Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Клиническое значение молекулярно-биологических маркеров в прогнозировании хирургического лечения рака пищевода

На правах рукописи

Григорчук Александр Юрьевич

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ РАКА ПИЩЕВОДА

14.03.12- онкология

АВТОРЕФЕРАТ 4840200

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 [\!ДР 2011

Москва-2011

4840200

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском Онкологическом Научном Центре имени Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Б.Е. Полоцкий

В.В. Делекторская

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

С.Б. Петерсон Л.Е. Гуревич

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет МЗ

совета по защите докторских диссертаций Д001.017.01 при Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478; г. Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН

Автореферат разослан < ЛЯ 2011 года.

СР РФ

Защита состоится «

М

2011 года в 14 часов на заседании

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Рак пищевода относится к высокозлокачественным опухолям и характеризуется ранним лимфогенным метастазированием. По данным различных авторов, пятилетняя выживаемость после радикального хирургического лечения рака пищевода не превышает 40% [Мамонтов А. С., 1986; Berrino F., 1995; Altorki N., 2001; Hulscher J. В., 2001; Medical Research Council Oesophageal Cancer Working Group, 2002; Стилиди И. С., 2003; Boyle P., 2008; Stahl M, 2009; Давыдов М. И., 2009], а в подгруппе больных с наличием пораженных лимфоузлов составляет менее 25% [Мамонтов А. С., 1986;"Berrino F., 1995; Стилиди И. С., 2003; Boyle Р., 2008; Stahl М., 2009; Давыдов М. И., 2009]. В настоящее время тактика лечения этих больных зависит от распространенности опухоли и определяется с использованием TNM-стадирования. Во многом это связано со способностью TNM классификации прогнозировать течение заболевания.

Опубликованная в декабре 2009 года седьмая редакция TNM-классификации (TNM7) позволяет более детально разделять заболевание на стадии и определять прогноз больных раком пищевода по сравнению с предыдущей редакцией данной классификации. Вместе с тем, среди радикально оперированных больных раком пищевода с одинаковыми TNM-стадиями наблюдается значительный разброс показателей выживаемости, а вопрос индивидуального прогнозирования результатов лечения даже при использовании 7й редакции TNM-классификации остается нерешенным [Edge S. В., 2009]. В свете последних достижений в области молекулярной биологии стало очевидно, что существенные различия в продолжительности жизни радикально оперированных больных с одинаковыми TNM-стадиями могут быть объяснены молекулярно-биологическими особенностями опухоли, в частности, критериями, определяющими пролиферативную активность и инвазивный потенциал раковых клеток. Данные параметры не учитывались при разработке 7-редакции TNM-классификации. Вместе с тем,

3

изучение молекулярно-биологических особенностей рака пищевода открывает перспективы для более точной оценки прогноза течения заболевания и, как следствие, для совершенствования и индивидуализации лечебной тактики. Таким образом, выявление молекулярно-биологических характеристик опухоли, имеющих дополнительное независимое прогностическое значение при использовании совместно с критериями TNM-стадирования, является актуальной задачей [Rice Т. W., 2010].

Недавно были получены данные ряда рандомизированных исследований, демонстрирующие способность неоадьювантного лечения увеличивать продолжительность жизни операбельных больных раком пищевода по сравнению с только хирургическим лечением. В этой связи в последние годы, как в Европе, так и в Канаде, США, Японии и других странах происходит пересмотр лечебной тактики в пользу применения предоперационной химио- или химиолучевой терапии [Kuwano Н., 2008; Higuchi К., 2009; Shitara К., 2009; Stahl М., 2009; Forastiere А., 2010; Malthaner R., 2010]. С учетом этих данных, актуальным является выявление больных раком пищевода с заведомо неблагоприятным прогнозом, что позволит обоснованно назначить им дополнительное лечение и, таким образом, улучшить результаты лечения в целом. В ряде случаев, отказ от хирургического лечения больных с плохим функциональным статусом и заведомым ранним послеоперационным прогрессированием в пользу альтернативных методов лечения, мог бы избавить таких пациентов от повышенного послеоперационного риска. С другой стороны, отказ от дополнительного лечения у больных с благоприятным прогнозом будет способствовать сохранению лучшего качества жизни и позволит избежать лишних затрат на лечение.

Актуальными для изучения молекулярно-биологическими факторами являются мембранные молекулы, связанные с передачей и активацией внутриклеточных митогенных сигналов, такие как рецепторы эпидермального фактора роста 1 и 2 типов (EGFR/HER-1 и HER-2).

Повышенный интерес к исследованию клинического значения этих рецепторов при раке пищевода определяется их ролью в качестве потенциальных маркеров прогноза заболевания, а также возможностью воздействия на них «таргетными» терапевтическими препаратами, что открывает дополнительные возможности лечения ряда больных [Metzger R., 2004].

Особого внимания заслуживают молекулярно-биологические факторы, связанные с клеточной адгезией, такие как Е-кадгерин, ß-катенин и CD44v6. Многочисленные экспериментальные данные подтвердили важную роль данных факторов в процессах инвазии и метастазирования раковых опухолей [Bourguignon L. Y., 2007; Herzig M., 2007; Napier S. L., 2007; Braun К. M., 2008; Nelson W. J., 2008]. Помимо участия в механизмах регуляции клеточной адгезии, ß-катенин способен активировать транскрипцию ряда важных для опухолевой прогрессии генов, влияющих на пролиферацию и клеточный рост [Gavert N.. 2007; Barker N., 2008; Huang H., 2008; Mosimann С., 2009].

В тоже время, несмотря на важную роль перечисленных молекулярно-биологических маркеров в процессах развития и прогрессии различных видов опухолей человека, их клиническое значение при раке пищевода изучено недостаточно, а данные уже опубликованных исследований противоречивы [Law S., 2009].

Таким образом, разработка новых прогностических критериев с использованием современных молекулярно-биологических характеристик опухоли является актуальной задачей, решение которой позволит индивидуализировать лечебную тактику и откроет дополнительные возможности для улучшения отдаленных результатов лечения больных раком пищевода.

Цель исследования

Усовершенствование индивидуального прогнозирования результатов хирургического лечения плоскоклеточного рака пищевода (ПРП) с учетом

5

клинико-морфологических и молекулярно-биологических особенностей опухоли.

Задачи

1. Изучить прогностическое значение основных клинических и морфологических параметров опухолей с учетом рТЫМ-стадирования, а также сравнить прогностическую значимость 6 и 7 редакций ТЫМ-классификации в исследуемой группе больных ГТРП.

2. Оценить частоту выявления и уровень иммуногистохимической (ИГХ) экспрессии молекулярно-биологических факторов клеточной адгезии (Е-кадгерина, Р-катенина и СБ44у6), а также рецепторов эпидермального фактора роста 1 и 2 типов (ЕвРЯ и НЕН-2) в опухолях больных ПРП.

3. Исследовать взаимосвязь между уровнями экспрессии молекулярно-биологических маркеров в опухоли и клинико-морфологическими характеристиками ПРП.

4. Определить прогностическую значимость изменений экспрессии молекулярно-биологических маркеров в опухолях больных ПРП.

5. Провести многофакторный анализ значимости изучаемых молекулярно-биологических факторов в индивидуальном прогнозировании течения заболевания с учетом традиционных клинико-морфологических критериев прогноза.

Научная новизна

Впервые при плоскоклеточном раке пищевода проведена комплексная оценка особенностей экспрессии таких молекулярных факторов, как ЕСРИ, НЕЯ-2, СЭ44у6, Е-кадгерин, Р-катенин и многофакторный анализ их прогностического значения с учетом традиционных клинико-морфологических характеристик, а также критериев 6 и 7 редакций ТЫМ-классификации данного заболевания. Разработана оригинальная прогностическая модель, предсказывающая течение заболевания после радикального хирургического лечения ПРП.

Практическая значимость

Исследованные молекулярные маркеры могут применяться для уточнения прогноза течения заболевания у больных плоскоклеточным раком пищевода в дополнение к ТЫМ-стадированию и для определения индивидуальной лечебной тактики на этапе планирования первичной терапии или после хирургического лечения. Выделенный кадгерин-катениновый фактор, основанный на сочетании различных уровней экспрессии Е-кадгерина и р-катенина, позволяет выделить группу больных ПРП с неблагоприятным прогнозом течения заболевания, которым может быть рекомендовано проведение дополнительного лечения.

Апробация диссертации

Материалы диссертации изложены 19 ноября 2010 г на совместной конференции отделений: хирургического торакального, абдоминальной онкологии, патологоанатомического, эндоскопического, клинической фармакологии и химиотерапии НИИ КО; лаборатории гистохимии и электронной микроскопии НИИ КО и лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Основные положения работы доложены на XVII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 12-16 апреля 2010г.) и на VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 28-29 октября 2010г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных научных работ.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 191 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Текст иллюстрирован 72 таблицами, 64 рисунками графического содержания и микрофотографиями. Библиографический список включает 212

7

источников литературы, из которых 6 отечественных и 206 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика и критерии отбора больных для анализа прогностического значения клинико-морфологических факторов

В группу для анализа прогностического значения клинико-морфологических характеристик заболевания вошло 180 больных ПРП, оперированных в НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН с 1995 по 2006 гг. и удовлетворяющих следующим критериям:

1. Диагноз- плоскоклеточный рак пищевода;

2. Продолжительность наблюдения - не менее полугода;

3. Исключались больные:

а. умершие не от прогрессирования опухолевого процесса;

б. умершие в течение 2х месяцев с момента операции.

Среди больных преобладали мужчины (72%), средний возраст составлял 58 лет (ст= ± 8; min = 30; шах = 76 лет). Согласно шестой редакции pTNM-классификации (pTNM6) Т1-глубина инвазии наблюдалась в 5%, Т2 -в 27%, ТЗ - в 55% и Т4 - в 13% случаев. В 70% наблюдений выявлялись метастазы в лимфоузлах (pNl). Преобладали больные со II (36%) и III (43%) стадиями заболевания (pTNM6). Чаще всего проксимальная граница опухоли определялась на уровне средней (62%) и нижней (30%) трети пищевода. В большинстве наблюдений рак пищевода характеризовался умеренной (63%) и низкой (31%) степенью дифференцировки. ПРП с ороговением различной степени выраженности определялся в 83% случаев.

С применением седьмой редакции pTNM-классификации (pTNM7) удалось проанализировать 149 из 180 включенных в исследование больных. При характеристике глубины инвазии согласно pTNM7, рТ1-критерий (4,7%) дополнительно разделился на рТ1а (1,3%) и pTlb (3,4%), а рТ4 (12,1%) на рТ4а (2%) и рТ4Ь (10,1%). В зависимости от количества пораженных

лимфатических узлов было получено следующее распределение: pNl - в 28,9%, pN2 - в 25,5% и pN3 - в 12,8% случаев. Преобладали пациенты со 11А-IV стадиями заболевания (наблюдались в пределах от 11,4% до 23,5%). Основным видом хирургического печения являлась субтотальная резекция пищевода (92%). В 7% случаев выполнялась резекция дистальных отделов пищевода при локализации эпицентра опухоли в абдоминальном отделе. В соответствии с классификацией, предложенной японскими авторами [Ide Н., 1998], объем лимфодиссекции подразделялся на 2S (19,8%), 2F (29,9%) и 3F (4,0%). 25-лимфодиссекция производилась только при небольших поражениях с расположением эпицентра на уровне абдоминального сегмента пищевода (п = 26) либо при паллиативных операциях (п = 9). Наиболее часто (46%) производилась расширенная 2S лимфодиссекция с удалением правой паратрахеальной клетчатки.

Трехлетняя общая выживаемость (ОВ) 180 больных, включенных в анализ прогностического значения клинико-морфологических характеристик, составила 43,5±6,6%, пятилетняя - 30,0±3,8%. Медиана ОВ была равна 2,19±0,33 лет (рис. 1а). Трехлетняя прослеженность больных составила 88,3% (в течение первых 3 лет с момента операции не удалось проследить 11,7% больных). Пятилетняя прослеженность больных составила 82,2% (на протяжении первых 5 лет не удалось проследить 17,8% больных).

Общая характеристика и критерии отбора больных для анализа клинического значения молекулярно-биологических факторов Для анализа прогностического значения молекулярно-биологических маркеров из общего количества включенных в исследование больных ПРП было отобрано 72 пациента согласно следующим дополнительным критериям:

1. Характер операции - радикальный и условно-радикальный (R0 резекция);

2. Исключались больные:

а. умершие в течение 5 лет с момента операции от других злокачественных новообразований;

б. получавшие неоадъювантное лечение;

в. с I стадией заболевания (согласно 6 редакции TNM);

е. при отсутствии в архиве парафиновых блоков с образцами опухоли.

В этой группе пациентов также преобладали мужчины (75%), средний возраст составил 58 лет (а= ±8; min = 36; max = 76 лет). В 93,1% наблюдалась Т2-ТЗ глубина инвазии. Как и в общей группе, у большинства больных (70,8%) было выявлено наличие метастазов в лимфатических узлах. В зависимости от количества пораженных лимфоузлов, отмечалось следующее распределение по N-критерию (pTNM7): N0 - 23,6%, N1 - 29%, N2 - 26.4%, N3 - 14%. При стадировании согласно pTNM6, IIA стадия составила 20,8%, IIB - 22,2%, III - 52,8%, IV-4,2%.

Как правило, хирургическое лечение заключалось в субтотальной резекции пищевода (91,7%) с одномоментной пластикой желудочным стеблем (86,1%), или толстой кишкой (6,9%). Хирургический доступ включал в себя верхнесрединную лапаротомию и, на втором этапе, боковую торакотомию справа. Такой доступ позволял выполнять адекватную лимфодиссекцию во время резекции пищевода. В двух случаях дополнительно был произведен шейный доступ и выполнена трехзональная лимфодиссекция. В шести наблюдениях, при локализации эпицентра опухоли в области абдоминального отдела пищевода, резекция была ограничена средней и нижней третью органа и 2S лимфодиссекцией.

Гистологические препараты были оценены по следующим морфологическим параметрам: гистологический тип опухоли, глубина инвазии, степень дифференцировки, наличие ороговения, инвазии лимфатических и кровеносных сосудов, периневрального роста, степень выраженности некроза, лимфоидной и воспалительной инфильтрации, десмопластической реакции стромы, характер опухолевой инфильтрации.

Трехлетняя OB 72 больных, включенных в анализ прогностического значения молекулярно-биологических факторов, составила 46±6%,

пятилетняя - 28±6%. Медиана ОВ была равна 2,59±0,55 лет (рис. 16). Трехлетняя прослеженность больных составила 87,5%, пятилетняя - 80,6%.

Общая выживаемость больных п=180 Общая выживаемость (OB) больных, п=72

Рисунок 1. ОВ больных ПРП. а. Общая группа, п=180; б. Больные включенные в анализ молекулярно-биологических факторов, п=72.

Иммуногистохимическое исследование молекулярно-биологических

факторов прогноза

Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования использовали ретроспективный послеоперационный материал 72 больных ПРП из архива Отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. ИГХ исследование выполнено на серийных парафиновых срезах ткани опухолей с антителами к следующим белковым маркерам: молекулам межклеточной адгезии Е-кадгерину, ß-катенину и CD44v6 ("Novocastra"); рецепторам семейства эпидермального фактора роста EGFR (HER-1) ("Novocastra") и HER-2 ("Dako"). Экспрессия HER-2 исследовалась с помощью системы HercepTest ("Dako"). Для выявления остальных маркеров использовали систему детекции Super Sensitive™ Polymer-HRP ("BioGenex"). Депарафинизированные срезы обрабатывали в цитратном буфере pH 6.0 в водяной бане при 95 °С в течение 40 мин. Оценка реакции в клетках первичных опухолей проводилась полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и

количества антиген-позитивных клеток. При ИГХ исследовании экспрессии молекул межклеточной адгезии Е-кадгерина, ß-катенина, CD44v6 оценивали локализацию продукта реакции на мембране, в цитоплазме и в ядре (только для ß-катенина) клетки. ИГХ реакция оценивалась как негативная («О» - нет реакции), слабопозитивная («+» - <10% окрашенных клеток), умереннопозитивная («++» - >10% клеток средней интенсивности окраски) и сильнопозитивная («+++» - >10% клеток высокой интенсивности окраски). При исследовании экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста EGFR и HER-2 учитывали только мембранную реакцию, а результаты реакции оценивали от «0» до «•+++» с помощью системы HercepTest.

В процессе последующего статистического" анализа мембранной экспрессии маркеров (EGFR, HER-2, Е-кадгерин, ß-катенин, CD44v6) выделяли два основных уровня иммунореактивности: низкий (-/+) и высокий (++/+++). А для оценки уровней экспрессии маркеров в цитоплазме (Е-кадгерин, ß-катенин, CD44v6) и в ядре (ß-катенин) клетки использовалось разделение на группы с отсутствием (-) или наличием (+/++/+++) позитивной экспрессии.

Методы статистического анализа данных

Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ SPSS 17.0 for Windows, Microsoft® Office Access 2007, Statistica 8.0 for Windows. Рассчитывали среднее значение показателей, стандартную ошибку среднего, а также их медианы. Определение достоверности различий частот признаков в изучаемых группах проводили с использованием критерия %2 и критерия ранговой корреляции Спирмена. Различия между показателями считались статистически значимыми при р < 0,05.

Анализ прогностической значимости содержания маркеров и построение кривых выживаемости проводили методом Каплан-Майера [Kaplan Е. L., 1958]. Достоверность различий в выживаемости при

однофакторном анализе оценивали с помощью теста "Гехана-Вилкоксона" ("Gehan's Wilcoxon test") и log-rank теста [Peto R., 1972].

Многофакторный анализ прогностической значимости молекулярно-биологических факторов был проведен с учетом комплекса клинико-морфологических критериев методом регрессионного анализа по Сох (Proportional hazard (Сох) regression model) [Сох D., 1984].

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ прогностического значения клииико-морфологических характеристик опухолей больных ПРП

Проведенное нами исследование выявило максимально значимую (р<0.001) связь с прогнозом для всех критериев (рТ, pN, рМ, pTNM-стадии), включенных в шестую (pTNM6) и седьмую (pTNM7) редакции TNM-классификации плоскоклеточного рака пищевода (рис. 2).

Стадии pTNM (6 ред.) n=180 р = 0,00000 1.0 0,9

¡S * 0,8 2

¡ 0,7

I 0,6

¡ 0,5

I о." I °'3

I0-2 0,1 0,0

Стадии pTNM OSCC п=149 р = 0,00000

Ь Ч -)

t Ч. ........НА

IIB:

Ч, — Ill

• %^ «• ¿.и . .. . ..... IV

а -к о -

% ^ ° i -

0 12 3 4

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0.0 Время, лет

— 1а ...... Ib

IIa

— IIb

— Illa Jllb

— lile

5 6 7 8 Время, лет

10 11 12 13

Рисунок 2. ОВ больных ПРП в зависимости от рТКМ-стадии. а. Согласно 6 редакции ТОМ (рТОМб); б. Согласно 7 редакции ТИМ (рТОМ7).

Максимально значимая (р<0.001) корреляция с прогнозом установлена также для следующих факторов: радикальность операции, характер опухолевой инфильтрации и наличие инвазии в кровеносные сосуды. Кроме того, статистически значимая корреляция с прогнозом отмечена для таких

факторов, как инвазия в лимфатические сосуды (р=0.02) и протяженность опухоли, измеренная морфологом (р=0.004).

Результаты нашего исследования не выявили статистически значимой связи других изученных клинико-морфологических характеристик с прогнозом заболевания.

По данным проведенного нами многофакторного анализа по СОХ методом пошагового включения, среди всех изученных клинико-морфологических характеристик, статистически значимым независимым прогностическим значением обладает только рТЫМб и рТММ7-стадирование. При этом рТЫМ7-стадирование продемонстрировало более значимую связь с прогнозом (р=1,6х10"14), чем рТЫМб-стадирование (р=3,2х10'13). Такой же вывод получен и при многофакторном анализе по СОХ с одновременным принудительным включением рТЫМб и рТЫМ7 стадий (табл.1).

Таблица 1. Одновременное включение Т]ЧМ6 и ПЧМ7-стадий в уравнение многофакторного анализа по СОХ.

Переменные в уравнении

В

Станд. ошибка

Знчение

••••• Р

чВ

еь

.......

Нижняя фан. Верхняя фан.

Стадия рТШ7 Стадия рТШб

0,312

0,114

0,006

1,360

1,092

1,707

0,375

0,190

0,048

1,450

1,003

2,120

Анализ прогностического значения рецепторов эпидермального фактора роста (ЕСРЯ и НЕИ-2) при ПРП

Рецепторы эпидермального фактора роста относятся к ключевым факторам, избыточная активация которых может приводить к усиленной пролиферации, снижению апоптоза, увеличению подвижности опухолевых клеток, стимуляции ангиогенеза и способствует прогресированию целого ряда злокачественных новообразований человека. Результаты проведенного исследования позволили выявить, что для ПРП характерна выраженная

14

экспрессия ЕСРИ в мембранах опухолевых клеток эпителиальных комплексов (55.6% наблюдений), в то время как гиперэкспрессия НЕЯ-2 является редким событием (2.8% наблюдений) (рис. 3).

В данном исследовании не было выявлено статистически значимой связи изменений экспрессии ЕОРЯ и НЕЯ-2 в опухолях больных ПРП с ТИМ-критериями согласно рТЫМб и р"ШМ7. Повышенный уровень белковой экспрессии ЕСП1 и НЕЯ-2 не был также ассоциирован с такими клинико-морфологическими характеристиками как степень дифференцировки опухоли, характер опухолевой инфильтрации, наличие инвазии кровеносных и лимфатических сосудов.

При анализе ОВ больных ПРП по методу Каплан-Майера с учетом уровней экспрессии ЕвРК и НЕ11-2 не было выявлено достоверной разницы между отдаленными результатами лечения в группах больных с антиген-позитивными и антиген-негативными опухолями. Многофакторный анализ также не подтвердил прогностического значения гиперэкспрессии рецепторов эпидермального фактора роста 1 и 2 типов (ЕСРЛ и НЕИ-2) в опухолях больных ПРП. Вместе с тем, выявленное нами повышение уровня экспрессии БвРЛ более чем у половины больных ПРП (55.6%) позволяет высказать предположение о возможности использования маркера в качестве перспективной терапевтической мишени для «таргетной» терапии при ПРП.

Рисунок 3. Иммуногистохимическое выявление мембранной экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста в клетках ПРП: а. ЕОРИ -негативная экспрессия «+» (400х); б. ЕвРЯ - позитивная экспрессия «++»

15

(400х); в. ЕОРЛ - гиперэкспрессия «+++» (250х); г. НЕЛ-2 - гиперэкспрессия «+++», 250х. Ядра клеток докрашены гематоксилином Майера.

Анализ прогностического значения молекул связанных с межклеточной адгезией (Е-кадгерина, В-катенина и СР44у6), при ПРП

Молекулы, ассоциированные с межклеточной и клеточно-матриксной адгезией, играют важную роль в процессах опухолевой прогрессии, так как нарушение их нормального функционирования влияет на способность клеток к инвазии и метастазированию. Отсутствие (-) экспрессии Е-кадгерина на мембране опухолевых клеток, не характерное для эпителия нормальной слизистой оболочки пищевода, довольно часто встречалось в исследованных новообразованиях больных ПРП (54,2%) (рис. 4а,б). Низкий (-/+) уровень экспрессии Е-кадгерина на мембране опухолевых клеток был значимо связан с лимфогенным метастазированием (р=0.013) и более поздней стадией заболевания (р=0.006). Наличие Е-кадгерина в цитоплазме опухолевых клеток достоверно коррелировало с опухолевой инвазией в лимфатические сосуды (р=0.004) и инфильтративным характером роста опухоли (р=0.005).

Увеличение уровня экспрессии СЭ44у6 на мембране опухолевых клеток ассоциировалось с инвазией кровеносных сосудов (р=0.001) и более поздней стадией заболевания (р=0.011), а повышенная экспрессия маркера в цитоплазме клеток с инфильтративным характером опухолевого роста (р=0,009) (рис. 4г).

При исследовании р-катенина (рис. 4в) в опухолях больных ПРП была выявлена тенденция к связи между снижением уровня экспрессии белка на мембране опухолевых клеток и более поздними стадиями заболевания. Не отмечалось корреляции уровня экспрессии Р-катенина на мембране, в цитоплазме и ядре клетки с какими-либо инвазивными характеристиками опухоли, в том числе с наличием метастазов в лимфоузлах.

В то же время при анализе прогностического значения белкового маркера определялось статистически значимое (р=0,005) ухудшение прогноза

заболевания в группе больных, в опухолях которых отмечено накопление (3-катенина в цитоплазме и такая же тенденция при наличии его в ядрах клеток. С худшим течением заболевания были значимо связаны: увеличение цитоплазматического уровня СП44у6 (р=0,006), особенно, в сочетании с выраженной окраской СБ44у6 на мембране (р=0,005) (мембранно-цитоплазматическая реакция) и снижение экспрессии мембранного Е-кадгерина (р=0,0001) в опухолевых клетках.

( Рисунок 4. Иммуногистохимическое выявление экспрессии молекул межклеточной адгезии (Е-кадгерина, Р-катенина и СЭ44у6) в клетках \ ПРП: а. Мембранная экспрессия Е-кадгерина «++», 250х; б. Редукция мембранной экспрессии Е-кадгерина «+», 25 Ох; в. |3-катенин на мембране клеток опухолевых комплексов, прорастающих мышечную оболочку стенки пищевода «+++», 250х; г. Мембранно-цитоплазматическая экспрессия СБ44у6 «++», 250х. Ядра клеток докрашены гематоксилином Майера.

Таким образом, одиофакторный анализ подтвердил наличие связи аберрантной экспрессии адгезивных молекул в клетках ПРП с инвазивными свойствами опухоли, процессом метастазирования и прогнозом заболевания.

В результате проведенных исследований был выявлен ряд статистически значимых ассоциаций между уровнями экспрессии в клетках ПРП исследованных молекулярно-биологических маркеров. Во всех случаях отмечалась прямая корреляция неблагоприятных уровней экспрессии одного фактора с неблагоприятными значениями другого.

Многофакторный анализ прогностической значимости каяедого из молекулярно-биологических маркеров с включением всех изученных клинико-морфологических характеристик

Выявлено статистически значимое увеличение прогностической точности рТИМб и рПЧМ7-стадирования при включении в уравнение показателей экспрессии мембранного Е-кадгерина, цитоплазматического Р-катенина или цитоплазматического СЭ44у6.

У больных с одинаковыми рТЫМ-стадиями наблюдалось достоверное ухудшение выживаемости в случаях наличия в ПРП редуцированной экспрессии Е-кадгерина по сравнению с наблюдениями, демонстрирующими высокий уровень экспрессии этого маркера в опухоли. Различия в выживаемости составили в среднем в 6,25 раза для рТЫМб (относительный риск, ОР = 6,25; 95% доверительный интервал, ДИ = 2,0 - 20,0) (р=0.002) и в 4,4 раза для рТЫМ7 (ОР = 4,4; 95% ДИ 1,3 -14,3) (р=0.016).

У больных с одинаковыми рТЫМ-стадиями в случаях наличия Р-катенина в цитоплазме клеток опухоли наблюдалось ухудшение выживаемости по сравнении с таковыми при отсутствии экспрессии этого маркера в среднем в 4,0 раза для рТЫМб (ОР=4; 95% ДИ 1,4 - 11,9) (р=0.01) и в 3,6 раза для р1ЫМ7 (ОР = 3,6; 95% ДИ 1,3 -10,5) (р=0.018).

Аналогичные показатели ухудшения выживаемости при наличии в опухолях цитоплазматического СБ44у6 (по сравнению с отсутствием

маркера) составили: в 2,9 раза для рТОМб (ОР = 2,9; 95% ДИ 1,5 - 5,5) (р=0.0017) и в 2.5 раза для рТОМ7 (ОР = 2,5; 95% ДИ 1,3 - 4,8) (р=0.009).

Многофакторный анализ с одновременным включением всех молекулярных факторов и клинико-морфологических характеристик Максимальная прогностическая точность была достигнута при одновременном включении в уравнение показателей экспрессии мембранного Е-кадгерина и цитоплазматического (3-катенина совместно с критериями 7ЪГМ6 (р=0,002 и р=0,01, соответственно) или ТЫМ7-стадирования (р=0,011 и р=0,013, соответственно). Это позволило сгруппировать комбинации уровней мембранного Е-кадгерина и цитоплазматического р-катенина в отдельный кадгерин-катениновый фактор. Случаи, сочетающие наличие экспрессии Р-катенина в цитоплазме с редукцией мембранного Е-кадгерина в клетках ПРП составили неблагоприятную группу кадгерин-катенинового фактора. В благоприятную группу вошли все остальные комбинации.

Кадгерин-катениновый фактор показал максимально значимую связь с прогнозом (р<0,001). Пятилетняя ОВ для благоприятной группы составила 75,3±11%, медиана ОВ - 8,9 лет. Значительно худшие показатели выживаемости наблюдались в неблагоприятной группе: пятилетняя ОВ составила 8,1±4,7%, а медиана ОВ - 1,7±0,25 лет. (рис. 5а).

Кривые ОВ для групп кадгерин-катенинового фактора были также стратифицированы в зависимости от наличия метастазов в лимфоузлах. На рисунке 5 показаны значительные различия ОВ в зависимости от значения кадгерин-катенинового фактора, как в группе с отсутствием (р = 0.016) (рис. 56), так и с наличием (р = 0.0005) (рис. 5в) метастазов в лимфатических узлах. При отсутствии метастазов в лимфоузлах пятилетняя ОВ в благоприятной группе кадгерин-катенинового фактора составила 71,4±21,4%, а в неблагоприятной - 20,0±17,4%. При наличии метастазов в лимфоузлах пятилетняя выживаемость в благоприятной группе кадгерин-катенинового фактора составила 30,1±19,6%, а в неблагоприятной - 2,6±3,4%.

ОВ в зависимости от группы кадгерин-катенинового фактора (р=0,00001)

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

\

О 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 — Благоприятная группа ........ Неблагоприятная группа

Кадгерин-катениновый фактор для группы с рМО (р=0,016)

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0.5 0,4 0,3 0,2 0,1 ОЛ.

Благоприятный Неблагоприятный

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Время, лет

Кадгерин-катениновый фактор для группы с р^ (р=0,0005)

Связь кадгерин-катенинового фактора с ОВ при ИА-стадии (ТШб) (р=0,02)

1,0

0.9 0,8 0.7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0.1 0,0

Благоприятный Неблагоприятный

0'

5 6 7 8 9 10 Время, лет

Благоп. группа Неблагоп. группа

11 12 13 р-Ч ,

ш

5 6 7 8 9 10 11 12 13 Время, лет

Связь

кадгерин-катенинового фактора с ОВ при ИВ-стадии (ТЫМб) (р=0,024)

Связь кадгерин-катенинового фактора с ОВ при Ш-стадии (ТЫМ6) (р=0,008)

4

•— Благоп.группа.

Неблагоп.группа

¿...........♦

12 3 4

5 6 7 8 Время, лет

9 10 11 12 13

V'..... — Благоп.группа ........Неблагоп.группа

о-6 0 :

6

6.....

5 6 7 8 Время, лет

9 10 11 12 13

Рисунок 5. Связь кадгерин-катенинового фактора с ОВ, стратификация по pN и pTNM (pTNM6). а. Без стратификации; б. ПРП без метастазов в лимфатических узлах (рИО); в. ПРП с метастазами в лимфоузлах (рИ+); г. НА-стадия ПРП; д. ПБ-стадия ПРП; е. Ш-стадия ПРП.

Кривые OB для групп кадгерин-катенинового фактора также были стратификацированы по pTNM-стадиям (TNM6) (рис. 5): Во всех случаях получены статистически значимые различия OB: при IIA стадии р = 0.02 (рис. 5г), при IIB стадии р = 0.024 (рис. 5д), при III стадии р = 0.008 (рис. 5е).

При IIA стадии пятилетняя выживаемость в благоприятной группе кадгерин-катенинового фактора составила 66,7±27,2%, в неблагоприятной -19,6±17,1%. При ИВ стадии этот показатель составил 77,8±19,6% для благоприятной группы и 6,5±8,6% для неблагоприятной. Пятилетняя выживаемость при III стадии в благоприятной группе определена на уровне 15,0±19,2%, а в неблагоприятной составила 0%.

При анализе с включением всех молекулярных маркеров, клинико-морфологических характеристик, кадгерин-катениновый фактор превзошел по уровню значимости pTNM6 и pTNM7 стадирование в данной выборке больных. Показана статистически значимая способность кадгерин-катенинового фактора уточнять прогноз TNM6 (р<0,0001) (относительный риск, ОР = 8,21; 95% ДИ 3,0 - 22,4) и ТЫМ7-стадирования (р=0,0003) (ОР = 6,18; 95% ДИ 2,3 - 16,7). Другие исследованные клинико-морфологические характеристики и молекулярные факторы не смогли значимо увеличить прогностическую точность, полученную при комбинации кадгерин-катенинового фактора и pTNM-стадирования.

Заключение

Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что наряду с традиционными клинико-морфологическими параметрами, определяющими риск прогрессии ПРП, такими как критерии pTNM стадирования, важную роль для оценки прогноза заболевания играют молекулярно-биологические характеристики опухоли, ассоциированные с адгезивными свойствами и инвазивным потенциалом клеток.

Анализ полученных данных позволил выделить общий кадгерин-катениновый фактор, показатели экспрессии которого могут оказаться полезными критериями для индивидуального прогнозирования клинического

течения ПРП и определения показаний к дополнительным методам терапии данного высокоагрессивного заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Клинико-морфологический анализ данных, полученных при исследовании опухолей больных плоскоклеточным раком пищевода, подтвердил статистическую значимость связи с прогнозом заболевания критериев ТЫМ-классификации (6 и 7 редакции) (р<0.001), а также наличия инвазии кровеносных и лимфатических сосудов (р<0.001 и р=0.02, соответственно).

2. Однофакторный математический анализ показал достоверную связь изменений экспрессии молекул межклеточной адгезии в опухолях больных плоскоклеточным раком пищевода с лимфогенным метастазированием (редукция мембранной экспрессии Е-кадгерина, р=0.013), инвазией лимфатических и кровеносных сосудов (появление цитоплазматической экспрессии Е-кадгерина, р=0.004 и повышение. мембранно-цитоплазматическая экспрессии СБ44у6, р=0.001, соответственно), более поздней стадией заболевания (редукция мембранной экспрессии Е-кадгерина, р=0.006 и повышение мембранно-цитоплазматическая экспрессия С044у6, р=0.011, соответственно).

3. С худшим прогнозом заболевания статистически значимо были связаны отсутствие или редукция в клетках опухоли мембранной экспрессии Е-кадгерина (р=0.0001), наличие высокого уровня цитоплазматической экспрессии Б-катенина (р=0.0049) и мембранно-цитоплазматической экспрессии СБ44у6 (р=0.006).

4. Достоверной связи с прогнозом плоскоклеточного рака пищевода гиперэкспрессии рецепторов эпидермального фактора роста 1 и 2 типов (ЕвРЯ и НЕЯ-2), а также накопления цитоплазматического Е-кадгерина в клетках опухоли не выявлено.

5. Многофакторный анализ комплекса клинико-морфологических признаков с учетом экспрессии молекулярно-биологических маркеров выявил

достоверное и независимое от критериев pTNM стадирования прогностическое значение мембранного Е-кадгерина, цитоплазматического ß-катенина и мембранно-цитоплазматического CD44v6.

6. На основании наличия в опухолях согласованных изменений экспрессии Е-кадгерина и ß-катенина выделен общий кадгерин-катениновый фактор, проявляющий независимую и наиболее высокую прогностическую значимость и точность с учетом критериев pTNM стадирования; данный фактор позволял стратифицировать прогноз заболевания в группах больных плоскоклеточным раком пищевода при наличии и отсутствии метастазов в регионарных лимфатических узлах.

7. Выделенные молекулярно-биологические маркеры могут быть использованы в качестве дополнения к TNM-классификации для уточнения индивидуального прогноза течения плоскоклеточного рака пищевода и определения лечебной тактики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Первичным больным со II-III стадиями (TNM6 и TNM7) ПРП рекомендуется определять уровни экспрессии Е-кадгерина и ß-катенина на материале биопсии (при ЭГДС) с целью уточнения индивидуального прогноза (согласно значению предложенного нами кадгерин-катенинового фактора) и лечебной тактики на этапе планирования хирургического лечения. В случае неблагоприятного значения кадгерин-катенинового фактора, целесообразно рассмотрение вопроса о проведения неоадьювантной противоопухолевой терапии таким больным.

. В случае отсутствия предоперационного исследования уровней Е-кадгерина и ß-катенина у радикально оперированных больных ПРП со II-III стадиями (TNM6 и TNM7), рекомендуется определять экспрессию этих маркеров в удаленной опухоли для уточнения индивидуального прогноза и лечебной тактики. При неблагоприятном значении кадгерин-катенинового фактора

необходимо рассматривать вопрос о проведении дополнительной противоопухолевой терапии таким больным.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Делекторская В.В., Чемерис Г.Ю., Завалишина Л.Э., Рязанцева А.А., Григорчук А.Ю., Кононец П.В., Давыдов М.И.. Плоскоклеточный рак пищевода: определение статуса рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR и HER-2) методами иммуногистохимии и IN SITU гибридизации. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Том 149, N 5 -с. 549-554.

2. Делекторская В.В., Чемерис Г.Ю., Кононец П.В., Григорчук А.Ю., Давыдов М.И. Экспрессия и клиническая значимость молекул межклеточной адгезии в опухолях больных плоскоклеточным раком пищевода. // Тезисы докладов в материалах VII Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность". (Москва, 28-29 октября 2010 г.). - М. - 2010. - с. 71-72.

3. Делекторская В.В., Чемерис Г.Ю., Кононец П.В., Григорчук А.Ю. Иммуногистохимическое исследование экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста при плоскоклеточном раке пищевода. // Архив патологии. - 2010. - Том 72, N 5. - с. 3-6.

4. Delektorskaya V.V., Chemeris G.Yu., Kononec P.V., Grigorchuk A.Yu. Expression and clinical significance of cyclin D1 in esophageal squamous cell carcinoma. // Abstract of the 21st International Congress on Anti-Cancer Treatment by ESMO (Paris, France 1-5 Feb, 2010). - Paris. - 2010,- p. 243-244 (P - IC/AB760).

5. Делекторская B.B., Чемерис Г.Ю., Кононец П.В., Григорчук А.Ю. Клиническое значение экспрессии молекул межклеточной адгезии в опухолях больных плоскоклеточным раком пищевода. // Тезисы докладов в материалах научно-практической конференции «Лабораторная наука -практике: первое десятилетие XXI века». (Москва, 27-30 октября 2010 г.). -Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - №. 9. - с. 26-27.

6. Делекторская В.В., Чемерис Г.Ю., Завалишина Л.Э., Рязанцева А.А., Кононец П.В., Григорчук А.Ю., Давыдов М.И. Клиническое значение определения статуса рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR и HER-2) при плоскоклеточном раке пищевода // Тезисы докладов в материалах XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 12-16 апреля 2010г.). - М. - 2010. - с.602.

7. Delektorskaya V.V., Chemeris G.Yu., Kononec P.V., Grigorchuk A.Yu. Expression of epidermal growth factor receptors (EGFR and HER-2) in esophageal squamous cell carcinoma. // Abstracts of the 22nd European Congress of Pathology (Florence, Italy 4-9 September 2009). - Virchows Archiv. - 2009. -Vol. 455, Suppl. 1.-S137. (P- 1.123).

8. Delektorskaya V.V.,Chemeris G.Yu., Grigorchuk A.Yu., Kononec P.V., Clinical significance of the epidermal growth factor receptors (EGFR and HER-2) overexpression in esophageal squamous cell cancer. // Abstracts of the EORTC-NCI-ASCO Annual Meeting on "Molecular Markers in Cancer" (15 - 17 October 2009, Brussels, Belgium). - Brussels. - 2009. - P 20.

9. Делекторская B.B., Чемерис Г.Ю., Кононец П.В., Григорчук А.Ю. Клиническая значимость гиперэкспрессии рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR и HER-2) при плоскоклеточном раке пищевода. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Том 147, N 8 -

с. 213-218.

Подписано в печать о 7. о 2.11 Формат 60x84/16. Бумага офисная «5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 172 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Рак пищевода относится к высокозлокачественным опухолям и характеризуется ранним лимфогенным метастазированием. Пятилетняя выживаемость после радикального хирургического лечения рака пищевода по данным различных авторов не превышает 40% [Мамонтов А. С., 1986; Berrino F., 1995; Altorki N., 2001; Hulscher J. В., 2001; Medical Research Council Oesophageal Cancer Working Group, 2002; Стилиди И. С., 2003; Boyle P., 2008; Stahl M., 2009; Давыдов М. И., 2009], а в подгруппе больных с наличием пораженных лимфоузлов пятилетняя выживаемость составляет менее 25% [Ide Н.; Мамонтов А. С., 1986; Berrino F., 1995; Стилиди И. С., 2003; Boyle Р., 2008; Stahl М., 2009; Давыдов М. И., 2009]. Неудовлетворительные показатели выживаемости и перспективы применения таргетной терапии диктуют необходимость исследования молекулярно-биологических особенностей, рака пищевода с целью усовершенствования лечебной- тактики и поиска новых терапевтических мишеней.

Известно, что в подгруппах радикально оперированных больных раком пищевода со сходными клинико-морфологическими особенностями наблюдается значительный разброс индивидуальных показателей выживаемости, что ограничивает возможности применения существующих клинико-морфологических классификаций для индивидуального прогнозирования отдаленных результатов лечения. Это хорошо демонстрирует исследование, включающее нескольких тысяч больных из 13 стран мира (3 континента - Северная Америка, Европа, Азия), прошедших радикальное хирургическое лечение (эзофагэктомию). Кривые выживаемости этих .больных были стратифицированы с использованием всех значимых клинико-морфологических показателей. Исследование было проведено специально созданной в 2006 году Международной Группой Сотрудничества по изучению Рака Пищевода (Worldwide Esophageal Cancer Collaboration), a данные представлены в руководстве AJCC 7-го издания [Edge S. В., 2009]. Подбор оптимального способа стратификации больных и отбор значимых клинико-морфологических показателей производился с помощью современного много факторного анализа, который был нацелен на максимальную эффективность предсказания выживаемости для будущих пациентов. Результаты этой стратификации легли в основу разделения на прогностические стадии рака пищевода в последней, седьмой, редакции международной TNM-классификации UICC, изданной в декабре 2009 года.

Время, лет

Рисунок 1. Выживаемость больных ПРП в зависимости от стадии TNM7-классификации по данным международного мультицентрового исследования [Edge S. В., 2009].

Как видно из графиков выживаемости, даже при таком разделении, продолжительность жизни больных в каждой подгруппе варьирует в очень широких пределах. Так, например, при lIIA-стадии более половины больных погибает в течение первых 2х лет после радикальной операции, в то время, как другие больные (около 25%) живут более 5 лет (рис. 1). В связи с этим, для увеличения точности индивидуального прогнозирования на базе данной классификации требуется разработка и изучение дополнительных факторов уточняющих прогноз.

На основании проведенного анализа Международной Группой Сотрудничества по изучению рака пищевода выделены следующие, прогностически значимые, клинико-морфологические показатели: Т-, N-, М-стадия, степень дифференцировки и уровень поражения пищевода. Использование их в совокупности позволяет наиболее точно и оптимально прогнозировать течение рака пищевода, основываясь на клинико-морфологических данных [Edge S. В., 2009]. Вместе с тем, оценка значимости молекулярных факторов для повышения точности прогнозирования на основе TNM стадирования продолжает оставаться предметом многих современных исследований [Rice Т. W., 2009; Rice Т. W., 2010]. Особую ценность представляет выявление молекулярных факторов, вносящих дополнительный, независимый вклад в повышение точности прогноза ПРП при использовании совместно с уже применяемыми клинико-морфологическими показателями.

Так, для пациентов, которым планируется только хирургическое лечение, выявление неблагоприятных прогностических маркеров, сопряженных с высоким риском послеоперационного прогрессирования, может способствовать пересмотру тактики лечения в пользу проведения неоадьювантной и/или адьювантной терапии, в том числе, с применением таргетных препаратов. Кроме того, молекулярные маркеры могут оказаться полезными для предсказания ответа на химио- и лучевую терапию перед началом лечения, что имеет большое значение, поскольку только в подгруппе больных ПРП с ответом на неоадьювантную терапию отмечается улучшение показателей выживаемости [Law S., 2009].

В настоящее время открыто множество молекулярных факторов, связанных с развитием и прогрессированием злокачественных опухолей, и активно изучаются молекулярные механизмы, лежащие в основе этих процессов. Однако особый интерес представляет изучение молекулярных показателей, которые могли бы быть полезными для клинического применения. В этом отношении наиболее перспективным является ряд мембранных факторов, участвующих в передаче и активации в клетке митогенных сигналов (EGFR, HER-2), а также в регуляции межклеточной и клеточно-матриксной адгезии (E-Cad, b-Cat, CD44). Нарушение нормального функционирования этих молекул в клетках различных новообразований человека обуславливает процессы опухолевой прогрессии и метастазирования.

Показано, что патологическая активация рецепторов эпидермального фактора роста может способствовать усиленной или неконтролируемой пролиферации клеток опухоли, увеличению их подвижности, снижению апоптоза и стимуляции ангиогенеза [Hynes N. Е., 1994; Prenzel N., 2001; Linggi В., 2006]. Перечисленные свойства предопределяют повышенный интерес к исследованию их клинического значения [Mandard А. М., 2000; Metzger R., 2004]. Вместе с тем, особенности экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста при ПРП остаются недостаточно изученными, а данные опубликованных исследований крайне противоречивы [Hardwick R. H., 1997; Lam К. Y., 1998; Friess H., 1999; Wang L. S., 1999; Akamatsu M., 2003; Gibault L., 2005; Mimura K., 2005; Sunpaweravong P., 2005; Dreilich M., 2006; Reichelt U., 2007; Sato-Kuwabara Y., 2009; Kaneko K., 2010].

Особого внимания заслуживают молекулярные факторы клеточной адгезии, такие как E-Cad, b-Cat и CD44. Многочисленные экспериментальные данные подтвердили важную роль этих факторов в процессах инвазии и метастазирования раковых опухолей [Seiter S., 1993; Sneath R. J., 1998; Naor D., 2002; Bourguignon L. Y., 2007; Herzig M., 2007; Napier S. L., 2007; Braun К. M., 2008; Nelson W. J., 2008]. В то же время, лишь небольшое количество исследований посвящено изучению клинического значения абберантной экспрессии молекулярных факторов адгезии при ПРП.

Таким образом, при плоскоклеточном раке пищевода многие больные даже после радикального хирургического лечения погибают в течение 1-2-лет от диссеминации опухолевого процесса. Вопрос выявления этой подгруппы больных до-начала лечения до сих пор не решен. Прогнозирование раннего прогрессирования у отдельно взятого больного раком пищевода на основании оценки молекулярно-биологических особенностей опухоли будет способствовать выбору наиболее адекватной лечебной тактики и улучшению результатов терапии. Однако полученных данных пока недостаточно для практического применения новых подходов к прогнозированию течения заболевания, что определяет актуальность дальнейшего исследования клинического значения молекулярно-биологических маркеров при ПРП. Кроме того, данные подобных исследований могут оказаться полезными при разработке методов «таргетной» терапии больных ПРП.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Усовершенствование индивидуального прогнозирования результатов хирургического лечения плоскоклеточного рака пищевода с учетом клинико-морфологических и молекулярно-биологических особенностей опухоли.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить прогностическое значение основных клинических и морфологических параметров опухолей в исследуемой группе больных ПРП с учетом 6 и 7 редакций ТЫМ-классификации. Сравнить прогностическую точность 6 и 7 редакций ТЫМ-классификации.

2. Оценить частоту выявления и уровень ИГХ экспрессии молекулярно-биологических факторов адгезии (Е-кадгерина, р-катенина и С044у6), а также рецепторов эпидермального фактора роста 1 и 2 типа (ЕОРЯ и НЕЯ-2) в опухолях больных ПРП.

3. Исследовать взаимосвязь между уровнями экспрессии молекулярно-биологических факторов в опухоли и клинико-морфологическими характеристиками ПРП.

4. Определить прогностическую значимость содержания молекулярно-биологических маркеров в опухолях больных ПРП.

5. Провести многофакторный анализ значимости изучаемых молекулярно-биологических факторов в индивидуальном прогнозировании течения заболевания с учетом традиционных клинико-морфологических критериев прогноза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые при плоскоклеточном раке пищевода проведена комплексная оценка особенностей экспрессии таких молекулярных факторов, как ЕвРК, НЕЫ-2, СБ44, Е-кадгерина, бета-катенина и многофакторный анализ их прогностического значения с учетом традиционных клинико-морфологических характеристик, а также 6 и 7 редакций ТЪГМ-классификации данного заболевания. Показана четкая

I связь экспрессии ряда белков с прогнозом больных ПРП. Разработана оригинальная прогностическая модель, предсказывающая течение заболевания после радикального хирургического лечения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Исследованные молекулярные маркеры могут применяться для уточнения прогноза течения заболевания у больных плоскоклеточным раком пищевода в дополнение к ПЧМ-стадированию и для определения индивидуальной лечебной тактики на этапе планирования первичного лечения или после хирургического лечения. Выделенный кадгерин-катениновый фактор, основанный на уровнях экспрессии Е-кадгерина и бета-катенина, позволяет выделить группу больных с неблагоприятным прогнозом, которым может быть рекомендовано проведение дополнительного лечения.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ. Основные положения работы доложены на XVII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 12-16 апреля 2010г.) и на VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 28-29 октября 2010г.).

Выводы

1. Клинико-морфологический анализ данных, полученных при исследовании опухолей больных плоскоклеточным раком пищевода, подтвердил статистическую значимость связи с прогнозом заболевания критериев ПЧМ-классификации (6 и 7 редакции) (р<0.001), а также наличия инвазии кровеносных и лимфатических сосудов (р<0.001 и р=0.02, соответственно).

2. Однофакторный математический анализ показал достоверную связь экспрессии молекул межклеточной адгезии в опухолях больных плоскоклеточным раком пищевода с лимфогенным метастазированием (редукция мембранной экспрессии Е-кадгерина, р=0.013), инвазией лимфатических и кровеносных сосудов (наличие цитоплазматической экспрессии Е-кадгерина, р=0.004 и повышенная мембранно-цитоплазматическая экспрессия СБ44у6, р=0.001, соответственно), более поздней стадией заболевания (редукция мембранной экспрессии Е-кадгерина, р=0.006 и повышенная мембранно-цитоплазматическая экспрессия СЭ44у6, рЮ.011, соответственно).

3. С худшим прогнозом- заболевания статистически значимо были связаны редукция в клетках опухоли мембранной экспрессии Е-кадгерина (р=0.0001), высокий цитоплазматический уровень экспрессии 13-катенина (р=0.0049), повышенная мембранно-цитоплазматическая экспрессия СП44у6 (р=0.006).

4. Достоверной связи с прогнозом плоскоклеточного рака пищевода экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста 1 и 2 типов (ЕСРЛ и НЕЯ-2), а также наличия цитоплазматического Е-кадгерина в клетках опухоли не выявлено.

5. Многофакторный анализ комплекса клинико-морфологических признаков с учетом экспрессии молекулярно-биологических маркеров выявил достоверное и независимое от критериев ТЫМ-стадирования прогностическое значение мембранного Е-кадгерина, цитоплазматического В-катенина и мембранно-цитоплазматического СБ44у6.

6. На основании наличия в опухолях согласованных изменений экспрессии Е-кадгерина и 6-катенина выделен общий кадгерин-катениновый фактор, проявляющий независимую и наиболее высокую прогностическую значимость с учетом рТТЧМ критериев; данный фактор позволял стратифицировать прогноз заболевания в группах больных плоскоклеточным раком пищевода при наличии и отсутствии метастазов в регионарных лимфатических узлах.

7. Выделенные молекулярно-биологические маркеры могут быть использованы в качестве дополнения к ТИМ-классификации для более точной оценки индивидуального прогноза течения плоскоклеточного рака пищевода.

Практические рекомендации

1. Первичным больным со II-III стадиями (TNM6 и TNM7) ПРП рекомендуется определять уровни экспрессии Е-кадгерина и ß-катенина на материале биопсии (при ЭГДС) с целью уточнения индивидуального прогноза (согласно значению предложенного нами кадгерин-катенинового фактора) и лечебной тактики на этапе планирования хирургического лечения. В случае неблагоприятного значения кадгерин-катенинового фактора, целесообразно рассмотрение вопроса о проведения неоадьювантной противоопухолевой терапии таким больным.

2. В случае отсутствия предоперационного исследования уровней Е-кадгерина и ß-катенина у радикально оперированных больных ПРП со II-III стадиями (TNM6 и TNM7), рекомендуется определять экспрессию этих маркеров в удаленной опухоли для уточнения индивидуального прогноза и лечебной тактики. При неблагоприятном значении кадгерин-катенинового фактора необходимо рассмотривать вопрос о проведении дополнительной противоопухолевой терапии таким больным.