Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клиническое значение фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) при раке молочной железы

Актуальность проблемы. Рак молочной железы - одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин. Статистические данные последних лет свидетельствуют о неуклонном росте заболеваемости и смертности от рака молочной железы, несмотря на значительный прогресс в лечении заболевания, достигнутый благодаря увеличению чувствительности диагностических процедур и совершенствованию хирургических и лекарственных методов лечения (Н.Н. Трапезников и Е.М.Аксель, 2001) .

В связи с этим не теряет своей актуальности разработка новых подходов к общему прогнозу заболевания и выбору наиболее адекватных схем лечения для каждой больной. Большое внимание в этой области уделяется различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим фундаментальные биологические свойства опухоли (Роекеш е1 а1., 1991; Н.Е.Кушлинский и Е.С.Герштейн, 2001; Е.С.Герштейн и Н.Е.Кушлинский, 2002). Они могут быть полезны, по крайней мере, в трех ситуациях: во-первых, для выявления пациентов с очень хорошим прогнозом, для которых осложнения и стоимость адъювантного лечения не будут оправданы имеющимся риском рецидива; во-вторых, для выявления группы больных с очень плохим прогнозом, которым требуется более агрессивное адъювантное лечение, и, в-третьих, для определения чувствительности или резистентности больных к конкретным видам терапии. Кроме того, на основании исследования молекулярнобиологических особенностей опухоли может быть создана новая стратегия лечения, непосредственно влияющая на определенные молекулы и процессы. Знание специфических биологических характеристик опухоли может помочь и в усовершенствовании существующих схем терапии, и в развитии новых подходов к лечению.

В последние годы большое внимание уделяется проблеме неоангиогенеза в злокачественных опухолях. Уже не вызывает сомнения тот факт, что опухоль не может развиваться и расти без образования в ней разветвленной сети сосудов, обеспечивающих снабжение клеток кислородом и питательными веществами (Le Querrec et al, 1993; Salven et al, 1997). Изучение молекулярных механизмов ангиогенеза позволило перейти от микроскопической оценки плотности сосудов в опухолевой ткани к исследованию конкретных молекул, участвующих в регуляции образования и роста новых сосудов в опухолевой ткани. Ведущая роль среди таких регуляторов, безусловно, принадлежит фактору роста эндотелия сосудов (ФРЭС) (Ferrara et al, 1995; Donovan et al, 1997). Доказано, что ФРЭС играет, в частности, ключевую роль в неоваскуляризации рака молочной железы (Toi et al, 1996; Borgstrom, 1999; Brown et al, 1999).

Результаты ряда ретроспективных клинических исследований, опубликованные в самое последнее время, свидетельствуют о том, что экспрессия ФРЭС при раке молочной железы имеет, по-видимому, существенное значение для прогноза заболевания (Harris et al, 1996; Eppenberger et al, 1998; Locopo et al, 1998; Gasparini, 2000; Linderholm et al,

2000), а также влияет на чувствительность опухолей к гормональному и лекарственному лечению (Gasparini et al, 1999; Adams et al, 2000). Кроме того, в настоящее время активно создаются и исследуются новые препараты с антиангиогенными свойствами (Klauber et al, 1997; Asano et al, 1999; Eisen et al, 2000), и оценка активности ФРЭС-зависимого ангиогенеза может стать основой для их целенаправленного применения.

В литературе, тем не менее, не существует до настоящего времени единого мнения о преимуществах тех или иных методов или субстратов (опухоль, кровь) для клинически значимого определения ФРЭС при раке молочной железы (Toi et al, 1996; Yamamoto et al, 1996; Kraft et al, 1999; Callagy et al, 2000). Все это и определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы: оценить клинические перспективы исследования содержания фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) в опухолях и сыворотке крови больных раком молочной железы.

Задачи исследования:

1. Иммуноферментными методами определить концентрацию свободного и общего ФРЭС в цитозолях опухолей и сыворотке крови больных раком молочной железы и оценить взаимосвязь между этими показателями.

2. Проследить динамику изменений содержания ФРЭС в сыворотке крови больных РМЖ после удаления первичной опухоли.

4. Проанализировать взаимосвязь частоты и уровня экспрессии ФРЭС в опухолях и его концентрации в сыворотке крови больных РМЖ с возрастом и менопаузным статусом больных, стадией заболевания и отдельными показателями системы ТЫМ, морфологическими и рецепторными характеристиками опухоли.

5. Выделить биохимический показатель, наиболее адекватно отражающий состояние процессов ангиогенеза при раке молочной железы.

Научная новизна: Впервые параллельно определено содержание свободного и общего ФРЭС в сыворотке крови до и после операции, а также свободного ФРЭС в опухолях и гистологически неизмененных тканях больных раком молочной железы и в фиброаденомах. В результате этого исследования впервые показано, что только содержание свободного ФРЭС увеличено в сыворотке крови больных РМЖ и взаимосвязано с уровнем экспрессии ФРЭС в опухолевой ткани, тем не менее после удаления первичной опухоли содержание свободного ФРЭС в сыворотке крови не нормализуется. Количественным биохимическим методом продемонстрировано значительное увеличение продукции ФРЭС в РМЖ по сравнению с окружающей тканью молочной железы и с доброкачественными опухолями. В результате изучения взаимосвязи между этими показателями и основными клинико-морфологическими

Практическая значимость работы: Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что количественное иммуноферментное определение содержания свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ достаточно адекватно отражает активность процессов неоангиогенеза в этой ткани. Данный показатель является перспективным тканевым биологическим маркером прогноза заболевания и чувствительности опухолей молочной железы к антиангиогенной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту: Концентрация свободного ФРЭС в цитозолях опухолей как наиболее адекватный количественный показатель активности неоангиогенеза при РМЖ.

ВЫВОДЫ

1. Содержание свободного ФРЭС в сыворотке крови 81% больных раком молочной железы превышает пороговый уровень для здоровых женщин, составляющий 6,98 пг/мл. Уровень общего ФРЭС в сыворотке крови больных РМЖ и здоровых женщин практически одинаков и на три порядка выше, чем уровень свободного ФРЭС.

2. Уровень свободного ФРЭС в сыворотке крови больных РМЖ слабо, но достоверно коррелирует с его концентрацией в цитозолях опухолей (Я = 0,32; р<0,05), но после удаления опухоли снижается лишь у половины больных; при этом направление и степень изменений концентрации свободного ФРЭС в сыворотке крови не зависят от его исходного уровня в крови и в опухолевой ткани.

3. Значимых взаимосвязей сывороточных концентраций свободного и общего ФРЭС со стадией заболевания, гистологическим строением и рецепторным статусом РМЖ не обнаружено, однако уровень свободного ФРЭС в сыворотке крови достоверно увеличивался с возрастом (Я= 0,35; р= 0,015).

4. Концентрация свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ была достоверно выше, чем в окружающих гистологически неизмененных тканях молочной железы, при этом увеличение экспрессии ФРЭС у 61% составило от 30 до 2430% (медиана - 370%). Концентрация свободного ФРЭС в фиброаденомах была практически такой же, как в неизмененной ткани молочной железы.

5. Концентрация свободного ФРЭС в цитозолях опухолей положительно коррелировала со стадией заболевания у больных РМЖ без отдаленных метастазов, а также с показателем размера опухоли (Т), но достоверно не зависела от степени поражения лимфатических узлов (Ы) и наличия отдаленных метастазов.

6. Концентрация свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ была достоверно повышена у больных старше 55 лет и у всех больных, находящихся в постменопаузе, но не зависела от рецепторного статуса и гистологического строения РМЖ.

7. Наиболее адекватным количественным биохимическим показателем активности внутриопухолевого ангиогенеза при раке молочной железы является концентрация свободного ФРЭС в цитозоле опухоли.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение неоангиогенеза (образования новых капиллярных отростков из уже существующих крупных сосудов) в злокачественных опухолях является одним из перспективных направлений современной онкологии, так как только разветвленная сеть сосудов может обеспечить необходимое для роста опухоли снабжение ее клеток кислородом и питательными веществами. Изучение молекулярных механизмов ангиогенеза, интенсивно проводившееся в последнее десятилетие, привело к обнаружению большой группы регуляторных ангиогенных и антиангиогенных факторов, динамический баланс которых обеспечивает формирование и распространение новых сосудов внутри опухоли.

Ключевым положительным регулятором ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС или УЕОР), гомодимерный белок с молекулярной массой 46-48 кЭа. Биологическая доступность ФРЭС во многом определяется размером молекулы и регулируется на генетическом и эпигеномном уровне, а также зависит от того, находится ли этот фактор в свободном или связанном состоянии. Единого мнения о том, с какими конкретно белками или структурами связан ФРЭС, не существует, однако, известно, что одной из форм существования ФРЭС в крови является его депонирование в тромбоцитах. С другой стороны, для проявления биологической активности ФРЭС и его успешного взаимодействия со специфическими рецепторами, необходимо комплексирование этого белка с гепарино-подобными соединениями.

Проблема ФРЭС-зависимого ангиогенеза при раке молочной железы является чрезвычайно актуальной в двух аспектах: во-первых, тканевой и сывороточный уровень ФРЭС, по-видимому, может служить значимым биологическим маркером прогноза заболевания; во-вторых, определение уровня ФРЭС необходимо для целенаправленного назначения антиангиогенной терапии и мониторинга за ее эффективностью.

Как было представлено в обзоре литературы, исследованию клинического значения ФРЭС при раке молочной железы посвящено очень большое число публикаций и большинство из них свидетельствует о перспективности использования этого показателя. Тем не менее, вопрос о том, какой из методов и субстратов (опухоль, сыворотка или плазма крови) для определения ФРЭС является наиболее адекватным и, в то же время, удобным для практического применения у больных РМЖ, пока остается открытым, что и определяет необходимость проведения дальнейших исследований.

В нашем распоряжении было два вида стандартных наборов фирмы Cytimmune Science Inc (США): прямая иммуноферментная тест-система «сэндвичевого» типа «CytElisa™ Human VEGF» для определения свободного ФРЭС и система для конкурентного иммуноферментного анализа «Accucyte® Human VEGF» для определения общего ФРЭС, что позволило нам провести сравнительное исследование содержания свободного и общего ФРЭС в сыворотке крови и цитозолях опухолей и гистологически неизмененных тканей молочной железы больных РМЖ.

В результате этого исследования удалось выявить ряд закономерностей и особенностей, имеющих принципиальное значение для использования этих показателей в клинической практике для оценки активности неоангиогенеза при данном заболевании.

Так, обнаружено, что в крови 81% больных РМЖ повышен уровень свободного ФРЭС по сравнению со здоровыми донорами, тогда как уровень общего (свободного и связанного с различными белками) ФРЭС практически не отличается от нормы. Таким образом, можно было предположить, что сывороточный уровень свободного ФРЭС при РМЖ отражает активацию процессов неоангиогенеза в опухолевой ткани. В пользу этого предположения свидетельствовало и наличие слабой, но достоверной положительной корреляционной взаимосвязи между уровнями свободного ФРЭС в сыворотке крови и цитозолях опухолей больных РМЖ, которой не наблюдалось для общего ФРЭС.

Тем не менее, ряд наших наблюдений дечает это предположение не столь однозначным. Оказалось, в частности, что при повторном исследовании сывороточного уровня ФРЭС через 2-14 дней после удаления первичной опухоли, этот показатель снижался лишь у половины больных, а у части больных он даже существенно увеличивался (возможно, за счет активации процессов ангиогенеза при заживлении послеоперационной раны). При этом степень и направление послеоперационных изменений сывороточной концентрации ФРЭС не зависели от его исходного уровня в сыворотке крови и в опухоли. Кроме того, мы не обнаружили ожидаемой положительной взаимосвязи между концентрацией ФРЭС в сыворотке крови и общей клинической стадией РМЖ или отдельными показателями распространенности процесса по системе ТЫМ. Более того, наблюдалось парадоксальное достоверное увеличение сывороточного показателя ФРЭС при первой стадии заболевания.

Таким образом, изучение содержания ФРЭС в сыворотке крови больных РМЖ показало, что только уровень свободного фактора роста в большей или меньшей степени отражает его продукцию в опухолевой ткани, но даже этот показатель, по-видимому, складывается из различных составляющих и не в полной мере характеризует активность неоангиогенеза в ткани РМЖ.

Более однозначные и обнадеживающие результаты получены при изучении содержания свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ.

Во-первых, было показано, что у 61% больных РМЖ содержание ФРЭС в опухоли повышено более чем на 30% (в среднем в 4-5 раз) по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью молочной железы. В небольшой группе обследованных нами больных фиброаденомой молочной железы внутриопухолевый уровень ФРЭС был также значительно ниже, чем в злокачественных опухолях и практически не отличался от нормальной молочной железы. Таким образом, нами подтверждено положение о том, что высокое тканевое содержание свободного ФРЭС характерно именно для злокачественных опухолей.

Во-вторых, нам удалось показать, что концентрация ФРЭС в первичной опухоли достоверно возрастает с увеличением стадии заболевания (до появления отдаленных метастазов) и наиболее четко коррелирует с размером первичной опухоли. Это наблюдение согласуется с представлениями о том, что значение и активность неоангиогенеза особенно возрастают в больших опухолях, где наиболее велика потребность в кислороде и питательных веществах для предотвращения некроза.

Таким образом, количественное определение содержания свободного ФРЭС в цитозолях опухолей больных РМЖ достаточно адекватно отражает активность процессов неоангиогенеза в этой ткани и является перспективным направлением в области разработки и использования новых биологических маркеров прогноза заболевания и чувствительности опухолей к антиангиогенной терапии. Дальнейшее наблюдение за обследованными больными позволит проверить правильность этого заключения и выработать количественные критерии для внедрения данного показателя в клиническую практику.

Г ~ .

90