Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение и характеристика интерлейкин-6-зависимой гибридомы и исследование продукции интерлейкинов -1 и -6 в патогенезе миеломной болезни

ад-1 з;з;

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

КЛЮШНЕНКОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИНТЕРЛЕЙКИН-б-ЗАВИСИМОЙ ГИБРИДОМЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКЦИИ ИНТЕРДЕЙКИНОВ -1 И В ПАТОГЕНЕЗЕ МИЕЛОМНОЙ

БОЛЕЗНИ.

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1УЯ2

Работа выполнена в Научном Центре молекулярной диагностики и лечения.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук В.В.МАЛАЙЦЕВ

кандидат физико-математических наук П.Г.СВЕШНИКОВ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик РАЕН А.А.ЯРИЛИН

доктор биологических наук, профессор И.Н.ГОЛОВИСТИКОВ

Ведущее учреждение:

Институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей ОНЦ РАМН.

Защита диссертации состоится "_"_ 191/3 года на

заседании специализированного совета Д.084.14.06 при Российском Государственном Медицинском Университете (117513, г. Москва, ул. Островитянова, д.1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан "_" _ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук,

доцент Т.Е.Кузнецов;)

. ...... 'А:-?

^уг^лиотгг^А i ^ t

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. l'f'í Актуальность темы.

Современный этап развития иммунологии характеризуется глубоким анализом тонких рсгуляторных механизмов иммунных реакций. В клинической иммунологии при исследовании иммунного статуса особое значение приобретает оценка способности иммунокомпетентных клеток к активации, пролиферации и дифференцировке, а также исследование клеток

иммунорегуляторного звена (макрофагов, Т- и B-лимфоцитов) и вырабатываемых ими факторов (Л.В.Ковальчук, А.Н.Чередеев, 1990). В настоящее время развиваются представления, согласно которым нарушение функционирования иммунокомпетентных клеток обусловлены дефектами в системе интерлейкинов. При этом оценка продукции и рецепции различных интерлейкинов не только дает возможность установить конкретные уровни дефектов иммунной системы, но позволяет по-новому подойти к иммунотерапии и выявить механизмы продукции самих интерлейкинов (Р.В.Петров и др., 1987).

В иерархии цитокинов интерлейкин (ИЛ)-б рассматривают как ключевой системный цитокин, который вызывает широкий спектр ответа организма на тканевое поражение, индуцирует синтез белков острой фазы (J.Gauldie et.al., 1987), воздействует на пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток (R.Garman et.al., 1987; A.Muraguchi et.al., 1988) и является фактором, регулирующим гемопоэз (T.Otsuka et.al.,1991). При этом биологический эффект ИЛ-6 осуществляется на фоне других цитокинов и гормонов. Индукция одного цитокина другим, их синергические или взаиморегуляторные взаимодействия, а также взаимодействия с другими гормонами играют решающую роль в запуске воспалительных и иммунных клеточных реакций (D.Emili et.al.,1989; E.Hooge-Peters et.al.,1991).

Повышенный уровень ИЛ-б в периферической циркуляции наблюдается при острой локальной бактериальной и вирусной инфекции (A.Waage et.al,.1989), аутоиммунных (T.Hirano et.al.,1987) и неопластических заболеваниях (R.Lang, A.Burgess, 1990). В связи с этим становится очевидной диагностическая и прогностическая ценность определения ИЛ-Ö в клинической практике, что, в свою очередь, делает необходимым создание чувствительных и специфичных систем детекции этого цитокина в биологических жидкостях.

Получены многочисленные данные, свидетельствующие о том, что ИЛ-6 играет ключевую роль в патогенезе меломной болезни (ММ), выступая в качестве аутокринного/паракринного фактора роста малигнизированных - плазмацитов (M.Kawano et.al.,15)88; B.Klein et.al., 1989). Получены доказательства существования иммунорегуляторного цитокинового каскада, включающего ИЛ-1 и фактор некроза онухолей-u (TNF-aj, которые, активируя транскрипцию гена ИЛ-6, усиливают ИЛ-б-опосредованную пролиферацию миеломных клеток (A.Carter et.al., 1990). Кроме того, ИЛ-1 и ИЛ-6 усиливают процесс деструкции кости, наблюдающийся при миеломной болезни, поскольку являются остеокласт-1-активирующими факторами (Y.Ishimi et.al., 1990).

Одним из существенных и вместе с тем мало изученных аспектов в исследовании роли цитокинов при ММ является способность мононуклеарных клеток к спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-1 и ИЛ-6 в культуре. При этом взаимосвязь локальной продукции зтих цитокинов в костном мозге и их продукции в периферической крови практически не исследована.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось получение интерлейкин-Ь-зависимой клеточной линии, разработка на ее основе метода количественного определения ИЛ-6 и изучение продукции jn vitro интерлейкинов-1 и -6 мононуклеарными клетками периферической крови и костного мозга при миеломной болезни.

В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

1.Получить . интерлейкин-6-зависимую гибридому, охарактеризовать ее свойства и разработать на ее основе метод количественного определения ИЛ-6.

2.Изучить спонтанную и липополисахарид (ЛПС)-индуцированную продукцию ИЛ-1 и ИЛ-6 в культуре мононуклеарных клеток крови и костного мозга больных ММ.

3.Исследовать продукцию ИЛ-6 субпопуляциями прикрепляющихся и неприкрепляющихся к пластику мононуклеарных клеток в норме и при ММ.

4.Исследовать кинетику продукции ИЛ-1 и ИЛ-6 при ММ.

5,Оиределить содержание ИЛ-6 в тканевых жидкостях и

плазме крови при ММ и, в качестве сравнения, при ревматоидном артрите.

Научная новизна работы.

Впервые проведен сравнительный анализ спонтанной и ЛПС-индуцируемой продукции цитокинов в периферической крови и костном мозге при миеломной болезни и установлен аномально высокий уровень ЛПС-индуцируемой продукции ИЛ-б моноцитами в популяции мононуклеарных клеток периферической крови больных.

Оценка продукции ИЛ-6 адгезивными и неприкрепляющимися клетками впервые проведена в контексте проблемы межклеточных взаимодействий при миеломной болезни. Показано, что в костном мозге кооперация опухолевых клеток и клеток стромального микроокружения приводит к усилению продукции ИЛ-6.

Впервые установлена принципиально различная роль ИЛ-6 в патогенезе воспалительного аутоиммунного заболевания (ревматоидный артрит) и ИЛ-6-зависимого неопластического процесса (миеломная болезнь). Показано, что повышенная локальная продукция ИЛ-6 при миеломной болезни сопровождается аутоутилизацией этого фактора, тогда как при ревматоидном артрите приводит к появлеггию ИЛ-0 в периферической циркуляции.

Практическая ценность работы.

Разработанный на основе гибридомы Б6С8 метод детекции ИЛ-б позволяет количественно определять активность этого цитокина в культуральных жидкостях , плазме крови и тканевых жидкостях в клинических исследованиях при многих патологиях (инфекциях,аутоиммунных и неопластических заболеваниях).

Результаты исследования продукции ИЛ-1 и ИЛ-6 имеют важное значение для понимания роли этих цитокинов при ММ, а также возможных причин нарушения функций цитокин-продуцирующих клеток при неопластических заболеваниях.

Исследование соотношения между локальными процессами и системным действием цитокинов позволяет осуществлять дифференцированный подход при диагностике и выборе тактики лечения при ММ.

Апробация работы.

Апробация работы состоялась на конференции молодых ученых Института прикладной молекулярной биологии МЗ СССР (1989) и

на межлабораторном семинаре отдела биорегуляции Научного Центра молекулярной диагностики и лечения (1992).

Материалы диссертации опубликованы в 5 печатных работах.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, двух глав обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав результатов собственных исследований и обсуждения полученных Данных, выводов, изложена на страницах машинописного текста,

иллюстрирована 10 рисунками и 5 таблицами, включает список литературы из наименований (из них источников

отечественных и - зарубежных авторов).

Список сокращений. ИЛ - интерлейкин; TNF - фактор некроза опухолей (tumor necrosis factor); MM - множественная миелома (миеломная болезнь); ЛПС -липополисахарид; ФГА - фитогемагглютинин; Мнк мононугслеарные клетки; СКМ- среда, кондиционированная макрофагами; СПК- сыворотка плода коров.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследований.

1. Получение фактор-зависимых гибридом. Крысам линии August вводили внутрибрюшинно по 400 мкг липополисахарида (ЛПС) E.coli 0III:B4 (Difco). Через 3 дня после иммунизации спленоциты сливали с миеломой X6ñ.Ag8-653 с помощью полиэтиленгликоля (Merk 4000). Гибридомы культивировали в присутствии фидерных клеток (перитонеальных макрофагов) в среде DMEM (Flow), содержащей гипоксантин, тимидин, аминоптерип (2с/с ГАТ-среды, Flow), 50 мкг/мл гентамицина, 4мМ глютамина и IQ'/i. сыворотки плода коров (СПК, Gibco, Myoclone plus). В качестве источника фактора роста использовалась среда, кондиционированная макрофагами (СКМ, см. ниже). Полученные гибридомы клонировали методом лимитирующих разведений, а затем в полужидком агаре в присутствии 12,5% СКМ.

2. Получение конлинионированных срел. Для приготовления СКМ мышам линии Balb/c вводили внутрибрюшинно по 50 мкг ЛПС. Перитонеальные клетки, извлеченные на следующий день, культивировали в концентрации 10^/мл в течение 1-5 дней в среде

DMEM, содержащей СПК при 37° С и СО2. Полученный

еупернатант инактивировали при 56°С в течение 30 мин.

3. Выделение и фракционирование мононуклсарньгх клеток человека. Мононуклеары выделяли из гепаринизированной крови и костного мозга здоровых доноров и больных ММ на среде для разделения лимфоцитов (Flow). Плазму для исследования отбирали после градиентного центрифугирования. Для продукции цитокинов мононуклеары культивировали 24 часа в концентрации Ю^/мл в среде RPMI 1640, содержащей 1О'/г СПК, 2 мМ глютамина, 50мкг,/мл гентамицина, 50мкМ 2-меркаптоэтанола (все реактивы фирмы Gibco) в 24-луночных планшетах для тканевых культур (Costar). Прикрепляющиеся к пластику клетки отделяли культивированием в течение 3 часов в среде, содержащей 20% СПК. Неприкрепившиеся клетки собирали, центрифугировали и ресуснендировали в исходном объеме свежей среды. Лунки с прикрепившимися клетками промывали и заливали исходным объемом свежей среды. Для индукции использовали ЛПС E.coli (Difco) в конечной концентрации 4мкг/мл.

4. Исследование пролиферативного ответа В-клеток. Для выделения популяции , обогащенной В-клетками, неприкрепившиеся к пластику мононуклеарные клетки костного мозга инкубировали с эритроцитами барана, обработанными нейроаминидазой для отделения розеткообразуклцих клеток. Клетки, не образующие розеток, выделяли на среде для разделения лимфоцитов. Популяция, обогащенная В-клетками, не пролиферировала в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином (ФГА, РНА-Р, Difco, Юмкг/мл). Для оценки пролиферативного ответа клетки культивировали в 96-луночных планшетах для тканевых культур в концентрации 10^/мл (2-10^/лунку в 200 мкл) в течение 72 часов в присутствии исследуемых ростовых факторов. Пролиферативный ответ оценивали по включению ЗН-тимидииа (20Ки/ммоль, 0,5мкКи/лунку) в течение последних 16 часов инкубации.

5. Определение активности ИЛ-в. Клетки клопа D6C8 наращивали в среде DMEM, содержащей 10% СПК и 10% СКМ, аликвоты клеток замораживали , хранили в жидком азоте и размораживали за несколько дней до опыта. Для определения содержания фактора роста гибридом серийные разведения тестируемых образцов инкубировали с клетками гибридомы D6C8

(5-1(Я клеток/лунку) в 96-луночных планшетах для тканевых культур (Costar) в 200 мкл в течение 48 часов при 37°С и 5^СС>2 в среде DMEM, содержащей 10% диализованной СПК (Gibco). Ore пень пролиферации клеток оценивали по включению гимидина, который вносили за 5 часов до окончания опыта (40 Ки/ммоль, , 1 мкКи/лунку). Меченые изотопом клетки собирали на фильтры, радиоактивность проб оценивали с помощью сцинтилляционного р-счетчика. Для определения содержания фактора в плазме крови и тканевых жидкостях образцы предварительно инактивировали при 5б°С в течение 30 мин.

6. Определение активности ИЛ-I. Определение активности ИЛ-1 проводили с помощью пролиферативного комитогенного теста (S.Gillis et.al.,1978). Тимоциты мышей линии СБА (106,/лунку в 200 мкл) культивировали в присутствии 0,5 мкг/мл ФГА (РНА-Р, Difco) с серийными разведениями образцов в среде RPMI 1640 , содержащей 10% СПК и 2мМ глютамина в течение 72 часов . Меченый тритием тимидин (20Ки/ммоль, 1мкКи/лунку) добавляли за 16 часов до окончания опыта. Радиоактивность проб оценивали так же, как и в случае ИЛ-б.

Определение биологической активности ИЛ-1 и ИЛ-б в исследованных образцах проводили методом пробит-анализа (S.Kronheim et.al,.1985), опираясь на результаты титрования внутренних лабораторных стандартов, которыми служили культуральные жидкости ЛПС-стимулироваиных мононуклеаров периферической крови здоровых доноров. За единицу биологической активности принималось количество фактора, вызывающее половину максимального пролиферативного ответа фактор-чувствительных клеток. Лабораторный стандарт ИЛ-б . был откалиброван относительно международного стандарта рекомбинантного интерлейкина-б (code 88/514), предоставленного National Institute For Biological Standarts and Control (NIBSC), PO BOX 1193, Potters Bar, Hertfordshire.EN63QH.U.K.

7. Рекомбииантные лимсЬокины. Нами использованы рекомбинантные ИЛ-1-p (10^ ед./мг) и фактор некроза опухолей-а человека (106ед./мг) фирмы Boerhinger Hannh, ИЛ-б человека (2-Ю6 ед./мг) фирмы Genzyme.

8. Клинический материал. Кровь и костный мозг больных ММ получены в МОНИКИ, кровь и синовиальная жидкость больных

ревматоидным артритом - в институте ревматологии АМН СССР. В качестве контроля использована кровь доноров и добровольцев.

Исследовано 18 больных миеломной болезнью (17 женщин, 1 мужчина) в возрасте от 50 до 05 лет, все с диагнозом "множественная миелома, III стадия " ( по классификации Durie-Salmon). Длительность заболевания составила от полугода до 8 лет, у большинства 2-3 года. Для всех исследованных больных были характерны деструктивные процессы в костях, остеопороз, остеолиз. Во всех случаях кровь и костный мозг брали перед началом очередного курса химиотерапии, когда со времени предыдущего курса прошло не менее 2 месяцев.

9. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью непараметрических методов анализа, используя для независимых выборок критерии Фишера, Уайта, для взаимозависимых - парный критерий Вилкоксона и коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Получение ИЛ-6-зависимой гибриломы и разработка метода определения ИЛ-6.

Для получения фактор-зависимых гибридом в качестве партнеров по слиянию были взяты клетки селезенки крыс, иммунизированных ЛПС (поликлональный активатор B-клеток), и миеломы мыши Х653 (J.Van.Snik et.al.,198ö). После слияния клетки культивировали в присутствии СКМ. Через 10 дней после гибридизации были отобраны 24 первичные культуры, каждая из них была проверена на способность расти в присутствии СКМ и без нее. В результате был отобран клон D6C8, характеризующийся наивысшей чувствительностью к фактору роста при оптимальных условиях. Зависимость синтеза ДНК клетками D6C8 от времени культивирования показана на рис.1. В присутствии фактора роста стимуляция синтеза ДНК наблюдалась уже через 24 часа, через 48 часов включение ^Н-тимидина увеличивалось в 10-15 раз по сравлению с исходным уровнем и было в 25-30 раз выше, чем в отсутствие СКМ. Время удвоения клеток в логарифмической фазе роста составило примерно 15 часов. Связь между уровнем синтеза ДНК и количеством СКМ, добавленным в культуральнуго среду, показана на рис 2. Для сравнения представлены данные для

Рис.1. Кинетика действия среды, кондиционированной макрофагами (СКМ), на включение ^Н-тимидина клетками БбСВ.

1- 12,5% СКМ;

2- среда без СКМ

Рис.2. Влияние среды, кондиционированной макрофагами на пролиферацию клеток Б6С8 (1) и Бр2/0 (2).

Рис.3. Влияние рекомбинантных цитокинов па пролиферацию клеток D6C8. 1- И.Л-6; 2-TNF-a; 3- ИЛ-1-Ц.

Рис.4. Калибровочный график титрования международного стандарта рекомбинантного ИЛ-6 (NIBSC code 88/514) в пролиферативном тесте с использованием гибридомы D6C8.

миеломы мыши sp2/0. Стимуляция роста клеток D6C8 наблюдалась при конечной концентрации СКМ 0,16%, зависимость была близка к линейной при низких концентрациях, кривая достигала плато при 2,5% СКМ. Рост клеток миеломы при тех же условиях практически не зависел от присутствия экзогенного фактора. Действие рекомбинантных цитокинов на рост клеток показано на рис.3. Рекомбинантные ИЛ-1-p и TNF-a не влияли на пролиферацию линии D6C8, тогда как ИЛ-6 значительно усиливал синтез ДНК этими клетками. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что гибридома D6C8 является ИЛ-6-зависимой.

Форбол миристат ацетат, ФГА и ЛПС в концентрациях, использованных для индукции, не оказывали влияния на рост клеток D6C8, однако при более высоких концентрациях ЛПС (20-40 мкг/мл) включение 3Н-тимидина клетками увеличивалось в 3-5 раз.

Дозозависимый характер пролиферативного ответа клеток D6C8 на рекомбинантный ИЛ-6 и СКМ позволил определить количественно этот фактор в различных культуральных жидкостях и клинических образцах. На рис.4 представлены результаты титрования международного стандарта рекомбинантного ИЛ-6 (NIBSC code 88/514) в пролиферативном тесте с использованием линии D6C8. Половина максимального включения ^Н-тимидина клетками наблюдалась при концентрации ИЛ-6 90 пг/мл. Следовательно, при объеме пробы 200 мкл, одной единице биологической активности в разработанном нами тесте соответствует 18 пг ИЛ-6, что сопоставимо с аналогичным показателем для ИЛ-6-зависимых гибридом, полученных другими авторами (P.Lansdorp et.al.,1986; J.VanSnik,1986). Уровень детекции, т.е. минимальная концентрация ИЛ-6, при которой включение ^Н-тимидин а достоверно отличалось от фонового, составил 8 пг/мл или 0,5 ед./мл. При титровании исследуемых образцов со стартового разведения 1/8 предел определения ИЛ-6 составил 4 ед./мл.

Для оценки воспроизводимости результатов тестирования с помощью метода пробит-анализа была определена активность ИЛ-6 в одном и том же образце как в пределах одного опыта (на разных планшетах), так и от опыта к опыту относительно одного и того же лабораторного стандарта. В пределах одного опыта активность фактора в образце составила 9,86±0,127 отн.ед./мл, (п=3), средняя активность по результатам разных опытов составила 11,43± 1,929 отн.ед./мл, (п=4).

и

2 Продукция ИЛ-1 и ИЛ-б при миеломной болезни.

В патогенезе миеломной болезни продукция ИЛ-б играет чрезвычайно важную роль, поскольку он выступает в качестве аутокрипного/паракринного фактора роста миеломггых клеток (М.Са\уапо ег.а1.,1988; В.К1ет е1.а!.,1989). ИЛ-1 является активатором транскрипции гена ИЛ-б (И.АпигайЬа е1.а1., 1988), действует во многих случаях синергично с ИЛ-б (М.НеНе е1.а).,1988) и обладает остеокласт-активирующей активностью при ММ (У.УзЫгш е1..а1.,1990). Поскольку нарушение функционирования иммунокомпетентных клеток при ММ могут быть обусловлены дефектами в системе интерлейкинов, мы исследовали продукцию этих двух цитокинов в периферической крови и костном мозге больных ММ и попытались оценить взаимосвязь между локальными процессами, происходящими в костном мозге и системным действием ИЛ-6 при данной патологии.

Продукция ИЛ-1 и ИЛ-6 при ММ. На рис. 5 и в табл.1 представлена активность ИЛ-1 и ИЛ-б в культуральных еупернатантах мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и больных ММ и костного мозга больных ММ. Спонтанная и ЛПС-индуцированная продукция ИЛ-1 и ИЛ-б мононуклеарными клетками периферической крови больных ММ оказалась достоверно выше, чем в контрольной группе (рис.5) (р< 0,05, критерий Уайта). В еупернатантах клеток костного мозга больных ММ уровень ИЛ-1 был достоверно ниже, чем в периферической крови (р<0.01, критерий Вилкоксона) (рис.5а).

Таблица1. Продукция ИЛ-1 и ИЛ-б мононуклеарными клетками периферической крови (ПК) и костного мозга (КМ) в норме и при миеломной болезни (ММ).

группы ИЛ- 1,ед./мл ИЛ-6,ед./мл

сравнения спонтан. етимулпр. спонтан. етпмулир.

норма, 6.2+4.0 18,6+9,0 188.2+62.6 474.8+121.4

ПК 0.7-18 3-38 40-380 240-1375

п=4 п—4 п=8 п»8

ММ. 18,7+5.3 63.2+15.9 532.4 + 130.2 2710.3+771.6

ПК 0.1-57 1-159 100-1700 210-8800

п=16 п=12 п=16 п-11

мм, 4.1 + 1.7 12,9+5,5 781,1+326,0 1372,5+859.6

км 0.1-19 0.1-47 50-430(1 60-7300

п=12 п—8 п-13 п-8

ед./мл

II III

Рис.5. Продукция ИЛ-1 (а) и ИЛ-6 (б) мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров (I) и больных ММ (II) и костного мозга больных ММ (III). О - спонтанная продукция; ЕВ - ЛПС-стимулированная продукция; |—| - различия достоверны.

Спонтанная продукция ИЛ-6 клетками костного мозга была, в отличие от ИЛ-1, гак же высока, как и в крови. При этом ЛПС-индуцированная продукция в костном мозге оказалась ниже, чем в периферической крови (р<0.05, критерий Вилкоксона) (рис.5б).

Для периферической крови больных ММ характерна повышенная "стимулируемость" клеток, продуцирующих ИЛ-6 по сравнению со здоровыми донорами. Индекс стимуляции, т.е. отношение ЛПС-стимулированной продукции к спонтанной при ММ составил 3,74+ 0,48 (1,7-7,1, п=11), тогда как в контрольной группе -2,56+0,72 (1,3-6,0, п=8) (р<0,01, критерий Уайта). При этом ИС,

превышающий 2, наблюдался у 2 здоровых доноров из 8, а у больных ММ - у 10 человек из 11. I1C для клеток костного мозга больных ММ оказался достоверно ниже, чем в периферической крови и составил 2,27+0,66 (0,2-5,9, п=8) (р<0,05, парный критерий Вилкоксона). Повышенная спонтанная продукция фактора при сниженной стимулированной свидетельствует, по-видимому, об активации in vivo популяции клеток костного мозга, секретиругащих И.Л-6, и об истощении их потенциала в отношении продукции цитокинов. Индекс стимуляции продукции ИЛ-1 мононуклеарными клетками крови больных ММ не отличался достоверно от контроля и составил в среднем соответственно 3,35+(1,3-6,б, п=8) и 2,77+0,75 (1,7-5,0, п=4).

При исследовании корреляционных связей между продукцией ИЛ-1 и ИЛ-6, а также продукцией этих факторов в крови и костном мозге выявлена достоверная корреляция средней силы между спонтанной продукцией ИЛ-6 мононуклеарами крови и костного мозга больных ММ ( коэффициент ранговой корреляции Спирмена р=(),66, р<0,05).

Зависимость продукции исследованных цитокинов от активности болезни представлена в табл. 2 и 3. Исследованные нами больные были разделены на три группы: в I группу вошли впервые поступившие пациенты, которым химиотерапия не проводилась вообще, во II группе объединены больные, резистентные к лечению либо с рецидивом ММ, в III группу вошли больные в стадии ремиссии. Критерием ремиссии считалось снижение концентрации парапротеина в сыворотке более чем на 50% при наличии стабильного или нарастающего уровня гемоглобина, сывороточного альбумина и отсутствие нарастания количества и размера остеодеструктивных очагов (Н.Е.Андреева,1976). Таким образом, I и II группы характеризовались активностью патологического процесса, а II и III группы - применением химиотерапии.

Как спонтанная, так и стимулированная продукция ИЛ-1 (табл.2) в крови в среднем максимальна в группе больных, которым не проводилась химиотерапия, при этом наблюдается тенденция к ее снижению в гр. II и III вне зависимости от активности болезни, однако различия статистически достоверны только для стимулированной продукции (р<0,05, критерий Уайта). Спонтанная и индуцированная продукция ИЛ-6 (табл.3) мононуклеарами периферической крови, напротив, максимальна в I и II группах, наблюдается тенденция к ее снижению у больных в стадии ремиссии.

Таблица 2. Продукция ИЛ-1 мононуклеарными клетками в зависимости от активности болезни (од./мл)

Группы кровь КОСТНЫЙ МОЛ'

больных спонтан. стимулир. спонтан. стимулир.

до лечения 33.2+11.2 100.2+23.7 0.4+0.2 1.2+0.5

4-57 28-159 0,1-1 0,1-1.8

п-5 п-5 п-3 п-3

резистент- 6,4+9,2 43,4+12,9 Й.б+4,3 20.2+9.4

ны. реци- 2-52 9-67 0.1-19 5-47

див п-5 п—э п-4 п-4

ремиссия 14,3+8,8 • 42.7+31,0 1.9+0.5 5.9+2.3

5-48 1-135 1-3 2-11

п-4 п-4 п-4 п-4

норма 6,3+4.0 1-18 п-4 18,6+9.0 3-38 п-4

Таблица 3. Продукция ИЛ-6 мононуклеарными клетками в зависимости от активности болезни (од./мл)

группы кровь костный мозг

больных спонтан. стимулир. спонтан. стимулир.

до лечения 730+260 2813+2046 76+16 117+61

100-1600 232-8800 50-104 52-240

п-5 п-5 п-3 п-3

резистент- 751+272 2954+823 1770+654 2337+1661

ны, реци- 270-1706 700-5120 600-4300 300-7300

див п-5 п—5 п-5 п-5

ремиссия 359+130 1137+463 149+46 616+360

80-846 210-2400 40-248 150-1180

п-5 п-5 п-4 п-4

норма 188±66 40-380 п-8 475+121 240-1375 п-8

Хотя при сравнении I и III , также как II и III групп различия статистически недостоверны , объединение больных I и II групп по признаку активности болезни приводит к появлению достоверных различий с группой III (р<0,01, критерий Уайта). Спонтанная и индуцированная продукция ИЛ-1 и ИЛ-6 мононуклеарами костного мозга оказалась достоверно выше в группе II по сравнению с больными в стадии ремиссии (р<0,05, критерий Уайта). Корректно сравнить I и II группы оказалось

Таблица 4. Спонтанная продукция ИЛ-б субпопуляциями мононуклеарных клеток (Мнк) периферической крови (ПК) и костном мозге (КМ) в норме и при миеломной болезни (ММ).

группы Продукция ИЛ-6, ед./мл Индекс

срав- 11 прмкрсп- нспрнкреп- суммарный нефракцио- коопера-

нения пляюшпеся ляюшиеся вклад нпрованиые тнвностн

Мнк Мнк Мнк

норма. 4 135.8±а9.5 186.0±105.2 318.8±104.2 206.0167.0 3.1!!±1.95

ПК 60-312 130-Г.00 130-Г)60 50-380 0.4-8.8

ММ. 10 179.2±:!4.0 242.1±105.1 423.4±123.2 620.6±181.8 1.01±0.30

ПК 16-300 24-1140 40-1400 100-1700 (1.2-2.9

ММ. 8 16.9±2.73 327.0+177.6 344.1±179.3 644.2±212.!> 0.61 ±0.13

км Г>-27 И!-1Г>00 23-1 ">30 50-1600 0.03-1.1

невозможно из-за отсутствия данных для двух больных, "внесших" максимальный вклад в средние показатели для крови.

Таким образом, повышенная продукция ИЛ-1 и ИЛ-б в периферической крови и костном мозге в значительной степени отражает активность патологического процесса при миеломной болезни, что совпадает с результатами других авторов (Х.2ап£ (Ч.а1.,1989). При этом следует отметить очень большую индивидуальную изменчивость продукции цитокинов, что свидетельствует о необходимости дифференцированного подхода при выборе тактики лечения и, в частности, при применении цитокиное для иммунокоррекции.

Спонтанная продукция ИЛ-б прикрепляющимися и ненрикрспляющимися к пластику субнопуляциями мононуклеаров. Несмотря на широкий спектр клеток-продуцентов ИЛ-б. главными его источниками принято считать моноциты/макрофаги и фибробласты. Поскольку паракринная регуляция роста опухолевых клеток, по-видимому, играет очень существенную роль при ММ (Л.Ниг1ег е1.а1.,1991), мы исследовали спонтанную продукцию ИЛ-б прикрепляющимися и неприкрепляющимися к пластику субпопуляциями мононуклеарных клеток (табл.4).

Уровень спонтанной продукции ИЛ-б прикрепляющимися к пластику клетками периферической крови практически неразличим у здоровых доноров и больных ММ (табл.4). Активность ИЛ-б' в супернатантах прикрепляющихся клеток костного мозга больных ММ оказалась очень низкой. Конститутивная продукция ИЛ-б неприкрепляющимися клетками во всех трех случаях достоверно по

различалась, хотя в среднем была максимальна для костного мозга больных ММ. Однако при атом суммарный вклад обеих субпопуляций и продукция ИЛ-б нефракционированными мононуклеарными клетками оказались различными (табл.4 что позволило предположить наличие регуляторных взаимодействий исследуемых субпопуляций при продукции ИЛ-б. Для исследования степени такого взаимодействии мы определили oi ношение суммарной активности ИЛ-б в супернатантах обеих субпопуляций к продукции фактора нефракционированпыми клетками, условно названное нами индексом кооперативное™ (ПК). Очевидно, что ИК, близкий к 1. свидетельствует об отсутствии взаимовлияний субпопуляций при продукции ИЛ-б, ИК, превышающий 1, означает наличие ингиоируюших, а ИК, меньший 1 - стимулнруюпшх воздействий клеток друг на друга. Несмотря на то, что различия между абсолютными значениями для ПК здоровых допоров оказались недостоверны, анализ ИК позволил предположить наличие ингибирующих регуляторных взаимодействий в норме и отсутствие их при ММ (табл.4). Продукция ИЛ-б нефракционированпыми мононуклеарами костного мозга оказалась достоверно выше, чем суммарный вклад обеих субпопуляций (р<0,01, критерий Вилкоксона), что и отражает ИК, меньший 1 ^табл.4). Можно предположить, что зарегистрированная нами повышенная спонтанная продукция ИЛ-б клетками костного мозга обусловлена взаимоешмулирующим действием прикрепляющихся (главным образом клеток стремы) и неприкрепляющихся ( в основном миеломпых клеток) субпопуляций мононуклеарных клеток.

Кинетика продукции ИЛ-1 и ИЛ-6. Кинетика спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-1 и ИЛ-б была исследована у 3 больных ММ и 3 здоровых доноров. Для ИЛ-1 максимальная спонтанная и индуцированная продукция наблюдалась в первый день культивирования, динамика изменений не отличалась в норме и при ММ. Максимальное содержание ИЛ-б (рис.б) в супернатантах мононуклеарных клеток крови и костного мозга как в норме, так и при ММ наблюдалось на 2 день, резко снижаясь к третьему дню культивирования (рис.6,AI-III). Такое резкое снижение содержания цитокина в среде культивирования можно интерпретировать как преобладание аутоутилизации над продукцией фактора. Более сильный ответ на стимуляцию ЛПС, свойственный клеткам периферической крови больных ММ, обусловлен, по-видимому,

N / \

I

I

2 II

В

2 3 лмч

III

Рнс.6. Кинетика продукции ИЛ-6 нефракционпрованнымп мононупслсарамп 1.\). прикрепляющимися (Б) и непрнкрепляюмшмиея (В) клетками т'рпферичпго'/. крови здоровых доноров (I). больных ММ (II) и костного мозга больных ММ 1Ш1 _- спонтанная продукция;____- ЛНС-индуцнропаннал продут;.".':

8

4

гиперчувствительностыо моноцитов, эти же клетки, скорее всего участвуют и в утилизации фактора (рие.бБП). Неприкрепляющиеся клетки периферической крови как в контроле, так и при ММ слабо отвечали на стимуляцию ЛПС, при этом активность ИЛ-б в супернатантах постепенно повышалась к третьему дню культивирования (рис.бВ1.Н). В костном мозге как продукция, так и утилизация фактора является, по-видимому, результатом взаимодействия опухолевых клеток и клеток стромалыюго микроокружения, приводящего к каскадному процессу с регуляцией по тину положительной обратной связи, поскольку каждая из субпопуляций в отдельности продуцировала очень незначительное количество фактора спонтанно и практически не отвечала на стимуляцию ЛПС (рис.6, ША-В).

Исследование пролиферативного ответа на ростовые факторы Фракции мононуклеарных клеток костного мозга., обогащенной В клетками. ИЛ-6 рассматривается как основной фактор роста миеломных клеток, тогда как ИЛ-1 и ТИК-а могут усиливать ИЛ-б-зависимую пролиферацию плазмацитов (М.Катуапо е1.а1.,1989). Мы исследовали пролиферацию В клеток костного мозга больных ММ в присутствии 100, 10 и 1 ед./мл рекомбинантных ИЛ-1-р, ТИР-а (ВоегЬ^ег НаппЬ) и ИЛ-6 (Оепгуше), а также супернатапта мононуклеарных клеток здоровых доноров, стимулированных в течение 48 часов ФГА ( РНА-Р, Б11со,20мкг/мл). По нашим данным, В клетки костного мозга отвечают дозозависимо на рекомбинантный ИЛ-б человека, индекс стимуляции при дозе 100 ед./мл составил в среднем 1,41+0,09 (1,05-2,9, п=14). У исследованных нами больных не зарегистрировано ни одного случая пролиферации В клеток в ответ на ИЛ-1-р или ТЫР-сс . Однако в присутствии супернатанта ФГА-активированных мононуклеаров индекс стимуляции оказался в среднем выше, чем в случае рекомбинантного ИЛ-б (при отсутствии пролиферативного ответа на ФГА): 2,6+0,21 (1,7-3,1, п=5). При этом в ряде случаев мы наблюдали увеличение пролиферации В клеток под действием супернатанта при полном отсутствии ответа на ИЛ-6. По-видимому, наряду с ИЛ-6, другие факторы могут усиливать пролиферацию миеломных клеток при ММ.

Содержание ИЛ-6 в плазме и тканевых жидкостях при миеломной болезни и ревматоидном артрите. Уровень ИЛ-6 в периферической циркуляции и тканевых жидкостях повышается при

Рис.7. Содержание ИЛ-б в плазме крови ( О) и тканевых жидкостях ( а ) в норме (I), при миеломной болезни (II) и при ревматоидном артрите (III).

| ] - различия достоверны

многих патологиях . При этом концентрация ИЛ-6 в локальных тканевых жидкостях (цереброспинальной, синовиальной, амниотической) может быть в 10-100 раз выше, чем в сыворотке, подтверждая локальную продукцию этого цитокина (P.Sehgal,1990). Показано, что уровень ИЛ-б в сыворотке крови отражает степень тяжести болезни при моноклональных гаммапатиях и может иметь прогностическое значение (Bataille et.al.,1989). У исследованных нами больных ММ (рис.7) содержание фактора, поддерживающего пролиферацию линии D6C8, составило в среднем 69,8+11,9 ед./мл (10-210, п=16) при норме 39,4+19,2 ед./мл (13-64, п=7), различия статистически недостоверны. Содержание ИЛ-6 в жидкости аспирата костного мозга у больных ММ оказалось достоверно ниже, чем в плазме: 46,6+9,2 ед./мл (3-106) (р<0,01, критерий Вилкоксона). Для сравнения мы исследовали содержание ИЛ-6 в плазме и синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом, поскольку

для этой патологии показана повышенная конститутивная продукция ИЛ-6 синовиоцитами и другими клетками, вовлеченными в воспалительный процесс (T.Hirano et.al.,1988). Содержание ИЛ-6 в плазме крови больных ревматоидным артритом оказалось достоверно выше нормы и составило 262,8+84,6 (67-517) ед./мл. В синовиальной жидкости содержание фактора оказалось достоверно выше, чем в плазме крови: 1310,3±270,9 (698-2484) ед./мл, п=6 (р<

0.01. критерий Вилкоксона)(рис.7). Поскольку повышенное содержание цитокина в локальной тканевой жидкости по сравнению с сывороткой традиционно рассматривается как доказательство его локальной продукции ( A.Waage et.al.,1989), можно предположить , что при ММ баланс между продукцией и поглощением ИЛ-6' в костном мозге сдвинут в сторону последнего. При этом основной вклад в потребление могут вносить миеломные клетки, составляющие, как правило, большую часть мононуклеарных клеток костного мозга при ММ, для которых ИЛ-6 является ростовым фактором.

ВЫВОДЫ.

1. Получена гетерогибридома крыса-мышь D6C8. ИЛ-6, но не ИЛ-1-p и TNF-a, является необходимым фактором для роста и выживания клеток линии D6C8 в культуре.

2. На основе линии D6C8 разработан метод количественного определения ИЛ-6 в культуральных жидкостях и клинических образцах.

3. Одной единице биологической активности ИЛ-6 в пролиферативном тесте с использованием линии D6C8 соответствует 18 пг стандартного препарата рекомбинантного ИЛ-6 (NIBSC code 88/514), при этом уровень детекции этого цитокина составляет 0,5 ед./мл.

4. Спонтанная и ЛПС-индуцированная продукция ИЛ-1 и ИЛ-в мононугслеарными клетками периферической крови при миеломной болезни повышена по сравнению с нормой и обусловлена повышенной способностью моноцитов отвечать на стимуляцию ЛПС при данной патологии.

5. Спонтанная и индуцированная продукция ИЛ-6 в крови и костном мозге и ИЛ-1 в костном мозге максимальна при активном течении болезни, наблюдается ярко выраженная тенденция к ее снижению при ремис;сии

6. При раздельном культивировании прикрепляющихся и неприкрепляющихся к пластику мононуклеарных клеток периферической крови различия в спонтанной продукции ИЛ-6 между больными миеломной болезнью и группой сравнения нивелируются, что свидетельствует о решающей роли межклеточной кооперации при регуляции продукции этого иитокина.

7. Повышенная спонтанная и индуцированная продукция ИЛ-6 клетками костного мозга при миеломной болезни является результатом взаиморегуляторных воздействий популяций прикрепляющихся и неприкрепляющихся к пластику мононуклеарных клеток.

8. Пониженное содержание ИЛ-6 в аспирате костного мозга по сравнению с плазмой крови, а также кинетика продукции этого цитокина в культуре мононуклеарных клеток при миеломной болезни свидетельствуют о сдвиге баланса между продукцией ИЛ-6 и его аутоутилизацией в сторону последнего.

9. При ревматоидном артрите, в отличие от ММ, продукция ИЛ-6 в локальном очаге воспаления приводит к появлению его в периферической циркуляции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Е.Н.Клюшненкова, В.В.Малайцев. Получение интерлейкин-6-зависимой гетерогибридомы и возможности ее использования в лабораторно-клинических условиях. Тезисы II Всесоюз. симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии",М.,1991, стр.94.

2. В.В.Малайцев, И.М.Богданова, Е.Н.Клюшненкова и др. Активация продукции интерлейкинов -1, -6 и фактора некроза опухолей новым иммуномодулятором ЛВ-2. Тезисы II Всесоюз. симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", М.,1991, стр.120.

3. И.М.Богданова, В.В.Малайцев,. Г.Т.Сухих, Е.Н.Клюшненкова. Новый подход к изучению продукции цитокинов в клинике. Тезисы II Всесоюз. симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", М.,1991, стр.35.

4. Е.Н.Клюшненкова, В.В.Малайцев. Получение интерлейкин-6-зависимой гибридомы. Бюл. эксп. биол. мед., 1992, 8, стр.179-181.

о. В.К.Оганезов, А.Е.Копылов, Л.В.Ковальчук, Р.Н.Стс'паненко. А.К.Голенков, И.Н.Назарова, Е.Н.Клюшненкова, Б.В.Пшктин. Продукция некоторых цитокинов при миеломной болезни. Иммунология, 1992, 5-й (в печати).

Подписано к печати IZl {2,У2г. Объем 1,5 п.л._Формат 60x84 1/16

ВНИРО. 107140, Москва, В.Краносельская, 17

Заказ 199 Тираж НО