Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Клиническое значение некоторых антигенов адгезии и активации при хроническом лимфоцитарном лейкозе

На правах рукописи 0034Э 1НЬЬ>

УДК: 616.155.32 - 006: 616 - 097

ОВЧИНИНА Наталья Геннадьевна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ АНТИГЕНОВ АДГЕЗИИ И АКТИВАЦИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЦИТАРНОМ ЛЕЙКОЗЕ

14.01.21 -гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

-4 ФЕБ'2010

Санкт - Петербург 2010

003491865

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего • профессионального образования «Ижевская государственная медицинская академия

Росздрава»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Никитин Евгений Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бубнова Людмила Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Пивник Александр Васильевич

Ведущая организация: Государственное учревдение «Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук»

диссертационного совета Д 208.074.01 при ФГУ «Российский НИИ Гематологии и Трансфузиологии» Федерального медико - биологического агентства (193024, г. Санкт - Петербург, ул. 2-ая Советская, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Российский НИИ Гематологии и Трансфузиологии» Федерального медико - биологического агентства

Защита состоится

на заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук

Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) - одно из распространенных опухолевых заболеваний кроветворной ткани, которое крайне неоднородно по клиническому течению, лабораторным особенностям и ответу на специфическое лечение (А.И. Воробьев и соавт., 2003; Е.Л. Никитин и соавт., 2003). Уровень заболеваемости XJIJI в Удмуртской Республике вырос с 1998 по 2008 годы. Кроме того, среднегодовой показатель заболеваемости ХЛЛ за 1989 - 1998 годы в Удмуртской Республике составляет 3,23±0,20 случаев среди мужчин и 2,21±0,31 случаев среди женщин на 100 ООО населения и является достоверно более высоким, чем по РФ в целом (1,50±0,10 и 0,80±0,03 случаев на 100 000 населения соответственно, р<0,05) (Е.Н. Никитин и соавт., 2009). Существующие нро1раммы химиотерапии хотя и позволяют получать длительные ремиссии, но не у всех групп пациентов, и имеют сопутствующий риск осложнений (М.А. Волкова, 2007). В связи с этим остается актуальным поиск факторов прогноза ХЛЛ. Прогнозирование течения ХЛЛ включает оценку длительности периода без лечения, решите вопроса о сроках назначения и варианте терапии, возможный ответ на нее и общую выживаемость. Гетерогенность клинического течения заболевания, а также ряда молекулярных и хромосомных изменений не исключает возможности на основе этих признаков выделять определенные варианты ХЛЛ, при которых обнаруживаются клинически значимые корреляции, хотя, по - видимому, трудно найти молекулярные признаки, которые обнаруживались бы во всех случаях, тем более, что каждый фактор характеризует определенную степень вероятности прогноза. Выявление характера связи факторов риска между собой принципиально важно для установления не только их взаимодополняемости, но и взаимозаменяемости при доступности их исследования в клинико - лабораторной практике. Кроме того, подавляющее большинство прогностических факторов при ХЛЛ могут изменяться в ходе опухолевой прогрессии (А.И. Свирновский, 2008). Генетические аномалии, имеющие прогностическое значение, реализуются в структурно — функциональных изменениях протеинов, входящих в состав рецепторного комплекса мембраны опухолевой клетки, регулируя таким образом его экспрессию и активность (Д.Д. Уотсон и соавт., 1994).

На последнем 8-ом международном рабочем совещании по CD - антигенам (8lh HLDA Workshop, Аделаида, Австралия, 2004) зарегистрировано свыше 400 антигенов, при этом число вновь открываемых антигенов, начиная с 1982 года, неуклонно растет. Предполагается, что общее количество мембранных молекул лейкоцитов может быть более 4 тысяч (II. Zola и соавт., 2005). Возможность идентификации большого числа антигенов,

экспрессируемых неопластическими клетками, позволит выделять новые варианты лейкозов и лимфом (L. Belov и соавт., 2006), а одновременное выявление широкого спектра прогностически значимых клеточных маркеров будет более достоверно характеризовать клинические свойства и поведение опухоли.

Иммунофенотип - это набор антигенов, экспрессируемый популяциями клеток данного индивида (H.H. Тупиции и соавт., 2001). В настоящее время существует несколько общепринятых методов установления иммунофенотипа опухолевой клетки при XJIJI: проточная цитофлюориметрия, иммуноцито-(гисто)-химическое исследование, иммунофлюоресцентное исследование, общей особенностью которых является определение ограниченного числа антигенов. Поэтому является весьма перспективным применение с целью диагностики ХЛЛ новых методов анализа, позволяющих расширить спектр одновременно исследуемых антигенов при сохранении доступности и простоты их применения в кпинико - лабораторной практике. К таким методам относится иммунофенотипирование клеток ХЛЛ с помощью иммунологических микроматриц (биочинов), которое позволяет определять от 32 до 147 маркеров (R.I. Christopherson и соавт., 2001; A.B. Шишкин, А.И. Воробьев и соавт., 2008). Однако к настоящему времени данный метод не был широко апробирован в диагностике ХЛЛ и с целью выяснения прогностического значения некоторых антигенов опухолевых лимфоцитов.

Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явились совершенствование иммунодиагностики и оценка эффективности лечения ХЛЛ с помощью иммунологических биочипов. Задачи исследования

1.Оценить эффективность применения иммунологических биочипов для лабораторной диагностики ХЛЛ.

2.Установить связь между числом опухолевых лимфоцитов, экспрессирующих ряд

изучаемых антигенов, и клинико - лабораторными особенностями ХЛЛ. 3.Оценить пролиферативный и адгезивный потенциалы лейкемических лимфоцитов при ХЛЛ.

4.0ценитъ прогноз заболевания на основании варианта иммунофенотипа лейкозных клеток при ХЛЛ.

5.Дать иммунологическую оценку эффективности традиционной химиотерапии ХЛЛ. Научная новизна исследования

Впервые установлена эффективность использования оригинальных иммунологических биочипов с целью диагностики ХЛЛ в репрезентативной выборочной совокупности

пациентов п оценки остаточной опухолевой массы в процессе химиотерапии; проведена комплексная оценка популяций опухолевых лимфоцитов при ХЛЛ, анализируемых по большому набору CD - антигенов, в зависимости от клинических проявлений болезни; предложены дополнительные маркеры оценки пролиферативного и адгезивного потенциалов лейкемических клеток при XJIJI; предложена качественная модель распределения иммунологических популяций лейкозных лимфоцитов в организме. Практическая ценность работы

Для практического здравоохранения предложен метод иммунодиагностики ХЛЛ с помощью иммунологических биочииов. Выделены клинически значимые антигены, которые могут рассматриваться как критерии прогноза течения ХЛЛ.

Доказана целесообразность использования иммунологических биочипов с целыо индивидуальной оценки течения ХЛЛ, а также для определения остаточной опухолевой массы в процессе химиотерапии заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Иммунологические биочипы могут быть использованы дня иммунодиагностики ХЛЛ.

2. Повышенное содержание лимфоцитов, позитивных но антигенам CD71, CD95, CD98, а также CD38, CD27, CD45RA, CD72, HLA - DR, свидетельствует о высоком пролиферативном потенциале опухолевых клеток ХЛЛ.

3. Антигены CD9, CDlla, CDllb, CD21, CD22, CD29, CD31, CD38, CD44 участвуют в распределении опухолевой массы при ХЛЛ.

4. Наиболее неблагоприятный вариант ХЛЛ характеризуется повышенным содержанием в периферической крови лимфоцитов, позитивных по антигенам CD38, CD71, CD95, CD98, CD9, а также CD45RA, CD72, CD27, HLA - DR, CD21, CD22, CD44.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты диссертационного исследования внедрены в практическую деятельность врачей гематологического отделения и клинической лаборатории ГУЗ « 1-ая Республиканская клиническая больница» МЗ УР, в работу автономной некоммерческой организации «Центр наношщустрии УР», учебно - экспериментальной лаборатории, центра трансфера технологий ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия Росздрава» и в учебный процесс кафедры факультетской терапии с курсами эндокринологии и гематологии ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия Росздрава». Апробация работы

Основные результаты исследования были доложены на научно - практической конференции врачей - гематологов (Ижевск, 2008), на научно - практической конференции

«Современные методы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Ижевск, 2008), на 12-ой Международной Путинской школе - конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2008), Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии» (Москва, 2008), на [I Российском форуме «Российким инновациям - российский капитал» (Саранск, 2009), на объединенном заседании кафедр факультетской терапии с курсами эндокринологии и гематологии, пропедевтики внутренних болезней с курсом сестринского дела, внутренних болезней с курсами лучевых методов диагностики, лечения и ВПТ, на проблемной комиссии по внутренним болезням с вопросами нефрологии, эндокринологии, гематологии и курортологии с физиотерапией ГОУ ВПО «Ижевская государствештя медицинская академия» (Ижевск, 2009).

Личный вклад автора в выполнение научной работы

Автором лично проведено клиническое обследование и наблюдение пациентов с XJIJI в условиях стационара и поликлиники. Выполнена подготовка образцов крови и самостоятельно проведено иммунофенотипирование клеток пациентов с помощью иммунологических биочипов. Автором работы осуществлена оценка результатов исследования, анализ и статистическая обработка данных 75 пациентов, страдающих XJIJI. Автор принимала участие в разработке иммунологических биочипов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 2 работы в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией (ВАК), и 1 патент на полезную модель (пат. № 87165).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 158 страницах машинописи, содержит 28 таблиц и 19 рисунков. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики обследовашшх пациентов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, 2 клинических примеров, заключения (резюме с обсуждением полученных результатов), выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, представленного 158 источниками, из них 65 отечественными, и 93 зарубежными.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика обследованных больных

В исследование включено 75 пациентов с ХЛЛ. Все пациенты наблюдались в гематологическом отделении и кабинетах поликлиники ГУЗ «1-ая Республиканская клиническая больница» МЗ УР. Диагноз ХЛЛ был установлен в соответствии с

общепринятыми критериями, а именно: абсолютный лимфоцитоз периферической крови составлял более 5x10%, лимфоцитоз в костном мозге - более 30% ядросодержаицих клеток, большинство клеток (более 90%) относились к малым лимфоцитам, устанавливался типичный иммунофенотип опухолевых лимфоцитов (CD19+, CD5+, CD23+, CD10-).

Возраст обследованных пациентов колебался в пределах 44 - 86 (в среднем - 67,3±1,2) лет. Среди пациентов было 36 мужчин и 39 женщин. Средний возраст мужчин составил 66,3±1,7 лет и достоверно не отличался от возраста женщин (68,2±1,7, р>0,10).

У 52 из 75 (69,3%) пациентов был проведен ретроспективный анализ течения XJ1JT, у 23 из 75 (30,7%) больных - проспективный (наблюдение до 2 лет). Согласно задачам исследования все пациенты были разделены на группы в соответствии с клииическими стадиями болезни (J.L. Binet, 1981). К первой группе отнесены 32 пациента (42,7%), которые имели стадию Л, вторую группу составили 30 больных в стадии В (40,0%), третья группа включала 13 пациентов со стадией С (17,3%). В процессе исследования учитывалась клиническая форма болезни (Л. 11. Воробьев, 2007). Доброкачественная форма ХЛЛ, зарегистрирована у 21 пациентов. ХЛЛ у 30 человек характеризовался прогрессирующим течением. У 4 пациентов наблюдалась опухолевая форма ХЛЛ; у других 4 пациентов -селезеночная форма. Абдоминальная и костномозговая формы среди включенных в исследование пациентов не установлены. Первую аналитическую группу составили пациенты с доброкачественной формой болезш!, во вторую группу вошли пациенты с прогрессирующей, опухолевой и селезеночной формами ХЛЛ. У 43 пациентов, которые в течение некоторого времени не получали специфического лечения, было оценено время удвоешм абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови (ВУЛ) по общепринятой методике (Montserrat Е., 1986). В соответствии с полученными данными была выделена группа пациентов, у которых ВУЛ не превышало 12 месяцев (16 пациентов) и группа больных, у которых ВУЛ было более 12 месяцев (27 пациентов).

Для оценки распределения опухолевых лимфоцитов между кровью и костным мозгом, мы рассчитали отношение абсолютного лимфоцитоза периферической крови (клеток х109/л) к количеству лимфоцитов по дшшым миелограммы (%). Введенный нами коэффициент распределения опухолевой массы варьировал в пределах 0,05 - 1,77 (0,55±0,07, п = 34). В зависимости от значения коэффициента по отношению к его среднему значению, все пациенты были разделены на две группы (А.К. Голенков и соавт., 2005): с лейкемическим (0,85±0,08, п = 16, интервал: 0,57 - 1,77) или костномозговым (0,28±0,03, п = 18, интервал: 0,05 — 0,52) вариантами распределения опухолевой массы при ХЛЛ.

Кроме того, было произведено разделение пациентов на группы в зависимости от вовлечения в патологический процесс селезенки (п=37), периферических лимфатических узлов (п=51) и печени (п=17). У пациентов, не получавших химиотерапии (п=41), были оценены размеры лимфатических узлов (как произведение минимального и максимального диаметров) (п=18) и площадь увеличенной селезенки (п=15). Пациенты, которые имели лимфаденопатию, разделены на две группы: с поражением (п=16) и без поражения (п=30) внутренних лимфатических узлов.

Иммуиофенотип лейкозных клеток определен у двух групп пациентов. В одну группу вошли больные, иммунофенотипирование которым проведено до начала специфического лечения (п=41), в другую группу - больные, у которых иммуиофенотип лимфоцитов периферической крови определен в процессе лечения хлорамбуцилом или СОР - терапии (п=34). Описанные группы больных не отличались по полу и возрасту. Результаты химиотерапии оценивались по общепринятым критериям ответа на лечение XJIJI (B.D. Cheson, 1996). Полная клинико - гематологическая ремиссия ХЛЛ в нашем исследовании не установлена ни у одного больного. Частичная клинико - гематологическая ремиссия зарегистрирована у 7 пациентов (20,6%). Прогрессия ХЛЛ на фоне химиотерапии отмечена у 14 больных (41,2%). Стабилизация ХЛЛ установлена у 13 пациентов (38,2%).

В ходе выполнения научной работы получено письменное информированное согласие пациентов, участвовавших в исследовании. Работа одобрена этическим комитетом ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия Росздрава».

Методы обследования и лечения

Наряду с общепринятым клиническим обследованием всем больным проводилось изучение параметров периферической крови, мочи, основных биохимических показателей (билирубин, АЛТ, ACT, ЛДГ, общий белок, протеинограмма, креатинин и др.). Для уточнения диагноза и распространенности опухолевого процесса были выполнены инструментальные методы обследования (рентгенограмма грудной клетки, КГ органов грудной и брюшной полостей, УЗИ органов брюшной полости и забрюшинного пространства, периферических лимфатических узлов), а также специальные методы исследования. Миелограмма выполнена у 34 (45,3%) пациентов. У 5 (6,7%) пациентов проведено гистологическое исследование трепанобиоптатов и биоптатов лимфатического узла с йммуногистохимическим анализом, а также цитологическое исследование мазков -отпечатков.

У 22 (29,3%) пациентов выполнено исследование экспрессии антигенов лейкозными клетками с помощью проточной цитофлюориметрии (проточный цитофлюориметр -

FACSCcanto II, Beacton Deakcinson, США), при этом анализировалось 9-20 антигенов клеток у каждого пациента.

Специфическое лечение ХЛЛ среди включенных в исследование пациентов (п=34) состояло в назначении первично - сдерживающей терапии хлорамбуцилом в дозе б - 10 мг 1 - 2 раза в неделю, а также в применении курсов СОР: циклофосфан 400 мг/м2 внутривенно ежедневно с 1 - ого но 5 - ый день, винкристин 2 мг внутривенно в 1 - ый день, преднизолон 40 мг/м2 внутрь с 1 - ого по 5 - ый день; повторные курсы с интервалом 14 - 20 дней. Монотерания хлорамбуцилом проводилась у 20 пациентов (58,8%), только СОР - терапию получали 3 пациента (8,8%), лечение хлорамбуцилом и курсами СОР на протяжении всего периода болезни осуществлено у 11 больных (32,4%). Средняя продолжительность лечения хлорамбуцилом составила 40,9±5,6 (4 - 157) месяцев, среднее количество курсов СОР -терапии соответствовало 4,1±1,4 (1 - 21).

У всех больных проводилось исследование поверхностных антигенов: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CDI0, CDIla, CDIlb, CD16, CDI9, CD20, CD2I, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM с помощью оригинальных иммунологических биочипов, разработашшх u.c., к.м.ц. Шишкиным A.B. в лаборатории физической биохимии системы крови (заведующий -д.б.и., профессор Ф.И. Атауллахаиов) ГУ «Гематологический научный центр РАМИ» (г. Москва) (научные руководители темы: д.б.н., профессор Ф.И. Атауллахаиов и академик РАН и РАМИ А.И. Воробьев). Биочипы были изготовлены и применены в соответствии с разработанной методикой.

Получение клеточной суспензии

Лимфоцитарная фракция была выделена из 10 мл каждого образца стабилизированной гепарином периферической крови пациентов, разведенной (1:1) 0,9% раствором NaCI, путем центрифугирования в градиенте плотности раствора Ficoll paque и урографина (плотность -1077 г/л). Полученные клетки трижды отмывались в физиологическом растворе хлорида натрия (0,9%), а зачем ресуспензировались в растворе, содержащем 0,1% сухого молока, 10% гретой человеческой сыворотки и 1,5 мМ раствора ЭДТА в PBS.

Количество клеток в суспензии определялось в камере Горяева или с помощью автоматического гематологического анализатора «Sysmex» (Япония).

Проведение анализа

Биочипы закреплялись на дне контейнера, затем проводилась их трехкратная отмывка 0,05% раствором детергента Tween-20. С целью блокирования участков неспецифического связывания клеток поверхность биочипа в контейнере заполнялась 1% раствором

обезжиренного сухого молока в фосфатном буфере (PBS). В таком виде биочип инкубировался в течение 1 часа при комнатной температуре и слабом перемешивании на шейкере. Затем вновь следовала его трехкратная отмывка 0,05% раствором детергента Tween-20 и ополаскивание фосфатным буфером для удаления следов детергента. В контейнер вносилась клеточная суспензия (1 - 2 мл с концентрацией 5 - 6 х К/1 клеток/мл), инкубация которой осуществлялась без перемешивания в течение 40 - 60 мин. После завершения инкубации контейнер, в котором находился биочип, заполнялся промывочным раствором (фосфатным буфером или 0,9% физиологическим раствором хлорида натрия), который заменялся после каждой отмывки. Отмывка биочипа происходила до тех пор, пока на его поверхности не оставалось клеток вне области пятен с антителами, что подтверждалось световой микроскопией. После завершения отмывки биочип высушивался на воздухе, затем проводилась фиксация метанолом связавшихся с антителами клеток в течение 15 минут и последующая их окраска по Романовскому — Гимзе. Из биочипа готовили долговременный препарат путем его заливки в канадский бальзам, либо его заменитель - жидкость «Shandon-Mount». Каждое пятно препарата биочипа оценивалось при малом и большом увеличениях микроскопа (Leyco DM — 2005) и фотографировалось с помощью смонтированного на микроскопе цифрового фотоаппарата (DFC - 420). Для определения плотности связывания клеток в пятнах препарата биочипа на микрофотографии каждого пятна было выбрано не менее трех участков, соответствующих области размером 100x100 мкм, в которых производился подсчет клеток, имеющих морфологические признаки малого лимфоцита (клетки других типов не учитывались). Полученные значения усредняли. Плотность связывания клеток в каждом пятне препарата биочипа могла быть выражена в процентах относительно максимально возможной (за 100% принималась плотность связывания лимфоидных клеток в области пятна с антителами, специфичными к антигену CD45 и CD44).

Перед изготовлением биочипов учитывалось сохранение активности антител путем титрования раствора с исходным разведением 1:20 до предельного разведения 1:10240, при котором плотность связывания клеток в пятнах биочипа еще не зависела от разведения. В качестве положительного контроля на антитела многократно были использованы лимфоциты одного и того же здорового донора. Для изготовления биочипов заведомо брали более высокий титр (1:40) для исключения ошибок.

Статистическая обработка материала

Статистический анализ проведен с использованием программы статистической обработки данных BioStat 2008 Professional Сборка 5.2.5.0. на персональном компьютере.

Количественные данные представлены в виде средней арифметической и ее ошибки (М±т). Для изучения достоверности различий количественных признаков 2 групп сравнения использовались как параметрические (критерий Стьюдента, (), так и непараметрические (критерий Колмогорова-Смирнова, X2, и критерий Манна - Уитни) методы статистического анализа; при сравнении более 2 групп применены дисперсионный анализ и его непараметричсский аналог - критерий Краскела - Уоллиса. Для установления различий качествеш1ых признаков рассчитан критерий х2 (хи - квадрат). Для анализа взаимосвязи признаков были рассчитаны коэффициенты линейной корреляции Пирсона и ранговой корреляции Спирмена (R). Результаты считались достоверными при р<0,05. Тенденцию к изменению показателей определяли при р<0,10.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В табл. 1 представлены средние значения численности клеток, экспрессирующих основные дифференциально - диагностические маркеры, позволяющие выделить ХЛЛ среди других лимфопролиферативпых заболеваний, а также широкий спектр других антигенов клеток, определенных с помощью иммунологических биочипов. Содержание лимфоцитов, несущих на мембране разные активационно - адгезивные молекулы, варьировало в широких пределах, за исключением антигена CD41, который в основном представлен на тромбоцитарном ростке кроветворения и, вероятнее всего, не экспрессируется лимфоцитами при ХЛЛ. Мембранный IgM и антиген CD 10 также были экспрессированы лимфоцитами на очень низком уровне, что является характерной чертой лейкемических клеток при ХЛЛ.

Таблица 1

Содержание иммунологических популяций лимфоцитов периферической крови

при ХЛЛ

Маркеры Количество клеток, %

М±ш Интервал

CD9 46,7±4,0 0 - 98,8

CDlla 41,3±3,7 0-96,7

CDllb 23,9±2,5 0 - 73,2

CD21 65,7±2,9 0-100

CD22 53,2±3,4 0-100

CD27 60,2±3,9 0-100

CD29 83,3±2,2 5,1-100

CD31 77,6±2,5 1,5-100

CD36 16,2±2,6 0-89,1

CD38 35,1±3,6 0-100

CD41 0,5±0,1 0-3,1

CD44 98,6±0,3 87,2-100

CD45 95,7±0,6 83,2-100

СВ4511А 84,4±1,5 52,8-100

С071 12,2±2,9 0 - 99,8

СП72 50,3±4,0 0 - 95,0

СГ)95 28,3±3,5 0-91,5

СИ98 67,7±3,8 0-100

1ёМ 1,3±0,4 0-14,2

С019 80,6±1,3 65,0-98,8

С020 76,5±1,9 46,5 - 98,8

СЭ5 85,6±1,7 48,0-100,0

С1)23 68,7±2,2 33,8 - 98,8

СОЮ 1,0±0,2 0-7,3

СЭ2 14,4±1,3 0-28,5

СОЗ 15,5±1,4 0-28,4

СЭ4 8,4±0,8 0 - 26,0

СИ7 10,5±1,1 0 - 22,9

С08 7,6±0,8 0 - 29,3

СБ16 4,8±0,4 0-24,0

С056 2.3±0,5 0-20,5

НЬА - 01* 78,0±2,1 8,9-100

При исследовании клеток с помощью иммунологических биочипов может быть проведена морфологическая оценка изучаемых клеток в пятнах с различными антителами. В ходе микроскопии пятен биочипа подавляющее большинство клеток, связанных с антителами используемой панели, было представлено преимущественно морфологически зрелыми лимфоцитами, которые являются основным субстратом ХЛЛ, и небольшим количеством пролимфоцитов и единичных плазмоцитов (рис. 2, 3).

Рис. 2. Микрофотография фрагмента пятна препарата биочипа с анти - СБ 19 больной II! (а) и мазка периферической крови той же больной (б). Ув. 10x100.

б)

Рис. 3. Фрагмент пятна препарата биочипа с антителами анти - С038 больной Б Единичные

плазматические клетки указаны стрелками. Ув. 10x100.

У части пациентов исследование иммунофенотипа было выполнено параллельно с помощью иммунологического биочипа и проточной цитофлюориметрии. Различия в результатах, полученных разными методами по каждому дифференциально-

диагностическому антигену у описываемых больных были недостоверны (р>0,05) (рис. 4).

~ 12-

-ч«

а)

/ 1

Рис. 4. Сравнительная оценка результатов иммунофенотипирования с помощью иммунологического биочипа и проточной цитофлюориметрии

При исследовании корреляционной зависимости результатов экспрессии дифференциально-диагностических антигенов, полученных с помощью биочипа и проточной | цитофшоориме фии, у каждого пациента установлена достоверная прямая сильная взаимосвязь (R = 0,935 - 0,997, р<0,01).Средние арифметические разности значений экспрессии по каждому дифференциально - диагностическому антигену, полученных сравниваемыми методами, представлены ниже: CD3 - 6,9±1,1, CD4 - 4,5±0,9, CD8 - 2,6±0,9, | CD16 - 2,2±0,5, CD56 - 1,6±0,4, CD19 - 7,2±0,9, CD20 - 10,3±1,3, CD22 - 12,3±1,4, CD5 -15,2±3,2, CD23 - 13,3±3,6, CD10-4,1±2,8, CD38 -6,9±),3, HLA -DR- 10,7±2,1.

В ходе работы выполнен анализ взаимосвязи содержания различных иммунологических популяций опухолевых лимфоцитов, результаты которого схематично I

изображены на рис, 5.

Выраженные достоверные связи между антигенами, которые могут быть экспрессированы на большинстве опухолевых В-клеток, можно расценивать как свидетельство коэкспрессии этих маркеров на мембране лимфоцитов (например, CD9 и CD21; CD9 и CD38; CD21 и CD27; CD21 и CD31; HLA - DR и CD45RA, CD72, CD98; CD98 и CD72, CD45RA и др.). Достоверные корреляции могут также свидетельствовать о кооперации рецепторов лейкозных ¡слеток и существовании функционально взаимосвязанных популяций опухолевых лимфоцитов в периферической крови больных.

По нашим результатам содержание CD38 - положительных клеток в стадии А достоверно ниже (р=0,03), чем в стадиях В и С, что характеризует более благоприятный прогноз у пациентов в начальной стадии болезни (табл. 2).

В соответствии с полученными данными содержание в периферической крови лимфоцитов, ,

экспрессирующих антиген CD9, нарастает по мере увеличения стадии, и количество CD9 — позитивных В-клеток достоверно выше в стадии С, чем в стадиях А (р=0,0008) и В (р=0,03) (табл. 2).

4---------------------> а»ОД I - 0,23,р»0.05-о, 1 о

*----Я =» 0,24 - 0,29. р «г 0,01 - 0,05

*-* К = 0,30 0,37, р * 0,001 -0.01

<...........................^ к > 0,38, р < 0.00!

Рис. 5, Схема положительных корреляций содержания иммунологических популяций клеток при ХЛЛ. Различными типами стрелок отмечена разная сила связи.

Также обнаружено достоверно (р=0,01) более высокое количество лимфоцитов в периферической крови, несущих на своей поверхности антиген СО 11Ы18 ([Ь - интегрил) на , начальной стадии заболевания в отличие от стадии В, хотя в отношения стадии С такое

различие не является достоверным (табл. 2). Учитывая, что рецепторы семейства интегринов играют роль в адгезии и миграции клеток, вероятно, по мере прогрессии ХЛЛ происходит такое распределение опухолевых лимфоцитов, при котором в периферической крови содержится меньше С011Ь - позитивных В - клеток.

Таблица 2

Содержание опухолевых лимфоцитов, экспрессирующих антигены адгезии и

активации, в разных клинических стадиях XJIJI

CD Стадии

А В С

п=32 п=30 п=13

Число клеток, % Число клеток, % Число клеток, %

М±т Интервал М±т Интервал М±ш Интервал

CD38* 21,6±3,5 0-74,1 44,1±7,0 1,8-94,7 41,2±9,5 0,9-100

CD9" 37,2±5,8 0-87,5 49,3±6,2 0-98,8 75,5±5,5 34,5-96,3

CDllb*** 29,6±3,8 0,9 - 73,2 17,1±3,4 0-71,2 20,7±5,7 1,8-56,1

CD95**** 32,3±5,4 0-91,5 14,9±3,9 0-60,8 37,4±9,7 0 - 82,8

CD98** 81,3±2,8 40,6-100 61,2±6,8 0-99,6 79,2±4,8 33,0-100

Примечание: различия достоверны, р<0,05: * - А от В и С, ** - С от А и В, *** - Л от В, **** -ВотАиС

Большое количество CD71\ CD95+, CD98* - клеток в стадии Л, а также в стадам С, вероятно, свидетельствует о более высоком пролиферативном и ашптотическом статусе лейкемических клеток при ХЛЛ. В стадии В, но - видимому, наблюдается плато этих процессов (табл. 2).

Количество циркулирующих CD38 -, CD9 CD31 -, CD21 -, CD22 - позитивных лимфоцитов существенно (р=0,04, 0,01, 0,04, 0,003 и 0,03 соответственно) выше у пациентов в прогрессирующей форме ХЛЛ, чем в доброкачественной (табл.3).

Таблица 3

Содержание опухолевых лимфоцитов, экспрессирующих антигены адгезии и

активации, в разных клинических формах ХЛЛ

Антигены Клинические формы ХЛЛ

Доброкачественная Прогрессирующая (в т.ч. опухолевая и селезеночная)

п=21 п=38

Число клеток, % Число клеток, %

М±ш, % Интервал М±ш, % Интервал

CD21** 50,6±6,4 0-89,5 70,6±3,6 6,9-100

CD22* 41,7±6,6 0-80,7 58,3±4,8 0-100

CD38* 18,4±3,6 0,9-51,1 38,6±5,3 0-100

CD9* 31,9±6,8 0-87,5 57,2±5,5 0-98,8

CD31* 77,8±3,2 35,2 - 95,0 83,9±2,4 39,3-100

*- различия достоверны, р<0,05 **- различия достоверны, р<0,01

В исследованной группе пациентов ВУЛ значительно колебалось в интервале 2,7 -2378,0 месяцев (170,2±76,7). Большее количество лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD22, CD38, CD9, CD45RA, CD72, CD95 и HLA - DR, циркулирует в периферической крови пациентов, у которых ВУЛ менее 12 месяцев, что достоверно (р=0,0001, 0,03, 0,008, 0,03, 0,002, 0,02 и 0,02 соответственно) отличается от более низкого содержания позитивных по перечисленным антигенам В-клсток среди пациентов, лимфоциты которых удваиваются в

- 15-

течеиие времени, превышающего 12 месяцев (табл. 4). Обнаружены достоверные реципрокные корреляции значений ВУЛ и содержания в периферической крови клеток, несущих на мембране антигены С038, С1)22, С045КД, ИГ.Д-1Ж (Я= - 0,31, - 0,52, - 0,40, -0,36 соответственно, р<0,05). Существенной оказалась отрицательная взаимосвязь значений ВУЛ и числом С072 - и С098 - положительных клеток, что свидетельствует в пользу роли этих рецепторов в пролиферации В-лимфоцитов (К- - 0,45, - 0,33 соответственно, р<0,05). Менее достоверной является связь между содержанием клеток, экспрессирующих СГ)71 (К= - 0,27, р=0,09) и СП95 (11= - 0,25, р=0,10). Интересно, что обнаружена достоверная отрицательная взаимосвязь между численностью циркулирующих С 1)27 - позитивных лимфоцитов-и ВУЛ (К- - 0,32, р=0,04). Следовательно, чем выше накопление лейкозных лимфоцитов в периферической крови, тем выше среди них содержание €027'- клеток. Можно предположить, что активно размножающиеся В-клетки экспрессируют антиген С027. Существует достоверная отрицательная корреляция между менее продолжительным временем удвоения лимфоцитов периферической крови и содержанием в ней В-клеток, экспрессирующих рецептор адгезии СБЗ1 (Г{- - 0,47, р=0,00), Вероятно, этот рецептор прямо или косвенно задействован в процессе деления опухолевых клеток при ХЛЛ.

Таблица 4

Время удвоении абсолютного количества лимфоцитов периферической крови н

содержание их популяций при ХЛЛ

Антигены ВУЛ

Более 12 месяцев Менее 12 месяцев

п=27 п=16

Число клеток, % Число клеток, %

М±ш Интервал М±ш Интервал

С022** 47,5±5,3 0-92,2 71,0±3,5 31,1-86,5

СЭ38* 20,9±4,2 0,9 - 70,5 39,0±7,7 6,1-93,2

СБ9** 38,5±6,5 0-96,3 70,9±4,2 31,0-92,2

С045ЯА* 83,3±2,5 61,8-100 92,3±1,6 81,6-100

С072** 43,6±6,5 0-94,9 78,0±3,1 48,9-95,0

С095* 21,6±5,0 0-72,9 44,0±9,0 0-91,5

НЬА-Ра* 77,3±3,1 43,3-100 88,2±2,0 71,8-98,2

*- различия достоверны, р<0,05 **- различия достоверны, р<0,01

В группе больных, не получавших химиотерапевтического лечения, ВУЛ составило 3,0 - 2376,0 месяцев (154,5±98,7), а лимфоцитоз на момент исследования соответствовал 5,0 -42,6 хЮ9/л (18,4±2,4). Необходимо подчеркнуть, что нарастание опухолевого лимфоцитоза в крови обусловлено не только соотношением интенсивности процессов пролиферации и апоптоза опухолевых лимфоцитов, но и их распределением между кровью и другими тканями. Это предположение подтверждается отсутствием явной достоверной корреляции

(Я= - 0,26, р=0,24) между уровнем абсолютного лимфоцитоза и ВУЛ в периферической крови исследуемых пациентов.

Абсолютное количество лимфоцитов в периферической крови пациентов, страдающих ХЛЛ, сущсствешю различалось (25,8±3,6 х I О'/л, интервал: 5,0 - 128,2 х Ю'/л). Мы провели корреляционный анализ содержания популяций лимфоцитов, экспрсссирующих некоторые адгезивные молекулы и рецепторы активации, в зависимости от уровня абсолютного лимфоцитоза в периферической крови пациентов с ХЛЛ, иммунофенотипирование которым было проведено до начала химиотерапии. Оказалось, что достоверная связь разной направленности была обнаружена в отношении следующих антигенов адгезии: СГ)9 (Я = 0,55, р=0,0002), СОПа (Я = - 0,33, р=0,042), СЭПЬ (Я = - 0,39, р=0,01), С029 (Я = - 0,58, р=0,0001), СЭЗ1 (Я = - 0,46, р=0,003).

Мы оценили взаимосвязь содержашм популяций опухолевых лимфоцитов в периферической крови с уровнем лимфоцитоза в миелограмме, полученным по результатам пункции костного мозга, который в обследованной группе пациентов составил 51,0±3,2 (30,0 - 83,0). Получена достоверная связь только в отношении антигена С 1)71 (К- - 0,36, р=0,04) и тенденция к достоверной связи в отношении антигена С 1)36 (Я= - 0,30, р=0,08).

Представляло интерес изучение содержания популяций опухолевых лимфоцитов в группах с разным вариантом распределения опухолевой массы. Достоверно более высокое содержание опухолевых С 1)21 '-лимфоцитов обнаружено при лейкемическом варианте (80,3±3,7 против 57,2±6,4, р=0,001), а СП22 - лимфоцитов при костномозговом варианте (56,6±6,0 против 34,0±8,1, р=0,02). Су1цественные связи между коэффициентом распределения опухолевой массы и содержанием иммунологических популяций лимфоцитов также обнаружены только в отношении клеток, экспрессирующих антигены СП21 (Я=0,44, р=0,01) и С022 (Я= - 0,36, р=0,04). По - видимому, лимфоциты, положительные по антигену €021, достаточно легко проникают в систему циркуляции крови, что соответствует более высокому значению коэффицие/гга распределения лейкемических лимфоцитов. Возможно, это связано с адгезивными свойствами непосредственного самого рецептора С02\. Напротив, С1)22 - положительные В-лимфоциты аккумулируются преимущественно в костном мозге.

Поражение селезенки сопровождалось достоверно более высоким содержанием в периферической крови лимфоцитов, положительных по антигену С1)9 (64,3±7,3 против 41,5±6,8, р=0,03) и одновременно более низким количеством циркулирующих СШ1Ь -позитивных клеток (16,6±3,9 против 34,0±5,4, р=0,03). Существенной положительной связью с размерами селезенки отличалось число циркулирующих лимфоцитов, положительных

только по антигенам С071 (Я= 0,55, р=0,02) и СР95 (Я= 0,46, р=0,04). Вероятно, что адгезив!ше молекулы на опухолевых лимфоцитах такие, как СОНЬ и СВ9, влияют на возможность проникновения лейкозных клеток в ткани селезенки, а экспрессия антигенов СП71 и СГ)95 свидетельствует о более активной пролиферации и повышенной готовности к ацоптозу проникших лимфоцитов.

В группе пациентов, у которых не обнаружено увеличение лимфатических узлов, в периферической крови содержалось существенно меньшее количество С139 - позитивных лимфоцитов (Зб,4±8,1 против 65,9±5,5, р=0,007), а также более высокое число клеток, экспрессирующих С011Ь (36,8±5,6 против 13,5±2,6, р=0,001). Можно предполагать вовлечение этих рецепторов адгезии в процессы инвазии лейкозных лимфоцитов в лимфатические узлы.

Оказалось, что поражение печени сопровождается существенно более высоким количеством СГ)9 - и С038 - позитивных клеток в периферической крови (77,0±4,2 против 41,1±4,4, р=0,0009 и 49,2±8,9 против 30,2±3,6, р=0,01 соответственно), что отражает агрессивность этой популяции лейкемических лимфоцитов по отношению к нелимфоидному органу. Интересно, что имеется достоверное преобладание количества С044 - позитивных лимфоцитов в крови при поражении печени (98,9±0,5 против 98,6±0,4, р=0,01), характерном для более продвинутых стадий ХЛЛ, хотя этот антиген экспрессирован на подавляющем большинстве лимфоцитов.

кос

Г

21* 21*

9+ ' 1 1Ь* ^ : . т'^р^пг-ггю'й ужп »V.. 71* ^

38*

I

44+

печень

(<§)- ИЬ-

* ЭИДОТЕЛЯЙ

Рис. б. Схема распределения иммунологических популяций лейкемических лимфоцитов при ХЛЛ (пунктирными стрелками указано предполагаемое распределение лимфоцитов).

В соответствии с приведенными выше данными можно предложить следующую схему распределения иммунологических популяций лейкемических клеток в организме при ХЛЛ (рис. 6).

В пашем исследовании полная клшшко - гематологическая ремиссия среди пациентов, которым проведена терапия хлорамбуцилом или СОР - терапия, не встречалась ни у одного больного. Этому также противоречили результаты иммунологического анализа, характеризующего сохранение популяции CD5 -, CD23 -, CD 19 - положительных лейкемических клеток. При сравнительном анализе иммунологических популяций лимфоцитов в группах пациентов с разными результатами химиотерапии было выявлено достоверно (р<0,05) более высокое количество Т - клеток, экспрессирующих CD2, CD3, CD4, CD7, и тенденция к снижению В - клеток, экспрессирующих В - клеточный рецептор (CD 19) в группе больных, у которых достигнута частичная ремиссия на фоне лечения хлорамбуцилом или СОР - терапией (р<0,10).

ВЫВОДЫ

1. Анализ лейкемических лимфоцитов с помощью иммунологических биочипов позволяет проводить их иммунофенотшшрованис по большому спектру поверхностных антигенов и морфологическую идентификацию изучаемых клеток при ХЛЛ.

2. Пролиферативный потенциал опухолевых лимфоцитов при ХЛЛ может быть охарактеризован содержанием в периферической крови опухолевых клеток, экспрессирующих антигены CD71, CD95, CD98, а также CD38, CD27, CD45RA, CD72, IILA - DR, CD21, CD22.

3. Адгезивные свойства опухолевых лимфоцитов при ХЛЛ, определяющие их распределение в организме, связаны с экспрессией антигенов CD9, CD 11 a, CD 11b, CD21, CD22, CD29, CD31, CD38, CD44.

4. Неблагоприятное течение ХЛЛ характеризуется значительным содержанием в периферической крови лимфоцитов, позитивных по антигенам CD38, CD71, CD95, CD98, CD9, а также CD45RA, CD72, CD27, HLA - DR, CD21, CD22, CD44, что отличает его от благоприятного варианта ХЛЛ.

5. Первично - сдерживающее лечение хлорамбуцилом и полихимиотерапия (СОР: циклофосфан, винкристин, преднизолон) не сопровождаются достижением как иммунологической, так и полной клинико - гематологической ремиссии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В связи с информативностью и доступностью анализа с помощью иммунологических биочипов целесообразно применение этого метода для иммунодиагностики ХЛЛ в лечебно - профилактических учреждениях, где отсутствуют другие методы иммунофенотипирования, а также в качестве параллельного метода для подтверждения иммунологического диагноза и применения расширенной панели антител к антигенам опухолевых лимфоцитов.

2. В случае высокого пролиферативного потенциала лейкемических лимфоцитов при ХЛЛ, оцененного по совокупности таких антигенов, как CD38, CD7I, CD95, CD98, CD45RA, CD72, CD27, IILA - DR, CD21, CD22, а также учитывая паллиативность лечения хлорамбуцилом и СОР - терапии, рекомендуется назначать более агрессивные курсы химиотерапии.

3. Учитывая, что CD9 - позитивные лейкозные лимфоциты периферической крови обладают преимуществом в заселении лимфатических узлов, и CD9 CD38 CD44 -положительные опухолевые В - клетки легко мигрируют из кровотока в печень, можно использовать определение численности данных популяций опухолевых лимфоцитов в качестве дополнительных критериев в дифференциальной диагностике специфического опухолевого поражения этих органов при ХЛЛ от реактивного лимфаденита и поражения печени другой этиологии при прочих равных условиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шишкин, A.B. Разработка имму?юлогических биочипов для исследования нормальных и опухолевых клеток крови / A.B. Шишкин, Н.Г. Овчннина // Материалы школы - конференции молодых ученых, аспирантов, студентов «Биомедицинская инженерия - 2007». - Пущино, 2007. - С. 8 - 13.

2. Шишкин, A.B. Способ повышения чувствительности анализа, проводимого с помощью иммунологических биочипов, предназначенных для определения поверхностных антигенов клеток / A.B. Шишкин, Н.Г. Овчипина // Материалы V Межрегиональной Межвузовской научно - практической конференции молодых

ученых и студентов «Современные аспекты медицины и биологии». - Ижевск, 2008. -Часть I,-С. 77-79.

3. Ovcliinina, ¡V.G. Methods for increasing the biochip immunological sensitivity / IV.G. Ovcliinina, A.V. Shishkin, Y.A. Lednev // 22nd European Immunogenetics mid Histocompatibility Conference «New horizons in Immunogenetics and Histocompatibility». - Toulouse, France, 2008. - P. 93.

4. Ovchinina, N.G. Methods for increasing the biochip immunological sensitivity / IN'.G. Ovcliinina, A.V. Shishkin, Y.A. Lednev // Tissue antigens. -2008. - Vol. 71. - No. 4. - P. 395.

5. Шишкин, A.B. Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток / А.В. Шишкин, И.И. Шмырсв, С.А. Кузнецова, Н.Г. Овчинина [и др.] // Биологические мембраны. -2008. - Т. 25. - № 4. - С. 277 - 284.

6. Shishkin, A.V. Immunological biochips for parallel detection of surface antigens and morphological analysis of cells / A.V. Shishkin, I.I. Shmyrev, S.A. Kuznetsova, N.G. Ovchinina [et al.J // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. - 2008. - Vol. 2. - No. 3. - P. 225 - 230.

7. Овчинина, 11.Г. Иммунологические биочины в диагностике хронического лимфоцитарного лейкоза / Н.Г. Овчинина, E.II. Никитин, А.В. Шишкин // Современные методы диагностики и лечения злокачественных опухолей: сборник статей. - Ижевск, 2008. - С. 69 - 72.

8. Кирьянов, Н.А. Разработка экспериментальных тест-систем для исследования поверхностных антигенов клеток на основе иммунологических биочипов / Н.А. Кирьянов, А.В. Шишкин, Н.Г. Овчиннна, Е.А. Ложкин, С.А. Суханов // Современные методы диагностики и лечения злокачественных опухолей: сборник статей. - Ижевск, 2008. - С. 106- 108.

9. Шишкин, А.В. Исследование с помощью иммунологических биочипов клеток хронического В - лимфолейкоза / А.В. Шишкин, Н.Г. Овчиннна, Е.Н. Никитин // 12-ая Пущинская международная школа - конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века»: сб. тезисов. - Пущино, 2008. - С. 246.

10. Шишкин, А.В. Разработка иммунологических биочинов для определения поверхностных антигенов нормальных и опухолевых клеток крови / А.В. Шишкин, И.И. Шмырев, Н.Г. Овчинина [и др.] // Всероссийская научная конференция с

международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008»: сб. тезисов. -Москва, 2008. - С. 112-113.

11. Овчишша, Н.Г. Иммунодиагностика хронического лимфоцитарного лейкоза с помощью иммунологических биочипов / Н.Г. Овчишша, E.Ii. Никитин, A.B. Шишкин // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10. -№ 2. - С. 255.

12. Овчишша, Н.Г. Клиническое значение антигена CD9 при хроническом лимфоцитарном лейкозе / 11.Г. Овчшшна [и др.] // Материалы межрегиональной научно - практической конференции, поев. 80 - летию проф. А.М. Корепанова. -Ижевск, 2009. - С. 121-124.

13. Никитин, E.H. Заболеваемость хроническим лимфолейкозом в Удмуртской Республике / E.H. Никитин, С.П. Никитин, М.Б. Костылева, А.К. Щербаков, Н.Г. Овчишша [и др.] // Материалы межрегиональной научно - практической конференции, поев. 80 - летию проф. А.М. Корепанова. - Ижевск, 2009. - С. 110 -113.

14. Шишкин, A.B. Опыт практического использования биочипов для иммунодиагностики хронического лимфоцитарного лейкоза и других опухолей системы крови / A.B. Шишкин, Н.Г. Овчинииа, E.H. Никитин II Всероссийская конференция с международным интернет - участием «От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий - к наноиндустрии»: сб. тезисов. - Ижевск, 2009. - С. 129.

15. Шишкин, A.B. Иммунологические биочипы для исследования клеток / A.B. Шишкин, Н.Г. Овчинииа // Всероссийская конференция с международным интернет -участием «От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий - к наноиндустрии»: сб. тезисов. -Ижевск, 2009. -С. 133.

16. Пат. 87165 Российская Федерация. C12Q 1/00 (2006.01). Устройство для инкубации биочипа с клеточной суспензией и его отмывки / Шишкин A.B., Овчишша Н.Г., Никитин E.H. и др.; заявитель и патентообладатель Шишкин A.B. - № 2009119879/22; заявл. 27.05.09; опубл. 27.09.09 // Бюл. - 2009. - К»27.

17. Никитин, E.H. Применение иммунологических биочипов в диагностике хронического лимфоцитарного лейкоза / E.H. Никитин, Н.Г. Овчишша, A.B. Шишкин // Вестник гематологии. - 2009. - №2. - С. 28.

Отпечатано с оригинал-макета -лаказчика

Подписано в печать 22.01.2010. Формат 60x84 716. Тираж 100 экз. Заказ № 130.

Типография ГОУВПО «Удмуртский государственный университет» 4.26034, Ижевск, ул. Университетская, 1, корп. 4.

Актуальность проблемы

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) - одно из распространенных опухолевых заболеваний кроветворной ткани, которое крайне неоднородно по клиническому течению, лабораторным особенностям и ответу на специфическое лечение [3, 45, 52]. Уровень заболеваемости ХЛЛ в Удмуртской Республике вырос с 1998 по 2008 годы. Кроме того, среднегодовой показатель заболеваемости ХЛЛ за 1989 — 1998 годы в Удмуртской Республике составляет 3,23±0,20 случаев среди мужчин и 2,21 ±0,31 случаев среди женщин на 100 000 населения и является достоверно более высоким, чем по РФ в целом (1,50±0,10 и 0,80±0,03 на 100 000 населения соответственно, р<0,05) [46]. Химиотерапия хотя и позволяет в настоящее время получать длительные ремиссии, но не у всех групп пациентов, и имеет сопутствующий риск осложнений [7, 11, 12, 60]. В связи с этим остается актуальным поиск факторов прогноза ХЛЛ. Прогнозирование течения ХЛЛ включает оценку длительности периода без лечения, решение вопроса о сроках назначения и варианте терапии, возможный ответ на нее и общую выживаемость. Гетерогенность клинического течения заболевания, а также ряда молекулярных изменений в опухолевых клетках не исключают возможности на основе этих признаков выделять определенные варианты ХЛЛ, при которых обнаруживаются клинически значимые корреляции, хотя, по - видимому, трудно найти молекулярные признаки, которые обнаруживались бы во всех случаях, тем более, что каждый фактор характеризует определенную степень вероятности прогноза. Выявление характера связи факторов риска между собой принципиально важно для установления не только их взаимодополняемости, но и взаимозаменяемости при доступности их исследования в клинико - лабораторной практике. Кроме того, подавляющее большинство прогностических факторов при ХЛЛ могут изменяться в ходе опухолевой прогрессии, а также существует проблема их дискоординации (несоответствия) [45, 54, 131]. Генетические аномалии, имеющие прогностическое значение, реализуются в структурно -функциональных изменениях протеинов, входящих в состав рецепторного комплекса мембраны опухолевой клетки, регулируя таким образом его экспрессию и активность [2, 27, 57].

На последнем 8-ом Международном рабочем совещании по CD -антигенам (8th HLDA Workshop, Аделаида, Австралия, 2004) зарегистрировано свыше 400 антигенов, при этом число вновь открываемых антигенов, начиная с 1982 года, неуклонно растет. Предполагается, что общее количество мембранных молекул лейкоцитов может быть более 4 тысяч [157]. Возможность идентификации большого числа антигенов, экспрессируемых неопластическими клетками, позволит выделять новые варианты лейкозов и лимфом [74], а одновременное выявление широкого спектра прогностически значимых клеточных маркеров будет более достоверно характеризовать клинические свойства и поведение опухоли.

Иммунофенотип - это набор антигенов, экспрессируемый популяциями клеток данного индивида [30, 36]. В настоящее время существует несколько общепринятых методов установления иммунофенотипа опухолевой клетки при XJ1J1: проточная цитофлюориметрия, иммуноцито-(гисто)-химическое исследование, иммунофлюоресцентное исследование, общей особенностью которых является определение ограниченного числа антигенов. Поэтому является весьма перспективным применение с целью диагностики XJ1J1 новых методов анализа, позволяющих расширить спектр одновременно исследуемых антигенов при сохранении доступности и простоты их применения в клинико — лабораторной практике. К таким методам относится иммунофенотипирование клеток XJIJ1 с помощью иммунологических микроматриц (биочипов), который позволяет определять от 32 до 147 маркеров [63, 69]. Однако к настоящему времени данный метод не был широко апробирован в клинической практике, в частности, для диагностики ХЛЛ и выяснения прогностического значения некоторых антигенов опухолевых лимфоцитов.

Исходя из изложенного выше, целью настоящего исследования явились совершенствование иммунодиагностики и оценка эффективности лечения ХЛЛ с помощью иммунологических биочипов.

Задачи исследования:

1. Оценить эффективность применения иммунологических биочипов для лабораторной диагностики ХЛЛ.

2. Установить связь между числом опухолевых лимфоцитов, экспрессирующих ряд изучаемых антигенов, и клинико — лабораторными особенностями ХЛЛ.

3. Оценить пролиферативный и адгезивный потенциалы лейкемических лимфоцитов при ХЛЛ.

4. Оценить прогноз заболевания на основании варианта иммунофенотипа лейкозных клеток при ХЛЛ.

5. Дать иммунологическую оценку эффективности традиционной химиотерапии ХЛЛ.

Научная новизна исследования:

Впервые установлена эффективность использования отечественных оригинальных иммунологических биочипов с целью диагностики ХЛЛ в репрезентативной выборочной совокупности пациентов и оценки остаточной опухолевой массы в процессе химиотерапии; проведена комплексная оценка популяций опухолевых лимфоцитов при ХЛЛ, анализируемых по большому набору СЭ — антигенов, в зависимости от клинических проявлений болезни; предложены дополнительные маркеры оценки пролиферативного и адгезивного потенциалов лейкемических клеток при ХЛЛ; предложена качественная модель распределения иммунологических популяций лейкозных лимфоцитов в организме.

Практическая ценность работы:

Для практического здравоохранения предложен метод иммунодиагностики XJ1J1 с помощью иммунологических биочипов. Выделены клинически значимые антигены, которые могут рассматриваться как критерии прогноза течения XJ1JI.

Доказана целесообразность использования иммунологических биочипов с целью индивидуальной оценки течения XJIJI, а также для определения остаточной опухолевой массы в процессе химиотерапии заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммунологические биочипы могут быть эффективно использованы для иммунодиагностики XJTJI.

2. Повышенное содержание лимфоцитов, позитивных по антигенам CD71, CD95, CD98, а также CD38, CD27, CD45RA, CD72, HLA - DR, свидетельствует о высоком пролиферативном потенциале опухолевых клеток XJIJI.

3. Антигены CD9, CD1 la, CD1 lb, CD21, CD22, CD29, CD31, CD38, CD44 участвуют в распределении опухолевой массы и обусловливают клинические особенности XJ1J1.

4. Наиболее неблагоприятный вариант XJ1J1 характеризуется повышенным содержанием в периферической крови лимфоцитов, позитивных по антигенам CD38, CD71, CD95, CD98, CD9, а также CD45RA, CD72, CD27, HLA - DR, CD21, CD22, CD44 и негативных по антигенам CDlla, CDllb.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты диссертационного исследования внедрены в практическую деятельность врачей гематологического отделения и клинической лаборатории ГУЗ «1-ая Республиканская клиническая больница» МЗ УР, в работу автономной некоммерческой организации «Центр наноиндустрии УР», учебно - экспериментальной лаборатории, центра трансфера технологий ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия Росздрава» и в учебный процесс кафедры факультетской терапии с курсами эндокринологии и гематологии ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия Росздрава».

Апробация работы

Основные результаты исследования были доложены на научно — практической конференции врачей - гематологов (Ижевск, 2008), на научно -практической конференции «Современные методы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Ижевск, 2008), на 12-ой Международной Пущинской школе - конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2008), Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии» (Москва, 2008), на II Российском форуме «Российким инновациям - российский капитал» (Саранск, 2009), на объединенном заседании кафедр факультетской терапии с курсами эндокринологии и гематологии, пропедевтики внутренних болезней с курсом сестринского дела, внутренних болезней с курсами лучевых методов диагностики, лечения и ВПТ, на проблемной комиссии по внутренним болезням с вопросами нефрологии, эндокринологии, гематологии и курортологии с физиотерапией ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия Росздрава» (Ижевск, 2009).

Личный вклад автора в выполнение научной работы

Автором лично проведено клиническое обследование и наблюдение пациентов с ХЛЛ в условиях стационара и поликлиники. Выполнена подготовка образцов крови и самостоятельно проведено иммунофенотипирование клеток пациентов с помощью иммунологических биочипов. Автором работы осуществлена оценка результатов исследования, анализ и статистическая обработка данных 75 пациентов, страдающих ХЛЛ. Автор принимала участие в разработке иммунологических биочипов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 2 работы в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией (ВАК), и 1 патент на полезную модель [48].

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 158 страницах машинописи, содержит 28 таблиц и 19 рисунков. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики обследованных пациентов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, 2 клинических примеров, заключения (резюме с обсуждением полученных результатов), выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, представленного 158 источниками, из них 65 отечественными, и 93 зарубежными.

ВЫВОДЫ

1. Анализ лейкемических клеток ХЛЛ с помощью иммунологических биочипов позволяет проводить иммунофенотипирование лимфоцитов по большому спектру поверхностных антигенов и морфологическую идентификацию изучаемых клеток.

2. Пролиферативный потенциал опухолевых лимфоцитов при ХЛЛ может быть охарактеризован количеством клеток, экспрессирующих антигены СЭ71, СВ95, СЭ98, а также СЭ38, СБ27, С045ЯА, СЭ72, НЬА - ЭЯ, СП21, СВ22.

3. Адгезивные свойства опухолевых лимфоцитов при ХЛЛ, определяющие их распределение в организме, связаны с экспрессией антигенов С09, СЭ11а, СВ\ 1Ь, СВ2\, С022, СГ)29, СБЗ1, СЭ38, СВ44.

4. Неблагоприятное течение ХЛЛ характеризуется значительным содержанием в периферической крови лимфоцитов, позитивных по антигенам С038, СБ71, СБ95, С098, СБ9, а также СВ45ЯА, СВ72, СШ1, НЬА - ЭЯ, СЭ21, СШ2, СБ44 и негативных по антигенам С011а, СБ11Ь, что отличает его от благоприятного варианта ХЛЛ.

5. Первично — сдерживающее лечение хлорамбуцилом и полихимиотерапия (СОР: циклофосфан, винкристин, преднизолон) не сопровождаются достижением как иммунологической, так и полной клинико - гематологической ремиссии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В связи с информативностью и доступностью анализа с помощью иммунологических биочипов целесообразно применение этого метода для иммунодиагностики ХЛЛ в лечебно - профилактических учреждениях, где отсутствуют другие методы иммунофенотипирования, а также в качестве параллельного метода для подтверждения иммунологического диагноза и применения расширенной панели антител к антигенам опухолевых лимфоцитов.

2. В случае высокого пролиферативного потенциала лейкемических лимфоцитов при ХЛЛ, оцененного по совокупности таких антигенов, как CD38, CD71, CD95, CD98, CD45RA, CD72, CD27, HLA - DR, CD21, CD22, а также учитывая паллиагивность лечения хлорамбуцилом и СОР - терапии, рекомендуется назначать более агрессивные курсы химиотерапии.

3. Учитывая, что CD9 — позитивные лейкозные лимфоциты периферической крови обладают преимуществом в заселении лимфатических узлов, и CD9 —, CD38 -, CD44 - положительные опухолевые В — клетки легко мигрируют из кровотока в печень, можно использовать определение численности данных популяций опухолевых лимфоцитов в качестве дополнительных критериев в дифференциальной диагностике специфического опухолевого поражения этих органов при ХЛЛ от реактивного лимфаденита и поражения печени другой этиологии при прочих равных условиях.