Автореферат и диссертация по медицине (14.00.40) на тему:Клиническое значение аллельного распределения гена GP3A при раке почки

На правах рукописи

КАШИНЦЕВ Кирилл Юрьевич

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АЛЛЕЛЬНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНА GP3A ПРИ РАКЕ ПОЧКИ

14.00.40 - «Урология» 03.00.15 - «Генетика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

003450930

Работа выполнена в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Росздрава.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор биологических наук, доцент Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор кафедры нефрологии и гемодиализа ММА Доктор медицинских наук, заведующая кафедрой медицинской генетики МГМСУ

Александр Васильевич Серегин Галина Ивановна Мяндина

Владимир Викторович Борисов

Лариса Вениаминовна Акуленко

Ведущее учреждение: ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Росздрава

в/^

Защита состоится <<^У>> года

на заседании

диссертационного совета Д208.041.06 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: 127006 ул. Долгоруковская, д.4. Почтовый адрес: 127449, Москва, ул. Делегатская д.20/1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медикостоматологического университета (127006 г. Москва, ул. Вучетича, д. 10,

Автореферат разослан «

Ж

2008г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор

Умаханова М.М.

Общая характеристика работы

Актуальность

Рак почки встречается в 3% от всех онкологических новообразований и занимает одно из ведущих мест по темпам прироста среди онкоурологических заболеваний (Аксель ЕМ, 2005). Рак почки является одной из самых агрессивных опухолей, так около трети пациентов на этапе первичного диагноза уже имеют местные и отдаленные метастазы (Lam JS, 2005). К основным проблемам при раке почки в настоящее время относятся как разработка новых средств системной терапии, так и прогнозирование клинического течения раковой опухоли, преследующее своей целью достижение максимальной эффективности в использовании имеющегося в настоящий момент лечебного потенциала.

Развитие раковой опухоли происходит вследствие генетических нарушений, приводящих к инактивации генов - супрессоров и стимуляции онкогенов. Известно 389 генов и порядка 1700 белковых фракций, показатели которых изменяются в клетках ПКР в сравнении с нормальными тканями почки (Huber W, 2002). Дисрегуляция в ходе онкогенеза характеризуется возникновением мутаций, приводящих к неконтролируемому клеточному росту, пролиферации и инвазии, некоторые мутации могут наследоваться, что обеспечивает предрасположенность к раку. Накопление сведений о генетических изменениях при раке почки уже привело к определенным достижениям как в вопросах диагностики и прогнозирования, так и в выработке новых подходов к системной терапии.

В настоящее время на различных стадиях испытаний клинической эффективности находятся такие потенциальные молекулярно-генетические маркеры как ферритин, индекс апоптоза, р53, Ki - 67, гелсолин, СА IX, СА XII, PTEN, ЕрСАМ, гамма - энолаза, CD44, CD95, MN/CA9, кадхерин - б,

Л

виментин, муцин - 1 и парвалбумин (Potter С, 2004; Kim HL, 2005). Принятые в США и в Европе в качестве первой или второй линии системной терапии рака почки 2 ингибитора неоангиогенеза - Сунитиниб (Sunitinib) и Сорафениб (Sorafenib) используют наиболее известные на данном этапе молекулярно-генетические механизмы онкогенеза рака почки (Staehler М, 2005). К сожалению, ни один из уже известных биологических маркеров ПКР не отвечает всем многочисленным предъявляемым к нему требованиям, что позволяет сделать вывод, что «идеального» прогностического критерия рака почки пока не создано.

Одним из многочисленных факторов, влияющих на онкогенез, является состояние механизмов, ответственных за адгезивные свойства клетки. Адгезия клетки к матриксу напрямую связана с ее пролиферативными возможностями, и нарушение межклеточных взаимодействий повышает способность опухоли к обретению метастатического фенотипа (Syrigos KN, 1999). В канцерогенезе рака почки наиболее изучена роль таких суперсемейств молекул клеточной адгезии, как кадхерины и иммуноглобулины, среди которых наиболее значимым является уровень экспресии таких молекул, как Е и N - кадхерины, Ksp - кадхерин, CD 44, Е - селектины (Fischer С, 1999, Zolota V, 2002). Наименее изученным из суперсемейств молекул клеточной адгезии при почечно-клеточном раке являются интегрины, хотя при неопластических процессах других локализаций их изучение занимает свое достойное место (Stig Е. 2003; Серегин А.А 2005).

Интегрины состоят из двух нековалентно связанных полипептидых цепей -альфа и бета и обеспечивают адгезию клетки к компонентам межклеточного матрикса и к соседним клеткам и участвуют в передаче сигналов от матрикса к внутриклеточным структурам и регуляторным молекулам (Eliceiri В.Р; 1999). Ген гликопротеина ЗА (GP3A) кодирует бета 3 субъединицу интегринового рецептора, характеризуется PLA полиморфизмом и может быть рассмотрен как объект изучения влияния интегринов на онкогенез рака почки. Даже небольшие интегринового рецептора, обусловленные аллельным полиморфизмом гена

вРЗА, могут изменить особенности поведения всей клетки при различных патологиях. Растущие опухолевые клетки на всех стадиях своего развития широко используют нормальные регуляторные и метаболические субклеточные механизмы и изучение этой взаимосвязи поможет лучше понимать природу злокачественного процесса.

Цель исследования:

Определить влияние аллельного распределения гена ОРЗА на особенности клинического течения рака почки.

Задачи исследования:

1. Проанализировать аллельное распределения гена ОРЗА в генотипе пациентов при раке почки и в контрольной группе

2. Определить относительный риск развития рака почки в зависимости от наличия определенных РЬА генотипов гена ОРЗА.

3. Определить влияние РЬА генотипа гена ОРЗА на процессы онкогенеза, инвазии, метастазирования рака почки на основании встречаемости аллелей РЬА у пациентов в зависимости от ТЫМ стадии.

4. Оценить корреляцию между полиморфизмом гена ОРЗА и степенью дифференцировки опухолевых клеток рака почки.

Научная новизна.

В клинических условиях впервые изучено влияние РЬА генотипа гена ОРЗА на развитие рака почки.

Благодаря включению в исследование пациентов с различными стадиями заболевания по ТЫМ степени впервые изучен вопрос влияния РЬА генотипа на процессы роста опухоли, инвазии и метастазирования.

Впервые установлено, что раковая опухоль у пациентов - носителей гетерозиготного генотипа РЬА1А2 обладает большим метастатическим потенциалом, чем у пациентов с РЬА1А1 генотипом. Определена достоверная взаимосвязь между аллельным распределением гена СРЗА и степенью дифференцировки опухоли.

Практическая значимость.

В ходе проведенной работы определена ценность потенциального молекулярно-генетического маркера прогноза течения рака почки.

Установлено, что у носителей генотипа РЬА1А2 гена вРЗА в 1,8 раза выше относительный риск развития рака почки, чем у лиц носителей генотипа РЬА1А1. Изучение распределения РЬА полиморфизма гена СРЗА в группах больных показало, что у больных носителей генотипа РЬА1А2 в 2,1 раза выше относительный риск развития локализованного рака почки, и в 3,17 раза выше риск развития метастатического ПКР, чем у лиц носителей генотипа РЬА1А1. Выявлено, что наличие у больных гетерозиготного генотипа РЬА1А2 увеличивает относительный риск развития рака почки со степенью клеточной анаплазии выше, чем 01, в 2,25 раза.

Полученные результаты позволяют использовать анализ аллельного распределения гена СРЗА в качестве потенциального маркера, применяемого для улучшения вопросов диагностики и прогнозирования у больных раком почки.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Среди пациентов с ПКР генотип РЬА1А2 встречается достоверно чаще, чем в популяции, а генотип РЬА1А1 - достоверно реже. Частота встречаемости РЬА2А2 генотипа не отличается от популяционных величин.

2. При раке почки пациенты с генотипом РЬА1А2 имеют в 1,8 раза выше относительный риск развития рака почки, чем носители генотипа РЬА1А1.

3. Наличие у больных РЬА1А2 генотипа гена вРЗА в 3,17 раза повышает относительный риск развития метастатических форм ПКР в сравнении с генотипом РЬА1А1. Влияния аллельного распределения гена йРЗА на процессы местной инвазии не отмечено.

4. Носительство генотипа РЬА1А2 у пациентов с ПКР определяет высокий риск развития почечно клеточного рака с более низкой степенью клеточной анаплазии

Апробация работы

Результаты диссертационного исследования отражены в докладе:

на Российском Медицинском Форуме, 19-20 октября 2006, Москва Апробация работы проведена на заседании кафедры урологии и хирургической андрологии РМАПО 27 мая 2008 года.

Внедрение

Полученные результаты позволяют использовать анализ аллельного распределения гена вРЗА в качестве маркера, применяемого для улучшения

вопросов диагностики и прогнозирования у больных ПКР, проходящих лечение в урологической клинике РМАПО на базе ГКБ им. С.П. Боткина.

Теоретические положения диссертации используются для проведения практических занятий, семинаров и лекций клиническим ординаторам, аспирантам и курсантам кафедры урологии РМАПО.

Личный вклад автора

В ходе сбора материала для диссертационной работы были освоены методики ультразвукового исследования, компьютерной томографии почек, а также ПЦР - аиализа для определения РЬА полиморфизма гена бРЗА. Планирование и проведение обследования пациентов (100 человек), расчеты, статистическая обработка результатов, оформление диссертации и автореферата выполнены автором самостоятельно.

Публикации

По теме диссертации опубликовано б печатных работ, в том числе 1 работа - в журнале «Онкоурология», рекомендованным ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов и 3 глав с описанием результатов собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 26 отечественных и 137 зарубежных источников. Работа содержит 13 таблиц и 18 рисунков.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Общая характеристика исследуемых больных

Материалы диссертации составили результаты клинических, лабораторных, инструментальных и морфологических исследований среди пациентов, находившихся на обследовании и лечении в стационаре и поликлинике клиники урологии Российской Медицинской Академии Последипломного Образования на базе ГКБ им. С.П. Боткина и в Московской городской онкологической больнице №62 с ноября 2005 по ноябрь 2006 года.

В наше исследование были включены 100 больных почечно-клеточным раком и 30 пациентов с мочекаменной болезнью, доброкачественной гиперплазией предстательной железы или воспалительными заболеваниями мочевых путей, составивших группу контроля.

Диагноз рака почки был установлен на основе комплексного обследования: УЗИ мочевыделительной системы с применением режимов цветового доплеровского картирования (ЦДК) и энергетического доплера (ЭД); компьютерной томографии почек с контрастным усилением. Патоморфологическое исследование ткани опухоли почки производилось в отделениях патоморфологии ГКБ им. С.П.Боткина и МНИОИ им. П.А.Герцена. Соотношение мужчин и женщин составило 1,13/1,0 или 53 пациента и 47 пациенток соответственно, средний возраст пациентов - 61,3 года. Таким образом, наша подборка соответствовала среднестатистическому эпидемиологическому портрету больного раком почки - преобладание мужчин над женщинами 1,5/1,0, пик заболеваемости - 60-70 лет.

В зависимости от задач исследования были образованы группы сравнения по TNM системе (табл №1) и степени клеточной анаплазии (Grade) (табл №2)

Таблица №1

Распределение пациентов по группам сравнения по системе TNM.

Группы пациентов Характеристика групп по системе TNM Число пациентов (%)

1ая группа Tl-2 No Mo 47 (47%)

2ая группа ТЗ-4 N0-2 Mo 28 (28%)

Зая группа Tl-4 N0-2 М+ 25 (25%)

Всего - 100(100%)

Различное число пациентов в группах связанно с более частым выявлением в настоящее время локализованных форм ПКР, то есть стадии процесса, представленного 1ой группой. Все пациенты 1-ой и 2-ой группы, а также 24 из 25 пациентов 3-ей группы в разные сроки были подвергнуты оперативному лечению по поводу ПКР в объеме радикальной нефрэктомии или резекции почки. Мы применяли систему стадирования TNM 2002 года (The 2002 TNM staging classification system)

Таблица №2

Распределение пациентов в зависимости от степени клеточной анаплазии

Степень клеточной анаплазии Число пациентов (%)

G1 23 (23,9%)

G2 47 (49%)

G 3-4 26(27,1%)

Всего 96(100%)

Тот факт что, один пациент из третьей группы, вследствие выраженных соматических противопоказаний не был нами оперирован, а 3 пациента - двое из первой, один из второй группы, были оперированы в других лечебных учреждениях, где по данным гистологического исследования О степень не определялась, заставило исключить их из групп сравнения по О-степени.

Определение РЬА полиморфизма гена вРЗА.

В нашей работе для определения генотипа пациентов по гену СРЗА мы применили метод ПЦР (полимеразной цепной реакции). Материалом для исследования геномной ДНК пациегов ПКР и группы контроля служили компоненты периферической крови пациентов. Фрагмент гена СРЗА, содержащий области анализируемого РЬА полиморфизма, получали в ходе ПЦР-амплификации при использовании олигонуклеотидных пар праймеров со следующими последовательностями: б-Н^а^^дасис^и-З и 5-tctctccccatggcaaagagt-3. Для идентификации точечной замены в гене СРЗА использовали олигонуклеотидный зонд cttacaggccctgcctc и подходящие смеси дезокси- и дидезоксинуклеозидтрифосфатов (сГЫТР и с!сЮТР). Регистрацию и первичный анализ масс-спектров производили с использованием программного продукта ХМАББ (Вгикег Вакошсэ, Германия), программу ХЮГ V. 1Л (Вгикег Бакошсз, Германия) использовали для последующей коррекции масс-спектров по отношению сигнал/шум и более точного определения значения пиков на спектрах. По наличию в масс-спектрах продуктов реакции пиков, соответствующих ионам определенной ожидаемой молекулярной массы, судили о нуклеотидном контексте гена в данном положении. Определение нуклеотидной последовательности исследуемого участка гена СРЗА в реакции секвенирования проводили путем расчета разниц масс между двумя соседними пиками спектра.

Лабораторная часть исследования проводилась в лаборатории НПФ "Литех".

Статистический анализ

Для объективного сравнения получаемых результатов производилась комплексная оценка достоверности различий в результатах с использованием методов сравнения наблюдаемого и ожидаемого распределения. Показатель Р<0.05 считался статистически значимым.

Расчет границ доверительного интервала относительной частоты РЬА генотипа проводили по формуле: ДИ^х^+^.где: Р - частота исследуемого события г» - число объектов в представленной выборке

I - значение I-критерия Стьюдента для данной выборки при 95%

доверительном интервале

1/2п - поправка на непрерывность

Расчет относительного риска (А) исследуемого события у носителей генотипа РЬА1А2 среди пациентов с ПКР по сравнению с популяционными значениями осуществлялся по формуле: А = (% РЬА1А2 в группе) х (%РЬА1А1 в популяции-) (%РЬА1А2 в популяции) (% РЬА1А1 в группе)

Относительный риск (А) выражался в процентных значениях, границы его указывались с учетом доверительных интервалов (ДИ). Для статистического анализа использовалась программа 81аИ511ка 6.0.

Результаты исследования

1. Анализ аллелыюго распределения гена СРЗА у больных раком почки, в группе контроля н в популяции.

Анализ наблюдаемых и ожидаемых частот генотипа гена СРЗА у пациентов в группе контроля и в популяции показал, что частота встречаемости аллелей гена СРЗА статистически не отличалась в обеих группах (р=0.85). Последнее дало нам право проводить сравнение полученных нами данных в группе больных раком почки с популяционными величинами, как статистически более мощными.

Рабочей гипотезой нашего исследования явилось наличие различий в аллельном распределении гена СРЗА у больных раком почки и в популяции. Генотип РЬА1А1 выявлен у 63 пациентов раком почки, что составило 63% (95% ДИ 53,4-72,6 (%)), генотип РЬА1А2 был обнаружен у 33 больных, то есть у 33% (95% ДИ 23,6-42,4 (%)), генотип РЬА2А2 - 4 пациента - 4 % (95% ДИ 0,08-7,92 (%)).

При анализе наблюдаемых и ожидаемых частот, аллельное распределение гена СРЗА у больных почечно-клеточным раком статистически значимо отличалось от такового в популяции (р< 0,05). Результаты приведены в таблице № 3

Таблица М'З

Аллельное распределения гена йРЗА при раке почки, в группе контроля и в популяции

Группы А1А1 А1А2 А2А2 Р

Рак почки 63% 33% 4%

<0,05

(п= 100) (п=63) (п=33) (п=4)

Контроль 73.4% 23,3% 3.3%

0,85

(п = 30) (п=22) (п=7) (п=1)

Популяция 76% 22% 2% -

2. Анализ аллельного распределение гена вРЗА у больных раком почки в зависимости от "ШМ стадии

Для более подробного изучения влияния РЬА генотипа гена СРЗА на процессы канцерогенеза ПКР, такие как онкогенез, инвазия и метастазирование, было проанализировано аллельное распределение гена вРЗА в зависимости от ТЫМ стадии заболевания.

Нами были получены следующие результаты: в группе больных локализованным раком почки выявлено 28 носителей генотипа РЬА1А1, что составило 59,5% (95% ДИ 45,3-73,7), 17 носителей генотипа РЬА1А2- 36,2% (95% ДИ 22,6-49,8) и 2 носителя генотипа РЬА2А2 - 4,3% (95% ДИ 0-10,28).

В местно-распространенной группе РЬА1А1 генотип выявлен у 23 пациентов -82,1% (95%ДИ 67,3-96,9), генотип РЬА1А2 выявлен у 5 пациентов - 17,9% (95% ДИ 3,1-32,7).

В метастатической группе нами получены следующие результаты; у 12 пациентов выявлен генотип РЬА1А1, что составило 48 (95% ДИ 27,8- 68,7); генотип РЬА1А2 у 11 пациентов- 44% (95% ДИ 24,4- 65,1); и генотип РЬА2А2 у 2 больных - 8% (95% ДИ 1-26) (рис№1) Данные представлены на рисунке № 1.

Рисунок № 1

Зависимость отельного распределения гена ОРЗА от ТИМ стадии у больных раком почки

100 90

70

50

а 30 0)

а 20

я 10

22

популяция

Р<0,05

59,5

36,2

Т1-2ЫоМо

Р=0.34

4,3

17,9

ТЗ-4Ы0-2Мо

Р<0,05

48

Т1-4М0-2М+

■ Р1_А1А1

Р1-А1А2

Р1А2А2

Как видно из рисунка №1 распределение аллелей гена СРЗА при местнораспространенном процессе (Тз-^п-зМо) статистически не отличается от популяционных значений (р=0,34). В тоже время, в группах больных локализованным (То-гТЧоМ») и метастатическим раке почки статистически достоверно повышена частота носительства генотипа РЬА1А2 и снижена частота носительства генотипа РЬА1А1 по сравнению с популяционной (р<0,05).

Расчет относительного риска развития локализованного рака почки у гетерозигот РЬА1А2 по сравнению со средней популяционной частотой показал, что у пациентов-носителей генотипа РЬА1А2 вероятность развития локализованного рака почки в 2,1 (95% ДИ 1,02 - 3,79) больше, чем у лиц носителей генотипа РЬА1А1, а относительный риск развитие метастатического фенотипа при генотипе РЬА1А2 составляет 3,17 (95% ДИ 2,02-4,9) раза.

3. Анализ аллельного распределение гена вРЗА у больных раком почки в зависимости от степени дифференцировки опухоли.

При анализе аллельного распределения РЬА генотипа гена вРЗА в зависимости от степени дифференцировки получены следующие данные: в группе пациентов с высокой степенью клеточной анаплазии (01) РЬА1А1 генотип обнаружен у 16 человек или 69,6 % (95% ДИ 47,1-86,8), генотип РЬА1А2 - у 5 пациентов-21,7% (95% ДИ 7,5-43,7), генотип РЬА2А2 - у 2 больных или 8,7% (95% ДИ 0,1 - 21,9). При умереннодифференцированном раке почки (02) генотип РЬА1А1 выявлен у 27 больных, то есть 57,4% (95% ДИ 50,2 - 64,6), генотип РЬА1А2 определен у 18 пациентов - 38,3% (95% ДИ 31,2 - 45,4) и генотип РЬА2А2 выявлен соответственно у 2 человек - 4,3% (95% ДИ 1,35- 7,3). При выраженной степени клеточной анаплазии (03-4) РЬА1А1 генотип был выявлен у 16 больных, что составило 61,5% (95 % ДИ 40,6 - 79,8), РЬА1А2 генотип представлен у 10 пациентов или у 38,5% (95% ДИ 20,2 - 59,4) Данные приведены на рисунке № 2.

Рисунок М> 2.

Зависимость отдельного распределение гена СРЗА от степени дифференцировки опухоли.

100

90

о н 80

I 70

=г «3 60

С

о 50

з:

X 0) 40

с;

«и Ч 30

Ф а 20

с

о га 10

а

НИ

нн ЯШ

76 59,6

22 2 ■ 1

Р=0,94

Р<0,05

ив

57,4

38,3

Р=0,07

4,3

Р<0,05

ьц в

61,5 К 58,9 И

1 38,5 1 91 38,4

ш

2,7

популяция С1 (п=23) в2 (п=47) в3 4 (п=26) в2-4 (п=73)

№ Р1_А1 Р1.А1 Р1_А1Р1_А2 Р1_А2Р1_А2

Распределение РЬА полиморфизма при высокодифференцированном ПКР (01) статистически не отличается от популяционного (Р=0,94). При раке почки умеренной (02) степени дифференцировки статистически достоверно повышалось носительство РЬА1А2 генотипа и снижалось соответственно РЬА1А1 генотипа (р<0,05), в группе же низкодифференцированных (03-4) опухолей достоверного отличия не получено (р=0,07), что могло быть связанно с небольшой выборкой пациентов. При объединении же для анализа пациентов 2 и 3 групп было определено, что при опухолях со степенью дифференцировки ниже чем 01, имеется статистически достоверное различие аллельного распределения РЬА полиморфизмов гена ОРЗА в сравнении с популяционными величинами (р< 0,05). При расчете относительного риска установлено, что наличие генотипа РЬАIА2 увеличивает относительный риск развития рака почки со степенью клеточной анаплазии ниже, чем 01 в 2,25 раза.

Выводы.

1. У пациентов с ПКР достоверно чаще, чем в популяции встречается РЬА1А2 генотип и достоверно реже - генотип РЬА1А1. Частота встречаемости РЬА2А2 генотипа достоверно не отличается от популяционных величин.

2. Пациенты с генотипом РЬА1А2 имеют в 1,8 раза выше относительный риск развития рака почки, чем носители генотипа РЬА1А1.

3. Наличие РЬА1А2 генотипа гена ОРЗА является статистически достоверным фактором риска развития метастатических форм ПКР, в то время как на развитие местной инвазии такого влияния не отмечено.

4. Носительство генотипа РЬА1А2 среди пациентов с ПКР определяет более высокий риск развития умереннодифференцированной (02) и низкодифференцированной (СЗ-4) злокачественной опухоли почки.

Практические рекомендации.

1. Учитывая более высокий риск развития низкодифференцированных форм раковой опухоли при PLA1A2 генотипе полезен учет этого фактора при планировании объема оперативного вмешательства.

2. Наличие PLA1A2 генотипа гена GP3A определяет большую вероятность метастазирования процесса и при послеоперационном ведении пациентов с данным генотипом необходимо более часто проводить контрольное обследование для выявления возможного рецидива заболевания на ранних стадиях.

3. Для повышения достоверности прогностических номограмм клинического течения рака почки, возможно включение в них определения PLA генотипа гена GP3A.

Список печатных работ по теме диссертации:

1) Серегин A.B., Енгай В.А., Мовсесян В.В., Шустицкий H.A., Кашинцев К.Ю. Клиническое значение аллельного распределения гена GP3A при раке почки. Сборник материалов научно-практической конференции, посвященной 300-летию основания Главного военно- клинического госпиталя имени академика Н.Н.Бурденко. 19мая 2006г. М, 2006; с.145.

2) О.Б. Лоран, A.B. Серегин, A.A. Серегин, К.Ю. Кашинцев. Клиническое значение аллельного распределения гена GP3A при раке почки (предварительные результаты). Материалы I конгресса Российского общества онкоурологов. М, 2006; с. 144

3) Серегин A.B., Кашинцев К.Ю., Шустицкий Н.Е., Енгай В.А., Серегин A.A. Прогностическое значение PLA полиморфизма гена GP3A при раке почки. Актуальные вопросы диагностики и лечения урологических заболеваний:У1 региональной научно-практической конференции урологов Западной Сибири: сборник научных трудов под редакцией доктора медицинских наук, профессора А.И. Неймарка. 10-11мая 2007г.Белокуриха, 2007; с.42-43.

4) О.Б. Лоран, A.B. Серегин, Г.И. Мяндина, A.A. Серегин, H.A. Шустицкий, К.Ю. Кашинцев «PLA полиморфизм гена GP3A - новый фактор прогноза при раке почки». Ж. Онкоурология 2007; 3; с 27-31.

5) О.Б. Лоран, A.B. Серегин, Г.И. Мяндина, A.A. Серегин, H.A.Шустицкий, К.Ю. Кашинцев. PLA полиморфизм гена GP3A как новый фактор прогноза клинического течения рака почки. Материалы II конгресса Российского общества онкоурологов. М, 2007: с. 127

6) А.В.Серегин, К.Ю. Кашинцев, В.А. Енгай, H.A. Шустицкий, A.A. Серегин. PLA полиморфизм гена GP3A как новый прогностический фактор при раке почки. Материалы XI Съезда урологов России. М, 2007, с 223.

Список сокращений:

ДИ- доверительный интервал КТ - компьютерная томография МКА - молекулы клеточной адгезии МРТ- магнитно-резонасная томография ОСО - органосохраняющие операции ПКР - почечно-клеточный рак ПЦР - полимеразная цепная реащия СА — карбоник ангидраза

CD44 - ген, кодирующий семейство гликопротеинов CD95 - белок, медиатор апоптоза

ELAM - молекула клеточной адгезии суперсемейства селектины FHIT - ген - супрессор рака почки GP3A - гликопротеин 3 альфа ген

HIF -молекулярный фактор, регулятор устойчивости тканей к гипоксии

Ki -67 - антиген, участвующий в пролиферации клеток

LOH - анализ потери гетерозиготности

ММР — матриксные металлопротеиназы

PDGF-B - фактор-регулятор неоангиогенеза

PLA1- аллель А1 гена GP3A

PLA2- аллель А1 гепаОРЗА

TGF - фактор-регулятор неоангиогенеза

TNM - система стадирования рака почки

VCAM- семейство молекул адгезии сосудистого эндотелия

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

Introduction & Objectives: Cell adhesion molecules play an important role in pathogenesis of RCC. Glycoprotein Ilia gene (gp3A) encodes the beta chain of integral receptor and contains P1A (Leu33Pro) polymorphism. Earlier we investigated role of GP3A polymorphism in prostate cancer and determined that the P1A2 polymorphism of gp3A gene increases the risk of prostate cancer development and invasion The aim of our study was to examine the association of PI A polymorphism with sporadic RCC patients in Moscow region.

Material & Methods: We determined the genotype of gp3A of 100 patients with RCC and 30 age-matched controls. The Polymerase Chain Reaction method was used.

Results: The distribution of P1A polymorphism in Moscow population is 76% of P1A1/A1 allele, 22% of P1A1/A2 allele and 2% of P1A2/A2 allele. 60 (60 %) RCC patients had P1A1/A1 allele, 33(33%) of patients had PIA1/A2 allele and 4(4 %) of patients had P1A2/A2 allele. The frequency of P1A1/A2 allele was significantly higher in RCC patients -33%, comparing to population (22%) (p<0,02). Analyzing the genotype subject to TNM stage, in patients with localized cancer (Tl-2N0M0) allele P1A1/A1 was determined in 27 cases(60%), P1A1/A2 in 15 (35,6%) and PLA1/A2 in 2 (4,4%). Among the patients with invasive cancer (T3-4N0-2M0) 23 patients had PLA1/A1 allele (82,1%) and 5 (17,9%) - PLA1/A2 . Also 48%(n=13) of patients with metastatic cancer had PLA1/A1; 44,5%(n=12) -PLA1/A2 and 2 (7,5%) - PLA2/A2 alleles. Concerning metastatic group frequency of P1A1/A2 genotype was significantly higher ( 44,5%) then in population (22%) (p=0,02)

The OR RCC development for PLA1/A2 genotype compared P1A1/A1 was 2,1 for localized cancer and 3,17 for metastatic group

Conclusions: The P1A2 polymorphism of gp3A gene increases the risk of RCC development and metastatis. The course of RCC in patients carrying P1A2

polymorphism is characterized by more rapid metastasis development. Comparison results of invasive and metastatic groups can give us some conclusions. PI A2 polymorphism may take more important part in metastatis processes, than in RCC development. This deduction may be trend to future investigations. The determination of P1A polymorphism seems to be a new prognostic factor for RCC and is useful and convenient for high risk patients screening.

Заказ №79/10/08 Подписано в печать 08 10 2008 Тираж 100 экз Уел пл 125

-- ООО "Цнфровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 Л- .) www.cfr.ru; e-maü.info@cfr.ru

Актуальность исследования

Рак почки составляет 3% от всех онкологических новообразований и занимает 10 место по уровню заболеваемости у взрослых (1). Среди впервые выявленных злокачественных новообразований почки 85% занимает почечно-клеточный рак почки (ПКР). ПКР принадлежит одно из ведущих мест по темпам прироста среди онкоурологических заболеваний, так встречаемость почечно-клеточного рака возрастает на 2,5 % ежегодно, а приблизительно у половины пациентов болезнь приобретет системный характер в разные сроки после оперативного лечения (83). В 2003 году в России выявлено 15.000 новых случаев злокачественных опухолей почки (1) в то время как в США в 2005 году диагностировано 36.160 новых случаев заболеваемости и 12.660 смертности от рака почки (84). Прирост заболеваемости злокачественными новообразованиями почек можно конечно объяснить улучшением диагностических возможностей современной медицины, связанных с внедрением в широкую практику объемных методов исследования (ультразвуковой диагностики, компьютерной томографии, магниторезонансной томографии), позволяющих обнаружить асимптомные опухоли небольших размеров (107). Однако отмечающийся рост выявления местнораспространенных и генерализованных форм заболевания позволяет оценить имеющийся «истинный прирост» ПКР (104; 115). Рак почки является одной из самых агрессивных опухолей, так около трети пациентов на этапе первичного диагноза уже имеют местные и отдаленные метастазы (95).

Рак почки в отличие от большинства онкоурологических злокачественных новообразований характеризуется плохим прогнозом -более 40% больных с этим диагнозом погибнет (99). Одной из причин такой печальной статистики является то, что единственно эффективным способом лечения является хирургический. Рак почки практически не чувствителен к традиционной химио- и лучевой терапии, что значительно сокращает арсенал современного уролога. Иммунотерапия, такая как использование высоких доз интерлейкина - 2 (IL - 2), эффективна в очень небольшом проценте случаев (8;32;33;90; 120).

В настоящий момент разработана система диагностики и хирургического лечения ранних стадий рака почки. В то же время, какое либо системное, этиотропное лечение отсутствует. Современный подход к диагностике и лечению рака почки невозможен без знаний генетических аспектов этиологии и патогенеза неопластического процесса. Процесс канцерогенеза без сомнения является сложным и многоэтапным, и каждому его этапу соответствуют определенные генетические, нарушения. Нарушение равновесия в, соотношении «митоз - апоптоз» в сторону угнетения апоптоза и вследствие этого неконтролируемому развитию органонеспецифичных клеток; без сомнения является одним из основных моментов канцерогенеза. Отсутствие окончательной ясности в вопросе регуляции апоптоза заставляет рассматривать 2 возможных пути регуляции «клеточной смерти». Согласно первому, апоптоз является запрограммированным процессом, регулируемый внутриклеточными механизмами, в то время как согласно второй теории, не' исключается возможное воздействие «извне» на вопросы клеточной «жизни и смерти»(19). Молекулы клеточной адгезии, ответственные за процессы; «сигналинга» (проведение сигналов от межклеточных структур к клетке), могут являться одним из звеньев канцерогенеза, в том числе и в отношении рака почки и определение их клинического значения даст нам ценные сведения для возможной выработки новых подходов к диагностике и лечению ПКР: Важность и большое научное значение определения состояния системы «сигналинга», которую обеспечивает связь клетки с внеклеточным матриксом можно продемонстрировать следующим примером. Dawidowitz et all. (2001) повторно' ввели в клетки линии ПКР 786 - О недостающий участок с нормально функционирующим VHL -gene (один из самых известных, органаноспецифичных генов рака почки) и при опытах на мышах добились стойкого супрессорного эффекта. В дальнейшем клетки с вновь введенным VHL (VHL(-)) и клетки, обладающие стабильной экспрессией

VHL ( VHL (+)) были размещены на межклеточном матриксе. В результате клетки VHL(+) дифференцировались в нормальные эпителиальные ткани, в то время как при VHL(-) отмечался бурный рост недифференцированных клеточных структур(50).

В этом ключе актуальным направлением генетических исследований является изучение интегринов - протеинов, ответственных за связь между клетками и межклеточным матриксом. В настоящее время установлена центральная роль интегринов в развитии некоторых злокачественных опухолей человека. В первую очередь это относится к различным формам меланомы и некоторых других злокачественных опухолей кожи. Также идут исследования роли интегринов в процессе канцерогенеза рака предстательной железы (22;68; 106).

В связи с этим, целью настоящего исследования является изучение роли интегринов, и, в первую очередь, аллельного распределения гена GP3A в развитии рака почки и в особенностях ее клинического течения. Ген GP3A кодирует бета 3 субъединицу интегринового рецептора и может быть рассмотрен в качестве объекта исследования роли интегринов при канцерогенезе рака почки.

Цель исследования:

Определить влияние аллельного распределения гена GP3A на особенности клинического течения рака почки.

Задачи исследования:

1. Проанализировать аллельное распределения гена GP3А у пациентов при раке почки и в контрольной группе

2. Определить относительный риск развития рака почки в зависимости от наличия определенных PLA генотипов гена GP3A.

3. Определить влияние PL А генотипа гена GP3A на процессы онкогенеза, инвазии, метастазирования рака почки на основании встречаемости PLA аллелей у пациентов в зависимости от TNM стадии.

4. Оценить связь между аллельным распределением PLA генотипа гена GP3A и степенью дифференцировки опухолевых клеток рака почки.

Научная новизна.

В клинических условиях впервые изучено влияние PLA генотипа гена GP3A на особенности развития рака почки.

Определенно, что порядок распределения аллелей гена GP3A влияет на риск возникновения рака почки, что может быть использовано для улучшения диагностики и прогнозирования клинического течения почечно-клеточного рака.

Благодаря включению в исследование пациентов с различными стадиями заболевания по TNM степени изучен вопрос влияния PLA генотипа на процессы роста опухоли, инвазии и метастазирования.

В ходе исследования установлено, что раковая опухоль у пациентов -носителей PLA1A2 генотипа обладает большим метастатическим потенциалом, чем у пациентов при PLA1A1 генотипе. Определена достоверная взаимосвязь между аллельным распределением гена GP3A и степенью дифференцировки опухоли.

Практическая ценность.

В клинических условиях оценена значимость потенциального молекулярно-генетического маркера прогноза течения рака почки.

Полученные результаты позволяют использовать анализ аллельного распределения гена GP3A в качестве маркера, применяемого для улучшения вопросов диагностики и прогнозирования у больных ПКР, проходящих лечение в урологической клинике РМАПО на базе ГКБ им. С.П. Боткина.

Положения диссертации используются для проведения практических занятий, семинаров и лекций клиническим ординаторам, аспирантам и курсантам кафедры урологии РМАПО.

Апробация диссертации

Результаты диссертационного исследования отражены в докладе:

- на Российском Медицинском Форуме, 19-20 октября 2006, Москва

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав с описанием результатов собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 26 отечественных и 137 иностранных источников. Работа содержит 13 таблиц и 18 рисунков.

Выводы.

1. При раке почки достоверно чаще, чем в популяции встречается PLA1A2 генотип и достоверно реже - генотип PLA1A1. Частота встречаемости PLA2A2 генотипа не отличается от популяционных величин.

2. Пациенты с генотипом PLA1A2 имеют в 1,8 раза выше относительный риск развития рака почки, чем носители генотипа PLA1A1.

3. Наличие PLA1A2 генотипа гена GP3A в 3,17 раза повышает относительный риск развития метастатических форм ПКР в сравнении с генотипом PLA1A1. Влияния аллельного распределения гена GP3A на процессы местной инвазии не отмечено.

4. Носительство генотипа PLA1A2 определяет более высокий риск развития почечно клеточного рака со степенью клеточной анаплазии ниже чем G1.

Практические рекомендации.

Для выделения групп риска возникновения рака почки и прогнозирования его клинического течения целесообразно исследование PLA генотипа гена GP3A.

Учитывая более высокий риск развития низкодифференцированных форм раковой опухоли при PLA1A2 генотипе полезен учет этого фактора при планировании объема оперативного вмешательства.

Наличие PLA1A2 генотипа гена GP3A определяет большую вероятность метастазирования процесса и при послеоперационном ведении пациентов с данным генотипом желательно чаще проводить контрольное обследование для выявления возможного рецидива заболевания на ранних стадиях.

Для повышения достоверности прогностических номограмм клинического течения рака почки возможно включение в них определения PLA генотипа гена GP3A.