНО-а в плазме крови для оценки тяжести течения и стадии ВИЧ-инфекции.

Установлено, что у больных ВИЧ-инфекцией, принимавших ретро-вир, спонтанная продукция ФНО-а МНПК in vitro и уровень ФНО-а в плазме крови были ниже, чем у больных, не получавших данный препарат. Эти данные могут иметь значение для оценки эффективности используемой терапии.

Показано, что увеличение спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro, уровня ФНО-а в плазме крови и снижение ответа мононуклеарных клеток на индукторы определяет неблагоприятный прогноз ВИЧ-инфекции.

Внедрение результатов. Результаты исследования внедрены в практику работы Республиканской клинической инфекционной больницы N3 и С.-Петербургской городской инфекционной больницы N30 им. С.П.Боткина.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на международной конференции "СПИД, рак и ретровирусы человека" -I: Санкт-Петербург, 1992 г., представлены на Десятой международной конференции по СПИДу: Йокогама, 1994 г., доложены и обсуждены на проблемной комиссии "СПИД и другие инфекционные болезни".

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", трех глав собственных иссле-

дований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 74 отечественных и 178 иностранных источников.

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 таблицами и 10 рисунками.

Объем работы и методы исследования. В работе представлены результаты комплексного клинико-иммунологического обследования 70 больных ВИЧ-инфекцией, находившихся на стационарном лечении в специализированном отделении Республиканской клинической инфекционной больницы. Среди них было 33 ребенка в возрасте от 2 до 13 лет и 37 взрослых (четверо были обследованы на разных стадиях ВИЧ-инфекции и повторные результаты были учтены как отдельные случаи, в связи с чем количество описываемых случаев увеличилось до 41).

Диагноз ВИЧ-инфекции устанавливался на основании общепринятых клинических и эпидемиологических данных и был подтвержден обнаружением специфических антител к ВИЧ и его отдельным белкам в реакциях им-муноферментного анализа и иммуноблотгинга. У всех обследованных заболевание было обусловлено ВИЧ первого типа.

Для описания результатов у взрослых больных была использована -классификация В.И.Покровского, предложенная в 1989 г, согласно которой в стадии НтБ находилось 7 (17.1%), в стадии II-B - 15 (36.6%), в стадии вторичных заболеваний ША-Б - 13 (31.7%) и в стадии СПИД - 6 (14.6%) больных, причем двое из них были в терминальном состоянии.

Из обследованных нами 33 детей с ВИЧ-инфекцией в соответствии с возрастными особенностями клеточного иммунитета [Hannet I. et al., 1992], были выделены две группы: в первую вошли 24 ребенка (72.2%) в возрасте 1- 5 лет, во вторую - девять детей (27.3%) в возрасте 6- 13 лет. Согласно международной классификации ВИЧ-инфекции у детей до 13 лет, предложенной CDC в 1994 г., 26 детей (78.8%) соответствовали клинической категории В, характеризующейся средневыраженнымн клиническими симптомами (В-1 - без явных признаков иммуносупрсссии - 9 больных, В-2 - с умеренно выраженными признаками нммуносупрессии - 17 больных). Среди них было 17 детей (65.4%) первой возрастной группы и девять детей (36.4%) - второй возрастной группы. Семь детей (21.2%) соответствовали ; клинической категории С (С-2 - 2 больных, С-3 - 5 больных) - все из первой возрастной группы.

С целью наблюдения в динамике за изменениями клинических проявлений и иммунологических показателей нами были обследованы повторно 10 взр». 1ых пациентов и девять детей с ВИЧ-инфекцией с интервалом меж-

ду обследованиями от 6 месяцев до 2.5 лет, а также учтены отдаленные результаты у 21 больного.

В качестве контрольных показателей при оценке параметров клеточного иммунитета и уровня ФНО-а в плазме крови у взрослых з чц с ВИЧ-инфекцией послужили результаты исследования 50 практически здоровых доноров, при оценке спонтанной и индуцированной продукции ФНО-а МНПК in vitro - 28 доноров.

В связи с тем, что большинство обследованных нами детей с ВИЧ-ин-фекиией (90.9%) страдали рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей, в качестве контроля были использованы показатели 39 детей, часто и длительно болеющих (ЧДБ) острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ).

Наряду с клиническим наблюдением и общепринятыми лабораторными исследованиями у больных определялись параметры клеточного иммунитета, включая CD3+, CD4+, CD8+, С020+-лимфоциты в лимфоцито-токсическом тесте по стандартной методике Национального Института Здоровья США с использованием моноклональных антител фирмы "Bering".

Для всех иммунологических тестов использовали мононуклеарные клетки, выделенные в градиенте плотности "Ficoll-Paque" по методу Bojum А. (1968).

Индукцию синтеза ФНО-а МНПК осуществляли культивированием клеток в концентрации 2х106/мл в течение 18 час. при температуре 37С в атмосфере с 5% С02 в 96-луночных плоскодонных микропланшетах в среде Игла с добавлением 10% сыворотки плода коровы, двух мМ глутамина, 80 мкг/мл гентамицина в присутствии индукторов - продшиозана в дозе 5 мкг/мл и форболмиристатацетата (ФМА) в дозе 5 нг/мл. Спонтанную продукцию ФНО-а МНПК исследовали в кондиционированной клетками среде после 18 часов культивирования в тех же условиях, но без добавления индукторов.

Содержание ФНО-а в супернатантах клеточных культур определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Результаты реакции оценивали спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Чувствительность метода составила 30 пг/мл. Для количественной оценки ФНО-а использовали пакет компьютерных программ "Microplate manager".

" Для подтверждения достоверности различий в сравниваемых группах применяли непараметрический метод Вилкоксона-Манна-Уитни (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973 г.).

к

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Результаты исследования у взрослых лиц с ВИЧ-инфекцией.

При оценке параметров клеточного иммунитета у обследоианных нами больных было выявлено, что средний уровень С04+-лимфоцитув в периферической крови был снижен во всех стадиях ВИЧ-инфекции по сравнению с контролем (890 (640-1000) в 1 мкл.) и уменьшался с прогрессией заболевания. В стадии Н-Б он составил 765 (612-1133) в 1 мкл., в стадии П-В - 614 (461-862) в 1 мкл., ри <0.01, в стадии ША-Б - 506 (225-850) в 1 мкл., рц <0.001,-в стадии СПИД - 396 (175-625) в 1 мкл., р„ <0.001 и в терминальной стадии - 82 (79-85) в 1 мкл., ри <0.001.

Средний уровень С08+-лимфоцитов в стадиях - П-Б, П-В, ША-Б превышал аналогичный показатель у здоровых доноров ( 640 (522-844) в 1 мкл.) и был равен: 881 (603-1338), 783 (502-1294), 756 (412-1146) в 1 мкл. соответственно. У больных в стадии СПИД количество СЭ8+-клеток было меньше, чем в предыдущих стадиях и в контроле и составило 580 (298-820) в 1 мкл. Минимальные значения определялись у больных в терминальном состоянии - 215 (189-242) в 1 мкл., р„<0.001.

Соотношение CD4+/CD8+ уменьшалось по мере развития ВИЧ-инфекции и было достоверно ниже (р„ <0.001), чем у здоровых лиц (1.4 (1.01,4» в стадиях П-В - 0.78 (0.67-0.88), ША-Б - 0.66 (0.5-0.81), СПИД - 0.53 (0.4-0.63) и в терминальной стадии - 0.38 (0.35-0.41).

Количество B-лимфоцитов (CD20+) в периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией на всех стадиях, за исключением терминальной, превышало аналогичный показатель у здоровых лиц (280 (200-400) в 1 мкл.) и составило в стадии Н-Б - 494 (372-857) в 1 мкл., р„ <0.001, П-В-522 (392666) в 1 мкл., ри <0.001, ША-Б - 576 (315-702) в 1 мкл., ри <0.001, СПИД -373 (184-788) в 1 мкл. У больных в терминальной стадии количество В-лим-фоцитов было достоверно ниже (рц<0.001), чем в контроле и в предыдущих стадиях - 99 (51-148) в 1 мкл.

Таким образом, у больных с прогрессией ВИЧ-инфекции происходила постепенная элиминация хелперного клона Т-лимфоцитов из периферической крови с компенсаторным увеличением цитотоксических Т-лимфоцитов и B-лимфоцитов преимущественно на ранних стадиях заболевания, и уменьшением кличества всех иммунокомпетентных клеток в стадии СПИД.

При анализе спонтанной продукции Ф'ЙО-а МНПК in vitro было обнаружено, что у больных ВИЧ-инфекцией уровень ФНО-а уже в стадии II-Б достоверно (рц<0.001) превышхз аналогичный показатель в контрольной

группе (50 (10-130) пг/мл) и состава! 210 (100-315) пг/мл, что свидетельствует об активации цитокинпродуцирующих клеток на ранних стадиях ВИЧ-инфекции.

По мере гтрогрессирования болезни спонтанная продукция ФНО-а МНПК повышалась с достоверными различиями р„<0.01 между стадиями (табл. 1). Индивидуальные уровни соответствовали глубине патологических процессов, степени клинических проявлений и тяжести состояния больного. Наиболее высокие значения определялись у пациентов с множественными и тяжелыми поражениями смешанной этиологии в стадиях Ш-Б и СПИД. У больных в терминально.« состоянии уровень спонтанной продукции ФНО-а был резко снижен (табл. 1), что указывает на истощение функциональных возможностей мононуклеарных клеток.

Таблица 1.

Показатели спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro у взрослых лиц с ВИЧ-инфекцией на разных стадиях заболевания.

Показатель II-Б и-в П1А-Б СПИД Терми-нальня Здоровые

п=7 п=15 п=13 п=4 п=2 п~28

Спонтанная

продукция 210* 403* 630* 990* 190 50

ФНО-а МНПК (100- (187- (450- (720- (100- (10-130)

in vitro, пг/мл 315) 510) 1000) 1300) 280)

* " Р„<0.001 - различия между показателями больных ВИЧ-инфекцией и

здоровых лиц

Для сопоставления уровня спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro и содержания С04+-лимфоцитов в периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией были выделены две группы пациентов: первая - с количеством С04+-лимфоцитов в периферической крови больше 500 в 1 мкл. (20 больных), вторая - с количеством С04+-лимфоцитов 200 - 500 в 1 мкл. (18 больных). Средний показатель спонтанной продукции ФНО-а МНПК в первой группе составил 417 (100-862) пг/мл и был достоверно ниже (р„<0.01), чем во второй группе - 790 (500-1300) пг/мл. Полученные данные

свидетельствуют о наличии зависимости между снижением количества С04+-лимфоцитов в периферической крови и повышением уровня спонтанной продукции ФНО-а MH1IK in vitro у больных ВИЧ-инфе кцией.

Таким образом, определение спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro показало, что мононуклеарные клетки в организме больных ВИЧ-инфекцией активированы уже в асимптомной стадии заболевания, вероятно, за счет непосредственного воздействия ВИЧ на цитокинпродуинрующие клетки. С прогрессией заболевания степень активации увеличивается, соответствует стадии развития и тяжести течения ВИЧ-инфекции, а также коррелирует с уменьшением количества С04+-лимфоцитов в периферической крови. Критическое снижение спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro у больных в терминальном состоянии говорит о неспособности мо-нонуклеарных клеток адекватно реагировать на антигенные стимулы.

При анализе уровней ФНО-а в плазме крови в целом были отмечены те же закономерности, что и при оценке спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro. Так у больных ВИЧ-инфекцией во всех стадиях заболевания уровень ФЙО-а в плазме был достоверно выше (р„<0.001) контроля (контроль - 46 (0-100) пг/мл). В стации И-Б он составил 213 (80-300) пг/мл, С профессией заболевания отмечалась очевидная тенденция к росту показателей ФНО-а в плазме крови, которые в последующих стадиях соответствовали: 397 (80-720) пг/мл - в стадии П-В, 523 (100-1100) пг/мл - в стадии IIIA-Б и 760 (348-1800) пг/мл - в стадии развернутого СПИДа. Различия были статистически достоверными между стадиями И-Б и ША-Б (pu<0.001), II-B и СПИД (pu<0.001), ША-Б и СПИД (ри<0.01). У больных в терминальном состоянии уровень ФНО-а в плазме был достоверно ниже (ри<0.001), чем в предыдущей стадии и составил 156 (116Г197) пг/мл.

При сопоставлении средних показателей ФНО-а в плазме с количеством С04+-лимфоцнтов в периферической крови на разных стадиях ВИЧ-инфекции была установлена обратнопропорциональная зависимость: с прогрессией ВИЧ-инфекции уровень ФНО-а в плазме крови повышался, тогда как количество С04+-л.нмфоцитов снижалось. Результаты представлены на рис. 1.

Таким бразом, уровень ФНО-а в плазме крови у больных ВИЧ-инфекцией был достоверно выше, чей у чдорсвых лиц и повышался в каждой г стадии заболевания, отражая r.poi рессию ВИЧ-инфекции, а также коррелировал со степенью снижения СЕХ+-лнмфош1№в в периферической крови.

Рисунок 1.

Средние показатели ФНО-а в плазме и С04+-лимфоцитов в периферической крови у взрослых, больных ВИЧ-инфекцией,на разных стадиях заболевания.

900

еоо

700 600 500 400 300 200 100 0

ПЬ

J3

а - количество С04+-лимфоцитов в периферической крови (в 1 мкл.); b -уровень ФНО-а в плазме крови (пг/мл);

1 - здоровые, 2 - стадия Н-Б, 3 - стадия II-B, 4 - стадия ША-Б, 5 - СПИД, 6 -терминальная стадия

С целью изучения функциональной активности мононуклеарных клеток у больных ВИЧ-инфекцией исследовалась продукция ФНО-а МНПК in vitro, индуцированная продигиозаном и ФМА. Результаты показали, что абсолютные значения индуцированной продукции ФНО-а МНПК при использовании как продигиозана, так и ФМА, в среднем у больных ВИЧ-инфекцией достоверно (pu<0.01) превышали аналогичные показатели у здоровых доноров. Индивидуальные уровни широко варьировали от 102 пг/мл до 1400 пг/мл - при использовании продигиозана, (контроль - 38-500 пг/мл), и от 80 пг/мл до 1200 пг/мл - при использовании ФМА, (контроль -45-500 пг/мл). Достоверных различий между стадиями ВИЧ-инфекции не выявлено.

Более точное представление о функциональной активности мононуклеарных клеток у больных ВИЧ-щфекцией было получено при сопостав-

лении показателей индуцированной продукции ФНО-а МНПК in vitro с уровнем спонтанной продукции ФНО-а данными клетками. Как выяснилось, ответ на оба индуктора был значительно меньше, чем у здоровых лиц и прогрессивно снижался с развитием болезни На рис. 2 показаны коэффициенты индукции (КИ) - отношение индуцированной продукции к спонтанной у больных на разных стадиях ВИЧ-инфекции.

Рисунок 2.

Коэффициенты индукции при ответе МНПК на продигиозан и ФМА у взрослых больных на разных стадиях ВИЧ-инфекции.

1 2 3 4 5 6

I- здоровые , 2 - стадия П-Б, 3 - стадия Н-В, 4 - стадия ША-Б, 5 - СПИД, 6 - терминальная стадия;

а - коэффициент индукции при использовании продигиозана, Ь - коэффициент индукции при использовании ФМА.

У здоровых доноров КИ составил 4.52 при индукции МНПК проди-гнозаном и 4.58 - при индукции ФМА. У ВИЧ-инфицированных в стадии П-Б коэффициенты индукции были равны и 2.52 соответственно. В стадии 11-В - 1.77 и 1,73.соотвехственио. Обращают на себя внимание прак-тичеки одинаковые темпы снижения ответа МНПК на индукцию продигио-заном и ФМА в стадиях П-Б и Н-В, тогда как в последующих стадиях ВИЧ-инфскц.ш отмечалось более быстрое снижение ответа МНПК на индукцию

ФМА по сравнению с ответом на продигиозан. Так в стадии III v-Б коэффициент индукции составил 1.54 - при использовании продигиозана и 1.19 -ири использовании ФМА. Анализ индивидуальных показателей выявил отсутствие ответа на ФМА у 46% больных в этой стадии ВИЧ-инфекции и у 15% больных - отсутствие ответа на продигиозан. В стадии раннего СПИДа и в терминальной стадии у всех больных не было ответа на ФМА (КИ - 0.87 я 0.94 соответственно). На продигиозан мононуклеарные клетки отвечали небольшой продукцией ФНО-а только у двух больных из стадии раннего СПИДа (КИ -1.03) и не отвечали у больных в терминальной стадии (КИ -0.99).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что, несмотря на достоверное увеличение абсолютных пока ¡ателей индуцированной продукции ФНО-а МНПК in vitro с прогрессией ВИЧ-инфекции, функциональная активность мононуклеарных клеток снижается, и в первую очередь происходит потеря ответа на ФМА (неспецифический активатор МНПК). Оценить степень снижения реактивности данных клеток можно путем определения коэффициента индукции.

По данным зарубежной литературы (М. Sala et al., 1995 г.) на продукцию ФНО-а у больных в клинически выраженных стадиях ВИЧ-инфекции оказывает влияние не только сам ВИЧ, но и возбудители оппортунистических и интеркурентных инфекций. У обследованных нами больных наиболее высокие значения показателей продукции ФНО-а определялись у больных с сочетанной патологией при наличии нескольких инфекций. Среди них необходимо отметить прежде всего бактериальные заболевания, вызванные патогенными штаммами стрептококков и стафилококков, микобактериями туберкулеза и, в меньшей степени, другими микроорганизмами.

Изучение влияния возбудителей бактериальных и вирусных инфекций на продукцию ФНО-а при ВИЧ-инфекции проводилось в двух группах больных. Первая состояла из 10 пациентов с заболеваниями, преимущественно обусловленными патогенными штаммами стрептококков и стафилококков. Среди них у восьми в качестве ведущей патологии выступали заболевания дыхательной системы (пневмонии, бронхиты, бронхо-зктатическая болезнь) и у двух больных - поражения кожных покровов (стрептостафило-дермни). Во вторую группу было выделено семь больных с поражениями герпесвирусной этиологии. Во всех рассматриваемых случаях заболевания характеризовались среднетяжелым течением по данной нозологической форме. В первой группе средний уровень спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro составил 742 (500-1000) пг/мл и был достоверно выше

(рц<0.001), нежели во второй группе - 320 (187-600) пг/мл. Уровень ФНО-а в плазме также был выше у больных с бактериа льными инфекциями (575 (207-1100) пг/мл, ри<0.01), чем с вирусными поражениями (222 (80-473) пг/мл ).

Результаты индуцированной продукции ФНО-а МНПК in vitro выявили различия в ответе на индукцию продигиозаном и ФМА. У больных с бактериальными заболеваниями ответ МНПК на продигиозан был выше, чем на ФМА. Коэффициенты индукции были равны 1.32 и 1.07 соответственно. В группе больных с герпесвирусными поражениями, напротив, выше были показатели продукции ФНО-а МНПК в ответ на ФМА (КИ -1.63), нежели на продигиозан (КИ-1.46).

Данные, полученные при анализе продукции ФНО-ot у больных ВИЧ-инфекцией с бактериальными и вирусными поражениями позволяют заключи гь,что уровень эндогенной продукции ФНО-а (в плазме) и в системе in vitro зависит как от самого ВИЧ, так и от этиологии вторичных заболеваний. Особенно высокую продукцию ФНО-а вызывают бактериальные инфекции, возбудители которых содержат липополисахаридный компонент клеточной стенки (ЛПС).

2. Результаты исследования у детей с ВИЧ-инфекцией.

При анализе состояния клеточного иммунитета у детей с ВИЧ-инфекцией было выявлено достоверное снижение (ри<0.001) абсолютного количества СБ4+-лимфоцитов по сравнению с нормой [Hannet I. et al., 1992] в обеих возрастных группах (табл. 2). Наименьшие значения определялись в стадии СПИД. Обращает на себя внимание значительное и достоверное (р„<0.001) снижение данного показателя у детей ЧДБ ОРЗ 1-5 лет, которые были использованы нами при сравнительной оценке продукции ФНО-а у детей с ВИЧ-инфекцией.

Среднее количество СБ8+-лимфоцитов у детей с ВИЧ-инфекцией во всех группах несколько превышало норму. Индивидуальные показатели варьировали в широких пределах. Соотношение CD4+/CD8+ как у больных клинической категории В, так и в стадии СПИД, было достоверно (ри<0.001) снижено по сравнению с нормой (табл. 2).

При оценке продукции ФНО-а у детей с ВИЧ-инфекцией в целом определялись те же закономерности, что и у взрослых больных, тем не менее, у детей до шести лет были выявлены некоторе особенности.

Таблица 2.

Показатели клеточного иммунитета у детей с ВИЧ-инфекцией и детей, часто болеющих острыми респираторными заболеваниями.

1 - 5 лет 6 - 13 лет

Показатель Клиническая Иаппе! е! Клиническая Наппе! е1

категория В СПИД ЧДБ ОРЗ* а!.. 1992 г категория В ЧДБ ОРЗ* а1.,1992 г

п=17 п=7 п=28 п=28 п=9 п=11 п=22

С04+ 792** 596** 999** 1600 627**" 753 800

в 1 мкл. (534-1049) (181- (806- (1000- (456-902) (605- (700-.

923) 1460) 1800) 1090) 1100)

С08+ 1101 983 862 900 912 626 800

в 1 мкл (613-1495) (448- (528- (800- (662-1544) (490-920) (600-900)

1749) 1160) 1500)

С04+/С08+ 0.73** 0.56** 1.16 1.3 0.66** 1.27 1.3

(0.57-0.87) (0.4- (0.9-1.5) (1.0-1.6) (0.58-0.89) (1.1-1.4) (1.1-1.4)

0.61)

" - дети, часто и длительно болеющие острыми респираторными заболеваниями;

** - ри<0.001 - различия между показателями обследованных детей и нормой (пс НаппсЧ I. а а!

1902)

Показатели спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro у детей с ВИЧ-инфекцией в обеих возрастных группах достоверно превышали аналогичные показатели в контрольных группах детей часто и длительно болеющих ОРЗ. У детей клинической категории В в первой возрастной группе спонтанная продукция ФНО-а МНПК составила 710 (213-1400) пг/мл, в контроле - 182 (15-352) пг/мл (ри<0.001), во второй возрастной группе - 413 (100-715) пг/мл, в контроле - 135 (20-315) пг/мл (ри<0.01).

У детей 1-5 лет данный показатель был выше (ри<0.01), чем в группе детей 6-13 лет. Это можно объяснить, с одной стороны тем, что дети младшей возрастной группы более реактивны в ответе на любую инфекцию, в том числе и вызванную ВИЧ, ввиду не вполне сформировавшегося иммунитета. С другой стороны - различиями в течении заболевания у детей с ВИЧ-инфекцией в разных возрастных группах. Так, у обследованных нами детей 1-5 лет чаще - в 41% случаев - встречались бактериальные инфекции с поражением внутренних органов,тогда как в группе детей 6-13 лет - в 33.3%. Из вирусных инфекций в первой возрастной группе чаще отмечалась цито-мегаловирусный паротит (47%) и хронический вирусный гепатит "В" (29%), которые по одному случаю выявлены у детей второй возрастной группы. Напротив, у детей 6- 13 лет чаще (55.5%) встречалась герпетическая инфекция, вызванная вирусом простого герпеса, тогда как у детей 1-5 лет данное заболевание отмечалось в 29.4% случаев. Другие инфекции получили примерно равное распространение в обеих возрастных группах детей.

В стадии СПИД средний уровень спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro составил 570 (352-1200) пг/мл, что достоверно (ри<0.001) выше, чем у детей ЧДБ ОРЗ, и несколько ниже, чем у детей того же возраста в предыдущей стадии ВИЧ-инфекции. Важно отметить, что у всех больных в стадии СПИД заболевание протекало с множественными поражениями внутренних органов и выраженной иммуносупрессией.

Содержние ФНО-а в плазме крови у всех обследованных детей с ВИЧ-инфекцией, так же, как и у взрослых больных, достоверно (ри<0.001) превышало аналогичные показатели в контрольнх группах детей ЧДБ ОРЗ. Так у детей клинической категории В в первой возрастной группе уровень ФНО-а в плазме составил 680 (150-1200) пг/мл, во второй возрастной группе - 553 (45-1400) пг/мл. Контрольные показатели были равны 108 (0300) пг/мл и 143 (0-257) пг/мл соответственно. В стадии СПИД (дети 1-5 лет) средний уровень ФНО-а в плазме был достоверно снижен по сравнению с предыдущей стадией в той же возр; /гной группе (р„<0.01) и составил 317(106-790) пг/мл.

Анализ индуцированной продукции ФНО-а МНПК in \i'ro показал, что у детей с ВИЧ-инфекцией (клиническая категория В и СПИД) абсолютные значения продукции ФНО-а при индукции как продигиозаном, так и ФМА, были достоверно выше, чем у детей ЧДБ ОРЗ (табл. 3) Это спя ишо с более выраженной лреактивацией мононуклеарных клеток у детей с клиническими формами ВИЧ-инфекции, нежели у детей ЧДБ ОРЗ.

Таблица 3.

Абсолютные показатели индуцированной продукции ФНО-а МНПК in vitro у детей с ВИЧ-инфекцией (пг/мл).

1-5 лет 6 - 13 лет

Индуктор категория В п=!7 СПИД п=7 ЧДБ ОРЗ" п=28 Клиническая категория В п-9 ЧДБ ОРЗ" п=11

Продигиозан (5 мкг/мл) 1050* (572-1800) 850* (3701300) 300 (60-420) 520* (390-900) 195 (75-570)

ФМА (5 нг/мл) 768* (490-1450) 518** (400960) 334 (80-520) 538* (280-1000) 230 (35-440)

" - дети, часто и длительно болеющие острыми респираторными заболеваниями

* - ри<0.001 , ** - ри<0.01 - разница между показателями больных ВИЧ-

инфекцией и детей ЧДБ ОРЗ

У детей клинической категории В 1-5 ле г абсолютные показатели были достоверно выше, чем в группе детей 6-13 лет как при индукнии продш ио-заном (ри<0.001), так и при индукции ФМА (ри<0.05).

Обращает на себя внимание более высокий ответ МНПК на продигно-зан у детей с ВИЧ-инфекцией первой возрастной группы как в клинический категории В, так и в стадии СПИД, но сравнению с ответом на ФМА (табл. 3). Данные различия можно объяснить высокой сенсибилизацией МНПК к ЛПС ввиду широкого распространения бактериальных инфекций с поражением внутренних органов у детей младшей группы и наличием специфических рецепторов к ЛПС на поверхности мононуклеарных клеток.

В стадии СПИД продукция ФНО-а МНПК in vitro в ответ на оба индуктора была меньше! чем в предыдущей стадии (табл.3).

Рассматривая продукцию ФНО-а у детей в зависимости от проводимой терапии, нами было отмечено, что средний уровень спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro у детей, не принимавших ретровир (697 (230-1400) пг/мл) достоверно (ри<0.01) превысил аналогичный показатель в группе детей, принимавших данный препарат (372 (100-887) пг/мл). Содержание данного цитокина в плазме у детей, не принимавших реровир (714 (120-1400) пг/мл), также превышало аналогичный показатель в группе детей, принимавших данный препарат (301 (45-680) пг/мл), (ри<0.01). Сравнение проводилось в двух группах детей с манифестными формами ВИЧ-инфекции, относящихся к клиническй категории В. Принимались во внимание дети обеих возрастных групп. В первую вошли 10 детей, систематически принимавших ретровир (более шести мес. до госпитализации и в момент обследования ), во вторую группу - девять детей, не принимавших ретровир совсем, либо принимавших ранее нерегулярно.

Исходя из полученных данных можно говорить о том, что прием рет-ровира способствует уменьшению уровня ФНО-а в организме больных ВИЧ-инфекцией. Ввиду этого определение в динамике уровня ФНО-а в плазме крови и спонтанной продукции ФНО-а мононуклеарными клетками in vitro у больных ВИЧ-инфекцией может иметь значение при оценке эффективности используемой терапии.

З.Результаты ретроспективного анализа динамики ВИЧ-инфекции у обследованных больных.

Ретроспективный анализ зависимости динамики ВИЧ-инфекции от показателей продукции ФНО-а был проведен у 21 больного (11 детей и 10 взрослых) через 6-25 мес. от момента исследования. Результаты показали, что прогрессирующее течение ВИЧ-инфекции отмечалось при высоких (выше среднестатистических в соответствующих стадиях ВИЧ-инфекции и возрастных категориях) показателях спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro (у 100% больных) и уровня ФНО-а в плазме крови (у 70% больных). У 80% больных отсутствовал ответ МНПК на индукцию ФМА и у 30% больных - на индукцию продигиозаном.

При отсутствии прогрессии ВИЧ-инфекции в 91 % случаев уровень спонтанной продукции ФНО-а был ниже среднестатистического в соответствующих стадиях ВИЧ-инфекции и i >зрастных категориях. Содержание ФНО-а в плазме у всех больных было ниже среднего показателя. Ответ на

индукцию МНПК продигиозаном сохранялся в 100% случаев, "а индукцию ФМА - в 73% случаев.

В соответствии с вышеизложенным можно говорить о том, что высокие показатели спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro, уровня ФНО-а в плазме крови и отсутствие ответа МНПК на индукцию ФМА или оба индуктора являются неблагоприятным прогностическим фактором для больных ВИЧ-инфекцией. Напротив, относительно невысокие показатели продукции ФНО-а и сохранение ответа МНПК на оба индуктора следует считать положительными прогностическими критериями в оценке дальнейшей судьбы пациентов.

ВЫВОДЫ

1. Комплексными исследованиями установлено, что спонтанная продукция ФНО-а мононуклеарами периферической крови in vitro и его содержание в плазме достоверно повышены и увеличиваются с прогрессией ВИЧ-инфекции, а также зависят от активности вторичных и сопутствующих заболеваний.

2. Выявлено наличие взаимосвязи между повышением уровня ФНО-а в плазме крови, спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro и снижением количества С04+-лимфоцитов в периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией.

3. Результаты изучения индуцированной продукции ФНО-а МНПК in vitro показали снижение реактивности мононуклеарных клеток с прогрессией ВИЧ-инфекции.

4. Сочетание высокой спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro и уровня ФНО-а в плазме крови со снижением ответа МНПК на индукторы является неблагоприятным прогностическим фактором для больных ВИЧ-инфекцией.

5. Прогрессивное снижение спонтанной продукции ФНО-а МНПК in

vitro, уровня ФНО-а в плазме крови и отсутствие ответа мононуклеарных клеток на индукторы у больных в стадии СПИД указывает на истощение функциональных возможностей клеток и наступлении терминальной фазы ВИЧ-инфекции.

6. Уровни ФНО-а в плазме крови, спонтанной и индуцированной продукции ФНО-а МНПК in vitro у детей с ВИЧ-инфекпией 1-5 лет превышали аналогичные показатели у детей 6-13 лет и взрослых больных, что, вероятно, связано с более высокой реактивностью и степенью сенсиОилн-

i.iiuiii мононуклеарных клеток, а также более тяжелым и быстро прогрессирующим течением заболевания у детей младшей возрастной группы.

7. Обнаружены более высокие уровни продукции ФНО-а МНПК in V uro и его содержание в плазме крови у детей с ВИЧ-инфекцией, не принимавших ретровир, по сравнению с детьми, получавшими данный препарат.

Практические рекомендации.

Предлагается включить определение уровней ФНО-а в плазме крови, спонтанной и индуцированной продукции ФНО-а МНПК in vitro в иммунологический мониторинг больных ВИЧ-инфекцией.

Рекомендуется рассматривать увеличение показателей спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro и его содержаний в плазме крови как неблагоприятный фактор, указывающий на прогрессирующее течение ВИЧ-инфекции. Напротив, отсутствие изменений, или уменьшение данных показателей в динамике свидетельствует о стабильности состояния больного на определенном этапе развития ВИЧ-инфекции.

Предлагается расценивать прогрессивное снижение показателей продукции ФНО-а и отсутствие ответа мононуклеарных клеток на индукторы у больных в стадии СПИД как переход в терминальную фазу ВИЧ-инфекции, что позволит определить дальнейшую тактику ведения больного.

Показатели спонтанной продукции ФНО-а МНПК in vitro и его содержание в плазме крови следует использовать в качестве критериев оценки эффективности специфической противовирусной терапии. Считать лечение целесообразным при уменьшении данных показателей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Endogenous TNF-a production and HLA phenotypes in HIV patients. Kalinina N., Bubnova L., Ketlinsky S., Tsvetkova S., Haldeeva N., Rakhmanova A., Koslov A.. International conferens "AIDS, Cancer and Human retroviruses" -1, 1992, november, 18-22. St.-Petersburg.

2.TNF-a serum levels, spontaneous and induced production by PBMC in HIV patients. Kalinina N-, HaldeevaN., Ketlinsky S., Rakhmanova A.. International conferens "AIDS, Cancer and Human retroviruses" -I, 1992, november, 18-22. St.-Petersburg.

3.Фактор некроза опухоли-a и интерлей! ш-lß в плазме крови больных ВИЧ-инфекцией. С.А.Кетлинский, Н.М.Калинина, С.Н.Цветкова,

А.Г.Рахманова, В.Н.Маслов, Н.А.Халдеева. Вестник Росспйск' fi Академии медицинских наук, 1992, N9-10, стр. 8-L0.

4.Changes in spontaneous and induced TNF-a production in HlV-infcctcd children. N.A.Chaldeeva, N.M.Kalinina, A.G.Rakhmanova, S.A.Kctlinsky. International confere.ns "AIDS, Cancer and Human retroviruses" -II, 1993,28 nov.-2 dec. St.-Petersburg.

5.Peculiarities of spontaneous and induced TNF-a production in HIV-infected children. N.A.Chaldeeva, N.M.Kalinina, A.G.Rakhmanova, S.A.Ketlinsky. Tenth International Conference on AIDS / International Conference on STD. 1994, august, 7-12. Yokohama.

6.Спонтанная и индуцированная продукция фактора некроза опухолей-а у детей с ВИЧ-инфекцией. Н.А.Халдеева, Н.М.Калинина, А.Г.Рахманопа, С.А.Кетлинский, А.М.Пинскер. Иммунология, 1995, N4, стр.16-18.

7.Цитокиновый статус, иммунологические и иммуногенетические показатели у детей, часто болеющих острыми респираторными инфекциями. Н.М.Калинина, С.А.Кетлинский, А.В.Нурк, Н.А.Халдеева, С.Н.Цветкова, Л.Н.Бубнова, Е.ПДмитриева, В.В.Борисова, Н.В.Пигарева, Е.Д.Прокопь-ева. Иммунология, 1995, N4, стр. 40-43.

гт сп»ги.1М)4. х». ^ Тир.