Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Клинические,морфологические и генетические предикторы резистентности к стероидной терапии хронического гломерулонефрита у детей

На правах рукописи

РЕЗНИКОВ АЛЕКСЕИ ЮРЬЕВИЧ

КЛИНИЧЕСКИЕ, МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТОРЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К СТЕРОИДНОЙ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА У ДЕТЕЙ

14.01.08 - педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 ОКТ 2013

Москва - 2013

005535011

005535011

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Петросян Эдита Константиновна

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор, Руководитель научно - консультативного

отдела ФНКЦ ДГОИ Николай Николаевич Володин

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой педиатрии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Минздрава РФ Светлана Стояновна Паунова

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Первый Московский Государственный Медицинский Университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России

Защита диссертации состоится «'¿Ь» \ О 2013 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.050.01 при ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, по адресу: 117997 г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

В.М. Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Нефротический синдром (НС), характеризуется массивной протеинурией и гипо-альбуминемией и выраженными отёками, является наиболее распространенным патологическим состоянием поражающим клубочковый аппарат почки у детей [МсЕпегу РТ, Strife FC, 1982]. Гистологическими основами идиопатического НС, наблюдаемого в детском возрасте, наиболее часто являются болезнь минимальных изменений (БМИ), мезангиопролиферативный гломерулонефрит (МезПГН) и фокально-сегментарный гломерулоклероз (ФСГС) (International Study of Kidney Disease in Children (ISKDC), 1978, Habib R, 1993). Доля других морфологических форм, таких как мембранопроли-феративный (МПГН) и мембранозный гломерулонефиты значительно скромнее [Churg J et al, 1970, Habib R, 1993]. В последние годы отмечается тенденция к росту стеро-идрезистентных форм НС у детей. Так по данным международного исследования заболеваний почек наиболее часто встречаемой морфологической формой НС у детей был нефрит с минимальными изменениями. ФСГС и другие морфологические формы наблюдались менее чем в 10% случаев. Более того, 93-98% детей с БМИ и 17-30% с ФСГС были чувствительны к стероидной терапии [ISK.DC, 1981; Tarshish P. et al, 1997]. Стероидрезистентность наблюдалась приблизительно у 20% детей с НС. На основе отчета ISKDC, применение глюкокортикостероидов было рекомендовано в качестве стандартной терапии НС у детей [ISK.DC, 1981].

Однако данные последних проспективных исследований демонстрируют неуклонный рост стероидрезистентного НС (СРНС), обусловленного увеличением встречаемости ФСГС, как морфологической основы НС у детей (Srivastava Т, et al., 1999; Haas M, et al.,1995; Filler G, et al., 2003).

Глюкокортикостероиды как основополагающие препараты при лечении НС при введении в организм взаимодействуют с глюкокортикоидными рецепторами (GR), оказывая противовоспалительное действие (Beato M. et al, 1995). Однако, для них характерны такие побочные эффекты, как нарушение обмена углеводов и липидов (Gwynne JT, et al, 1982; Taylor D. et al, 1986), ожирение и диабет (Bjorntorp P. et al, 2000), нарушение развития скелета и мускулатуры (Leong D et al, 1996) и многие другие.

При использовании глюкокортикостероидов в нефрологии отмечаются многочисленные случаи резистентности к стероидным препаратам, не получившие пока объяснения. По аналогии с другими заболеваниями, предполагается, что основную роль играют мутации в гене глюкокортикоидного рецептора (JiGR). В настоящее время известно более 300 мутаций в этом гене, однако в популяциях европеоидов с частотой более 1% встречаются 5 из них: аминокислотные замены во 2 экзоне N363S и ER22/23EK, мутация участка узнавания рестриктазы TthlIII в 5'-нетранскрибируемой области, мутация участка узнавания рестриктазы Bell во 2 интроне и замена A->G в 3'-нетранслируемой области (Huizenga NA et al, 1998; van Rossum EF et al, 2003). Каждая из них ассоциирована с нарушением функций рецептора и изменением чувствительности к глюкокортикоидам.

Накопленные данные о патогенезе идиопатического НС позволяют предположить, что часть детей со СРНС может иметь первичный дефект клубочкового фильтрата (Antignac С. et al 2002, Kestila M et al., 1998). Недавние исследования показали, что мутации в гене NPHS2, кодирующего подоцин (структурный белок подоцита), ответственны за развитие аутосомно-рецессивного НС (N. Boute, et al., 2000), но также могут быть причиной формирования спорадически возникшего СРНС, наблюдаемого, по данным разных авторов, в 10,5 - 28% (Caridi G., et al., 2003 Weber S., et al., 2004, Ruf R. G., et al., 2004).

Таким образом, чрезвычайно актуальным, в настоящее время, является определение морфологической структуры стероидрезистентного НС у детей и генетических факторов, как возможных предикторов резистентности к иммуносупрессивной терапии.

Цель исследования: Определение клинических, морфологических и генетических предикторов влияющих на эффективность глюкокортикостероидной терапии у детей с хроническим гломерулонефритом.

Задачи исследования:

1. Определить морфологическую структуру стероидрезистентного нефротического синдрома у детей;

2. Определить клинические особенности течения и прогрессирования стероидрезистентного нефротического синдрома у детей;

3. Определить мутацию гена подоцина(МР#52), как возможного фактора развития СРНС;

4. Изучить ассоциацию полиморфных маркеров ER22/23EK, Tthllll, N363S, Bell гена NR3C1 (глюкокортикоидного рецептора) с резистентностью к глюкокорти-коидной терапии;

5. Определить тактику ведения больных стероидрезистентной формой нефротического синдрома с учетом морфологических форм СРНС и генетических данных исследования.

Научная новизна

Впервые в отечественной педиатрической практике изучены морфологические и генетические предикторы стероидрезистентного нефротического синдрома у детей. На основании проведенного исследования сделан вывод о том, что среди морфологических форм СРНС большую часть составляет фокально-сегментарный гломерулосклероз (52%), вторым по частоте встречаемости является мезангиопролиферативный гломерулонефрит (30%), болезнь минимальных изменений наблюдалась в 15% случаев. К морфологическим маркерам прогрессирования СРНС относятся степень фиброза интерсти-ция и наличие «пенистых» клеток (подоциты, эпителий канальцев и клетки интерсти-ция, содержащие включения липидов) в морфобиоптате почек больного. Впервые изучены полиморфные маркеры ER22/23EK, Tthllll, N363S, Bell гена NR3C1 (глюкокортикоидного рецептора) у детей со СРНС. Установлена достоверная ассоциация аллеля

А и генотипов GA и А А полиморфного маркера ER22/23EK и аллеля G полиморфного маркера N363S гена NR3CI с резистентностью к глюкокортикостероидной терапии СРНС. Впервые внедрение генетического исследования мутации гена NPHS2 (подоци-на) в текущем режиме позволило выявить больных с генетически детерминированным стероидрезистентным нефротическим синдром и определить адекватную тактику ведения больного. Установлены морфологические формы СРНС, при которых наблюдается эффективность циклоспорина А и его эффективная лечебная концентрация.

Практическая значимость

Предложена диагностическая система для определения чувствительности к глюкокортикостероидной терапии у пациентов со СРНС, основанная на идентификации мутации и полиморфных маркеров гена подоцина NPHS2 и гена глюкокортикоидного рецептора NR3C1. Носительство генотипа GA и АА полиморфного маркера ER22/23EK гена NR3C1 является независимым фактором резистентности к глюкокортикостероидной терапии детей с хроническим гломерулонефритом. Использование установленной эффективной лечебной концентрации циклоспорина А(1000-1200пг/мл) позволит увеличить процент больных достигающих ремиссии НС.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Среди морфологических форм СРНС большую часть составляет фокально-сегментарный гломерулосклероз (52%), вторым по частоте встречаемости является ме-зангиопролиферативный гломерулонефрит (30%), болезнь минимальных изменений наблюдалась в 15% случаев, и только в 3% случаев отмечался МПГН. Отмечается возрастная изменчивость морфологической структуры СРНС;

2. Наиболее низкая почечная выживаемость отмечается у детей с ФСГС;

3. Генетическое исследование мутации гена NPHS2 (подоцина) в режиме реального времени позволяет выявить больных с генетически детерминированным стероидрезистентным нефротическим синдром и определить адекватную тактику ведения больного;

4. Исследование полиморфных маркеров гена глюкокортикоидного рецептора NR3C1 на ранних этапах формирования НС позволит предположить развитие стеро-идрезистентной формы НС и оптимизировать лечебную тактику;

5. Установлена наибольшая эффективность циклоспорина А (ЦсА) в лечении СРНС у детей, с лечебной концентрацией 1000-1200 нг/мл.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практику работы отделениях нефрологии ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова (зав. отд. М.Б. Бояджян, главный врач - к.м.н. К.В. Константинов) и ФГБУ Российской Детской Клинической Больницы Минздрава России (главный врач - д.м.н., профессор H.H. Ваганов) (зав. отделением -д.м.н. Ю.Б. Юрасова), а также применяются в учебном процессе на кафедре госпитальной педиатрии №1 (зав. кафедрой - д.м.н., профессор П.В. Шумилов) Российского Национального Исследовательского Медицинского Университета им. Н.И. Пирогова (и.о. ректора - д.м.н., профессор А.Г. Камкин).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании кафедры госпитальной педиатрии №1 Российского Национального Исследовательского Медицинского Университета им. Н.И. Пирогова 28

июня 2012г. Материалы и основные положения диссертации доложены на IX Российском конгрессе по детской нефрологии (Москва, 2011), X Российском конгрессе по детской нефрологии (Ростов-на Дону, 2012). IX Российская конференция «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском федеральном округе» (Казань, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы содержит 219 источника (9 отечественных, 210 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 37 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы обследования

Работа выполнена на кафедре госпитальной педиатрии №1 педиатрического факультета Российского Национального Исследовательского медицинского университета (зав. кафедрой - д.м.н., проф. П.В. Шумилов) на базах отделений нефрологии детской Российской клинической больницы (зав.отд. д.м.н. Ю.Б.Юрасова, главный врач- д.м.н., проф. Н.Н.Ваганов) и детской клинической больницы № 13 им. Н.Ф. Филатова (зав. отд. М.Б. Бояджян, главный врач - к.м.н. К.В. Константинов).

Всего обследовано 100 человек: 60 (37д/23м) больных с стероидрезистентным нефротическим синдромом в возрасте от 5,5 мес. до 17 лет 7мес. (10,6+5,5 лет) и 40, составляющие контрольную группу для проведения генетического обследования. Структура обследования представлена на рисунке 1.

Всем больным проводилось стандартное комплексное клинико-лабораторное обследование, включающее в себя сбор анамнеза, физикальный осмотр больного, инструментальные исследования.

Морфологическое исследование почечной ткани пациентов со СРНС с проведением световой и электронной микроскопии, а также иммунофлюоресценции нефробио-птатов проводилось доктором медицинских наук, профессором Варшавским В.А. и кандидатом биологических наук Голициной Е.П. на кафедре патологической анатомии (зав. - академик РАЕН, профессор, доктор медицинских наук Пауков B.C.) В отделе патологической анатомии НИИТи ИО МЗ РФ A.B. Сухановым! С 2010г. световая и им-мунофлюоресцентная микроскопия проводились в лаборатории морфологии ГКБ №52 д.м.н. Столяревич Е.С. Морфологическое исследование биоптата почки методом электронной микроскопии проводилось на базе ЭМ - ГУЗ Патологоанатомического бюро Ростовской области, к.м.н. Повилайтите П.Э.

Анализ эффективности лечебной концентрации циклоспорина А, проведен у 27 больных с непролиферативными формами гломерулонефрита. 27 больных, получавших разные дозы циклоспорина А были разделены на две группы. Дети, имеющие лечебную концентрацию 800-900нг/мл(п=11) и пациенты с лечебной концентрацией 1000-1200нг/мл(п=16).

Рисунок 1. Дизайн исследования

Возраст дебюта заболевания

Биохимические показатели крови

Уровень протеинурии

Уровень гематурии

Уровень АД

Функция почек

Генетическое исследование проводилось в лаборатории арбовирусов в Научно-исследовательском институте вирусологии имени Д.И. Ивановского (зав. лабораторией - проф., д.м.н. Н.В. Логинова).

Нами исследованы четыре полиморфных маркера Tthlll\ (rsl0052957), ER22/23EK (rs6\&9hs6\90), N363S(rs6195), Bell (rs41423247) гена глюкокортикоидного рецептора (GR) NR3C1.

Молекулярно - генетическое исследование предусматривало выделение геномной ДНК из венозной крови человека методом фенол-хлороформной экстракции. В работе использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq®, которая была получена от НПО «Биотех» (Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ООО «Синтол» (Москва). В работе использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq, которая была получена от фирмы "Fermantas" (г. Вильнюс, Литва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО "Синтол" (г. Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0.1% додецилсульфата натрия.

Амплификацию полиморфного участка гена NR3C1 проводили с помощью по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере "Терцик" (ЗАО "ДНК-Технология", г. Москва) с последующим расщеплением рестриктазами и электрофоре-тическим разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле.

Мутации гена подоцина NPHS2 исследовали методом прямого автоматического секвенирования. ДНК больных была выделена из лейкоцитов крови с использованием набора «ДНК-сорб-Б» фирмы Интерлабсервис (Россия) по инструкции, прилагаемой к набору.

Амплификацию фрагментов ДНК, представляющих собой экзоны гена NPHS2 с фланкирующими их последовательностями, проводили на термоциклере Dyad фирмы Bio-Rad (США) с использованием программы для первого экзона: 98*С -5',85*С-5\ 60*С-30",72*С-60" далее 35 циклов по программе 98*С-30", 60*С-30", 72*С-60". Для амплификации первого экзона использовался фермент "ThermalAce DNA Polymerase" фирмы Invitrogen (США).

Остальные экзоны амплифицировали с использованием фермента "HS-DNA Polymerase" фирмы Евроген (Россия) по программе: 95*С-3',95*С-30",60*С-30", 72*С-60",далее 35 циклов по программе 95*С-30",60*С-30",72*С-60"

Характеристика контрольной группы

В качестве популяционного контроля, в котором проводилось генетическое исследование полиморфных маркеров гена глюкокортикоидного рецептора (GR) NR3C1 использовали выборку из 40 человек (24 мужчины и 16 женщин) в возрасте от 27 до 78 лет (средний возраст 50,1+16,5 лет) без хронических заболеваний почек и АГ. Для проведения сравнительного анализа встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров гена подоцина нами использовались данные контрольной группы отражен-

ные в статье К. Maruyama et al.(2003). Частоту встречаемости полиморфного маркера R229Q гена NPHS2 мы сравнили с данными контрольной группой полученной в исследовательской работе Петросян Э.К. (2007). Для проведения генетического обследования получено согласие со стороны родителей и детей (старше 14 лет), что отражено в информированном согласии и одобрено этическим комитетом РНИМУ.

Статистический анализ

Статистическая обработка данных проводилась при помощи компьютерной программы для статистического анализа «Statistica 7,0».

Для проверки статистической значимости различий частотных показателей использовали критерий х2 по Пирсону. При количестве наблюдений меньше 5 использовался точный критерий Фишера. Достоверными считались различия при р < 0,05; 0,05 < р < 0,1 рассматривали как тенденцию к различию. Для выявления и оценки связей между исследуемыми показателями, применялся непараметрический анализ ANOVA и коэффициент корреляции. О силе и направленности связи судили по величине и знаку коэффициента регрессии R. Достоверными считали корреляции с р<0,05. Для описания относительного риска развития заболевания рассчитывали отношение шансов (OR). Вычисления производили с помощью программы Calculator for confidence intervals of odds ratio (David Hutchon). OR = 1 рассматривали как отсутствие ассоциации; OR > 1 как положительную ассоциацию («повышенный риск развития патологии»), OR < 1 -как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием («пониженный риск развития патологии»). Также рассчитывали величину доверительного интервала (CI, confidence interval) - интервала значений, в пределах которого с вероятностью 95% находится ожидаемое значение рассматриваемого параметра, в данном случае, значение OR. Почечную выживаемость оценивали моментным методом Каплана-Мейера с учетом времени от начала заболевания (соответствует моменту появления мочевого синдрома) до исхода. В качестве исхода рассматривали увеличение концентрации сывороточного креатинина выше возрастной нормы и снижения клиренса креатинина ниже 60 мл/мин (по формуле Шварца).

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ морфологического спектра у детей со СРНС показал, что более чем у половины (52%) детей СРНС представлен фокально-сегментарным гломерулосклеро-зом, вторым по частоте встречаемости (30%) был МезПГН, болезнь с минимальными изменениями наблюдалась у 15% пациентов. Иммунокомплексные формы гломеруло-нефрита наблюдались нами в виде мембранопролиферативного гломерулонефрита в 3% случаев (рис. 2)

Рисунок 2. Спектр морфологических изменений в структуре СРНС у обследованных больных.

Такой характер морфологического спектра в целом совпадает с данными зарубежных коллег (Haas М, 1995; Srivastava Т. et al., 1999; Bonilla-Felix М. et al., 1999). Еще в 1994 г. в исследовании D'Agati VD, с последующим анализом спустя год Haas М et al. (1995) продемонстрировано увеличение заболеваемости ФСГС у взрослых. В дальнейшем Bonilla-Felix М et al. (1999) и Kari et al.(2009), опубликовали свои результаты, показывающие значительное увеличение (с 22% до 47%) выявление ФСГС при морфологическом обследовании у детей с идиопатическим НС. Авторы отметили, что высокая доля афро-американцев и азиатов в исследовании могла повлиять на их результаты. В 2003, Filier et al., опубликовали увеличение частоты ФСГС у детей в два раза (в течение 17 лет), из которых 89% были европейцы. Однако, демонстрирующее увеличение ФСГС при НС у детей и изменение структуры гистопатологии НС не является единственной причиной стероидной резистентности у детей.

Полученные нами результаты частоты встречаемости СРНС в разных возрастных группах, демонстрируют его преобладание у детей школьного возраста и подростков, у которых спектр морфологических форм НС приближается к взрослым. Однако более детальный анализ частоты встречаемости различных морфологических форм в различных возрастных группах показал, что для детей грудного и раннего возраста наиболее характерными были болезнь минимальных изменений (44,4%), фокально-сегментарный гломерулосклероз (25,8%) и IgM-нефропатия (28,6%) (рис.3). С возрастом БМИ встречалась значительно реже (11,1% у детей 4-6лет и 11,1% у пациентов младшего школьного возраста). В то же время достаточно высокий процент (33,3%) встречаемости БМИ у подростков может быть обусловлен низкой репрезентативностью нефробиоптата. Динамика ФСГС демонстрирует некоторый спад его встречаемости у детей дошкольного и младшего школьного возраста (9,7% и 19.4% соответственно), и наибольшую долю у пациентов подросткового возраста (45,2%). Аналогичная динамика наблюдается у детей с МезПГН (4-6лет-25%, 7-10лет-25%, 11-15лет-50%) и IgA-нефропатией (4-6 лет-14,3%,7-10 лет-42,9%, 11-15 лет-42,9%). Наличие МПГН только для детского возраста специфично первичное повреждение подоцита в силу разных причин.

Ю

Более того, наше исследование показало, что даже для больных IgA-нефропатией было характерно изменения близкие к изменениям при ФСГС, а lgM-нефропатия у детей всегда характеризовалась сочетанием мезангиальной пролиферации с изменениями структуры подоцита. Преобладание ФСГС как морфологическая основа СРНС отразилось в прогрессирующем течении СРНС и формировании ХПН у большей части (60%) детей в течение 5 лет, поскольку ФСГС характеризуется ранним формированием ХПН (Папаян A.B. и соавт.. 1997, Рябов С.И.,1992). Напротив, формирование ХПН у детей с проли-феративными нефритами чаще отмечалось после 6 лет от начала заболевания, и на ее развитие нередко влиял такой фактор как неадекватная терапия.

120 100 80 60 40 20 о

.. 1

1Ы . s

БМИ ФСГС МезП ГН IgA-нефр. IgM-нефр. мпгн

»4мес.-Згода 44,3 25,8 28,6

■ 4-блет ИД 9,6 25 14,2 28,6

7-Юлет 11,1 19,4 25 42,9 42,8

■ 11-15ДЄТ 33,3 45,2 50 42,9 100

Рисунок 3. Частота встречаемости различных морфологических форм в разной возрастной группе.

Нами выявлено, что у 85% детей СРНС проявлялся в виде смешанной формы (с гематурией и/или АГ), т.о. наличие АГ и гематурии в дебюте НС у детей, на наш взгляд, должно насторожить врача в прогнозе заболевания. Более того 33,3% детей имели изменения в анализах мочи до развития НС. Однако клиническая форма дебюта нефрита не влияла на последующую почечную выживаемость =2.27: р=0,32) (рис. 4), равно как и возраст манифестации заболевания. Причем данная тенденция наблюдалась как при пролиферативных, так и при не пролиферативных формах нефрита (р>0,05) (рис.5, 6).

Рисунок 4. Почечная выживаемость больных с СРНС в зависимости от клинической формы дебюта заболевания

Кумулятивная доля почечной выживаемое™ (Kaplan-Meier) Chi-square - 2,273048 df= 2 р- ,32095 • наличие ХПН 1 отсутствие ХПН

1 9

60 80 100 120 140 160 Длительность заболевания в месяцах

Кумулятивная доля почечной выживаемости (Kaplan-Meier)

Chi-square = 1,398670,df =3 p = 0,70585 • наличиеХПН - отсутствиеХПН

- ;

Ч 1" Т."

і

і і * ......1

0 60 80 100 120 140 160 180 Длительность заболевания в месяцах

Рисунок 5. Зависимость почечной выживаемости больных с ФСГС и БМИ от возраста дебюта заболевания

— 0-Згода

— 4-блет

!.....7-Юлет

-11-15лет

Кумулятивная доля почечной выживаемости (Kaplan-Meier)

Chi-square = 1,335393 df = 3 р = ,70662

о наличие ХПН і отсутствие ХПН

40 60 80 100 120 140 Длительность заболевания в месяцах

Рисунок 6. Зависимость почечной выживаемости больных с МезПГН от возраста дебюта заболевания

-1-Згода

— 4-6лет

— 7-Юлег

— 11-15лет

Мы уже отмечали, что более половины детей со СРНС были представлены больными ФСГС, поэтому у данной категории больных нами проведен детальный анализ почечной выживаемости в зависимости от определенных морфологических маркеров таких как степень фокального и тотального склероза, интерстициального фиброза, наличия или отсутствия «пенистых» клеток и щелевой диафрагмы. Наше исследование показало, что такие маркеры как степень интерстициального фиброза и наличие «пенистых» клеток достоверно влияли на прогрессирующее течение заболевания (р=0,008 и р=0,002 соответственно) (рис. 7, 8).

Кумулятивная доля почечной выживаемости (Kaplan-Meier)

Test statistic = 2,635749 р = ,00840 • наличие ХПН t- отсуствиеХПН

Рисунок 7. Почечная выживаемость больных с ФСГС в зависимости от степени интерстициального фиброза

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 .

Длительность заболевания в месяцах

<30% фіброза >30% фіброза

Кумулятивная доля почечной выживаемости (Kaplan-Meier)

Test statistic = 3,070, р = ,00214 • наличие ХПН : отсутствие ХПН

Рисунок 8. Почечная выживаемость больных с ФСГС в зависимости от наличия или отсутствия пенистых клеток

100 120 1« 160 180 200 220

..... нет ПК

Длительность заболевания в месяцах

Однако нами не выявлено корреляции между степенью снижения концентрационной функции почек и скоростью клубочковой фильтрации. Таким образом, можно говорить, что основным критерием почечной выживаемости может быть только скорость клубочковой фильтрации с одной стороны, а концентрационная функция почек имеет более сложный патофизиологический механизм, обусловленный не только морфологическими изменениями интерстиция почек (рис. 9).

R=0,16; р>0,05

Рисунок 9. Корреляционная зависимость между удельным весом мочи и скоростью клубочковой фильтрации

уцельный вес

скорость клубочковой фильтрации

■ І51 * 81

■ Щ £

1-Я В 1. га ■ KÍ3BÍS

Выявленный нами такой неблагоприятный морфологический маркер как наличие «пенистых» клеток является не случайным. Гиперлипидемия является частым спутником заболеваний почек, в некоторых случаях даже отражающим степень активности почечного процесса. К сожалению, практически всегда наличие нарушений липидного обмена у почечного больного ухудшает прогноз, как за счет ускорения нефросклероза, так и за счет ускорения атеросклероза и развития сердечно-сосудистых осложнений. «Нефротоксическое» действие липидов широко исследуется с 1982 г., когда Моог11еас1 была предложена теория о повреждающем действии гиперлипидемии на эндотелий капилляров клубочков. Липопротеиды, отложившиеся в базальной мембране клеток, связывают отрицательно заряженные гликозаминогликаны и нейтрализуют ее отрицательный заряд, повышая проницаемость мембраны для белков. Помимо этого, фильтрующиеся в клубочках липопротеины, осаждаясь в канальцах почек, индуцируют

13

и тубулоинтерстициальные процессы, склероз интерстиция и развитие почечной недостаточности. При избыточном накоплении крупных липидных включений мезангиаль-ные клетки, макрофаги и эпителиальные клетки канальцев в интерстиции клетки приобретают вид «пенистых» (Смирнов А. В., 1997, Колина И. Б., 2002).

Среди наблюдаемых нами больных у % (25%) пациентов отмечалась отсроченная резистентность к глюкокортикоидам, обуславливающая присоединение второго имму-носупресанта. Однако прогрессирующее течение СРНС, приводящее к развитию ХПН не зависело от чувствительности к стероидам в дебюте (х2 =0,13; р=0,97) (рис. 10).

Кулулятавная доля почечной выживаемсота (Kaplan-Meier) Chi-square= 0,13; df =2 р=0,97

• наличие ХПН • отсутствие ХПН

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

Э о 0,4

-С <0 "0,3

-5 -С X *0,2

о 5< S ГО 0) ф

TL.

60 80 100 120 140 160 Длительность заболевания в месецах

Рисунок 10. Почечная выживаемость больных СРНС в зависимости от чувствительности к преднизолону в дебюте

Лечение стероидрезистентного нефротического синдрома всегда была одной из сложных задач в нефрологии. В нашем исследовании мы провели экспертизу проведенного лечения у всех наблюдаемых нами больных. Следует отметить, что длительность наблюдения за больными составляла от 1,5 лет до 12 лет. И как следствие столь длительного наблюдения мы столкнулись с разными протоколами ведения больных, в которые входили такие препараты как циклофосфамид, хлорамбуцил, циклоспорин А, микофенолаты. Из пятидесяти больных СРНС, циклофосфамид получали 13 человек, эффективность последнего отмечалась только у 4 (30,7%), причем у больных с МПГН эффективность была не длительной, и достижение полной ремиссии было получено при переходе на прием микофенолатов. В целом наши данные, даже в не столь репрезентативной группе, полностью перекликаются с результатами полученными ТагвЫвЬ Р. е1 а1 (1996) и АЬЬауа Н.О. е1 а1 (2003). Неутешительные результаты, полученные еще в двадцатом столетие, при использовании циклофосфамида (ремиссия наблюдалась только в 25% случаев) заставили продолжить поиск других иммуносупрессивных препаратов. Так в 80-90 г.г. активно использовался другой алкилирующий препарат - хлорамбуцил, отличающийся большей эффективностью, однако возможное развитие олигос-пермии ограничило его широкое использование (Кап .1.А. е1 а!, 2006), что отразилось и на нашем исследовании. Хлорамбуцил в нашей выборке получали только четыре человека, эффективность последнего отмечалась только у одной девочки, однако из-за развившейся лейкопении мы вынуждены были сократить длительность использования препарата.

Внедрение циклоспорина А (ЦсА) в лечение стероидрезистентного нефротиче-ского синдрома обнадежило педиатров-нефрологов. Действительно, немало работ посвященных лечению СРНС данным препаратом продемонстрировало весьма утешительные результаты - возможности достижения ремиссии в 80-85% случаев (Hamasaki Y et.al,2009). Начиная с 2004 г. в нефрологическом отделении РДКБ активно используется циклоспорин А. 37 больных с различными морфологическими формами получали циклоспорин А. Нами используются различные схемы терапии. Пациентам с тяжелой формой НС чаще использовалась схема Waldo F. et al. (1987), всего у 24 человек. Остальные 13 детей получали ЦсА в сочетании с пероральным приемом стероидов. Эффективность терапии отмечалась у 29 (78,3%), из них полная - у 20 (54%) детей, частичная - у 9 (24,3%). Отсутствие ремиссии - у 8 (21,7%). Вопросы, связанные с эффективностью ЦсА при НС актуальны до настоящего времени. На протяжении последних лет в литературе дебатируются данные относительно клинической эффективности препарата при разных морфологических вариантах НС у детей со СРНС. Наиболее сложным для лечения оказывается СРНС при фокально-сегментарном гломерулосклерозе (ФСГС). Waldo F. et al. предложили схему терапии ФСГС в виде использования ме-тилпреднизолона (МП) в сочетании с ЦсА. J. Drube et al. (2007) сообщили о 15-летней ремиссии СРНС у пациента, леченного МП и ЦсА. Взяв за основу предложение F. Waldo, О.В. Комарова и соавт. (2006) несколько усовершенствовали этот вариант терапии, удлинив использование внутривенных сеансов пульс-терапии МП в дозе 30 мг/кг до 6-9 введений, после чего применяли ЦсА в средней дозе 5 мг/кг/24 ч в сочетании с преднизолоном 30 мг/48 ч., получив полную или частичную ремиссию почти у 75% из 21 пациента со СРНС и ФСГС, находившихся под наблюдением в течение года. Мы получили сходные результаты. Однако 3 детей с ФСГС достигли ремиссии при сочетании терапии циклоспорином А с микофенолатами (МФ).

Более того, у больных с БМИ и ФСГС мы провели сравнительный анализ разных лечебных концентраций циклоспорина А и выявили, что количество детей достигших полной или частичной ремиссии спустя год от начала терапии, имеющие концентрацию ЦсА в пределах 1000-1200 нг/мл (2вариант) было достоверно больше {■£ =6,68, р=0,01) (табл.1) в сравнении с детьми, имеющие концентрацию 800-900 нг/мл (1 вариант).

Таблица 1

Эффективность лечения циклоспорпном А в зависимости от лечебной

концентрации в динамике

Пациенты 1-2мес. 3-4мес. 6-7мес. 9-12мес.

Р ЧР HP Р ЧР IIP Р ЧР HP Р ЧР HP

1вариант(п=11) 1 2 8 1 4 6 2 5 4 2 5 4

2вариант(п=16) т 4 5 8 5 3 10* 3 3 11* 3 2

Р -ремиссия, ЧР -частичная ремиссия, НР - нет ремиссии.

*- х2 =6,68, р=0,01, в сравнении с 1 вариантом лечения #- х =5,19, р=0,02, в сравнении с 1 вариантом лечения а- х2 =3,76, р=0,05, в сравнении с 1 вариантом лечения

Мы провели анализ зависимости эффективности лечения от использования разных схем терапии: схема Вальдо и изолированное использование циклоспорина А. Нами не получено достоверной разницы в чувствительности к лечению у детей с разной схемой лечения (Б(1, 19)=0,90476, р=0,35345) (рис. 12).

Рисунок 12. Зависимость эффективности терапии от использования схемы Вальдо у больных с ФСГС и БМИ.

W

fij пол. отр.

1Г

эффективность терапии

Десять из 37 пациентов, леченных ЦсА были дети с пролиферативными формами нефрита (IgA- и IgM - нефропатиями). При назначении циклоспорина А, мы руководствовались морфологическими изменениями. В случае, если при IgM-нефропатии (п=5) при электронной микроскопии отмечалось структурное изменение подоцитов в виде тотального или, на значительном протяжении, распластывания «ножек» подоцитов и сочетания аналогичных изменений с фокальным склерозом при IgA-нефропатии (п=5) (вариант II по Haas) мы назначали циклоспорин А. Подбор дозы проводился также как у детей с непролиферативными гломерулонефритами по концентрации препарата в сыворотке крови. Отмечалась различная эффективность терапии циклоспорином А. Часть детей (п=7): IgA-нефропатия (п=4(80%) и IgM-нефропатия (п=3(60%)) достигли полной ремиссии НС, у одного (20%) ребенка (IgA-нефропатия) была достигнута частичная ремиссия. У двоих (40%) больных (IgM-нефропатия) достичь ремиссии вовсе не удалось.

Эффективность ЦсА у больных со СРНС с IgA-нефропатией оценивалась в работе Chabova V et al. (2000) у всех шестерых пациентов спустя год была достигнута частичная ремиссия, при сохранении функции почек.

Появление препаратов микофеноловой кислоты в консервативной нефрологии расширило спектр используемых иммуносупрессивных препаратов, тем самым увеличивая процент достигших ремиссии пациентов (de Mello VR et al, 2010). В нашем исследовании 12 больных получали микофенолаты. Шестеро детей с непролиферативными формами нефрита (ФСГС и БМИ) в связи с рецидивами НС на фоне лечения циклоспорином А получали дополнительно препараты микофеноловой кислоты. На фоне данного лечения полная ремиссия отмечалась у троих детей. У одной девочки достигнута частичная ремиссия. Двое подростков сохраняют активность НС. Интересным оказалось то, что присоединение второго селективного иммуносупресанта в начале,

Current effect: F(1,19)=,90476, p=,35345

Effective h>pothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals

имело выраженный лечебный эффект. Активность НС купировалась у всех детей к концу первого или к началу второго месяца от начала лечения. Однако, у трёх девочек в дальнейшем вновь отмечались рецидивы НС, требующие введения внутривенного ме-тилпреднизолона. У двух из них НС сохраняет свою активность до настоящего времени. У одной удалось добиться частичной ремиссии. Аналогичная схема лечения была использована у двух пациентов с ^М-нефропатией без существенного эффекта -нефротический синдром сохраняет свою активность. Таким образом, из 8 больных СРНС, получавших сочетанную терапию ЦсА и МФ ремиссии достигли только 4 (50%).

Еще четверо больных со СРНС и пролиферативными вариантами нефрита получали микофеналаты в сочетании с низкими дозами стероидов. Сочетание преднизолона с микофенолатами получили один пациент с ^А-нефропатией и трое с МезПГН. Успешной она оказалась только у троих (1 пациент с ^А-нефропатией и 2 - с МезПГН). Следует отметить, что эффективность лечения микофенолатами отмечается спустя 6-9месяцев от начала приема препарата.

Трое детей с ФСГС в связи с неэффективностью лечением циклоспорина А получали такролимус. Доза такролимуса составляла 0,1-0,3 мг/кг/сут с лечебной концентрацией 5-8 нг/мл. Эффективной она оказалась только у одной девочки. У двух других пациентов активность НС сохранялась. Сравнительная эффективность такролимуса и циклоспорина А исследовалась в работе СИоийгу 8 й а\. (2009). Авторами показано отсутствия значимой разницы в эффективности обоих препаратов. Частота развития нефротоксичности, гипертонии и сахарного диабета не отличались между группами. Гипертрихоз и гиперплазия десен значительно чаще встречались у пациентов, получавших циклоспорин А.

Последнее десятилетие ознаменовалась активным изучением молекулярной структуры подоцита и генами, кодирующими структурные белки подоцита. Именно с мутацией в этих генах связывают развитие СРНС у детей в раннем возрасте. В нашем исследовании проведен генетический анализ на определение мутаций в гене подоцина №Н82 34 больным. В группу обследуемых вошли дети с ФСГС, БМИ и ^М-нефропатией, морфологические формы, характеризующиеся повреждением подоцита, с ранним дебютом заболевания и торпидным течением НС. В результате обследования нами выявлены впервые описанные гетерозиготные мутации в 1 экзоне в положении Т63Р(А187С) и Т93Р(А277С) у девочки с поздней манифестацией НС (в возрасте 10 лет 9 мес.), с быстрым выходом в ХПН в течение 2,5 месяцев от начала заболевания. Еще у двух девочек с ранним дебютом заболевания в виде изолированного мочевого синдрома, с сохранившейся функцией почек в течение 22 и 13 лет выявлены гомозиготная мутация в положение Я2290(О686А) в 5 экзоне и гетерозиготные полиморфизмы в положениях Я229(3(0686А) 5 экзона и А297У (С890Т) 8 экзона. Сочетание последних как причина развития НС описано в работе О.СапсН е1 а1.(2003) у двух братьев близнецов, родители которых были носителями одного из полиморфных маркеров. У этих детей при иммуногистохимическом исследовании нефробиоптата с использованием антител к подоцину отмечалась очень низкая экспрессия последнего, что позволило авторам считать данные полиморфизмы причиной развития НС. Роль полиморфного маркера

R229Q как причина СРНС дискутируется до настоящего времени. Ранее было показано, что эта замена ассоциирована с протеинурией и микроальбуминурией (Pereira A.C. et al., 2004). Однако Weber S. et al.,2004), исследовали 319 пациентов из Франции и североафриканских стран, и пришли к заключению, что G755A (R229Q) является лишь полиморфизмом, вероятно не приводящим к развитию протеинурии. В тоже время Karle S. М. et al. (2002), провели исследование 53 пациентов из 27 семей, а также 25 спорадических случаев нефротического синдрома и отметили, что G755A (R229Q) встречался в 3 из 4 семей, имеющих одну мутацию в гене NPHS2. При этом авторы отмечают, что функция аминокислотной замены R229Q неизвестна и относят данную замену к значимым полиморфизмам. С другой стороны, Bakr А. et al. (2008), исследовав 16 египетских пациентов со стероидрезистентным нефротическим синдромом, не обнаружили замены R229Q, также эти авторы не обнаружили и другой известной замены R138Q. Niaudet Р. et al. (2004), указывают на то, что в 10-30% случаев при спорадическом стероидрези-стентном нефротическом синдроме обнаруживается мутация R229Q в гене NPHS2. Хотя, многие авторы оценивают замену R229Q как популяционный полиморфизм (Weber S. et al, 2004), некоторые показывают его ассоциацию с протеинурией, липидемией, микроальбуминурией (Hinkes В. et al, 2008). Hinkes В. et al. (2008), показали, что при семейном нефротическом синдроме замена R229Q присутствует в 27,7% случаев. В нашем исследовании замена R229Q обнаруживалась у 23,5% больных со СРНС (частота мутантного аллеля R229Q составила 14,7%) (табл.2).

Таблица 2

Частота генотипов и аллелей полиморфного маркера G755A гена NPHS2

у детей с СРНС в сравнении с контролем

Аллели Больные СРНС Контролі! Xі Р OR

п = 34 п = 80 знач. 95% CI

Аллель G 0,853 0,981 14,6 0,0001 0,11 0,03 - 0,42

Аллель А 0,147 0,019 9,02 2,40-33,94

Генотип G/G 0,735 0,963 13,4 0,001 0,11 0,03 - 0,43

Генотип О/Л 0,235 0,038 7,90 1,95-32,01

Генотип А/А 0,029 0,000 7,21 0,29-181,50

Это согласуется с ранее опубликованными данными, полученными на европейских и американских выборках (Niaudet P. et al, 2004). Обнаруженная высокая частота данного полиморфизма у детей с СРНС позволяет рассматривать его как причину последнего, однако в ряде работ демонстрируется его сочетание с гетерозиготными мутациями гена нефрина NPHS1 (Мао J. et al. 2006, G.Caridi et al., 2004). Более того, y части больных (п=11) нами выявлен полиморфный маркер G101А впервые описанный К. Maruyama (2003) в японской популяции, аллель А которого достоверно (^2=6.88; р=0.009) ассоциировал со СРНС (табл. 3).

Таблица 3

Частота генотипов и аллелей полиморфного маркера вКНА гена А7РН$2 у детей с СРНС в сравнении с контролем

Аллели Больные СРНС Контроли х2 Р OR

п= 11 п = 44 знач. 95% CI

Аллель G 0,618 0,807 6,88 0,009 0,39 0,19-0.80

Аллель А 0,382 0,193 2,59 1,26-5.31

Генотип G/G 0,545 0,636 10,1 0,006 0,57 0,23-1.42

Генотип G/A 0,181 0,341 0,59 0,22-1.63

Генотип А/А 0,272 0,023 15,48 1,85- 129.49

Ранее в европейской популяции был выявлен синонимичный полиморфизм 01020, который также был выявлен у 8 пациентов из нашей выборки. При отсутствии данных его распространенности в популяции сложно предполагать его роль в развитии НС. Более того, отсутствие замены аминокислоты при данной мутации ставит под вопрос его значимость. Аналогичные выводы можно сделать по полиморфному маркеру Т954С, с которым мы не получили достоверной ассоциации с СРНС.

Другим главным выводом нашего исследования является отсутствие встречаемости мутации 11138(2, которая имеет высокую ассоциацию с СРНС в европейской популяции. Нткев В. е1 а1. (2008), при исследовании 430 пациентов с семейным стероидре-зистентным иефротическим синдромом из европейской популяции отметил, что замена Ш38(3 встречается в 57,5% случаев. В нашем исследовании аминокислотная замена 11138(3 в исследуемой выборке не была обнаружена. Возможно, это связано с особенностями выборки больных стероидрезистентным нефротическим синдромом. Полтавец Н.В. и соавт. (2006), исследовали ген ЫРН52 у 21 ребёнка с СРНС и также не выявили никаких мутаций этого гена. Аналогичные данные получены в работе Корниенко В.Ю. и соавт. (2012). Возможно, для российской популяции данная мутация не является па-тогномоничной.

Отсутствие значимой доли генетически обусловленного стероидрезистентного нефротического синдрома в нашем исследовании обусловило поиск другой причины резистентности к глюкокортикоидной терапии. В последнее время были предприняты усилия в изучении фармакокинетики глюкокортикоидов (ГК) у детей с почечной патологией, их взаимодействие с глюкокортикоидными рецепторами (ГР) и аффинность последних (М. Яовйп ее а1.,1990, Б. Нааск сЧ а1.,1999, А.Р. СаНоШ е1 а1.,2004). Молекулярные механизмы, лежащие в основе стероидной резистентности в спорадических формах НС, обусловленного дисбалансом Т-лимфоцитов до сих пор не выявлены.

Влияние на клетки глюкокортикоиды оказывают через глюкокортикоидный рецептор, который состоит из Ы-концевого трансактивирующего домена, центрального ДНК-связывающего домена и С-концевой гормон-связывающей области (НоИепЬе^ 8.М. й а!.,1988). Знания об этих механизмах подвигло многих ученных к изучению гена ГР при многих заболеваниях. В настоящее время обнаружено большое количество полиморфизмов, однако лишь немногие из них функциональные. Выявлены ассоциации

19

полиморфных маркеров TthllR (rs 10052957), ER22/23EK (rs6189/rs6190), N363S (rs6195), Bell (rs41423247) и GR-9ß (rs6198) с различными метаболическими параметрами и массой тела, аутоиммунными и кардиоваскулярными заболеваниями. Эти генетические полиморфные маркеры ассоциированы с чувствительностью к ГК и изменением уровня кортизола (Manenschijn L et al.,2009), и могут объяснить различия эффективности глю-кокортикостероидной терапии.

Проведенный нами анализ ассоциации полиморфных маркеров TthllR, ER22/23EK, N363S, Bell с СРНС у детей продемонстрировал достоверную ассоциацию лишь одного маркера ER22/23EK. Три полиморфных маркера изучены у больных с рассеянным склерозом TthllR, ER22/23EK и 9ß-G, гаплотипы которых были ассоциированы с резистентностью к ГК и более быстрым прогрессированием заболевания. Однако именно наличие полиморфизма ER22/23EK, а не двух других полиморфизмов повлияло на полученный результат (van Winsen LM et al., 2009). В нескольких исследованиях была изучена ассоциация этих полиморфных маркеров с воспалительными заболеваниями кишечника, в которых не было выявлено ассоциации между полиморфным маркером ER22/23EK и эффективностью ГК (Chen HL, et al. ,2012, G Decorti et al., 2006).

В нашем исследовании мы получили высокую ассоциацию стероидной резистентности при НС у детей с аллелем А, как в гомозиготном так и в гетерозиготном состоянии полиморфного маркера ER22/23EK (х2= 10,81, р=0,001 и х2=Ю,17, р=0,001). В то время как распределение полиморфного маркера TthllR и BcR практически соответствовало таковой в контрольной группе (табл.4).

Таблица 4

Частота генотипов и аллелей полиморфных маркеров N363S, Tthllll, ER22/23EK,

Bell гена NR3C1 у больных с СРНС в сравнении с контрольной группой

Ген Аллели/ генотипы Больные СРНС Контролі! X2 Р OR

п = 60(%о) п = 40(%о) знач. 95% CI

ER22/ 23ЕК Аллель G 0,875 1,000 10,8 0,001 0,04 0,00-0,72

Аллель А 0,125 0,000 23,65 1,39-401,27

Генотип G/G 0,767 1,000 10,2 0,001 0,04 0,00 - 0,68

Генотип G/A 0,217 0,000 23,02 1,33-399,45

Генотип А/А 0,017 0,000 2,04 0,08-51,39

У детей с вторичной резистентностью к стероидам отмечалась ассоциация с полиморфными маркерами N363S (/>6,31. р=0,01и х2=4,85, р=0,03) и ER22/23EK (х2=13,5, р=0,0002 и х2=12,1, р=0,002) (табл.5).

Для других полиморфных маркеров также не выявлено достоверной ассоциации. Обнаруженная ассоциация вторичной резистентности с полиморфным маркером N363S, с которым, напротив, связывают чувствительность к глюкокортикоидам (N.A. Huizenga et al., 1998, P.J. Bray et al., 2003, A. Stevens et al., 2004), возможно определяет отсроченную резистентность к стероидам у больных СРНС и влияние других факторов на развитие резистентности.

При изучении ассоциации наличия АГ у детей со СРНС со всеми полиморфными маркерами выявлена достоверная ассоциация со всеми полиморфными маркерами. Причем для таких полиморфных маркеров как N363S и ER22/23EK вновь была достоверная ассоциация с аллелем G (х2=5,78, р=0,02 и х2=4,63, р=0,03) и А соответственно (х2=5,68, р=0,02 и х2=3,83, р=0,05).

Таблица 5

Частота генотипов и аллелей полиморфных маркеров N363S, Tthllll, ER22/23EK, Bell гена NR3C1 у больных с СРНС, с вторичной резистентностью к стероидам в

сравнении с контрольной группой.

Ген Аллели/ генотипы Больные СРНС Контролі! X2 Р OR

п = 15(%о) п = 40(%о) знач. 95% CI

N363S Аллель А 0,866 0,988 6,31 0,01 0,10 0,01-0,87

Аллель G 0,134 0,013 10,13 1,14-89,69

Генотип Л/Л 0,800 0,975 4,85 0,03 0,12 0,01-1,11

Генотип A/G 0,133 0,025 6,16 0,60-63,21

Генотип G/G 0,067 0,000 5,65 0,22- 144,75

ER22/ 23ЕК Аллель G 0,800 1,000 13,5 0,0002 0,03 0,00 - 0,56

Аллель А 0,300 0,000 32,20 1,79-578,73

Генотип G/G 0,666 1,000 12,1 0,002 0,03 0,00 - 0,59

Генотип G/A 0,266 0,000 25,46 1,33-485,85

Генотип А/А 0,066 0,000 5,65 0,22- 144,75

Напротив полиморфные маркеры Tthllll и Bell имели очень высокую ассоциацию с наиболее часто встречающимся в популяции аллелями С (х2=14,5, р=0,0001 и Х2=13,3, р=0,001) и G (х2=8,01, р=0,005и х2=8,46, р=0,01) соответственно (табл.6).

Полученные данные нельзя однозначно трактовать, поскольку патофизиологические механизмы АГ у детей с НС настолько многогранны, что какой из них превалирует у каждого ребенка сложно определить. Можно лишь предполагать, что у большей части детей в нашем обследовании АГ возникала и в результате влияния стероидов, обеспеченное частичной чувствительностью ГР к глюкокортикоидам. Проведено лишь несколько исследований о роли полиморфизма N363S в чувствительности к экзогенным ГК. Szabö V et al. (2007) продемонстрировали варианты полиморфных маркеров NR3C1 гена, способствующие развитию стероидной гипертензии. У 102 пациентов, перенесших фоторефракционную кератэктомию и получавшие стероиды в рамках послеоперационной терапии, отмечалась значительная корреляция между N363S гетерозиготным генотипом и глазной гипертензией. Кроме того, у 48 пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна, получавших преднизолон или дефлазакорт, N363S носители GG-генотипа дольше сохраняли мышечную функцию (Bonifati DM et al, 2007).

Пятнадцать больных со СРНС за время нашего наблюдения сформировали хроническую почечную недостаточность. Во многом формирование ХПН зависит и от эффективности терапии. Нами проведен анализ выживаемости в зависимости от носи-тельства различных генотипов исследуемых нами полиморфных маркеров гена NR3C1 у больных СРНС.

Таблица 6

Частота генотипов и аллелей полиморфных маркеров N363S, Tthllll, ER22/23EK, Bell гена NR3C1 у больных СРНС с наличием АГ в сравнении

с контрольной группой

Ген Аллели/ генотипы Больные СРНС с АГ Контролн X2 Р OR

п = 29(96«) п = 40(%о) знач. 95% CI

N363S Аллель А 0,897 0,988 5,78 0,02 0,11 0,01-0,94

Аллель G 0,103 0,013 9,12 1,07-77,92

Генотип А/А 0,828 0,975 4,63 0,03 0,12 0,01-1,12

Генотип A/G 0,138 0,025 6,24 0,66 - 59,09

Генотип G/G 0,034 0,000 4,26 0,17-108,46

Tthllll Аллель С 0,966 0,713 14,5 0,0001 11,30 2,54-50,19

Аллель Т 0,034 0,288 0,09 0,02-0,39

Генотип С/С 0,931 0,525 13,3 0,001 12,21 2,55-58,40

Генотип С/Т 0,069 0,375 0,12 0,03-0,59

Генотип Т/Т 0,000 0,100 0,14 0,01-2,66

ER22/ 23ЕК Аллель G 0,931 1,000 5,68 0,02 0,08 0,00-1,43

Аллель А 0,069 0,000 13,29 0,70-251,95

Генотип G/G 0,897 1,000 3,83 0,05 0,09 0,00-1,88

Генотип С/Л 0,069 0,000 7,36 0,34- 159,39

Генотип А/А 0,034 0,000 4,26 0,17-108,46

Bell Аллель G 0,845 0,625 8,01 0,005 3,27 1,41-7,59

Аллель С 0,155 0,375 0,31 0,13-0,71

Генотип G/G 0,793 0,450 8,46 0,01 4,69 1,57-13,98

Генотип G/C 0,103 0,350 0,21 0,05-0,84

Генотип С/С 0,103 0,200 0,46 0,11-1,92

Получив достоверную ассоциацию прогрессирования НС с генотипом йО полиморфного маркера N3635 гена ЫКЗС1(х2=Ю,9, р=0,004) (рис.12), лишь подчеркивает неоднозначное действие глюкокортикоидов в организме человека, в том числе и при НС. Поскольку высокие дозы стероидов, используемые при лечении НС и позволяющие добиться ремиссии заболевания одновременно запускают механизмы облегченного апоптоза и связанного с ним развития фиброза (8сЬбпепЬег§ег Е. й а1., 2011).

Рисунок 12. Почечная выживаемость у больных СРНС в зависимости от генотипов полиморфного маркера N.3635 гена N1130.

( Kaplan-

!Й9Є№£ІКЮО ЭЕюоздх X ЕФ

Meier)

Chl-square ■ 10,91316 df = 2 p ■ ,00427

• наличиеХПН отсутствие ХЛН

60 80 100 120 140 Длительность заболевания в месяцах

Таким образом, в нашем исследовании продемонстрирована морфологическая структура стероидрезистентного нефротического синдрома у детей, ее возрастная изменчивость. Выявлены наиболее эффективные иммуносупрессивные препараты при разных морфологических формах СРНС, а также режим их дозирования. Показана необходимость проведения генетического исследования на определение мутации гена подоцина в текущем режиме, для установления аутосомно-рецессивного стероидрезистентного нефротического синдрома с целью подбора корректной тактики ведения больного. Более того, выявленная ассоциация развития стероидрезистентности при НС с полиморфными маркерами гена глюкокортикоидного рецептора позволила установить один из механизмов резистентности к стероидной терапии у детей с НС.

Выводы

1. Стероидрезистентный нефротический синдром у детей представлен следующими морфологическими формами: ФСГС - у 52% больных, МезПГН - у 30% пациентов, БМИ наблюдались у 15% пациентов, и только в 3% случаев отмечался МПГН. У 85% детей стероидрезистентный НС сочетался с гематурией и/или АГ.

2. У 65% больных дебют СРНС наблюдается в возрасте 7-15 лет. У 13 (21,6%) больных заболевание манифестировало в грудном и раннем возрасте и гораздо реже (13,3%) оно дебютировало в возрасте 4-6 лет. Более того, для детей грудного и раннего возраста наиболее характерными были болезнь минимальных изменений (44,4%), фокально-сегментарный гломерулосклероз (25,8%) и ^М-нефропатия (28,6%). У больных дошкольного возраста преобладал МезПГН (25%) и ^М-нефропатия-28,6%. У детей младшего и старшего школьного возраста преобладали такие морфологические формы как ФСГС (64,6%), МезПГН (75%), ^А-нефропатия (83%) и у подростков отмечался МПГН (100%).

3. Хроническая почечная недостаточность развилась в 23,3% случаев СРНС. У' 60% больных сформировавших ХПН в течение первых 50 месяцев от начала заболевания преобладала морфологическая форма в виде ФСГС, больные с пролиферативными формами нефрита формировали ХПН спустя 6 лет от начала заболевания. Почечная выживаемость СРНС не зависела от клинической формы дебюта хронического гло-мерулонефрита (х2=2,27; р=0,32). Степень интерстициального фиброза и наличия «пенистых» клеток, выявленные в нефробиоптате, достоверно влияли на прогноз ФСГС (р=0,008 и р=0,002 соответственно).

4. Из 34 больных с СРНС у 8,8% больных причиной развития СРНС являлась мутация гена подоцина ЫРН82. Установлена достоверная ассоциация с аллелями А и генотипами ОА и АА полиморфных маркеров ОЮ1А и в686А гена подоцина ЫРНЯ2 с СРНС (р<0,05).

5. Установлена достоверная ассоциация аллели А (р<0,05) и генотипов в А и А А (р<0,05) полиморфного маркера ЕЯ22/23ЕК гена М?ЗС/с первичной и вторичной резистентностью к ГК. Вторичная резистентность к стероидной терапии у детей с СРНС ассоциирована с аллелем в и генотипом вв полиморфного маркера ШбЗБ (р<0,05).

6. Наличие АГ у больных СРНС достоверно ассоциировано со всеми исследуемыми полиморфными маркерами гена N11301 (р<0,05). Однако выраженная скорость про-грессирования заболевания достоверно отмечалось у больных носителей генотипа вО полиморфного маркера N3635 гена ШЗС1 (х2=10,9, р=0,004).

7. Эффективность циклофосфамида и хлорамбуцила отмечалась только в 30,7% и 25% случаев у больных со СРНС соответственно. Результативность терапией ЦсА отмечалась у 78,3% больных (с пролиферативными и непролиферативными формами нефрита), из них полная - у 54% детей, частичная - у 24,3%. Отсутствие ремиссии

24

отмечалась у 21,7% детей. При этом у больных с ФСГС и БМИ отмечались следующие показатели: полная ремиссия - у 48,2% детей, частичная - у 29,6%, отсутствие ремиссии - у 22,2% детей. У больных с IgA-нефропатией (второй класс по Haas), отмечалась высокая эффективность ЦсА: у 80%-полная ремиссия и у 20%-частичная ремиссия. Для больных с IgM-нефропатией ЦсА был эффективен только в 60% случаев. Сочетанное использование ЦсА и МФ приводило к развитию полной ремиссии только в 50% случаев. У детей с пролиферативными формами нефрита (МезПГН, МПГН и IgA-нефропатия) МФ в качестве индукционной и поддерживающей терапии были эффективны в 83,3% случаев.

8. Доказана достоверная эффективность лечебной концентрации в пределах 1000-1200нг/мл циклоспорина А в точке С2(р<0,05).

Практические рекомендации:

1. Наличие смешанной формы НС у детей в дебюте заболевания сопряжено с высокой вероятностью развития стероидрезистентной формы нефротического синдрома.

2. Всем детям с ранним дебютом НС и торпидным течением следует проводить генетическое исследование гена подоцина NPHS2.

3. При назначении циклоспорина А детям с СРНС, следует добиться насыщения его концентрации в пределах 1000-1200нг/мл в т. С2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Reznikov A. Polymorphic marker er22/23ek and n363s of the nr3cl gene in children with steroid resistant nephrotic syndrome (srns). Kornienko V., Petrosyan E., Seregin J. // 43th Annual Meeting of European Society Pediatric Nephrology.-Birningham-2008.-P.81

2. Резников A.IO. Мутация гена подоцина NPHS2 у детей со стероидрезистентным нефротическим синдромом. Корниенко В.Е., Петросян Э.К., Цыгин А.Н, Носиков В.В. // Материалы XIV конгресса педиатров России « Актуальные проблемы пе-диатрии»-Москва,2010. Вопросы современной педиатрии- 2010- Т.5 №2.-с. 674

3. Резников АЛО. Лечение стероидрезистентного нефротического синдрома у детей. Юрасова Ю.Б., Гаврилова В.А., Сагалович М.Б., Петросян Э.К., Мухина Ю.Г. // Детская больница 2011, №2 стр. 55-57.

4. Резников A.IO. Ассоциация полиморфных маркеров гена глюкокортикоидного рецептора у детей с стероидрезистентным нефротическим синдромом. Тихомиров Е.Е., Гаврилова В.А., Юрасова Ю.Б., Петросян Э.К. //Клиническая нефрология -2012, №5-6, стр. 45 - 48.

Список, использованных сокращений

АГ - артериальная гипертония

БМИ - болезнь минимальных изменений

ГК - глюкокортикостероиды

ГР - глюкокортикоидный рецептор

МезПГН - мезангиопролиферативный гломерулонефрит

МПГН - мембранопролиферативный гломерулонефрит

МП - метилпреднизолон

МФ - микофенолаты НС- нефротический синдром СРНС - стероидрезистентный нефротический синдром ФСГС - фокально-сегментарный гломерулосклероз ХПН - хроническая почечная недостаточность ЦсА - циклоспорин А

ISKDC - International Study of Kidney Disease in Children

Подписано в печать. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 Экз. Заказ № 10071 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39