Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клиническое значение гена СОМТ у больных раком молочной железы при комбинированном лечении.

0\ I

I На правах рукописи

ЖАРИКОВА Ирина Анатольевна

Клиническое значение гена СОМТ у больных раком молочной железы при комбинированном лечении.

14.01.12- онкология, 14.01.13 - лучевая диагностика, лучевая терапия.

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 О Г.ИЗ 2011

Москва-2011

004619629

Работа выполнена в ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России, (директор академик Цыб А.Ф.)

Научные руководители:

доктор медицинских наук Смирнова Ия Алексеевна

Член-корреспондент РАМН,

профессор Мардынскпй Юрий Станиславович

Официальные оппонепты:

Доктор медицинских наук, профессор Петерсон Сергей Борисович

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Доктор медицинских наук Кудрявцев Дмитрий Владимирович

ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России.

Ведущая организация: Российская академия медицинских наук Российский Онкологический Научный Центр имени H.H. Блохина.

Защита состоится «15» февраля 2011 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.047.01 ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А.Герцена (125284, г Москва, 2-й Боткинский проезд, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского онкологического института имени П. А. Герцена

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор биологических наук Завалишина Лариса Эдуардовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак молочной железы (РМЖ) в России, так же как и в странах Европы и Америки, занимает первое место в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных образований среди женщин. Социальное значение этой формы рака настолько велико, что исследования по проблеме рака молочной железы занимают одно из ведущих мест в современной онкологической науке. Число умерших от рака молочной железы в России увеличилось на 72% (по сравнению с 1980 г. и достигло 19,6 тыс., заболевших - до 39 тыс.). Данная патология представляет собой наиболее распространенную форму злокачественных заболеваний у женщин, а в качестве причины онкологической смертности уступает только раку легкого. Эти факты подчеркивают актуальность разработки новых эффективных методов профилактики, ранней диагностики и лечения. Как стало понятно в последние годы, разработка таких методов требует глубокого понимания молекулярно-биологической природы опухолевого процесса.

Изучая отечественную и зарубежную литературу, можно отметить, что в понимании механизмов канцерогенеза, ключевую роль играют мутации, которые определяют злокачественную трансформацию клеток и механизмы прогрессирования опухолевого процесса. В связи с этим изучение факторов, определяющих возникновение повреждений ДНК при воздействии экзо- или эндогенных генотоксических агентов, представляет несомненный интерес. К числу таких факторов следует отнести показатели антиоксидантной способности клеток. Молекулярно-биологические исследования позволили идентифицировать ряд генов, продукты которых регулируют окислительный статус клеток, в том числе ген СОМТ. Как известно, ген СОМТ кодирует фермент катехол-О-метилтрансфераза, участвующий в метаболизме катехоловых эстрогенов, в ходе которого образуются продукты, обладающие генотоксическим действием. Предполагают, что функциональная активность этого фермента, определяемая однонуклеотидным полиморфизмом гена (single nucleotide polymorphism, SNP), коррелирует с антиоксидантной способностью эстроген-зависимых клеток, например, клеток молочной железы (Lavigne et al, 1997; Thompson et al, 1998). Пониженная функциональная активность продуктов указанного гена, вероятно, может привести к индукции дополнительных повреждений ДНК, в том числе и в генах, имеющих непосредственное отношение к канцерогенезу. Поэтому изучение полиморфизма гена СОМТ, по всей видимости, внесет вклад в понимание механизмов возникновения и развития злокачественных новообразований молочной железы. С другой стороны, исследование полиморфизма этого гена может быть полезно для

з

прогнозирования эффективности лечения больных РМЖ в связи с возможной модификацией эффектов радио- и химиотерапии в клетках с различным окислительным статусом.

Цель работы: оценить значение полиморфизма гена СОМТ для формирования групп высокого риска возникновения РМЖ и прогнозирования эффектов радиационного воздействия на опухолевую и нормальную ткани. Задачи исследования.

1. Сравнить частоту встречаемости аллельных форм гена СОМТ у больных РМЖ и у здоровых доноров и рассчитать относительные шансы возникновения РМЖ у женщин с различными генотипами СОМТ.

2. Проанализировать и сравнить у больных с разными аллельными формами гена СОМТ клиническое течение и эффективность лечения РМЖ, используя при этом следующие показатели:

• реакция опухоли на терапию

• лучевые реакции здоровых тканей

• данные трехлетней выживаемости

3. Проанализировать и сравнить у больных с разными аллельными формами гена СОМТ показатели лабораторных исследований, включая:

• наличие рецепторов к эстрогену в опухолевых клетках

• пролиферативную активность опухолевых клеток

4. Проанализировать и сравнить у больных с разными аллельными формами гена СОМТ ряд данных анамнеза.

Научная новизна и практическая значимость работы:

В работе получены приоритетные данные о распределении генотипов в локусе С1947А (Н/Ь) гена СОМТ в контрольной популяции здоровых женщин, проживающих в РФ. Эти данные составляют основу для дальнейших молекулярно-биологических исследований возможного медицинского значения полиморфизма СОМТ. Образцы ДНК, накопленные при выполнении данной диссертационной работы, могут быть использованы в дальнейших исследованиях в области молекулярной медицины с целью выяснения диагностического и прогностического значения полиморфизма других генов.

Впервые проведена сравнительная оценка полиморфизма гена, принимающего участие в регуляции окислительного статуса клетки, у здоровых доноров и больных РМЖ. с разными клинико-морфологическими и биологическими характеристиками опухоли, включая пролиферативную активность опухолевых клеток и экспрессию рецепторов эстрогена. Полученные результаты свидетельствуют об ассоциации изучаемого полиморфизма с риском развития РМЖ в ряде обследованных групп и представляют не только теоретический, но и практический интерес, поскольку позволяют рекомендовать проведение целенаправленных профилактических мероприятий в группе повышенного канцерогенного риска (тучные женщины с генотипом НН).

Впервые в данной работе оценивались эффекты действия ионизирующего излучения на нормальные и опухолевые клетки в группах больных с разным

генотипом СОМТ. Полученные в работе данные о корреляции радиочувствительности нормальной ткани с генотипом имеют важное значение как в теоретическом, так и в практическом отношении, поскольку предоставляют новый критерий для прогнозирования лучевых осложнений.

Таким образом, результаты работы позволили оценить значение полиморфизма гена СОМТ со следующих точек зрения:

• как фактора риска по отношению к РМЖ с различным гормональным статусом (по частоте встречаемости аллельных форм в группе первичных больных с эстроген - зависимыми и эстроген- независимыми опухолями и здоровых лиц)

• как прогностического фактора в отношении течения заболевания и ответа на терапию, поскольку накопление в клетке дополнительных генотоксических агентов (вследствие сниженной функциональной активности белка СОМТ) может модифицировать эффекты терапии, и, следовательно, как показателя целесообразности назначения дополнительного специфического лечения. Реализация п внедрение результатов работы.

Работа выполнена в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний торакальной области с группой лечения заболеваний молочной железы ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России.

Апробация работы.

Материалы доложены на VI всероссийском съезде онкологов ( Ростов-на-Дону, 2005);на IV Съезде онкологов стран СНГ( Баку, 2006); на Российской научно-практической конференции «Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях» (Барнаул, 2007);на Международном Конгрессе по онкохирургии ( Краснодар, 2007),на XIII Российском онкологческом конгрессе (Москва, 2009);на 1У(ХШ) Международной научной конференций Хошимин, Вьетнам,2009). Апробация диссертации состоялась на научно-практической конференции клинического радиологического сектора МРНЦ РАМН 28 декабря 2009 года (протокол № 11) и. Заседании межотделенческой конференции ФГУ «Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А.Герцена Росмедтехнологий» от 17 июня 2010 г. (протокол №6).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в центральном рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК МО и Н РФ

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных материалов, заключения, выводов и указателя литературы. Работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 14 рисунками. Список литературы содержит 347 источников, в том числе 97 отечественных и 250 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы.

Под нашим наблюдением находилась 103 женщины с заболеванием рака молочной железы II-III стадии (основная группа). Диагноз устанавливался на основании стандартных исследований, а также гистологической или цитологической верификации. II стадия РМЖ была диагностирована у 45(43,6%), а III- у 58 (56,4%) пациенток. Кроме того, были обследованы 43 женщины с доброкачественными заболеваниями молочных желез. В данной группе были выявлены следующие заболевания: фибрознокистозная мастопатия- 30 (69,6%), Фиброаденома-10 (23,5%), Хронический мастит-1 (2,3%), Цистаденопапиллома-2 (4,6%).

Контрольную группу составили 117 практически здоровых женщин, в анамнезе которых отсутствовали не только онкологические заболевания, но и любые заболевания репродуктивной сферы (половой системы и молочной железы).

Анализ эстрогеновых рецепторов проводился в лаборатории патологической анатомии МРНЦ. Для определения наличия эстрогеновых рецепторов использовался операционный материал или ткань образования, полученная при трепанбиопсии. Оценка реакции определялась субъективно на основании интенсивности окрашивания ядер клеток опухоли и количества окрашенных ядер:+,++,+++.

При обследовании 54 (52,4%) женщин было выполнено определение наличия эстрогеновых рецепторов в опухолевой ткани в первой группе и у 13 (30,2%) больных во второй группе.

Молекулярно-генетическин анализ гена СОМТ проводился в лаборатории молекулярной и клеточной радиобиологии экспериментального сектора МРНЦ и состоял из следующих этапов:

• Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови

• Определение концентрации полученной ДНК

• Амплификация фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт COMT*WL, методом Полимеразной Цепной Реакции

• Обработка рестриктазами.

• Электрофорез фрагментов ДНК в полиакриламидном геле.

• Определение генотипов СОМТ

По длине фрагментов рестрикции мы определяли генотип. Без рестрикции размер амплифицируемого фрагмента СОМТ - 169 пар оснований. После рестрикции при генотипе НН выявлялся только фрагмент с длиной 114 пар оснований, при LL 96 пар оснований, а у гетерозигот оределялись фрагменты, содержащие оба этих показателя. Как определено в предыдущих исследованиях посвященных изучению полиморфизма гена СОМТ аллель Н является базовой, а L вариантной.

Анализ пролиферлтивнон активности опухоли проводился в лаборатории пострадиационного восстановления экспериментального радиологического сектора МРНЦ. Пролиферативная активность опухоли была исследована у 19 (42%) больных раком молочной железы с II стадией после предоперационного курса лучевой терапии. Пролиферативную активность опухоли оценивали по распределению клеток по фазам клеточного цикла с помощью анализа содержания ДНК методом проточной цитометрии. Для исследования использовался операционный материал, который доставлялся в лабораторию в течение часа после операции. Пролиферативную активность опухоли оценивали по распределению клеток по фазам клеточного цикла с помощью анализа содержания ДНК методом проточной цитометрии. Определяли относительное количество клеток в фазах клеточного цикла 01(00), Б, С2+М.

Методы лечения.

Все больные раком молочной железы получили комплексное лечение, которое у больных первично-операбельным РМЖ (Т1-2Ш-Ш0) включало интенсивный предоперационный курс дистанционной лучевой терапии (ДЛТ) крупными фракциями. Разовая очаговая доза (РОД) проводилась через день, и составляла 6 Гр, суммарная очаговая доза на молочную железу с тангенциальных полей составила 24Гр, подмышечный лимфатический коллектор облучался с одного переднего поля до СОД 18Гр. В процессе предоперационной лучевой терапии проводился курс полихимиотерапии (ПХТ) в режимах САР. Гамма-терапия проводилась на гамма-терапевтических аппаратах «Рокус», «Агат». Оперативное лечение проводилось в течение 7 дней после окончания лучевой терапии. Выполнялась радикальная мастэктомия по Мадену. В случае наличия у больных данной группы морфологически неблагоприятных форм: центральной или медиальной локализации, прражение подмышечных или подключичных лимфатических узлов (по данным морфологического исследования) в течение двух-трех недель после оперативного лечения начинали облучение всех групп лимфатических узлов: подмышечной, над-и подключичной, а также стернапьной области. Послеоперационная лучевая терапия проводилась в традиционном режиме в РОД 2Гр до СОД-5С)Гр. У больных с высоким риском локального рецидива так же проводили электрон-терапию Е=8МеУ на послеоперационный рубец в области удаленной молочной железы. При положительном рецепторном статусе опухоли у молодых менструирующих женщин назначался тамоксифен после оперативной или лекарственной кастрации. У пожилых женщин данный препарат назначался без какого-либо воздействия на яичники.

Больным с местно-распространенным раком молочной железы (Т3-4Ы0-2М0) проводили радикальный курс ДЛТ на область молочной железы и зон регионарного лимфооттока. Дистанционная лучевая терапия осуществлялась в режиме конвекционного облучения. В РОД по 2 Гр 5 раз в неделю до СОД бОГр. Лечение в данной группе также сочеталось с проведением

полихимиотерапии. Во всех случаях применялся курс САР. Непосредственная эффективность лучевой терапии оценивалась несколькими специалистами не ранее, чем через четыре недели после завершения лечения на основе клинико-рентгенологических исследований и оценивалась согласно «критериям эффекта по шкале ВОЗ при солидных опухолях».

Таблица 1. Распределение больных в зависимости от проведенного лучевого лечения.

Группы (N=103)

Комплексное лечение с интенсивной предоперационной ДЛТ Только интенсивной предоперационной ДЛТ 12(11,7%)

с послеоперационной ДЛТ на регионарные л/у 39(37,9%)

Радикальный курс ДЛТ С отсроченной радикальной мастэктомией 11(10,6%)

Самостоятельная ДЛТ 41(39,8%)

При отсутствии отдаленных метастазов, через 4 недели после завершения лучевого лечения осуществлялась отсроченная радикальная мастэктомия.

Местные лучевые реакции.

Оценка влияния лучевой терапии на окружающие опухоль нормальные ткани осуществлялась на этапе лучевой терапии и в дальнейшем наблюдении. Регистрировались ранние и поздние лучевые реакции и повреждения по мере их возникновения. По классификационным критериям острой и подострой токсической реакции на облучение. В соответствии с классификацией острой и подострой токсической реакции на облучение (разработанной Онкологической группой радиационной терапии и Европейской организацией по исследованию терапии рака в 1987г.), реакции кожи подразделяют на несколько степеней:

Степень 0 - без изменений по отношению к исходному состоянию.

Степень 1 - слабо или незначительно выраженная эритема, выпадение волос, сухое шелушение.

Степень 2 - слабая эритема, сухой эпидермит, зуд, умеренный отек, влажно очажковое шелушение.

Степень 3 - сливное влажное слущивание, влажный эпидермит, образование язв, пастозный отек.

Степень 4 - слущивающийся дерматит, изъязвление, геморрагии, некроз, требующий хирургического вмешательства.

Статистическая обработка результатов

Данные представлены в виде средних значений с их стандартными отклонениями (непрерывные переменные) либо в виде частот (категориальные переменные). Сравнение средних значений непрерывных переменных проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Сравнение частот генотипов (категориальные переменные) выполняли с помощью х,2-теста для таблиц вида 2x3 и 2x2. В случаях, когда хотя бы одна из ожидаемых частот оказывалась меньше 5, вместо %2 использовали точный критерий Фишера. Для оценки достоверности тренда при сравнении нескольких пропорций использовали статистику х2 с одной степенью свободы. Достоверными считали различия, характеризуемые уровнем значимости более 95% (р<0,05). Уровень значимости более 90% (р<0,1) рассматривали как пограничный. Выживаемость больных в группах была расчитана с помощью метода Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier).Уровень значимости различий между сравниваемыми группами определялся с помощью логарифмического рангового критерия Long-Rank-Test. Различия считались достоверными при значении (р< 0,05). При выборе статистических подходов, а также в процессе вычислений, руководствовались рекомендациями, содержащимися в руководстве

Демографические характеристики обследованных групп

Согласно литературным данным аллельные частоты H/L полиморфного гена СОМТ характеризуются этнической зависимостью. Для европейских популяций аллельная частота L составляет около 0,5 . У народов Восточной Азии и Африки частота вариантного аллеля L значительно ниже, чем у жителей Европы, Юго-Западной Азии и Северной и Центральной Америки (Palmatier М.А. et al, 1999). Поэтому для всех исследований, посвященных анализу роли этого гена в предрасположенности к тому или иному заболеванию, важно знать, каково распределение альтернативных генотипов и какова популяционная частота вариантного аллеля среди здоровых лиц данной популяции. Публикации, в которых бы анализировались генотипы россиян, крайне немногочисленны. В исследовании Зимариной Т.С. с соавторами, 2004г приводится оценка для российской популяции. Выборка, на которой базируется эта оценка, составляет 40 женщин, и для аллельной частоты L приводится значение 0,57.

Оценки, сделанные в нашей работе, основаны на анализе генотипов 117 здоровых женщин. Эти оценки в целом вполне согласуются с цитированными выше данными других авторов.

Таблица 2.Сравнение демографических характеристик обследованных групп

РМЖ (п=103) ДЗМЖ (п=43) Контроль (п= 117) Р. Р2 Рз

Возраст, лет* 27-75 54.0±11.2 28-68 46.U9.8 28-75 43.6±11.6 < 10"6 <10"4 0.19

ИМТ, кг/м2* 19.1-47.7 28.7±5.4 19.541.5 27.0±5.7 16.9-45.7 25.5±4.8 < 10"4 0.08 0.14

Славяне, п (%)** 99 96.1% 38 88.4% 113 96.6% 0.50 0.87 0.73

Курящие, п (%) 11 10.7% 6 14.0% 11 10.7% 0.05 0.57 0.35

Менопауза, п (%)*** 65 63.1% 12 27.9% 34 29.1% < 10~6 ю-4 0.89

* Указан разброс наблюдаемых значений (минимальное - максимальное), а также среднее значение ± стандартное отклонение

** К славянам относили русских, а также украинцев, белорусов и поляков; *** К женщинам, находящимся в менопаузе, относили тех, у кого период аменореи составлял один год и более

Р] — критерий статистической значимости различий между группой больных РМЖ и контрольной группой

Р2 - критерий статистической значимости различий между группой больных РМЖ и группой больных доброкачественными заболеваниями молочной железы (ДЗМЖ)

Р3 - критерий статистической значимости различий между группой больных ДЗМЖ и контрольной группой

В результате проведенного анализа, как указано в таблице 2, нами не было выявлено статистически значимых различий в распределении генотипов СОМТ между данными группами. Но согласно литературным сведениям, некоторые авторы отмечали такие различия только при учете других факторов риска РМЖ (возраст, состояние менопаузы, тучность и т.д.), причем опубликованные результаты противоречивы. В нашей работе мы исследовали риск развития рака молочной железы в зависимости от генотипа СОМТ и выше перечисленных факторов риска. Согласно литературным данным, к наиболее значимым факторам относятся менопаузальный статус и индекс массы тела (ИМТ). В качестве пограничного значения ИМТ мы выбрали медиану ИМТ в группе больных РМЖ - 28.7 кг/м2. Подразделение по ИМТ позволило получить нам интересные результаты. Распределения генотипов представлены в таблице 3.

ю

Таблица 3. Генотипы СОМТ среди женщин с ИМТ менее и более 28.7 кг/м2

ИМТ ИМТ<28.7 ИМТ>28.7

Аллели СОМТ РМЖ (п=51) Контроль (п=88) Р, РМЖ (п=52) Контроль (п=29) Р|

НН, п (%) 9 (17.6%) 28 (31.8%) 0.11 12 (23.1%) 2 (6.9%) 0.18

т, п (%) 30 (58.8%) 37 (42.0%) 30 (57.7%) 20 (69.0%)

ЬЬ,п (%) 12(23.5%) 23 (26.2%) 10 (19.2%) 7(24.1%)

НН+НЬ 39 (76.4%) 65 (73.8%) 0.73 42 (80.8%) 22 (75.9%) 0.60

ьь+нь 42 (82.3%) 60 (68.2%) 0.07 40 (76.9%) 27 (93.1%) 0.06

Аллель 1 0.529±0.04 9 0.472±0.03 8 0.35 0.481 ±0.0 49 0.586±0.065 0.20

При рассмотрении распределения всех трех генотипов (первые три строки таблицы 3) можно заметить, что у женщин с ИМТ<28.7 частота генотипа НН ниже, чем в контроле, а у женщин с ИМТ>28.7 - наоборот, выше. Однако в обоих случаях различия недостоверны (р=0.11 и р=0.18). Если же обратиться к данным с объединением генотипов, то обращают на себя внимание два значения Р, близкие к 0.05 (которое принято считать указывающим на статистическую значимость различий). Во-первых, это Р=0.07, относящееся к более низкой частоте генотипа НН у больных РМЖ (17.6%), чем в контрольной группе (31.8%), для женщин с ИМТ менее 28.7. Во-вторых, это Р=0.06, характеризующее, наоборот, более высокую частоту генотипа НН у больных РМЖ (23.1%), чем в контрольной группе (всего 6.9%), среди тучных женщин (ИМТ больше 28.7). При этом различия в частоте генотипа'НН между больными РМЖ с ИМТ менее и более 28.7 статистически незначимы (Р=0.49), тогда как в контрольной группе генотип НН встречается существенно реже среди тучных женщин, чем среди женщин с ИМТ<28.7 (Р<0.01).Эти данные наглядно отражены и на рисунке 1.

и

Рисунок 1.Частота генотипа СОМТ-НН среди здоровых женщин и больных РМЖ с ИМТ менее и более 28.7 кг/м2

контроль, ИМТ<28,7 РМЖ ИМТ<28,7 контроль, ИМТ>28,7 РМЖ, ИМТ>28,7

В соответствии с этими данными, мы оценили риск развития РМЖ в связи с гомозиготным носительством аллеля Н отдельно для женщин с ИМТ<28.7 и для женщин с ИМТ>28.7. В качестве оценки риска использовали величину OR (odds ratio, или отношение шансов). Результаты этих оценок (значения OR и соответствующие 95%-ные доверительные интервалы) приведены в таблице 4. Таким образом, у женщин с ИМТ<28.7 носительство генотипа НН понижает риск развития РМЖ, а у более тучных женщин, наоборот, повышает. Интересно отметить при этом, что среди здоровых женщин генотип НН оказался связанным с пониженным риском развития тучности: OR=0.16 (при 95% CI от 0.04 до 0.71).

Таблица 4. Оценка риска РМЖ у носительниц генотипа НН по сравнению с носительницами генотипов HL и LL: стратификация по индексу массы тела (ИМТ)

ИМТ<28.7 ИМТ>28.7

Относительный риск (OR) 95%-ный CI Относительный риск (OR) 95%-ный СТ

0.46 0.20-1.07 4.05 0.84-19.56

Таким образом, наши результаты согласуются с результатами тех авторов, которые считают, что корреляция между полиморфизмом СОМТ и

риском РМЖ существует, но на ее проявление существенно влияют другие факторы риска РМЖ, в частности, индекс массы тела.

Генотип СОМТ и экспрессия эстрогеновмх рецепторов

Определение рецепторного статуса опухоли было проведено у 54 больных РМЖ. Для достижения лучшей статистической значимости мы не подразделяли препараты с иммуногистохимическим окрашиванием по степеням +, ++ и +++, а объединили их в группу ЭР-положительных (указывающих на присутствие рецепторов эстрогена). Данные о генотипах СОМТ у ЭР-положительных и ЭР-отрицательных женщин представлены в таблице 5

Таблица 5. Генотипы СОМТ среди женщин с различным рецепторным статусом опухоли.

Генотип ЭР-отрицательные (п=13) ЭР-положительные (п=41) Р1

НН, п (%) 1 (7.7%) 13 (31.7%) 0.05

HL, п (%) 10(76.9%) 16(39.0%)

LL, п (%) 2(15.4%) 12(29.3%)

Из таблицы 5 видно, что распределение генотипов существенно (р=0.05) различалось между рассмотренными подгруппами. Генотип НН встречался намного чаще у женщин с ЭР-положительными опухолями, чем с эстроген-отрицательными (р=0.08).

Расчет отношения шансов (odds ratio) показал, что носительство генотипа НН повышает риск формирования эстроген-положительной опухоли (OR=5.57, 95%-ный доверительный интервал 0.7 - 45.5).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что значение генотипа СОМТ в возникновении эстроген-зависимых и эстроген-независимых опухолей может различаться. Механизмы участия эстрогенов в канцерогенезе, по-видимому, различаются у женщин с разным генотипом по локусу СОМТ. В частности, у женщин с генотипом НН, кодирующим ферменты с высокой активностью, не происходит сильного накопления генотоксических метаболитов эстрогенов, и канцерогенез протекает в соответствии с концепцией усиленной пролиферации, вследствие чего возникают чаще опухоли, высоко экспрессирующие эстрогеновые рецепторы. Напротив, у носителей хотя бы одного аплеля L, который кодирует фермент СОМТ с низкой активностью, в клетках накапливается существенно больше генотоксических метаболитов. Можно предположить, что накопление этих веществ является превалирующим фактором канцерогенеза - в этом случае стимуляция пролиферации через эстрогеновые рецепторы, по-видимому,

играет меньшую роль, поэтому чаще возникают опухоли, не экспрессирующие или слабо экспрессирующие эстрогеновые рецепторы.

Результаты анализа генотипа больных РМЖ с разной экспрессий рецепторов к эстрогенам проясняют в определенной степени роль и место основных механизмов возникновения этого заболевания под влиянием эстрогенов.

Данные по выживаемости больных РМЖ

Нами была проанализирована общая выживаемость для больных раком молочной железы II и III стадии. Данные по выживаемости получены у 94 пациенток.

Из 94 больных, наблюдавшихся в течение 3 лет после лечения, для 47 имелись данные о наличии или отсутствии рецепторов эстрогена в опухоли. Мы рассмотрели эти данные в связи с выживаемостью (таблица б).

Таблица 6. Трехлетняя выживаемость больных РМЖ и наличие рецепторов эстрогена в опухоли

ЭР-положительные N=38 ЭР-отрицательные N=9 Р

Выжившие (п=40) 34 (85%) 6(15%) 0.08

Умершие (п=7) 4 (57%) 3 (43%)

Эти данные показывают, что доля эстроген-положительных опухолей была выше среди выживших больных (85%), чем среди тех, кто не пережил три года после лечения (57%), при пограничном уровне критерия значимости различий (0.05<Р<0.1).

В литературе нам не встречались данные по корреляции между наличием рецепторов к эстрогенам в опухолевой ткани и полиморфизмом гена СОМТ, поэтому в нашем исследовании мы уделили внимание сравнению данных показателей. По данным литературы известно, что гормонозависимые опухоли молочной железы имеют более благоприятное течение, и послеоперационный прогноз у больных с такими опухолями, независимо от проводимого адьювантного лечения, лучше, чем у больных с рецептор-отрицательными опухолями (Powles TP, Casey SO, et al. 1993r).

Для анализа трехлетней выживаемости в связи с генотипами СОМТ были доступны данные 42 пациенток с II стадией рака молочной железы и 52 пациенток с III стадией.

Общая выживаемость больных с II стадией составила 92.5%. Нами не выявлено статистически значимых различий в зависимости от полиморфизма гена СОМТ у этих больных (88.9% у больных с генотипом НН, 100.0% у больных с генотипом HL, 80.0% у больных с генотипом LL). Можно отметить

наличие тенденции благоприятного прогноза у женщин с генотипом НН+НЬ против ЬЬ (96,42% против 80.0%, р=0,091).

Рисунок 2. Выживаемость больных раком молочной железы II стадии.

Ш ¿. -М

: Ш

' -

Рисунок 3. Общая выживаемость больных III стадией в зависимости от полиморфизма гена СОМТ.

ОСНяя выживаемость, (8 стадия (Kaptttn-MeteQ о Compielß Cffnsosea

Время («зшоденяя ;«вс)

Как показано на рисунке 3, для больных с III стадией заболевания выживаемость составила 75.0%. При этом различие выживаемости у больных с генотипом LL (100.0%) по сравнению с генотипами HH+HL (65,27%) оказалось статистически значимым (р=0,04).

Анализ общей выживаемости больных III стадии рака молочной железы показал наличие благоприятного прогноза у больных генотипом LL, по сравнению генотипом HH+HL. Данное различие статистически достоверно.

Можно полагать, что создание дополнительного окислительного стресса в клетках опухоли с данным генотипом повышает эффективность радиотерапии и, таким образом, влияет на выживаемость.

Реакция опухоли и здоровых тканей на лучевую терапию и распределение

генотипов СОМТ

Реакция опухоли на проведенную лучевую терапию изучалась у больных, получивших СОД JIT на молочную железу и/или зоны л/оттока 50-бОГр.

Клинические данные о терапевтическом эффекте радикальной лучевой терапии имелись для 37 из 47 больных РМЖ, так что мы имели возможность сравнить генотипы женщин с разной реакцией ткани опухоли на лечение только для этих 37 женщин. Данные о реакции опухоли были разделены на две группы: регрессия опухоли больше 50% и меньше 50%. Реакция опухоли на лучевую терапию оценивали по критерию уменьшения ее более 50%-выраженный положительный эффект (ВПЭ), и менее 50% -слабый положительный эффект (СПЭ). В группу ВПЭ включались пациентки с полным и частичным эффектом (согласно классификации по шкале ВОЗ при солидных опухолях), а в группу СПЭ больные со стабилизацией опухолевого процесса. Прогрессирования заболевания не отмечалось. Оценка результатов проведенной лучевой терапии проводилась спустя четыре или пять недель после последнего облучения. Для оценки результатов использовались стандартные методы диагностики (маммография, УЗИ молочных желез и зон л/оттока, пальпация). Результаты статистического анализа представлены в таблице 7.

Таблица 7. Распределение генотипов и аллельные частоты в полиморфном сайте COMT*H/L среди больных РМЖ с разной реакцией опухоли на терапевтическое облучение

Генотип Регрессия менее 50% N=16 Регрессия более 50% N=21 Р

НН 3 (18,8%) 4(19,0%) 0,9

HL 10(62,5%) 13(62,0%)

LL 3 (18,8%) 4(19,0%)

HL+HH 13 (81,3%) 17(81,0%) 0,9

HL+LL 13 (81,3%) 17(81,0%) 0,9

Аллель L 0,50 0,50 0,9

По данным литературы, наличие вариантного аллеля гена СОМТ (кодирующего белок СОМТ с низкой активностью) может усугубить окислительный стресс, создаваемый лучевой терапией. Следовательно, можно ожидать, что у носительниц аллеля Ь реакция опухоли на облучение будет отличаться от реакции опухоли на облучение носительниц аллеля Н.

Однако, из приведенных данных видно, что никаких различий в реакции опухоли на облучение между носительницами вариантного и основного аллелей не было обнаружено. При этом следует отметить, радиотерапия большинства больных проводилась на фоне гормонального лечения. Вероятно, отсутствие различий связано с применением гормонотерапии, нивелирующей возможное влияние полиморфизма СОМТ на радиочувствительность опухолевых клеток. Это предположение подтверждается данными о разной пролиферативной активности клеток в операционном материале больных с разным генотипом после предоперационной радиотерапии. В этом случае до момента анализа пролиферативной активности больные не получали гормонального лечения, поэтому влияние полиморфизма СОМТ можно было обнаружить.

Пролиферативная активность была определена у 19 пациенток II стадии заболевания после предоперационного курса лучевой терапии. РОД на молочную железу составила 6Гр, СОД 24Гр.

Как видно из таблицы 8, доля клеток в фазах в2+М в операционном материале была ниже у носителей аллеля Н, составляя у больных с генотипами НН, НЬ, IX 7,0±2,4%, 10,3±2,3% и 22,0±5,2% соответственно. Установлено статистически значимое различие по этому показателю пролиферативной активности между носителями аллеля Н (генотипы НН, НЬ) и больными с гомозиготным генотипом ЬЬ: 9,5 против 22,0% соответственно (р=0,01). Несмотря на это данный генотип имел тенденцию к улучшению выживаемости, что может быть связанно с более высокой чувствительностью к проведенной терапии в целом.

Таблица 8. Зависимость распределения доли клеток в фазе С2+М от полиморфизма гена СОМТ

Полиморфизм гена СОМТ Средняя доля клеток в фазе 02+М Р

НН 7,0±2,4% 0,01

НЬ . 10,5±2,3%

ЬЬ 22,0±5,2%

НЬ+ЬЬ 9,5±5,2%

Хотя в данной работе не проводился анализ пролиферативной активности опухоли до лечения и её изменений в ходе радиотерапии, можно полагать, что

установленные различия обусловлены различной реакцией опухолевой ткани на облучение в зависимости от генотипа СОМТ.

Оценка влияния лучевого воздействия на окружающие опухоль нормальные ткани осуществлялась в процессе лучевой терапии, последующего лечения и наблюдения, регистрировались ранние лучевые реакции по мере их возникновения. Влажный эпидермит был зарегистрирован у 14 (16 %) этих больных. Эзофагит и пульмонит наблюдался у 4 больных, получавших радикальный курс лучевой терапии. В целом можно сказать, что лучевые реакции здоровой ткани, наблюдавшиеся в обследованной нами группе больных РМЖ, варьировали от умеренного отека и сухого эпидермита до некроза, требовавшего хирургического вмешательства. Данные по типам реакции здоровой ткани были доступны у 91 больной. Реакции здоровых тканей степеней 0 и 1 (по классификационным критериям острой и подострой токсической реакции на облучение) мы объединили в группу, характеризующуюся отсутствием реакции; кроме того, поскольку реакция степени 4 (некроз) отмечалась только у одной больной, мы включили этот случай в подгруппу реакций степени 3. Таким образом, мы анализировали три подгруппы, обозначив их как «отсутствие кожной реакции», «слабая реакция» и «средняя и сильная реакция».

Таблица 9 представляет данные о частоте генотипов, содержащих хотя бы один вариантный аллель гена СОМТ, т.е. суммарную частоту генотипов НЬ и IX. Вычисление величины Р1ге„<] для этих данных показало, что увеличение тяжести лучевых эффектов достоверно (Р,гсп,)=0.046) коррелировало с присутствием вариантного аллеля (Ь) гена СОМТ.

В доступной нам научной литературе не удалось найти данных о возможной ассоциации полиморфизма гена СОМТ со степенью выраженности тканевых лучевых реакций. Однако, по нашим данным, выявленная зависимость указывает на то, что пониженная активность фермента СОМТ может служить одной из причин возникновения выраженных лучевых эффектов в нормальной ткани. Кожные лучевые реакции были гораздо сильнее выражены у носительниц вариантного аллеля Ь. При этом увеличение тяжести лучевых реакций достоверно (Р1гспс1 < 0.05) коррелировало с частотой аллеля СОМТ*Ь. Таблица 9 Распределение генотипов и аллельные частоты в полиморфном сайте СОМТ*Н/Ь среди больных РМЖ с разной реакцией здоровой ткани на терапевтическое облучение в зависимости от тяжести лучевой реакции.

Генотип Реакция отсутствует Слабой степени Средней и сильной степени Р{гепс1

НН 14(26,4%) 5 (20,8%) 0 (0%) 0.046

нь+ьь 39 (73,6%) 19(79,2%) 14(100%)

Аллель Ь 0,46 0,52 0,64 0,094

Всего (п= 91)

Эти результаты, показывающие, что сниженная активность фермента СОМТ сопровождается накоплением в здоровой ткани дополнительных генотоксических агентов, являются важными для планирования лучевой терапии.

Выподы

1. Варианты распределения генотипа СОМТ имеют различное значение в прогнозе течения рака молочной железы.

2. Варианты генотипа СОМТ у российских женщин при выборке (263 человека) распределились следующим образом: частота встречаемости аллелей гена СОМТ*Н/Ь составила-52,9%; аллель НН- 24,7% аллель Ы- 22,4%.

3. Генотип СОМТ*НН в сочетании с тучностью повышает риск развития рака молочной железы по сравнению группой здоровых женщин в 4 раза. Носительство аплеля НН достоверно чаще встречается у женщин с ЭР+ опухолями.

4. Вариант генотипа СОМТ с аллелем ЬЬ повышает риск развития кожных реакций. При выявлении данного генотипа необходимы профилактические мероприятия, направленные на уменьшение кожных реакций.

5. Носительство генотипа СОМТ с аллелем Ы коррелировало с высокой пролиферативной активностью опухоли после предоперационного крупнофракционного облучения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Irina A.Zharikova. Frequency of hemochromatosis gene mutations in Russian healthy women and patients with estrogen-dependent cancers. Tatiana V. Kondrashova, Kazuo Neriishi, Sadayuki Ban, Tatiana I. Ivanova, Lyudmila I. Krikunova, Nataliya I. Shentereva, Iya A. Smirnova, Irina A.Zharikova // Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and cell Biology of Lipids, 1762. (2005) p. 59-65.

2. Жарикова И.А. Полиморфизм генов COMT и HFE и риск рака молочной железы. Т.В. Кондрашова, И.А.Смирнова, Т.Н. Иванова, И.А. Жарикова, Е.В. Ефременкова //Материалы VI всероссийского съезда онкологов. Том II. Ростов-на-Дону. 2005. С.335.

3. Жарикова И.А. Оценка роли полиморфного гена СОМТ в реакции опухолевой и нормальной ткани на лучевую терапию. Т.В. Кондрашова, И.А. И.А.Смирнова, Е.А. Осокова, И.А. Жарикова //Материалы IV Съезда онкологов стран СНГ. Баку. 2006. С.45.

4. Жарикова И.А. Полиморфизм гена гемахроматоза (HEF) и риск развития рака молочной железы Т.В. Кондрашова, Т.И. Иванова, И.А. Жарикова, И.А.Смирнова, В.И. Киселева //Молекулярный полиморфизм человека под редакцией С.Д.Варфоломеева. 2007. Т.1. С.168-177.

5. Жарикова И.А. Частота мутаций гена гемохроматоза (HFE) у Российских здоровых женщин и больных эстрогензависимым раком. Т.В.Кондрашова, Т.И Иванова, И.А Жарикова., И.А.Смирнова, Н.И. Шентерева, Л.И. Крикунова, Е.А. Осокова //Российская научно-практическая конференция «Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях». Барнаул. 2007.

6. Жарикова И.А. Определение рецепторного статуса рака молочной железы при полиморфизме гена СОМТ. И.А.Смирнова, Т.В. Кондрашова, И.А.Жарикова //Материалы Международного Конгресса по онкохирургии.-Краснодар, 2007. Т.1. С. 90.

7. Жарикова И.А. Анализ молекулярно-генетических особенностей клеток крови больных раком молочной железы и доброкачественными заболеваниями молочной железы. И.А. Жарикова, И.А. Смирнова, Т.В. Кондрашова //XIII Российский онкологический конгресс. Москва. 2009. С.285-286.

8. Жарикова И.А. Лучевые реакции нормальных тканей у больных раком молочной железы: взаимосвязь с аплельными формами гена СОМТ. И.А. Жарикова, Т.В.Кондрашова, Е.А.Осокова, И.А.Смирнова //Радиация и риск,-2009. т.18. N4. С.60-72.

9. Жарикова И.А. Риск развития рака молочной железы в зависимости от полиморфизма гена СОМТ и ИМТ. И.А.Жарикова, И.А.Смирнова, Т.В. Кондрашова //Материалы IV(XIII) Международной научной конференции. Хошимин, Вьетнам. 2009. С. 78-80.

Заказ 3159 Тираж 100 Объём 1 п.л. Формат 60x841/16 Печать офсетная

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035 Калужская обл., г. Обнинск, ул. Комарова, 6

Рак молочной железы (РМЖ) в России, так же как и в странах Европы и Америки, занимает первое место в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных образований среди женщин [15,21,76,152,218]. Социальное значение этой формы рака настолько велико, что исследования по проблеме лечения рака молочной железы занимают одно из ведущих мест в современной онкологической науке. Злокачественные новообразования молочной железы имеют наибольший удельный вес в структуре смертности женского населения (16,4%). Стандартизированный показатель смертности женщин от злокачественных новообразований молочной железы вырос за последние 10 лет на 17,29% и составил в 2008 году 17,24 на ЮОтыс. населения. Среднегодовой темп прироста-1,79% [21]. Средний возраст умерших (61,7г.) всего на 3,4 года превышает показатель заболевших. Эти факты подчеркивают актуальность разработки новых эффективных методов профилактики, ранней диагностики и лечения. Как стало понятно в последние годы, разработка таких методов требует глубокого понимания молекулярно-биологической природы опухолевого процесса.

Существенный прогресс в изучении механизмов канцерогенеза, достигнутый в последние годы, свидетельствует о ключевой роли мутаций в ответе за злокачественную трансформацию клеток и прогрессировании опухолевого процесса. В связи с этим изучение факторов вызывающих повреждения ДНК, представляет несомненный интерес. К ним также следует отнести и потенциал антиоксидантных механизмов клеток. Молекулярно-биологические исследования позволили идентифицировать ряд генов, продукты которых регулируют окислительно-восстановительные процессы в клетках, в том числе ген СОМТ. Как известно, ген СОМГ кодирует фермент катехол-О-метилтрансферазу, участвующую в метаболизме катехоловых эстрогенов, которые, обладают генотоксическим действием. Предполагают, что функциональная активность этого фермента, определяемая однонуклеотидным полиморфизмом гена (single nucleotide polymorphism, SNP), коррелирует с антиоксидантной способностью эстроген-зависимых клеток, например, клеток молочной железы [230,318]. Пониженная функциональная активность указанного гена, вероятно, может привести к индукции дополнительных повреждений ДНК, в том числе и в генах, имеющих непосредственное отношение к канцерогенезу. Поэтому изучение полиморфизма гена СОМТ, по всей видимости, может внести вклад в понимание механизмов возникновения и развития злокачественных новообразований молочной железы. С другой стороны, исследование полиморфизма этого гена позволит прогнозировать эффективность лучевого лечения больных РМЖ в связи с возможной модификацией эффектов радиотерапии в клетках с различным окислительным статусом.

Действие лучевой терапии на биологические объекты клеточного уровня может осуществляться как вследствие непосредственного повреждения ДНК, так и опосредованно через образование свободных радикалов в результате радиолиза. Накопление генотоксических продуктов в клетке за счет уменьшения активности СОМТ может усиливать эффект лучевой терапии.

Лучевая терапия занимает одно из главных мест в лечении РМЖ, поэтому увеличение эффективности этого компонента позволит улучшить результаты лечения и качества жизни больных с данной патологией [55,204,217].

Цель данной работы: изучить результаты воздействия ионизирующего излучения на опухоль и здоровые ткани больных раком молочной железы в зависимости от полиморфизма гена СОМТ.

Задачи:

1. Сравнить частоту встречаемости аллельных форм гена СОМТ у больных РМЖ и у здоровых индивидов и влияние этого фактора на риск развития РМЖ.

2. Исследовать ассоциацию различных аллельных форм гена СОМТ с наличием эстрогеновых рецепторов и пролиферативной активностью опухолевых клеток.

3. Изучить влияние полиморфизма СОМТ на непосредственные результаты лучевого лечения, трехлетнюю выживаемость и уровень лучевых реакций и осложнений у больных РМЖ после проведения лучевой терапии в объеме комплексного лечения.

Научная новизна и практическая значимость

В работе впервые получены данные о распределении генотипов в локусе 01947А (Н/Ь) гена СОМТ в исследуемой популяции здоровых женщин, проживающих в РФ. Эти данные составляют основу для дальнейших молекулярно-биологических исследований возможного медицинского значения полиморфизма СОМТ. Образцы ДНК могут быть использованы и в дальнейших исследованиях в области молекулярной медицины с целью выяснения диагностического и прогностического значения полиморфизма других генов.

Впервые проведена сравнительная оценка полиморфизма гена СОМТ, принимающего участие в регуляции окислительно-восстановительных процессов в клетке, у здоровых доноров и больных РМЖ. Изучено его влияние на разные клинико-морфологические и биологические характеристики опухоли, такие как пролиферативная активность опухолевых клеток и экспрессия рецепторов эстрогена. Полученные результаты свидетельствуют об ассоциации изучаемого полиморфизма с риском развития РМЖ в исследуемых группах, которые представляют не только теоретический, но и практический интерес, поскольку позволяют рекомендовать проведение целенаправленных профилактических мероприятий в группе повышенного канцерогенного риска (тучные женщины с генотипом НН).

В данной работе впервые изучены эффекты воздействия ионизирующего излучения на нормальные и опухолевые клетки в группах больных с разным генотипом СОМТ. Полученные данные о корреляции радиочувствительности нормальной ткани с генотипом, имеют, важное значение как в теоретическом, так и в практическом отношении, поскольку предоставляют новый критерий для прогнозирования лучевых;осложнений;

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфизм? гена СОМТ может оцениваться! как прогностический фактор в отношении риска развития заболевания РМЖ.

2. Носительство, аллеля НН' ассоциировано с риском формирования эстроген-положительной опухоли.'

3. Наличие аллеля IX повышает риск развития кожных реакций; при проведении радикального курса лучевой терапии в традиционном режиме.

Апробации работы и публикации

Материалы доложены на VI всероссийском съезде онкологов (Ростов-па - Дону, 2005); IV Съезде онкологов'/стран СНЕ (Баку, 2006); Российской? научно-практической конференции «Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях» (Барнаул, 2007); . Международном; Конгрессе- по онкохирургии (Краснодар, 2007), XIII! Российском онкологическом; конгресс. (Москва, 2009);; П/(ХШ) Международной научной конференции (Хошимин, Вьетнам,2009).

Апробация диссертации состоялась на межотделенческой конференции ФРУ «Московского научно-исследовательского онкологического института: им. П.А.Герцена Росмедтехнологий 17 июня 2010 года.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в; центральном рецензируемом журнале, рекомендованном: ВАК Минобнауки РФ.

Объем н структура диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста. Состоит из введения,- обзора литературы, 2 глав собственных исследований;

выводы

1. Варианты распределения генотипа СОМТ имеют различное значение в прогнозе течения рака молочной железы.

2. Варианты генотипа СОМТ у российских женщин при выборке (263 человека) распределились следующим образом: частота встречаемости аллелей гена СОМТЧ1/1 составила-52,9%; аллель НН- 24,7%; аллель ЬЬ- 22,4%.

3. Генотип СОМТ*НН в сочетании с тучностью повышает риск развития рака молочной железы по сравнению группой здоровых женщин в 4 раза. Носительство аллеля НН достоверно чаще встречается у женщин с ЭР+ опухолями.

4. Вариант генотипа СОМТ с аллелем ЬЬ повышает риск развития кожных реакций. При выявлении данного генотипа необходимы профилактические мероприятия, направленные на уменьшение кожных реакций.

5. Носительство генотипа СОМТ с аллелем ЬЬ коррелировало с высокой пролиферативной активностью опухоли после предоперационного крупнофракционного облучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как было отмечено в литературном обзоре аллельные частоты H/L полиморфного гена СОМТ характеризуются этнической зависимостью. Для европейских популяций аллельная частота L составляет около 0,5. У народов Восточной Азии и Африки частота вариантного аллеля L значительно ниже, чем у жителей Европы, Юго-Западной Азии и Северной и Центральной Америки [277]. Поэтому для всех исследований, посвященных анализу роли этого гена в предрасположенности к тому или иному заболеванию, важно знать, каково распределение альтернативных генотипов и какова популяционная частота вариантного аллеля среди здоровых лиц данной популяции. Однако в литературе имеется очень небольшое число работ, где была бы проанализирована частота генотипов COMT*ff/L для российских популяций. В исследовании Зимариной Т.С. с соавторами приводится оценка для российской популяции женщин. Выборка, на которой базируется эта оценка, составляет 140 t женщин, и для аллельной частоты L приводится значение 0,57.

Оценки, сделанные в нашей работе (см. табл. 6) частоты генотипов СОМТ*НН, сомтть и СОМТ*Ы - 25.6, 48.7 и 25.6%, соответственно; популяционная частота вариантного аллеля COMT-L - 0,50), основаны на анализе генотипов 117 здоровых женщин. Эти оценки в целом вполне согласуются с цитированными выше данными других авторов. Полученные в. работе оценки частоты альтернативных генотипов/ в полиморфном сайте COMT*ff/L могут быть использованы в качестве контрольных значений для дальнейших исследований возможной роли этого полиморфизма в развитии мультифакториальных болезней.

В течение последнего десятилетия опубликовано значительное число работ по анализу ассоциации между риском РМЖ и наличием; аллеля L, соответствующего низкой; активности фермента; однако результаты этих исследований крайне противоречивы. .

Одни авторы, считают, что; носительство аллеля ¿ действительно предрасполагает к развитию РМЖ [204,339]; Авторы»' других публикаций; отрицают наличие какой-либо зависимости предрасположенности к РМЖ от полиморфизма; гена СОМТ [29, 261, 185, 224]; Еще одна группа ученых полагает, что такая зависимость, существует, но она выражена по-разному у женщин разного менопаузального статуса [229,315]; Наконец, есть исследователи,, которые считают, что на . проявление, этой зависимости существенно влияют другие1 факторы риска РМЖ [113,174,266,334].

Так, в работе Thompson и соавт. (1998г) отмечено; увеличение риска развития; рака; молочной; железы у женщин,. находящихся в пременопаузальном периоде, при наличии аллеля пониженной активности [318]. В том же исследовании было обнаружено. снижение риска развития рака молочной: железы у женщин, находящихся в постмеиопаузальном периоде, при снижении активности СОМТ и пониженном индексе' массы тела. Подобные: данные: встречаются и в исследованиях Trentham-Dietz, A. Newcomb, Р.А et ali (1997г), Ursin G., Longneeker М.Р.(1995г) [320; 324]. В исследовании Lavigen J.А., Helzlsouer K.J., et al. (1997г) была показана; такая же корреляция, что и в исследовании Thompson; только для постменопаузальных женщин [229].

При исследовании' постменопаузальных тайваньских женщин Huang H.D., et al. (1999г) отметили увеличение риска развития рака; молочной железы при снижении, активности СОМТ [203]. У корейских женщин риск развития рака молочной железы при снижении активности СОМТ возрастал как в пре-, так и в постменопаузальном периоде [342 ].

В исследованиях Jackie A.Lavigne, Kathy J.helzlsouer et al. (1997г) было отмечено, что у постменопаузальных COMT*LL женщин более чем в 2 раза увеличивается риск развития рака молочной железы [229]. Низкая активность данного белка при индексе массы тела >24кг/м2 статистически была связана с риском развития рака молочной железы у постменопаузальных женщин.

Судя по этим публикациям, к наиболее значимым факторам, благодаря которым ассоциация между генотипом СОМТ и риском РМЖ может проявляться по-разному, относятся менопаузальный статус и индекс массы тела (ИМТ).

Как следует из «табл. 6», нам не удалось установить существенных различий между больными и здоровыми женщинами в распределении генотипов СОМТ*Н/Ь. Средняя частота встречаемости СОМГ-Ь в группе РМЖ составила 0.505±0.035, а в группе ДЗМЖ-0.419±0.053.

Однако, как сказано выше, выявление корреляции между присутствием вариантного аллеля СОМГ-Ь и риском РМЖ требует учитывать .различия« между сравниваемыми группами не только по частоте исследуемых генотипов, но также по другим факторам риска. Как видно из данных, приведенных в «табл. 5», обследованные нами группы действительно существенно различались по некоторым из этих факторов, а именно по возрасту, менопаузальному статусу и индексу массы тела.

Поэтому далее мы провели стратификацию обследованных групп по каждому из этих параметров и сравнили частоту генотипов в получившихся подгруппах.

Аналогичные данные о генотипах были исследованы по отдельности для женщин репродуктивного возраста и женщин в менопаузе (см. «табл. 8, 9»). Они показывают, что существенных различий между группами в распределении генотипов СОМТ или в частоте аллеля Ь обнаружено не было. Встречаемость генотипов была примерно одинаковой среди женщин репродуктивного возраста в каждой из групп и среди женщин в менопаузе в каждой из групп. Следует отметить, что различия по изученным показателям между женщинами в пре- и постменопаузе в пределах каждой подгруппы также были несущественными.

Далее для исследования возможной ассоциации индекса массы тела (ИМТ), генотипа СОМТ и риска РМЖ мы подразделили основную и контрольную группы в соответствии со значениями ИМТ. Этот показатель рассчитывается ка& отношение веса тела к квадрату роста, имеет размерность кг/м2 и характеризует степень отклонения веса человека от нормы. По* критериям Всемирной организации здравоохранения, ИМТ<25.0> соответствует нормальному весу; значения ИМТ от 25.0 до<29.9 означают излишек веса; если. ИМТ>29.9, можно говорить о тучности (ожирении). С наступлением менопаузы гормональный фон женского организма сильно меняется, при этом большая часть эстрогена начинает вырабатываться в жировой ткани.

В качестве пограничного значения ИМТ мы выбрали медиану ИМТ в. группе больных РМЖ — 28.7 кг/м2. Сравнение генотипов СОМТ в подгруппе женщин с ИМТ менее этого значения и в подгруппе тучных женщин («табл. 10») привело к противоположным результатам. Среди больных РМЖ с ИМТ менее 28.7 гомозиготные носительницы аллеля Н встречались существенно реже, чем в контрольной подгруппе (17.6 и 31.8%, соответственно). И наоборот, их процент был повышен среди тучных больных РМЖ (23.1% по сравнению с 6.9% в контрольной группе). В обоих случаях различия имели пограничную статистическую значимость менее 0.1. Дальнейшая оценка риска РМЖ, связанного с гомозиготным носительством аллеля Н («табл. 11»), показала, что этот риск снижен для женщин нормального веса (ИМТ<28.7), составляя 0.46, и повышен для тучных женщин: 4.05. Уровень значимости приведенных оценок риска не достигал общепринятой величины 0.05, что может быть связано с недостаточной численностью подгрупп, однако он был менее 0.1, что позволяет думать об этих результатах как о заслуживающих доверия, и о возможности дальнейших исследований.

Таким образом, наши данные согласуются с результатами тех авторов, которые считают, что корреляция между полиморфизмом СОМТ и риском РМЖ существует, но на ее проявление существенно влияют другие факторы риска

РМЖ, в частности, индекс массы, тела [113,174,266,334]. Детальный анализ сложной взаимозависимости различных факторов риска РМЖ представляет собой интересную задачу для специального исследования; результаты: которого позволят обоснованно судить о роли полиморфизма гена С0МГ в канцерогенезе РМЖ. Данные, собранные в настоящей работе, являются' вкладом; в такое исследование. :•

Рецепторы половых стероидных гормонов, в первую очередь, эстрогенов и прогестинов, по мнению большинства исследователей, играют ведущую! роль в канцерогенезе рака молочной1 железы. [3, 14, 88]. Вклад экзогенных; и эндогенных эстрогенов в канцерогенез;; обусловлен; во-первых, индукцией; усиленной клеточной пролиферации [267], а во-вторых, образованием генотоксических метаболитов эстрогенов, которое; запускает цепь событий; приводящих, к формированию свободных; радикалов/ и, как следствие, к повреждению ДНК [6, 126, 127, 322, 345; 346]. Важно подчеркнуть, что оба эти механизма (усиленная клеточная; пролиферация и генотоксический эффект метаболитов; эстрадиола); могут действовать в синергической или аддитивной; манере:. /. ;

Уровень эстрогеновых рецепторов, варьируется от женщины к женщине и определяется; индивидуальными генетическими' факторами., Обычно он невысок в здоровых тканях молочной железы, а высокий уровень эстрогеновых рецепторов прямо связан с повышенным риском РМЖ. Все последующие звенья метаболизма- эстрогена также влияют на риск РМЖ и также зависят от генетических факторов, в том числе и от полиморфизма гена СОМТ, белковый продукт которого является инактиватором катехоловых эстрогенов [252, 253; 180, 182,248].

В литературе нам не встречались, данные о корреляции между наличием рецепторов к эстрогенам в опухолевой ткани и полиморфизмом гена СОМГ, поэтому в нашем исследовании мы уделили внимание сравнению данных показателей (см. таб. 12 и рис. 9). Оказалось, что среди носительниц активной: формы гена {СОМТ*НН) было всего 7% больных с ЭР-отрицательными опухолями, т.е. гораздо меньше, чем среди женщин с другими генотипами (30%). Относительный шанс формирования ЭР-положительной опухоли у больных с генотипом СОМТ*НН составил 5.57. На основании этих данных можно предположить, что носительство этого аллеля ассоциировано с развитием ЭР-положительного РМЖ.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что генотип СОМТ в возникновении эстроген-зависимых и эстроген-независимых опухолей может различаться. Как' упоминалось выше, существуют две основные теории, связывающие эстрогены с канцерогенезом в молочной железе: концепция усиленной пролиферации и концепция образования стабильных и нестабильных аддуктов ДНК под влиянием метаболитов эстрогенов. Вторая концепция подвергается критике рядом авторов, утверждающих, что концентрация генотоксических метаболитов эстрогенов недостаточна для индукции значимых биологических эффектов. Другая группа не менее многочисленных исследователей считает, что локальная* продукция эстрогена в ткани молочной железы может обеспечить уровень эстрадиола, достаточный для возникновения генотоксического-эффекта. Наша интерпретация полученных в работе данных отчасти снимает указанное противоречие двух концепций канцерогенеза в молочной железе. Есть основание полагать, что механизмы участия эстрогенов в канцерогенезе, по-видимому, различаются у женщин с разным генотипом по локусу СОМТ. В частности, у женщин с генотипом НН, кодирующим ферменты с высокой активностью, не происходит сильного накопления генотоксических метаболитов эстрогенов, и канцерогенез протекает в соответствии с концепцией усиленной пролиферации, вследствие чего возникают чаще опухоли, высоко экспрессирующие эстрогеновые рецепторы. Напротив, у носителей хотя бы одного аллеля Ь, который кодирует- фермент СОМТ с низкой активностью, в клетках накапливается существенно больше генотоксических метаболитов. Можно предположить, что накопление этих веществ является превалирующим фактором канцерогенеза - в этом случае стимуляция пролиферации через эстрогеновые рецепторы, по-видимому, играет меньшую роль, поэтому чаще возникают опухоли, не экспрессирующие или слабо экспрессирующие эстрогеновые рецепторы.

Результаты анализа генотипа больных РМЖ с разной экспрессий рецепторов вносят определенный вклад в понимание роли и места основных механизмов возникновения этого заболевания под влиянием эстрогенов.

Интересны данные о выживаемости больных РМЖ с разным рецепторным статусом опухоли (таб. 13 и рис.10): доля эстроген-положительных опухолей была выше среди выживших больных (85%), чем среди тех, кто не пережил три года после лечения (57%), при пограничном' уровне критерия значимости различий. По данным литературы известно, что гормонозависимые опухоли молочной железы имеют более благоприятное течение, и послеоперационный прогноз у больных с такими- опухолями, независимо от проводимого адьювантного лечения, лучше, чем у больных с рецептор-отрицательными опухолями [287].

При объединении генотипов анализ общей- выживаемости больных III стадии рака молочной железы показал наличие благоприятного прогноза, у больных генотипом ЬЬ, по сравнению-с генотипом НН+НЬ. Данное различие статистически достоверно («рис. 12»).

Можно полагать, что создание дополнительного окислительного стресса в • клетках опухоли с данным генотипом повышает эффективность лучевой терапии и, таким образом, может оказывать влияние на результаты лечения.

В доступной литературе нам не встречались данные по этому вопросу, поэтому это представляет интерес для дальнейшего исследования. Объем диссертационной работы не позволяет полностью охватить рассматриваемую проблему и поэтому сравнение выживаемости, применяемых методов лечения и результатов генотипирования, возможно, позволит осуществлять выбор наилучшей индивидуализированной терапии, что является целью* дальнейших исследований.

Одним из терапевтических эффектов облучения злокачественной опухоли (в данном случае РМЖ) является создание окислительного стресса в опухолевой ткани-. При взаимодействии энергии , излучения с органическими веществами., происходит, ионизация вещества? с образованием пар ионов и свободных радикалов, обуславливающих разрушение молекулярных структур; обусловленные как прямым,. так. и косвенным действием ионизирующего излучения. Под прямым действием понимают непосредственное изменение: молекулы вещества при. прохождении- через нее излучения. При; непрямом (косвенном), действии молекула облучаемого: вещества изменяется не за счет поглощенной ею энергии излучения, а за счет энергии, получаемой от другой молекулы: [97, 96]. Непрямой эффект ионизирующего излучения« связан? с возникновением свободных радикалов* из пар ионов, образовавшихся; при; ионизации^ молекул воды (составляющих большую- часть биологических объектов). Эти свободные радикалы (радикал гидроксила ОН; гидроперекисный радикал Н02, перекись водорода Н202, атомарный водород Н и другие) в силу своей высокой? реакционной 'способности могут повреждать, биологические молекулы. В частности, свободные радикалы. индуцируют двунитевые разрывы ДНК [97], что может повлечь за собой целую цепь неблагоприятных биологических.эффектов: генные мутации, аберрации хромосом, гибель клетки. Образование свободных радикалов в определенных количествах постоянно сопровождает жизнедеятельность клеток и тканей организма; но лучевая < терапия: индуцирует неизмеримо большее: их число. Повреждающее действие облучения на биологическую ткань может быть усилено за счет кислородного эффекта, который состоит в .том, что радиочувствительность ткани тем выше, чем больше она оксигенирована (т.е., чем выше в ней концентрация кислорода)

Как было показано в обзоре литературы, наличие вариантного аллеля гена СОМТ (кодирующего белок СОМТ с низкой активностью) может усугубить окислительный стресс за счет повышения концентрации свободных радикалов из-за накопления метаболитов хиноновых эстрогенов, в результате проведения лучевой терапии. Следовательно, можно ожидать, что у носительниц аллеля Ь реакция опухоли на облучение будет отличаться от реакции опухоли на облучение носительниц аллеля Н.

Такое же предположение можно сделать и относительно реакции здоровых тканей на лучевую терапию. Поэтому представляется интересным сравнить выраженность лучевых реакций опухоли и здоровых тканей между носительницами двух аллельных форм гена СОМТ.

Результаты этого исследования могут быть очень важны для индивидуальной оптимизации лучевой терапии с учетом генетических особенностей реакции на нее. В доступной нам научной литературе не удалось найти данных о возможной ассоциации полиморфизма гена СОМТ со степенью выраженности тканевых лучевых реакций.

В случае радикальной радиотерапии'данные о распределении генотипов СОМТ у женщин с разной реакцией опухоли на облучение (см. «табл. 16») показали, что значимых различий в реакции опухоли на облучение между носительницами вариантного и основного аллелей обнаружено не было. Вероятно, отсутствие различий связано с применением гормонотерапии, нивелирующей возможное влияние полиморфизма СОМТ на радиочувствительность опухолевых клеток. Это предположение подтверждается данными о разной пролиферативной активности клеток в операционном материале больных с разным генотипом после предоперационной радиотерапии. В этом случае до момента анализа пролиферативной активности больные не получали гормонального лечения, поэтому влияние полиморфизма СОМТ можно было обнаружить. В частности, была показана в 2 раза более высокая доля клеток в фазах в2+М у больных с генотипом IX по сравнению с остальными пациентками, но несмотря на это, данный генотип имел тенденцию к улучшению выживаемости, что может быть связано с более высокой чувствительностью к проведенной терапии в целом.

В отношении лучевых реакций здоровых тканей было обнаружено («рис. 13» и «табл. 18»), что кожные лучевые реакции были значительно сильнее выражены у носительниц вариантного аллеля Ь. При этом увеличение тяжести лучевых эффектов (при подразделении их на три группы — отсутствие реакции, реакция слабой степени и реакция средней и сильной степени (см. «табл. 18» и ее описание в тексте)) достоверно (Р1хепс1 < 0.05) коррелировало с частотой аллеля СОМТ*Ь («рис. 14»).

Эти результаты показали, что снижение активности фермента СОМТ сопровождается накоплением дополнительных генотоксических агентов в здоровой ткани, и являются важными для планирования лучевой терапии.

Таким образом, результаты представленного исследования показали, что женщины, получающие лечение по поводу РМЖ, являются неоднородной группой в отношении метаболизма катехоловых эстрогенов, имеющих свойства свободных радикалов. Данные соединения способны быть причиной развития РМЖ, модулировать ответ опухоли на адъювантную лучевую и химиотерапию, а также обуславливать различный уровень лучевых реакций и осложнений. Влияние этого фактора на пролиферативную активность опухоли и ее эстрогеновый рецепторный статус, их моделирование в процессе проведения лучевой и химиотерапии требует уточнения в дальнейших исследованиях. Однако уже сейчас по результатам представленной работы можно заключить, что статус пациента по полиморфному гену СОМТ*Н/Ь ассоциирован с эстрогеновым рецепторным статусом опухолевых клеток и влияет на уровень лучевых реакций и осложнений.