Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Молекулярная диагностика и интенсификация химиотерапии прогностически неблагоприятных форм саркомы Юинга у детей

\

ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ И МЕДИЦИНСКОЙ РАДИОЛОГИИ им. H.H. АЛЕКСАНДРОВА»

УДК: 616.71 - 006.3 04(476)

КИСЕЛЕВ Леонид Петрович

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА И ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ХИМИОТЕРАПИИ ПРОГНОСТИЧЕСКИ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФОРМ САРКОМЫ ЮИНГА У ДЕТЕЙ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

по специальности 14.00.14 - онкология

□ОЗ 17Ыэо г

Минск, 2007

003176587

Работа выполнена в Государственном учреждении «Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии»

Алейникова Ольга Витальевна, доктор медицинских наук, профессор, директор Государственного учреждения «Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии»

Жаврид Эдвард Антонович, доктор медицинских наук, профессор, первый заместитель директора Государственного учреждения «Научно-исследовательский институт онкологии и медицинской радиологии им Н Н Александрова»

Потапнев Михаил Петрович, доктор медицинских наук, профессор, директор Государственного учреждения «Научно-практический центр гематологии и трансфузиологии»

Оппонирующая организация: Учреждение образования

«Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»

Защита состоится «12» декабря 2007 г в 14 час на заседании совета по защите диссертаций Д 03 12 01 при ГУ «Научно-исследовательский институт онкологии и медицинской радиологии им Н Н Александрова» (223040 Минский р-н, п/о Лесной-2, E-mail NArtemova@omr med by. тел 287-95-61)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Научно-исследовательский институт онкологии и медицинской радиологии им Н Н Александрова»

Автореферат разослан « ноября 2007 г

Ученый секретарь совета по защите диссертаций кандидат медицинских наук, доцент

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

С05 Артемова Н А

ВВЕДЕНИЕ

Среди актуальных проблем онкологии, требующих глубокого изучения, одно из важнейших мест принадлежит опухолям костной системы Саркома Юинга (СЮ) является одной из наиболее часто встречающихся первичных опухолей костей неостеогенного генеза [Алейникова О В, 2004] Заболеваемость данной патологией в Республике Беларусь составляет 0,31 на 100 тысяч детского населения [Петрович С В и др, 2004] Современные методы морфологической, иммуногистохимической, цитогенетической и молекулярно-биологической диагностики позволили включить в группу опухолей семейства СЮ опухоль Аскина, периферическую примитивную нейроэктодермальную опухоль (ПНЭО) и эстезионейробластому

Наиболее часто встречаемыми (95-99%) при данных заболеваниях генетическими поломками являются химерные онкогены EWS/FLI1 (соответствует транслокации t(l I,22)(q24,ql2)) и EWS/ERG (соответствует транслокации t(21,22)(q22,ql2)) Высокая чувствительность метода полимеразой цепной реакции (ПЦР), используемого для определения онкогенов EWS/ERG и EWS/FLI1 в материале ткани патологического очага, костном мозге и периферической крови помимо усиления инициальной диагностики позволяет применять данный метод для мониторинга ответа опухоли на лечение, а так же для определения минимальной резидуальной болезни [BurchillS et al, 2003]

Сообщения о прогностически неблагоприятной роли химерного гена EWS/ERG по сравнению с EWS/FLI1, наряду с результатами исследований, свидетельствующих об отсутствии влияния генотипа опухоли на выживаемость, делают весьма актуальным исследование, направленное на оценку клинического исхода в зависимости от вида онкогена у пациентов с СЮ/ПНЭО [Shalini et al, 2002]

Для пациентов группы высокого риска (больные с нерезектабельными опухолями осевого скелета (череп, позвоночник, кости таза), пациенты с другими локализациями опухоли, не подлежащими радикальному хирургическому удалению, больные с большим объемом опухолевой массы (>150 см3) на момент постановки диагноза, пациенты с генерализованной формой заболевания) пятилетняя выживаемость составляет лишь 13-18% Для повышения выживаемости указанной группы больных используется несколько направлений увеличение радикальности удаления опухоли с использованием эндогенных трансплантатов, применение биотерапии интерлейкином-2 (ИЛ-2), интенсификация индукционной фазы лечения Однако наиболее перспективным вариантом зарекомендовала себя высокодозная

полихимиотерапия (ВПХТ) с поддержкой периферической стволовой клеткой (ПСК) [Burdach S et al, 2003]

Таким образом, использование молекулярно-биологических методов для диагностики и мониторинга специфических генетических поломок при опухолях семейства СЮ/ПНЭО, а так же разработка интенсивных химиотерапевтических программ лечения и биотерапия прогностически неблагоприятных форм заболевания являются актуальной задачей современной детской онкологии

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Связь с крупными научными программами и темами

Работа выполнена в рамках задания Государственной научно-технической программы "Лечебные и диагностические технологии", подпрограммы "Онкология" Наименование задания № 03 10 «Разработать и внедрить новый протокол диагностики и лечения группы высокого риска саркомы Юинга/ПНЭО у детей и взрослых трудоспособного возраста с использованием интенсивной химиотерапии, высокодозной химиотерапией с аутотрансплантацией периферических стволовых клеток и биотерапией интерлейкином-2 » № Гос регистрации 20062964 Дата регистрации 06 07 2006 Время выполнения 01 01 2006 - 31 12 2008

Тема диссертации соответствует приоритетному направлению научных исследований в области онкологии - поиску новых высокоэффективных методов диагностики и лечения злокачественных новообразований

Цель и задачи исследования

Цель исследования - повысить качество диагностики и увеличить долгосрочные показатели выживаемости детей с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО

Для достижения поставленной цели решаются следующие задачи

1 Определить значение метода ПЦР в диагностической схеме у детей с опухолями семейства СЮ/ПНЭО

2 Оценить влияние вида альтернативных химерных онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG на показатели выживаемости

3 Проанализировать результаты терапии в зависимости от наличия интенсификации химиотерапии в индукционной фазе и проведения высокодозной консолидирующей полихимиотерапии с поддержкой периферической стволовой клеткой

4 Изучить течение и осложнения индуктивной полихимиотерапии и высокодозной консолидирующей терапии с поддержкой ПСК

5 Выявить влияние биотерапии интерлейкином-2 на динамику показателей противоопухолевого иммуннитета и безрецидивную выживаемость детей с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО после проведения ВПХТ с аутотрансплантацией ПСК на этапе консолидации

Объектом исследования послужили больные дети с распространенными и метастатическими формами опухолей семейства СЮ/ПНЭО Все дети находились на лечении в детском отделении ГУ «Научно-исследовательский институт онкологии и медицинской радиологии им НН Александрова» и в Республиканском научно-практическом центре детской онкологии и гематологии в период с января 1989 г по январь 2006 г

В соответствии с критериями включения больных в протокол, для исследования отбирались пациенты с гистологически верифицированным диагнозом опухоли семейства СЮ/ПНЭО с нерезектабельными опухолями осевого скелета (череп, позвоночник, кости таза), пациенты с другими локализациями опухоли, не подлежащими радикальному хирургическому удалению, больные с большим объемом опухолевой массы (>150 см3) При исследовании эффективности и целесообразности использования метода полимеразной цепной реакции в диагностической схеме объектом исследования были дети с подозрением на опухоль семейства саркомы Юинга

Предметом исследования были непосредственные (объективный эффект лечения, частота и выраженность токсических эффектов лечения) и отдаленные (безрецидивная и бессобытийная выживаемость) результаты комбинированного лечения больных данной категории При оценке результатов лечения учитывались стандарты ВОЗ и рекомендации Европейского общества детских онкологов

Положения, выносимые на защиту

1 Использование метода ПЦР для определения специфических для СЮ/ПНЭО онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG позволяет повысить качество и сократить сроки постановки диагноза опухолей семейства СЮ/ПНЕО и является необходимым компонентом диагностической схемы, как для выбора адекватного варианта терапии, так и для контроля опухолевого процесса во время лечения

2 Вид специфических для СЮ/ПНЭО альтернативных химерных онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG не оказывает достоверного влияния на исход основного заболевания

3 Интенсификация лечения, включающего высокодозную полихимиотерапию с аутотрансплантацией ПСК, позволяет достоверно (Р<0,02) увеличить выживаемость пациентов с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО детского возраста

4 Использование интерлейкина-2 после проведения ВПХТ с аутотрансплантацией ПСК на этапе консолидации не оказывает значимого влияния на показатели иммунитета и безрецидивную выживаемость больных с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО

Личный вклад соискателя

Участие автора в выполнении диссертационной работы состояло в следующем

• обоснование темы исследования, составление исследовательских протоколов

• обоснование применения метода полимеразной цепной реакции при постановке диагноза опухоли семейства саркомы Юинга

• обоснование применения интенсификации полихимиотерапии, а также биотерапии интерлейкином - 2 у детей с прогностически неблагоприятными формами опухолей семейства саркомы Юинга

• курация и непосредственное ведение тематических больных

• формирование базы данных, статистическая обработка и анализ полученных результатов

Я искренне благодарен и глубоко признателен за научную и консультативную помощь и поддержку научному руководителю д м н, профессору О В Алейниковой

Апробация результатов диссертации

Материалы диссертации доложены на III Съезде онкологов и радиологов СНГ, г Минск, 25-28 мая 2004 г, Республиканском съезде врачей лучевой диагностики, г Гомель, 3-4 ноября 2005 г, IV Съезде онкологов и радиологов СНГ, г Баку, 29-30 сентября 2006 г, 5-ом симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний», г Москва, 9-10 февраля 2007 г

Опубликованность результатов диссертации

Основное содержание диссершции изложено в 12 печатных работах, в том числе в 6 статьях объемом 2,6 авторских листа, 2 - в сборниках научных трудов, 4 - в тезисах докладов

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 86 страницах, содержит 20 иллюстраций и 16 таблиц Включает введение, общую характеристику работы, обзор литературы, 2 главы собственных исследований, заключение, 4 приложения, количество использованных библиографических источников 176 20 - русскоязычных, 144 - англоязычных, 12 - собственные публикации

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Материалы и методы исследования

Работа основана на изучении ближайших и отдаленных результатов комплексного лечения 69 больных детей с прогностически неблагоприятными формами опухолей семейства СЮ/ПНЭО за период с 1 01 89 по 1 01 06 годы включительно

Критерии включения в протокол исследования возраст до 19 лет, цитоморфологическая верификация гистоструктуры опухоли, отсутствие сопутствующей соматической патологии в стадии декомпенсации

Для пациентов с СЮ/ПНЭО, включенных в исследование, определены следующие критерии высокого риска

1 Наличие отдаленных метастазов, метастазов в региональные лимфатические узлы

2 Локализация опухоли в костях таза или местах, где невозможно в дальнейшем выполнить радикальную операцию

3 Объем первичного опухолевого очага более 150 см3, наличие патологического перелома в месте первичного расположения опухоли или прорастание опухолью магистральных сосудов

В исследование не включены пациенты СЮ/ПНЭО с локальными формами, не подпадающие под критерии группы высокого риска

Для оценки непосредственного эффекта терапии определены следующие критерии

• Полный эффект (ПЭ) устанавливался лишь после тотальной резекции опухолевого очага, морфологически подтвержденном лечебном патоморфозе опухоли 4 степени (т е при отсутствии жизнеспособной опухолевой ткани) и отсутствии отдаленных метастазов Отсутствие в материале открытой биопсии (или в материале трепанбиоптата) опухолевых клеток не гарантировало их отсутствие во всем объеме опухолевых масс, а лишь свидетельствует о выраженном клиническом эффекте

• Выраженный клинический эффект (ВЧЭ) регрессия опухоли более 90%, исчезновение всех внекостных опухолевых очагов (легкие, костный мозг и т д), рентгенологически положительная динамика в виде исчезновения мягкотканного компонента опухоли, уменьшение очагов деструкции в кости

• Частичный клинический эффект (ЧЭ) редукция более 50% опухолевой массы по сравнению с первоначально диагносцированными размерами продолжительностью не менее 2 недель при отсутствии новых опухолевых очагов

• Стабилизация заболевания (СЗ) редукция менее 50% или увеличение менее 25% от первоначальных размеров опухоли для всех известных очагов

• Прогрессия заболевания (ПЗ) увеличение более 25% от первоначальных размеров опухоли или появление новых метастазов

При исследовании эффективности и целесообразности использования метода ПЦР в диагностической схеме объектом изучения был 71 ребенок с подозрением на СЮ/ПНЭО

При определении хромосомной транслокации t(ll,22)(q24,q22) (онкоген EWS/FLI1) и хромосомной транслокации t(21,22)(q22,ql2) EWS/ERG (онкоген EWS/ERG) выделенную из образцов тотальную РНК в количестве 1-4 мкг обратно транскрибировали в кДНК с помощью рэндом гексамеров и фермента обратной транскриптазы (Promega, США) Полученную кДНК (4 мкя) подвергали специфической 2-шаговой амплификации на аппарате Thermocycler ТЗ Combiblock (Biometra, Германия) После проведения амплификации 10 мкл продуктов ПЦР подвергали электрофорезу в 2,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидиумом Наличие химерных генов оценивали по присутствию продуктов амплификации специфического размера Время от предоставления гистологического образца до получения результата составляло 36 часов, при экстренном режиме исследования - 24 часа

Определение иммунологического статуса проводили в клинико-диагностической лаборатории ГУ РНПЦ ДОГ (группа иммунологии) Субпопуляционный состав лимфоцитов (CD3+, CD3+CD25+, CD3+HLA-DR+, CD 16+56+, CD16+CD56+CD3+) определяли методом проточной цитометрии на аппарате FACScan (Becton Dickinson, США), используя моноклональные антитела той же фирмы по методикам, описанным в прилагаемых инструкциях Абсолютное содержание Т-, В- и NK-клеток рассчитывали с учетом содержания лейкоцитов и процента лимфоцитов в общем анализе крови

Компьютерная обработка полученных количественных данных проводилась с использованием статистической программы «STATISTICA 6 0» Во всех совокупностях использовался метод вариационной статистики и корреляционного анализа с изучением основных статистических показателей М - средней арифметической величины, ±т - ошибки средней арифметической величины Оценка статистической достоверности различий между сравниваемыми показателями проводилась по критерию Стьюдента (t) Сравнение в группах по индивидуальным параметрам проводилось с помощью %2 теста, в немногочисленных группах - U тестом Манна-Уитни, Уилкоксона Различие считалось достоверным при степени безошибочного прогноза, равной 95% (Р<0,05) Количественная оценка связи между оцениваемыми показателями определялась посредством коэффициента корреляции г

Для оценки выживаемости пациентов использовалась методика KaplanMeier Сравнительный анализ кривых выживаемости проводился с использованием log-rank теста Значение Р<0,05 считалось достоверными В

качестве основных показателей эффективности терапии использовалась оценка клинического эффекта, бессобытийная выживаемость (БСВ) - период от начала терапии до статистически значимого события и безрецидивная заболеваемость (БРВ) - период от начала терапии до констатации наличия/отсутствия рецидива заболевания

При оценке результатов лечения учитывались стандарты ВОЗ, рекомендации Европейского общества детских онкологов Отдаленные результаты лечения больных с СЮ/ПНЭО анализировались на основании сведений, предоставленных Белорусским детским суб-канцеррегистром

Результаты исследования

Оценка эффективности использования методов молекулярно -биологической диагностики у пациентов с СЮ/ПНЭО. Из 71 пациента, у которых был проведен поиск специфических онкогенов методом ПЦР, на инициальном этапе диагноз СЮ/ПНЭО был исключен у 19 больных с костной патологией (26,7%) Обязательным критерием исключения опухоли семейства СЮ/ПНЭО было отсутствие онкогенов EWS/FLI1 или EWS/ERG в ткани патологического очага Впоследствии, у этих 19 больных, после получения гистологического заключения 10 пациентам был выставлен диагноз остеосаркомы, по 1 случаю остеобластокластомы и гистиоцитоза из клеток Лангерганса, у 7 пациентов обнаружены воспалительные изменения и исключено онкологическое заболевание

У 41 пациента вследствие обнаружения в любой из исследуемых сред онкогенов EWS/FLI1 или EWS/ERG был поставлен диагноз СЮ/ПНЭО Диагноз во всех случаях был подтвержден гистологическими, иммуногистохимическими и клинико-лабораторными методами диагностики

Данные о клинической значимости ПЦР - диагностики онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG представлены на рисунке 1

Как видно из рисунка 1, у 4 пациентов (7,6%) по результатам определения онкогенов методом ПЦР при первичной диагностике была изменена тактика ведениия

• 1 больному (1,9%) вместо первоначального диагноза остеосаркомы была выставлена опухоль семейства СЮ/ПНЭО (в материале опухоли, обнаружен онкоген EWS/FLI1)

• 1 пациенту (1,9%) направительный диагноз саркомы Юинга был исключен и выставлена рабдомиосаркома (При наличии атипичных клеток не выявлены специфические онкогены EWS/FLI1 или EWS/ERG в костном мозге)

• 2 пациентам с саркомой Юинга (3,8%) вторая стадия заболевания была изменена на четвертую в результате положительной ПЦР в биоптате костного мозга (при отсутствии морфологических данных за его поражение)

N=52

■ Онкогенов не выявлено (исследовался только КМ и ПК) В Диагноз изменен El Стадия изменена Ш Ранняя диагностика

О СЮ/ПНЭО доказана всеми методами диагностики

Рисунок 1 - Клиническая значимость ПЦР -диагностики онкогенов EWS/FLU и

EWS/ERG

У 10 пациентов (19,0%) с СЮ/ПНЭО при исследовании только ПК и КМ специфических онкогенов обнаружено не было, что совпадало с морфологическим заключением об отсутствии опухолевого поражения указанных выше тканей на данном этапе диагностики; 32 больным (62%) диагноз СЮ/ПНЭО доказан с использованием всех методов диагностики (при ПЦР в одной и более из исследуемых сред найден онкоген EWS/FLI1 или EWS/ERG); 6 пациентам (11,4%), у которых при первичной биопсии отсутствовало достаточное количество материала для гистологического исследования, обнаружение онкогенов EWS/FLI1 и/или EWS/ERG в биоптате опухоли позволило немедленно начать терапию, не дожидаясь результатов повторной биопсии.

При исследовании пораженной ткани легкого и плевральной жидкости у больных с СЮ/ПНЭО на фоне химиотерапии у 1 пациента отсутствие химерных генов в исследуемом материале позволило доказать неопухолевую природу изменений (позднее на основании данных морфологического и иммунологического исследования был поставлен диагноз аспергиллеза легкого), у 1 больного был обнаружен химерный ген EWS/FLI1 в биоптате ткани патологического очага легкого и констатирована прогрессия основного заболевания. При ПЦР-исследовании ткани лимфатического узла патологических химерных генов найдено не было, что позволило исключить опухолевое поражение региональных лимфатических узлов у данного пациента.

Можно утверждать, что определение онкогенов t(l I;22)(q24;ql2) EWS/FLI1 и t(21;22)(q22;ql2) EWS/ERG методом ПЦР у педиатрических

пациентов с СЮ/ПНЭО имеет несомненную клиническую значимость для диагностики опухолевого процесса на всех этапах ведения пациента Верификация диагноза опухоли семейства саркомы Юинга должна осуществляться с использованием молекулярной диагностики в качестве обязательного компонента

Оценка влияния вида онкогена на клинический исход у пациентов с СЮ/ПНЭО. Из 40 включенных в исследование пациентов с СЮ/ПНЭО, у которых онкоген EWS/FLI1 или EWS/ERG был обнаружен в одной и более из исследуемых сред, нами были выделены структурные группы в зависимости от вида онкогена и наличия (группа высокого риска раннего рецидивирования процесса) или отсутствия (группа стандартного риска) у больных прогностически неблагоприятных форм заболевания

У пациентов с СЮ/ПНЭО частота встречаемости онкогена EWS/FLI1 (t(l I,22)(q24,ql2)) составила 75% (30 из 40 пациентов), химерного гена EWS/ERG (t(21,22)(q22,ql2)) - 25% (10 из 40 пациентов) Такое же соотношение имело место в группах стандартного (4 из 16 больных) и высокого риска (6 из 24 пациентов)

С целью оценки прогностической значимости нами была проанализирована выживаемость пациентов с диагнозом СЮ/ПНЭО в зависимости от вида обнаруженного онкогена Пятилетняя (4,25 года для группы стандартного риска) безрецидивная (БРВ) и бессобытийная выживаемость (БСВ) оценивалась как в общей когорте пациентов, так и в структурных группах (таблица 1)

Как видно из данных, представленных в таблице 1, отмечена тенденция к снижению показателей как безрецидивной так и бессобытийной выживаемости у пациентов с EWS/ERG онкогеном во всех сравниваемых группах, однако разница в выживаемости не была статистически значимой

Таблица 1 - Выживаемость пациентов детского возраста с СЮ/ПНЭО в зависимости от вида онкогена

Группа пациенов Вид онкогена N* БРВ, % P БСВ, % P

Высокий риск EWS/FLI1 18 63 0,61 51 0,57

EWS/ERG 6 33 33

Стандартный риск EWS/FLI1 12 67 0,51 67 0,51

EWS/ERG 4 38 38

Общая когорта EWS/FLI1 30 62 0,57 55 0,75

EWS/ERG 10 37 37

*N - число случаев в представленных группах

Таким образом, при анализе долгосрочных показателей выживаемости, нами не получено убедительных данных за значимое влияние вида онкогена на клинический исход у детей с опухолями семейства СЮ/ПНЭО

Оценка эффективности интенсификации химиотерапии в индукционной фазе и проведения высокодозной полихимиотерапии с поддержкой периферической стволовой клеткой в фазе консолидации. Для объективизации оценки роли интенсификации химиотерапии с использованием ВПХТ больные с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО разделены на 2 группы Пациентам 1 (основной группы), начиная с октября 1999 года проводилось лечение согласно протоколу ММСЮ-99 (Минск-Москва-саркома Юинга-99), который является кооперативным исследованием Республиканского научно-практического центра детской онкологии и гематологии г Минск (директор профессор Алейникова О В) и научно-исследовательского института детской онкологии г Москва (директор академик РАМН, профессор Алиев М Д), Российского онкологического научного центра им Блохина (директор академик РАН и РАМН, профессор Давыдов МИ) с использованием интенсификации индукционной полихимиотерапии, консолидации высокодозной химиотерапией с аутотрансплантацией ПСК и иммуномодулирующей терапией ИЛ-2 Пациентам 2 (контрольной группы) проводилось лечение по протоколу стандартной терапии СЕ88-86/Е1СЕ8Б-92 с января 1989 по октябрь 1999 года Распределение больных основной и контрольной групп по полу, возрасту, гистоструктуре и распространенности процесса приведены в таблице 2

Таблица 2 - Клиническая характеристика

пациентов основной и контрольной групп

Показатель Основная группа п=34 Контрольная группа п=35 Р

абс % абс %

Мальчики / девочки 16/18 47,0/53,0 12/23 34,3/65,7 0,28

Средний возраст, годы 12,6 -/- 11,7 -/- 0,14

Медиана, лет 13,7 -/- 13,9 -/- -/-

СЮ/ПНЭО 26/8 76,5/23,5 31/4 88,5/11,5 0,18

Локальные централыюрасположенные формы 7 20,5 9 25,7 0,61

Локальные формы конечностей 3 8,8 17 48,6 0,0003

Метастатические формы 24 70,7 9 25,7 0,0003

Данные, представленные в таблице 2, позволяют сделать вывод о сопоставимости групп, преобладание больных с локальными

центральнорасположенными и метастатическими формами в основной группе по сравнению с контрольной можно объяснить повышением качества диагностики, в том числе, благодаря использованию метода ПЦР

Среди вышедших в длительную ремиссию (срок наблюдения 82,4+23,7 месяца, от 39 до 133 месяцев) пациентов контрольной группы представлены только больные с неметастатическими формами процесса, поскольку лечение пациентов, имевших генерализованную форму заболевания на момент постановки диагноза (9 больных) оказалось неэффективным 3 больных контрольной группы погибли от инфекционных осложнений в период нейтропении В основной группе на момент анализа живы без признаков болезни 18 пациентов в сроки от 8,2 до 73,5 месяца (медиана наблюдения 39,8 месяца) У 8 пациентов диагностирован метастатический рецидив заболевания в среднем через 8,7 месяцев (от 4,2 до 28,3 месяцев) от начала лечения Сепсис на фоне нейтропении, приведший к смерти, отмечен у 4 пациентов в среднем через 5,3 месяцев (от 0,8 до 11,2 месяцев) от начала терапии

Бессобытийная выживаемость пациентов основной группы, получивших ВПХТ на этапе консолидации представлена на рисунке 2

0 9' 080*-

§05-

I?

а

&04-030.2 01-

О'

0 1 2 3 4 5 6

годы

1 - II стадия

Всего 7 пациентов, без события 5 пациентов 8=0 71 5е(0 17) 2- IV стадия

Всего 14 пациентов, без события 9 пациентов 8=0 49 эе(0 13) Рисунок 2 - Бессобытийная выживаемость пациентов основной группы, получивших ВПХТ в зависимости от стадии заболевания

Бессобытийная шестилетняя выживаемость пациентов основной группы, получивших ВПХТ на этапе консолидации, составила 60% при медиане наблюдения 29,6 месяцев, БСВ пациентов, не получивших ВПХТ, была 31% при медиане наблюдения 42,8 месяца (log-rank test Р<0,02)

У больных с IV стадией БСВ была 49% при медиане наблюдения 16,1 месяцев Для пациентов, относившихся к прогностически неблагоприятной группе по другим параметрам (И стадия), БСВ составила 71% при медиане наблюдения 41,3 месяца (рисунок 2)

Необходимо отметить, что ВПХТ в схеме терапии пациентов с прогностически неблагоприятными формами саркомы Юинга/ПНЭО является фактором, улучшающим прогноз заболевания Обращает на себя внимание достаточно высокий уровень выживаемости (49%) пациентов с IV стадией, получивших программную высокодозную полихимиотерапию

Сравнение результатов лечения пациентов основной и контрольной групп. Непосредственный положительный эффект индукционной терапии (ПЭ + ВКЭ + ЧЭ) пациентов основной группы составил 82,3%, в то время как у больных контрольной группы - 61,6%

Для оценки отдаленных результатов терапии, мы сравнили безрецидивную (рисунок 3) и бессобытийную (рисунок 4) выживаемость пациентов основной и контрольной группы

1- Основная группа

Всего 34 пациента, без рецидива 22 пациента Э=0 57 Бе(0 08)

2- Контрольная группа

Всего 35 пациентов, без рецидива 9 пациентов Б=0 19 зе(0 07)

Рисунок 3 - Безрецидивная выживаемость пациентов в основной и контрольной группах

1- Основная группа

Всею 34 пациента, без события 18 пациентов Б=0 49 ье(0 09)

2- Контрольная группа

Всего 35 пациентов, без события 6 пациентов 5=0 17 &е(0 06)

Рисунок 4 - Бессобытийная выживаемость пациентов в основной и контрольной группах

Графики, представленные на рисунке 2 и 3 позволяют констатировать статистически значимое различие между показателями в сравниваемых группах как при оценке БРВ, так и при анализе БСВ

• БРВ пациентов основной группы составила 57% при медиане наблюдения за живущими 20,9 месяцев, в то время, как БРВ пациентов контрольной группы была 19% при медиане наблюдения 68,5 месяцев (Р< 0,01)

• БСВ для пациентов основной группы составила 47% при медиане наблюдения за живущими 39,6 месяцев, БСВ пациентов контрольной группы составила 17% с медианой наблюдения 77,2 месяца (Р<0,02)

Сравнительная характеристика основных показателей терапии пациентов основной и контрольной группы представлены в таблице 3

Таблица 3 - Сравнение результатов терапии

пациентов основной и контрольной группы

Показатель Основная группа, п=34 Контрольная группа, п=35 Р

абс % абс %

Эффективность индукции (ПЭ+ВКЭ+ЧЭ) 28 82,3 22 61,6 0,07

Интервал между курсами индукции, дни 24,7 22,4 <0,001

Лучевая терапия 21 61,7 26 74,2 0,26

Оперативное лечение 12 35,3 7 20,0 0,16

4 степень патоморфоза 8* 66,6 3* 42,8 0,31

Смерть в нетропении 4 11,8 3 8,6 0,66

Безрецидивная выживаемость 0,57 0,19 <0,01

Бессобытийная выживаемость 0,49 0,17 <0,02

* процентное соотношение приведено для пациентов, у которых проведено оперативное вмешательс!во

Как видно из показателей, представленных в таблице 3, лучевая терапия использовалась чаще (74,2% против 61,7%) для пациентов контрольной группы Указанный факт можно объяснить совершенствованием хирургической техники (в том числе активным внедрением эндопротезирования), что позволило увеличить процент (35,3%о против 20,0%) оперативного удаления остаточной опухоли у больных основной группы и тем самым исключить необходимость проведения JIT на этапе локального контроля Анализируя полученные данные, можно констатировать, что использование более интенсивной схемы полихимиотерапии (протокол ММСЮ-99) для больных основной группы привело к некоторому удлинению межкурсовых интервалов (до 24,7 дней против 22,4 дней у пациентов группы контроля, Р<0,001) Так же, увеличение

дозовой нагрузки, вероятно, повлияло на больший удельный вес смертности от инфекционных агентов в период нетропении в основной группе больных Однако, значимо большая эффективность индукционной полихимиотерапии пациентов протокола ММСЮ-99 (82,3% против 61,6%) была подтверждена практически полуторократным увеличением процента больных основной группы с 4 степенью патоморфоза опухоли Исходя из этого, абсолютно закономерным представляется статистически значимое более чем двукратное превосходство не только в безрецидивной (Р<0,01) но и в бессобытийной (Р<0,02) выживаемости пациентов основной группы по сравнению с контрольной

Представленные результаты свидетельствуют, что у детей с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО интенсификация индукционной фазы терапии и проведение консолидирующей фазы с использованием ВПХТ с поддержкой ПСК усиливает непосредственный эффект лечения и достоверно увеличивает долгосрочные показатели выживаемости

Оценка эффективности биотерапиии интерлейкином-2 у пациентов с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО. Была оценена динамика показателей иммунитета при использовании ИЛ-2 и сравнение БРВ у пациентов, получавших биотерапию (13 пациентов) и больных, у которых ИЛ-2 не применялся в схеме терапии (8 пациентов)

Значимых изменений в показателях иммунитета на фоне проведения биотерапии ИЛ-2 получено не было Наряду с некоторой динамикой к увеличению абсолютного количества лейкоцитов и субпопуляции Т-лимфоцитов и естественных киллеров, прослеживалась тенденция к снижению их процентного соотношения в периферической крови

Мы сравнили БРВ в зависимости от наличия ИЛ-2 в схеме лечения Терапию ИЛ-2 получили 13 больных, 5-летняя БРВ которых составила 69% при медиане наблюдения 31,5 месяцев Для пациентов, у которых ИЛ-2 отсутствовал в схеме лечения, БРВ составила 58% при медиане наблюдения 11 месяцев Хотя разница в выживаемости пациентов представленных групп, при оценке боле, чем пятилетнего периода наблюдения не была статистически достоверной, можно отметить некоторую тенденцию худшего клинического исхода для пациентов, у которых биотерапия не проводилась

Таким образом, не удалось получить убедительных доказательств значимого влиянии биотерапии на уменьшение числа возвратов заболевания при использовании ИЛ-2 после ВПХТ с аутотрансплантацией ПСК Можно констатировать, что вопрос о месте ИЛ-2 в терапевтическом плане детей с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО остается открытым и не исключает поиск других вариантов биотерапии при указанной патологии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные научные результаты диссертации

Использование метода ПЦР для определения специфических для СЮ/ПНЭО онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG позволяет повысить качество и сократить сроки диагностики опухолей семейства СЮ/ПНЕО, и является необходимым компонентом схемы обследования, как для выбора адекватного варианта терапии, так и для контроля опухолевого процесса во время лечения В проведенном исследовании у 7,6% больных (4 пациента) диагностика на молекулярном уровне непосредственно повлияла на тактику ведения вследствие изменения диагноза и стадии онкологического процесса [1,9]

По результатам анализа показателей пятилетней бессобытийной и безрецидивной выживаемости не было выявлено статистически значимых доказательств влияния вида специфических для СЮ/ПНЭО альтернативных химерных онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG на исход основного заболевания [2, 7, 10]

Лечение больных по протоколу ММСЮ-99 с интенсификацией индукционной фазы и использованием высокодозной полихимиотерапии в режиме (Бусульфан - Мелфалан - Тиофосфамид) и аутотрансплантацией ПСК на этапе консолидации позволило увеличить шестилетнюю бессобытийную выживаемость пациентов детского возраста с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО с 17 до 49% (Р<0,02) [3,4, 5,11, 12]

Использование интерлейкина-2 после проведения ВПХТ с аутотрансплантацией ПСК на этапе консолидации не оказало значимого влияния на показатели иммунитета и безрецидивную выживаемость детей с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО [6, 8]

Рекомендации по практическому использованию результатов

Использование метода ПЦР для определения специфических для СЮ/ПНЭО онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG в ткани патологического очага и костном мозге показано при первичной диагностике у пациентов с подозрением на опухоль семейства саркомы Юинга

При обнаружении онкогена в ткани патологического очага и отсутствии гистологического заключения о наличии СЮ/ПНЭО или в обратной ситуации, необходим обязательный пересмотр препаратов (возможно в другой

лаборатории), при необходимости - проведение повторной открытой биопсии патологического очага

Обнаружение онкогена в биоптате костного мозга, при отсутствии морфологических признаков поражения последнего, свидетельствует о том, что костный мозг вовлечен в основное заболевание Выставляется IV стадия процесса

В тяжелых клинических случаях, требующих немедленной специфической терапии, обнаружение онкогена EWS-FLI1 или EWS/ERG в любой из исследуемых сред является основанием для начала лечения по схеме терапии СЮ/ПНЭО, не дожидаясь гистологического заключения и результатов иммуногистохимического исследования

В процессе терапии пациентов с опухолями семейства саркомы Юинга, использование метода ПЦР для определения наличия специфических для СЮ/ПНЭО онкогенов показано при дифференциальной диагностике основного процесса от сопутствующих осложнений [1,9]

Вид альтернативных химерных онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG не должен расцениваться как фактор, значимо влияющий на прогноз заболевания пациентов с СЮ/ПНЭО [2, 7, 10]

Пациентам с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО терапией выбора является схема с интенсификацией индукционной фазы и использованием высокодозной полихимиотерапии в режиме (Бусульфан -Мелфалан - Тиофосфамид) с аутотрансплантацией ПСК на этапе консолидации [3,4,5,11,12]

Использование интерлейкина-2 после проведения ВПХТ с аутотрансплантацией ПСК на этапе консолидации не должно рассматриваться как единственный способ стимуляции противоопухолевого иммунитета у детей с прогностически неблагоприятными формами СЮ/ПНЭО [6, 8]

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ СОИСКАТЕЛЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных изданиях для опубликования диссертационных исследований

1 Киселев, JIП Определение химерных онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG в диагностике опухолей семейства саркомы Юинга у детей / JIП Киселев, HB Липай, OB Алейникова // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии - 2006 - Т. 5, № 1 - С 36-39

2 Киселев, Л П Клиническая значимость вида патологических химерных онкогенов t(lI,22)(q24,ql2) и t(21,22)(q24,ql2) при опухолях семейства саркомы Юинга у детей / Л П Киселев, Т В Савицкая, О В Алейникова//Детская онкология -2006 -№ 1 -С 11-16

3 Эффективность интенсификации полихимиотерапии с аутологичной трансплантацией гемопоэтических клеток у детей с прогностически неблагоприятными формами саркомы Юинга/ПНЭО / ЛП Киселев, С В Петрович, Ю С Стронгин, О В Алейникова // Медицинские новости -2006 - № 9 - С 111-114

4 Лечение прогностически неблагоприятных форм саркомы Юинга у детей / Л П Киселев, С В Петрович, Ю С Стронгин, О В Алейникова // Здравоохранение - 2006 - № 6 - С 65-68

5 Киселев, Л П Шестилетняя выживаемость детей с прогностически неблагоприятными формами саркомы ЮингаУПНЭО / ЛП Киселев // Актуальные проблемы онкологии и медицинской радиологии сб статей / НИИ ОМР им Н Н Александрова - Минск, 2006 - С 470-477

6 Киселев, Л П Результаты биотерапии интерлейкином-2 пациентов детского возраста с прогностически небагоприятными формами саркомы Юинга/ПНЭО / Л П Киселев, М В Белевцев, О В Алейникова // Актуальные проблемы онкологии и медицинской радиологии сб статей / НИИ ОМР им Н Н Александрова - Минск, 2006 - С 465-470

Статьи

7 Киселев, ЛП Определение влияния вида специфических транслокаций t(ll,22)(q24,ql2) и t(21,22)(q24,ql2) на клинический исход у детей с опухолями семейства саркомы ЮингаЛШЭО / ЛП Киселев // VIII съезд педиатров Республики Беларусь материалы, Минск, 23-24 ноября 2006 г /Мин здрав РБ , редкол В И Жарко [и др] -Минск, 2006 -С 191-194

8 Киселев JIП Использование интелейкина-2 у детей с прогностически неблагоприятными формами саркомы Юинга/ПНЭО / ЛП Киселев, О В Алейникова // VIII съезд педиатров Республики Беларусь материалы, Минск, 23-24 ноября 2006 г / Мин здрав РБ , редкол В И Жарко [идр] -Минск,2006 - С 194-197

9 Киселев, ЛП Определение онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG при первичной диагностике у детей с опухолями семейства саркомы ЮингаЛШЭО / Л П Киселев // VI съезд онкологов и радиологов СНГ материалы, Баку, 28 сентября -1 октября 2006 г / Мин здрав Азербайджанской Республики, редкол Р С Зейналов [и др ] - Баку, 2006 - С 266

10 Киселев, ЛП Влияние вида онкогена на клинический исход при опухолях семейства саркомы Юинга/ПНЭО у детей / Л П Киселев, Н В Липай, О В Алейникова // VI съезд онкологов и радиологов СНГ материалы, Баку, 28 сентября -1 октября 2006 г / Мин здрав Азербайджанской Республики, редкол Р С Зейналов [и др ] - Баку, 2006 - С 266

11 Лечение прогностически неблагоприятных форм саркомы Юинга у детей / Л П Киселев, С В Петрович, Н В Пономаренко, О В Алейникова // 3 съезд онкологов и радиологов СНГ материалы, Минск, 25-28 мая 2004 г / Мин здрав РБ , редкол В А Кадулин [и др ] - Минск, 2004 - С 394

12 Киселев, Л П Результаты лечения группы высокого риска саркомы Юинга/ПНЭО у детей / Л П Киселев // VI съезд онкологов и радиологов СНГ материалы, Баку, 28 сентября - 1 октября 2006 г / Мин здрав Азербайджанской Республики, редкол Р С Зейналов [и др ] - Баку, 2006 - С

Тезисы докладов

266

РЭЗЮМЭ

Юсялеу Леашд Пятров1Ч

Малекулярная дыягностыка ды штэнйфжацыя х1м1ятэрапй прагнастычна неблагапрысмных формау саркомы IOiiira у дзяцей

Словы для пошуку: саркома Юшга, пршныуная переферычная нейраэктадэрмальная пухлша, анкагены, выжываемасць, EWS/FLU, EWS/ERG, палшеразная ланцуговая рэакцыя, высокадозная пол1Х1М1ятерапш, переферычная ствалавая клетка, аутатрансплантацыя

Мэта работы: удасканалщь дыягностыку i павял1чыць доугатэрмшовыя паказчыю выжываемасш у дзяцей, хворых на саркому Юшга з неблагапрыемным1 формалп працэсу

Метады даследвания: цыталапчны, псталапчны, малекулярна-бшлапчны метад палшеразнай ланцуговай рэакцьп, кампьютерная тамаграф1я, магнитна-рэзанансная тамаграфш

Атрыманыя BbiiiiKi: ужыванне малекулярна-бшлапчнага метаду палшеразнай ланцуговай рэакцьп дзеля пошуку анкагенау, спецыфиных для пухлш сямейства саркомы Юшга дазволша 7,6% хворых скарэктаваць кл1н1чныя дадзеныя (змена дыягназа i стадьп распаусюджвання пухлшы), засведчана адсутнасць пераканаучых дадзеных за уплыу анкагенау EWS/FLI1 ды EWS/ERG на клшшны bhhik захворавання, ужыванне штэнафшацьн х1М1ятэрапи ды высокадознай полшмштерапп з аутатрансплантацыяй псрыферычнай стволавай клеткай, даставерна (Р<0,02) павялшыла паказчыю шасшгадовай безвыпадковай выжывальнасщ з 17,0 да 49,0%, у той час, кал1, б1ятэрапш штэрлейкшам-2 пры ужыванш пасля высокадознай пол1Х1М1ятерапа не дазволша атрымаць статыстычна значнага паляпшэння узР°Уня безрэцыдыунай выжывальнасщ дзяцей з пухлшам1 сямейства саркомы Юшга / прш1тыунай переферычнай нейраэктадэрмальнай пухлшы

Навуковая павпна: упершыню абгрунтавана ужыванне малекулярна-б1ялапчнага метаду палшеразнай ланцуговай рэакцьп у дзяцей, з дыягназам пухлшы сямейства саркомы Юшга ды атрыманы новыя дадзеныя за уплыу анкагенау EWS/FLI1 ды EWS/ERG на юншчны вынж захворавання, абгрунтаваны новыя метады камбшаванага лячэння дзяцей, хворых на саркому Юшга з неблагапрыемным1 формам1 працэсу

Рэкамендацьи па выкарыстанню: вынш работы могуць быць рэкамендаваны да укаранення у лячэбна-прафшактычных установах рэспубл1К1 Гал1на ужывання: установы аховы здароуя

РЕЗЮМЕ

Киселев Леонид Петрович

Молекулярная диагностика и интенсификация химиотерапии прогностически неблагоприятных форм саркомы Юинга у детей

Ключевые слова: саркома Юинга, примитивная нейроэктодермальная опухоль, онкогены, выживаемость, EWS/FLI1, EWS/ERG, полимеразная цепная реакция, высокодозная полихимиотерапия, периферическая стволовая клетка, аутотрансплантация

Цель работы: повысить качество диагностики и увеличить долгосрочные показатели выживаемости детей с прогностически неблагоприятными формами опухолей семейства саркомы Юинга / примитивной нейроэктодермальной опухоли

Методы исследования: цитологический, гистологический, молекулярно-биологический метод полимеразной цепной реакции, компьютерная томография, магнитно-резонансная томография

Полученные результаты: применение молекулярно-биологический метода полимеразной цепной реакции для определения онкогенов, специфических для опухолей семейства саркомы Юинга позволило 7,6% больных скорректировать клинические данные (смена диагноза и стадии распространения онкологического процесса), показано отсутствие значимого влияния вида альтернативных онкогенов EWS/FLI1 и EWS/ERG на клинический исход заболевания, применение интенсификации химиотерапии и миелоаблативного режима с аутотрансплантацией периферической стволовой клетки, достоверно (Р<0,02) улучшило показатели шестилетней бессобытийной выживаемости с 17,0 до 49,0%, в то время как использование интерлейкина-2 после проведения высокодозной полихимиотерапии с аутотрансплантацией периферической стволовой клетки на этапе консолидации не оказало значимого влияния на показатели иммунитета и безрецидивную выживаемость детей с прогностически неблагоприятными формами опухолей семейства саркомы Юинга / примитивной нейроэктодермальной опухоли

Научная новизна: впервые обосновано применение молекулярно-биологического метода полимеразной цепной реакции у детей с опухолями семейства саркомы Юинга и получены новые данные о влиянии вида специфического онкогена на клинический исход заболевания, обоснованы новые методы интенсивного лечения детей с прогностически неблагоприятными формами опухолей семейства саркомы Юинга Область применения: практическое здравоохранение

SUMMARY

Leanid Kisialeu

Molecular detection and chemotherapy dose-intensification for pediatric patients with poor prognosis Ewing's family of tumors

Key words: Ewing's sarcoma, pediatric patients, gene, EWS/FLI1, EWS/ERG, survival, polymerase chain reaction, high dose chemotherapy, stem-cell reconstitution

Aim of the study: to improve the quality diagnosis and increase long-term survival rates of pediatric patients with adverse forms of Ewing's sarcoma family of tumors

Method of research: cytological, histological, molecular-biological method of polymerase chain reaction, computed tomography, magnetic resonance imaging tomography

Results obtained: use an algonthm of molecular-biological method of polymerase chain reaction for detection highly specific for Ewing's sarcoma genes allow corrected clinical data (choose diagnosis and tumours dissemination) for 7,6% patients, we could not find significant proofs of influence of two alternative gene on a clinical outcome, for pediatric patients with poor prognosis Ewing's family of tumors dosemtensified and myeloablative chemotherapy with stem cell rescue significantly improved six-event-free survival rate from 17,0% to 49% (P<0,02), but there were no significant clinical differences observed between the group with and without biotherapy of Interleukin - 2 in progression-free survival

Scientific novelty: an algonthm of molecular-biological method of polymerase chain reaction for detection highly specific for Ewing's sarcoma genes and influence of two alternative gene on a clinical outcome has been developed for the first time, new data of dosemtensified, myeloablative chemotherapy with stem cell rescue and immunotherapy of pediatric patients with poor prognosis Ewing's family of tumors

Recommendation on use: results of research and methods of treatment may be introduced into practice of pediatric oncological clinics

Field of application: practical health care

КИСЕЛЕВ Леонид Петрович

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА И ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ХИМИОТЕРАПИИ ПРОГНОСТИЧЕСКИ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФОРМ САРКОМЫ ЮИНГА У ДЕТЕЙ

Автореферат

Подписано в печать 22 10 2007 г Формат 60x84/16 Бумага офсетная №1 Гарнитура Times Услпечл 1,50 Уч-издл 1,36 Тираж 60 экз Заказ 13

Отпечатано на ризографе с оригинал-макета заказчика ОДО «Экспресс Принт» 220002, Минск, ул Кропоткина, 44 Лицензия ЛП 02330/0131654 от 29 12 2005 г