Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Клинические и патогенетические аспектыиммуноморфологических исследований материалабольных пузырчаткой и другими буллезными дерматозами

На правах рукописи

Г 0 Д

МАХНЕВА Наталия Викторовна

Клинические и патогенетические аспекты иммуноморфологических исследований материала больных пузырчаткой и другими буллезными дерматозами

14.00.11 - кожные и венерические болезни 14.00.36 - аллергология и иммунология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Московском областном научно-исследовательском клиническом институте

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор В.А. Молочков доктор медицинских наук, профессор Л.В.Белецкая

Официальные оппоненты:

член-корр.РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Н.С.Потекаев доктор медицинских наук, профессор И.В.Петрова Ведущее учреждение: Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится 28 мая 1997 г. в 12 часов на заседании специализированного совета Д 074.10.01 при Центральном научно-исследовательском кожно-венерологическом институте Министерства здравоохранения РФ по адресу: 101076, Москва, ул.Короленко, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического института МЗ РФ

Автореферат разослан апреля 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат медицинских наук

Н.К.Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее актуальных проблем в клинике пузырных кожных заболеваний является установление точного диагноза с целью подбора адекватных методов терапии. Современная медицина обладает целым рядом эффективных средств, позволяющих успешно подавлять развитие патологического процесса при пузырных заболеваниях [Глухенький Б.Т., Грандо С.А., 1990; Машкиллейсон А.Л., 1990]. Однако те же средства обладают нередко побочным действием, нарушающим функцию тех или иных физиологических систем организма. Например, кортикостероиды, азатиоприн, метотрексат и другие. Принцип лечения заболеваний, при которых одним из патогенетических факторов являются аутоанти-тела, направленные к антигенам тканевых структур, сходен для многих медицинских областей. Однако, также как в клинике кожных заболеваний, разные формы патологии требуют различные схемы лечения, в частности разные дозировки, назначаемых препаратов. Учитывая возможные осложнения, необходимо применять оптимальные дозы, т.е. наименьшие дозы, позволяющие достигать терапевтического эффекта. Оптимальные дозы препаратов при таких заболеваниях как вульгарная пузырчатка, буллезный пемфигоид, дерматит Дюринга также как и схемы их лечения значительно отличаются друг от друга [Грандо С.А., 1989; Машкиллейсон А.Л., 1990]. Назначение излишне больших доз кортикостероидоз и цитостатиков при любой из форм пузырных заболеваний неоправдано. Поэтому необходима тщательная дифференциальная диагностика. Существующие данные [Беренбейн Б.А.. 1995; ВеШпег Е.Н. е( а1., 1964, 1973] свидетельствуют о том, что применение ряда иммунологических методов, в том числе метода иммунофлюоресценции, в дополнение к клиническому обследованию во многих случаях позволяют уточнить диагноз. Полученные нами предварительные результаты подтверждают эти наблюдения. Однако, например, встречаются ложноположительные реакции в прямой иммунофлюоресценции, которые могут быть вызваны приемом лекарственных препаратов, при болезни Гроувера (МШпб ,1.1.. е1 а!., 1980], афтозном стоматите [Созаа-Рогет I. е1 а!., 1985], или ложно-отрицательные (непрямой метод) - либо в начале заболевания, либо в стадии ре-

миссии. Таким образом, иммунофлюоресцентный метод, применяемый в комплексе с другими исследованиями, при диагностике акантолитической пузырчатки, требует усовершенствований, которые бы позволили сократить количество как ложнополо-жительных, так и ложноотрицательных реакций до минимума. В доступной нам литературе нет сведений о попытках стабилизировать реакции иммунофлюоресценции и фиксировать растворимые иммунные комплексы в тканях, результаты которых существенно дополнили бы возможности кпинико-лабораторной диагностики.

Цель настоящей работы: разработать дополнительные способы дифференциальной диагностики пузырных заболеваний с помощью антител к антигенам различных структур кожи и иммуноморфологического метода исследования биопсии кожи и слизистых оболочек, покрытых многослойным плоским эпителием, при сопоставлении полученных результатов с клиническими и морфологическими наблюдениями.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи исследования:

1. Определение процента больных с положительной реакцией иммунофлюоресценции в межклеточной склеивающей субстанции многослойного плоского эпителия среди контингента больных пузырчаткой в Московской области.

2. Изучение возможности использования биопсии интактной кожи при иммуногисто-химических исследованиях больных с локализацией патологического процесса в недоступных областях (слизистых оболочках полости рта, носа, гениталий) для выявления характерной иммуноморфологической картины при акантолитической пузырчатке.

3. Разработать способ стабилизации иммунных комплексов и фиксации иммуноглобулинов в тканях при пузырных заболеваниях в случав слабой аффинности антитканевых антител с целью выявления их в срезах биопсии кожи и слизистой оболочки.

4. Разработать схему дополнительного иммуноморфологического анализа биопсии кожи и слизистой оболочки полости рта с использованием моноклональных и по-

ликлональных антител к антигенам тканевых структур (коллаген IV типа, цитоке-ратины клеток базального слоя многослойного эпителия и другие).

Научная новизна исследования:

Впервые сделана попытка стабилизации реакции иммунофлюоресценции в :резах биопсии кожи с целью выявления фиксации в тканях слабоаффинных ауто-знтител и растворимых иммунных комплексов .

Использован молекулярно-биологический подход с применением монокпональ--1ых и поликлональных антител к антигенам тканевых структур кожи для дополни--ельной характеристики патологического процесса при буллезных заболеваниях.

Практическое значение:

Проведение иммунологических и иммуноморфологических исследований для голучения дополнительных данных с целью установления или уточнения диагноза 1узырных заболеваний и подбора адекватных методов терапии.

Положения выносимые на защиту :

1. Предложен метод повышения процента положительных реакций в межклеточной склеивающей субстанции при акантолитической пузырчатке, включая периоды ремиссии, а также на фоне медикаментозного лечения.

2. Установлен факт участия растворимых иммунных комплексов в патогенезе большинства случаев (10 из 12-ти) семейной пузырчатки Хейли-Хейли.

3. Получена с помощью поликлональных и моноклональных антител к антигенам кожи (коллаген IV типа базальных мембран эпидермиса и сосудов дермы, антиген базальной мембраны, специфичный для эпидермиса, цитокератины клеток базального и дифференцированных слоев эпидермиса) дополнительная молеку-лярно - биологическая характеристика изменений в коже при пузырных заболеваниях (акантолитическая пузырчатка, буллезный пемфигоид, дерматит Дюринга, приобретенный буллезный эпидермолиз, линейный lgA-зависимый дерматоз).

Апробация работы: Материалы диссертации доложены на V Российском съез-¡е специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 24-26 мая 1995 г.); на VII

Российском съезде дерматологов и венерологов (5-7 июня 1996 г., г.Казань), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию ЦНИКВИ (Москва, 1996 г.)..

Структура диссертации:

Диссертация изложена на 183 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, иллюстрирована 52 рисунками, 6 таблицами. Библиографический указатель включает 48 отечественных и 339 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на основании клинического обследования и изучения био-псийного материала 106 больных различных нозологических групп, включая 39 больных акантолитическим пемфигусом (29 больных вульгарным пемфигусом, 7 больных себорейным пемфигусом, 2 больных листовидным пемфигусом и одного больного вегетирующим пемфигусом), 12 больных доброкачественной семейной пузырчаткой Хейли-Хейли, 13 больных буллезным пефигоидом, 5 больных дерматитом Дюринга, 10 больных, страдающих токсикодермией, и 27 - различными другими кожными заболеваниями (псориаз, склеродермия, пруриго, стрептодермия, дискоид-ная, диссеминированная и системная красная волчанка, витилиго, рецидивирующий герпес, чесотка, красный плоский лишай, пузырно-сосудистый синдром, линейный 1дА-зависимый дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз, плоскоклеточный рак, демодекс). Обследование больных проводилось в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ (Московский областной научно-исследовательский клинический институт) и в Московском областном кожно-венерологическом диспансере (МОКВД).

В каждом случае диагноз заболевания ставился на основании анамнестических сведений, клинической картины, результатов цитологического, патоморфологическо-го, иммунологического и иммуноморфологического исследований.

Цитологическое и патоморфологическое исследования проводились в лаборатории МОКВД и в отделении патоморфологии МОНИКИ соответственно. Иммунологические и иммуноморфологические исследования были проведены автором на базе лаборатории трансплантационной иммунологии НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (заведующая, кандидат биологических наук Ф.С.Баранова).

Первичная обработка биопсийного материала. Под местной анестезией 0,5% раствором новокаина проводилась биопсия кожи (из пораженных и клинически непораженных участков) или слизистой полости рта размером 0,3 х 0,5 см. Кусочки тканей кожи или слизистой замораживали при -20 С. Срезы толщиной 5 мкм готовили в криостате (-20 С) и использовали часть серийных срезов в нефиксированном виде, а другую часть предварительно обрабатывали мягко денатурирующими 40-60% смесями этанола при комнатной температуре. Криостатные серийные срезы, фиксированные 96 этанолом, окрашивали гематоксилином и эозином с целью морфологического контроля.

Метод выявления фиксированных антител (иммуноглобулинов) и иммунных комплексов. Применяли классический метод прямой иммунофлюоресценции [Белецкая Л.В., Данилова Т.А., 1977; Beutner Е.Н. et al., 1973] с использованием моноспецифических люминесцирующих сывороток против IgG, IgA, IgM и сыворотки против третьего компонента комплемента (НИИЭМ им.Н.Г.Гамалеи АМН РФ). В отдельных случаях была использована сыворотка против Clq-компонента комплемента.

Серийные криостатные срезы помещали на предметное стекло, подсушивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывали в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS), рН 7,0-7,4, в течение 10 мин с целью удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывали люминесци-рующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против иммуноглобулинов классов G, М, A, C1q- и СЗ-компонентов комплемента в течение 30 мин. Затем вновь промывали PBS в течение 10 мин и заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. С целью предохранения срезов от выгорания в люминес-

центном микроскопе в глицерин добавляли кристаллик пара-фенилендиамина [Лей-си А., 1992].

Модифицированный метод прямой иммунофлюоресценции. Предлагаемый нами способ диагностики пузырчатки путем иммунофлюоресцентного метода отличается тем, что при нем производят предварительную обработку срезов водной смесью этанола или диоксана [Белецкая Л.В., Махнева Н.В.. 1995 ].

Модифицированная методика (изобретение N94036174/14): использовались срезы фиксированные (1-3 мин) в стабилизирующем растворе 40-60% этанола или диоксана. Исходные 96 этанол или 1,4-диоксан (РЕАХИМ, Шостка) принимали за 100%. После освобождения срезов от водной смеси этих органических растворителей подсушиванием при комнатной температуре и промывкой в сменяемом физиологическом растворе 5 мин партии срезов обрабатывали люминесцирующей сывороткой против Ig человека класса G. Обработку проводили 30 мин во влажной камере при комнатной температуре, промывали 5 мин и заключали в 60% нейтральный глицерин под покровное стекло. Исследовали срезы в люминесцентном микроскопе LABORLUX (LEIKA, Германия) с объективом 40. Часть срезов, фиксированных 96 этанолом, окрашивали гематоксилином и эозином и изучали в световом микроскопе. В качестве контроля использовали сыворотки против альбумина и фибрина.

Метод выявления циркулирующих аутоантител. Метод НИФ при исследовании циркулирующих в крови больных аутоантител был использован в принятой форме [Белецкая Л.В., Данилова Т.А., 1977]. При изучении циркулирующих в крови антител криостатные срезы готовили из тканей кожи человека и ряда видов лабораторных животных (мыши, крысы, кролики, обезьяны). Одновременно ставили положительный и отрицательный контроли. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку (человека) в тех же разведениях и инкубировали на срезе столько же времени, как и испытуемую сыворотку, содержащую антитела. В качестве положительного контроля использовали заведомо известную сыворотку, содержащую антитела против изучаемого антигена.

Выявление шпокератинов. Использовали моноклональные антитела (МкАТ) к цитокератинам базально-клеточного слоя двух серий (А4, А6/1), надбазальных слоев серии В5/1 и серии ММ к общим антигенам всех слоев эпидермиса, полученные в НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ [ Вавилов A.M. и др., 1989; Силагадзе Д.Г. и др., 1989; Белецкая Л.В. и др.. 1991]. При этом характеризовали цитокератины соответственно современной номенклатуре [Mol! R. el al., 1982]. МкАТ А6/1 направлены к цитокератину N5, А4 - К14, В5/1- к антигенам клеток дифференцированных слоев эпидермиса, ММ - к общему антигену кератиноцитов как низкодифференцирован-ных, так и высокодифференцированных слоев эпителия.

В НИФ применяли люминесцирующие сыворотки против lg мышей (НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ). Серийные срезы кожи толщиной 5 мкм готовили в крио-стате (-20 С) и использовали в нефиксированном виде. При нанесении монокло-нальных антител на срезы препараты выдерживали в течение 18 ч при 4 С во влажной камере. После промывки в течение 10 мин в PBS (рН 7,2) срезы обрабатывали люминесцирующей сывороткой против lg мышей в течение 30 мин во влажной камере, вновь промывали PBS 10 мин и заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Исследовали препараты с помощью люминесцентного микроскопа LABORLUX (LEIKA).

Выявление антигенов основного вещества базальной мембраны эпителия. При исследовании антигенов базальной мембраны кожи больных использовали МкАТ серии Мб, по косвенным данным, относящиеся к антителам против одного из антигенов lamina densa [Коган М.Г. и др., 1988]. В НИФ применяли люминесцирующие сыворотки против lg мышей. Серийные криостатные срезы толщиной 5 мкм в нефиксированном виде, промывали 10 мин в PBS рН 7,0, после нанесения МкАТ на срезы препараты выдерживали в течение 18 ч при 4 С во влажной камере. После промывки в течение 10 мин в PBS рН 7,0 срезы обрабатывали люминесцирующей сывороткой против иммуноглобулинов мышей в течение 30 мин во влажной камере при комнатной температуре, вновь промывали PBS 10 мин и заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин.

Выявление коллагена IV типа базальной мембраны эпителия и сосудов кожи. Срезы толщиной 5 мкм готовили в криостате (-20 С) и использовали в нефиксированном виде. Для выявления коллагена IV типа использовали антисыворотку, приготовленную на кроликах и предоставленную С.П.Домагвтским (Кардиоцентр АМН РФ). В НИФ использовали меченные изотиоцианатом флюоресцеина антитела к lg кролика (НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ). Срезы предварительно смачивали PBS рН (7,0), наслаивали сыворотку против коллагена и помещали во влажную камеру на 45 мин при комнатной температуре или на 18 ч при 4 С. После промывки в PBS 10 мин срезы обрабатывали мечеными антителами к IgG кролика в течение 30 мин, снова промывали и заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин.

Выявление экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости I и II класса. Использовали МкАТ к HLA I класса серии ИКО-53 и антитела к Н LA II класса серии ИКО-1. Для выявления HLA I класса использовали срезы в нефиксированном виде, для выявления антигенов II класса срезы фиксировали последовательно по 10 мин соответственно В 50% и 100% холодном ацетоне (+4 С). Подсушивали, промывали в PBS. После нанесения антител срезы оставляли на ночь при +4 С, промывали в PBS (10 мин) и обрабатывали 30 мин люминесцирующими антителами к lg мышей. После окончательной промывки заключали в 60% нейтральный глицерин.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Акантолитический пемфигус - это достаточно редкое специфическое аутоиммунное заболевание кожи и других органов, где патогенетическая роль принадлежит циркулирующим аутоантителам, направленным к антигенам межклеточной склеивающей субстанции: белкам десмосомального аппарата и молекулам адгезии многослойного плоского эпителия [Ежов Н.Я.. 1974; Beutner Е.Н. et al., 1964; Jablonska S„ 1975; Amagai M. et al., 1992]. Известно, что эти аутоантитела обладают высокой специфичностью и относятся к классу иммуноглобулина G, причем доминирующим субклассом в патогенезе пемфигуса является иммуноглобулин G4 [Матушевская Е.В. и др., 1995; Rock В. et al., 1989; Shirakata Y. et al., 1990]. Исследования некоторых авторов [Amagai M. et al., 1994] в настоящее время позволили установить принадлеж-

ность антигенов-мишеней при аутоиммунной пузырчатке к семейству кадгеринов, что позволяет рассматривать пемфигус как антикадгериновое аутоиммунное заболевание [ТЫуоЫ Л. е! а!., 1995]. Учитывая разнообразие клинических и нередко атипичных форм проявлений данного заболевания [А1ЬегНп1 в. а!., 1990; ОпЬо Н. е! а!., 1994; СИогге1эк1 Т.Р. е! а1., 1995] все более часто клиницисты сталкиваются с необходимостью использования дополнительных методов с целью постановки точного диагноза, четкой дифференциальной диагностики между отдельными группами буллезных дерматозов и проведения адекватной терапии. Благодаря изучению аутоиммунного пемфигуса на молекулярно-биологическом уровне стало возможным более широкого исследования патогенеза этого заболевания на современном этапе и расширения практических клинических знаний [ТЬК/о1е1 и. е1 а1., 1995]. Учитывая выше описанное, мы усовершенствовали метод прямой иммунофлюоресценции, как наиболее перспективный метод диагностики аутоиммунных заболеваний, с целью повышения процента положительных реакций в межклеточной склеивающей субстанции при атипичных формах проявления акантолитического пемфигуса. Также на молекулярно-биологическом уровне с помощью поликлональных и моноклональ-ных антител к антигенам различных тканевых структур многослойного плоского эпителия попытались изучить некоторые стороны патогенеза аутоиммунного пемфигуса и других буллезных дерматозов и тем самым найти дополнительные маркеры, позволяющие провести между ними более точную дифференциальную диагностику при поэтапном обследовании больного.

Работа выполнена на базе данных клинического обследования и изучения био-псийного материала 39 больных акантолитической пузырчаткой и других буллезных дерматозов. В качестве контроля использовали биоптаты кожи 67 больных различными кожными патологиями и 13 недерматологических больных.

По нашим данным аутоиммунному пемфигусу наиболее подвержены жители города (68,%). Среди больных акантолитическим пемфигусом преобладают женщины в возрасте 61-70 лет (88,8%) и мужчины в возрасте от 51 года до 60 лет (70%). У подавляющего большинства больных (46,2%) диагноз был выставлен спустя 6 меся-

цев после начала появления первых признаков заболевания, что привело к моменту обследования к углублению и распространению процесса. Частой формой проявления истинной пузырчатки является вульгарная пузырчатка, причем наибольший процент больных имеет поражение кожи (64,1%) без видимого вовлечения в патологический процесс слизистой оболочки. Локализуется чаще патологический процесс на коже спины (90%) и груди (76,7%). В отдельных случаях было отмечено поражение слизистых оболочек без клинических проявлений на коже (12,8%).

Нами отмечено, что клиническая картина акантолитического пемфигуса на современном этапе претерпевает эволюцию, что подтверждает мнение ряда авторов [СИогге^к! Т.Р. е1 а1., 1994, 1995]. Чаще наблюдается полиморфизм кожных проявлений: папулы, склонные к слиянию и образованию фигур с полициклическими очертаниями, бляшки, эритематозные высыпания, пузыри с тонкой или плотной покрышкой, эрозии, корочки. Отмечается наличие интенсивного зуда. Ранее описанные признаки классического акантолитического пемфигуса такие как наличие пузырей и положительного симптома Никольского встречаются лишь в 28,2% и 48,7% случаев соответственно.

Для уточнения и подтверждения клинического диагноза, как отмечалось выше, мы использовали цитологический, патоморфологический, иммунологический и имму-номорфологический методы исследования.

Цитологическое исследование мазков-отпечатков содержимого пузыря или материала со дна эрозий на наш взгляд недостаточно информативен, т.к. акантолити-ческие клетки были обнаружены только в 59,4% случаев. При этом акантолитиче-ские клетки могут наблюдаться и у больных другими заболеваниями: хронической доброкачественной семейной пузырчаткой Хейли-Хейли, экземе, фолликулярным дискератозом Дарье и различными вирусными пузырьковыми поражениями кожи [Глухенький Б.Т., Грандо С.А., 1990; Тгапк А., 1948].

При патоморфологическом изучении биопсийного материала из очага поражения и участка на вид здоровой кожи нами отмечено, что выявление акантолиза и образование микроскопических внутриэпидермальных пузырей наблюдается как в по-

раженной коже, так и на участках кожи свободных от клинических проявлений патологического процесса, в 82,1% и 87,2% (при р=0,5) случаев соответственно, т.е. практически с одинаковой частотой. Это позволило в дальнейшем исследовать только непораженные участки кожи, что значительно менее травматично для больного. Несмотря на высокую информативность гистологического метода (по нашим данным и данным патоморфологического отделения в сумме типичные изменения отмечались в 93,2%) сходные морфологические изменения наблюдаются при некоторых других заболеваниях, например, себорейном дерматите, импетиго, розовом лишае, буллезной многоформной экссудативной эритеме, вегетирующей пиодермии, болезни Дарье [Lever W.F., 1990].

Известно, что в сыворотке больных акантолитической пузырчаткой содержатся аутоантитела, направленные к антигенам межклеточной склеивающей субстанции многослойного плоского эпителия, образующие в тканях иммунные комплексы [Ма-тушевская Е.В. и др., 1996; Romanenko G.F. et al., 1979]. Иммунные комплексы, которые локализуются в межклеточных пространствах многослойного плоского эпителия больного, оказывают токсическое воздействие, приводящее к разрушению межклеточных структур, в том числе десмосом, и к последующему разрыву связей между отдельными клеточными элементами, развитию акантолиза и образованию пузырей. При некоторых формах пузырчатки этот процесс, как известно, приводит к тяжелым последствиям. Некоторые авторы считают, что выявление антител и фиксированных иммунных комплексов во многих случаях позволяет не только подтвердить диагноз, но и прогнозировать дальнейшее течение заболевания [Грандо С.А., 1989; Jablonska S., 1975]. Однако в наших исследованиях с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции специфические аутоантитела были выявлены только в 70,4% случаев. При этом титры антител(от 1: 5 до 1: 10240) не всегда коррелировали с клиническими проявлениями, что подтверждает данные и других авторов [Cozzani E.et al., 1994; Emery D.J. et al., 1995]. Трудности при использовании этого метода мы испытывали в подборе субстрата тканей кожи человека и ряда видов лабораторных животных. При этом различия в реакциях на срезах тканей разных ви-

дов животных с сывороткой одного и того же больного в титрах носили выраженный количественный характер.

С целью обнаружения фиксированного иммуноглобулина класса G в межклеточной склеивающей субстанции эпидермиса больного мы использовали классический метод прямой иммунофлюоресценции, который по представлению ряда авторов [Беренбейн Б.А., 1995; Beutner E.H. et at., 1973] является наиболее перспективным в диагностике пузырчатки. Особая практическая ценность метода иммунофлюоресценции при данном заболевании, как указывалось, связана с тем, что она позволяет отдифференцировать его от других хронических буллезных дерматозов [Nicolas J.F. et al., 1993; Kumar V. et al., 1994].

Классическим методом прямой иммунофлюоресценции при исследовании кожи больных пузырчаткой выявлена иммуноморфологическая картина, характерная для аутоиммунного пемфигуса в 34 случаях из 39 (87,1%). В отдельных группах больных процент был еще ниже (77,8%). Иногда степень реакции была настолько слаба, что не позволяла с уверенностью подтвердить диагноз пузырчатки.

В 46,2% случаев обнаружен только один класс иммуноглобулина (IgG) по межклеточной склеивающей субстанции без видимого участия других классов иммуноглобулинов и СЗ-компонента комплемента. Последний факт позволяет предположить участие в патогенезе пемфигуса доминирующего комплемент нефиксирующего субкласса иммуноглобулина G4 [Yamada Н. et al„ 1989]. При этом необходимо отметить, что нередко наблюдалась одновременная фиксация иммуноглобулинов классов А и М в самых различных структурах эпидермиса и дермы, что можно объяснить наличием у больных сопутствующих антител, которые могут являться отягощающими основное заболевание факторами. Фиксация СЗ-компонента комплемента в некоторых структурах многослойного плоского эпителия, не связанных с межклеточной субстанцией была выявлена в 51,3% случаев. Эти данные подтверждают мнение ряда авторов об активации системы комплемента при пузырчатке [De Messias I.T. et al., 1989] и возможности изолированной экспрессии комплемента в тканевых структурах [Baldwin W.M. et al., 1995].

При использовании классического метода прямой иммунофлюоресценции встречаются трудности в виде ложноположительных и ложноотрицательных имму-номорфологических реакций. Ложноположительные реакции при прямой иммуноф-люоресценции встречаются при некоторых других заболеваниях кожи и слизистых, таких, например, которые могут быть вызваны действием лекарственных препаратов, при болезни Гроувера, афтозном стоматите [Mils V. et al., 1980; Coscia-Porazzi L. et al., 1985]. При этом необходимы тщательный анализ и сопоставление клинических и лабораторных данных. Ложноотрицательные и слабые реакции, не позволяющие с уверенностью поставить диагноз пузырчатки, отмечаются либо в начале заболевания, либо в период ремиссии и на фоне медикаментозного лечения. Отрицательные реакции иммунофпюоресценции в срезах биопсии в этих случаях могут быть связаны с синтезом небольших трудноуловимых количеств аутоантител к антигенам межклеточной склеивающей субстанции. Кроме того, негативные результаты могут быть получены в связи со слабой аффинностью (степенью связывания с антигеном) аутоантител и быстрым распадом иммунного комплекса, а также с наличием в тканях иммунных комплексов в растворимой форме [Кормейн Р.Х., Асгар С.С., 1983; Белецкая Л.В., Махнева Н.В., 1995]. Наличие ложноотрицательных результатов (по нашим данным 12,9%, а в некоторые, по-видимому, сезонный периоды - до 23%) снижает ценность реакции, в связи с чем, применяемый способ не во всех случаях позволял подтвердить диагноз.

Мы усовершенствовали технику иммунофпюоресценции и разработали метод, позволяющий повысить процент положительных реакций в тканях биопсии кожи больных пузырчаткой. Предложен модифицированный метод прямой иммунофпюоресценции (изобретение N94036174/14), который заключается в предварительной обработке криостатных срезов в течение 1-2 мин 50% водной смесью этанола. Данный способ позволил получить 100% (при р=0,001) положительных реакций в межклеточной склеивающей субстанции эпидермиса кожи больных пузырчаткой и наблюдать более четкую иммуноморфологическую картину, что заставило нас в дальнейших исследованиях использовать этот метод. Предполагается, что механизм

усиления реакции заключается в стабилизации растворимых иммунных комплексов. В эпидермисе кожи больных недерматологическими заболеваниями ни до, ни после обработки 50% этанолом в межклеточных пространствах эпидермиса типичной для пузырчатки картины локализации иммуноглобулина не обнаружено. Фиксации сывороточных белков плазмы крови в просветах сосудов при этом не наблюдалось, она отмечалась лишь при использовании этанола в более высоких концентрациях (70100%).

С помощью модифицированного метода прямой иммунофлюоресценции были исследованы биоптаты кожи 12-ти больных доброкачественной семейной пузырчаткой Хейли-Хейли. При обработке принятым методом прямой иммунофлюоресценции срезов кожи больных данной патологией ни в одном случае реакция в межклеточной склеивающей субстанции отмечена не была. Исключение составляла зона эпидермиса, прилегающая к пузырному образованию, где отмечалась фиксация иммуноглобулинов в следовых количествах. Сходную картину наблюдали и некоторые другие авторы [Hospital-Gil М. et al., 1992]. После использования предварительной обработки срезов 50% этанолом в 10-ти случаях из 12-ти в эпидермисе удалось выявить значительное количество иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах эпидермиса, т.е. в локализации, характерной для пузырчатки. Таким образом, любой вид иммунных комплексов, в том числе и растворимых, надо полагать, способен вызывать разрушение тканевых структур, частности десмосомального аппарата, и участвовать в патологическом процессе.

Следует предположить, что предлагаемый метод может быть использован в иммуноморфологических исследованиях при анализе разных иммунопатологических процессов. Однако для работы с другими органами и тканями необходим дополнительный подбор условий выявления растворимых иммунных комплексов.

Для выявления иммунных комплексов в многослойном плоском эпителии в случаях локального патологического процесса только на слизистых оболочках полости рта, носа, гениталий, когда взятие биопсийного материала затруднено, метод прямой иммунофлюоресценции и его модификация позволяют выявить иммунные ком-

плексы в клинически непораженных участках кожи больных. Это явление можно объяснить генерализованным характером патологического процесса при аутоиммунной пузырчатке.

При иммуноморфологическом исследовании биоптатов кожи больных другими дерматологическими заболеваниями, в том числе буллезными дерматозами, мы наблюдали характерную для каждой нозологии картину. С помощью метода иммуноф-люоресценции удалось диагностировать такое редко наблюдаемое заболевание как линейный lgA-зависимый дерматоз. Необходимо отметить, что при исследовании биоптатов кожи больных различными буллезными дерматозами, в частности с поражением дермо-эпидермального соединения, кроме фиксации основного иммуноглобулина, составляющего диагностический признак, можно обнаружить нередко фиксацию иммуноглобулинов и других классов, но как правило в меньшем количестве.

При использовании моноклональных антител к антигенам ряда тканевых структур кожи (цитокератины №№5 и 14 базального слоя и цитокератин супрабазальных слоев многослойного эпителия, коллаген IV типа, антиген lamina densa) с целью изучения молекулярно-биологических сдвигов в тканях при изучении булпезных дерматозов были отмечены особенности, характерны© для некоторых их этих Заболеваний.

При определении синтеза цитокератинов №№5 и 14 клетками базального слоя эпидермиса больных акантолитической пузырчаткой и других буллезных дерматозов с помощью моноклональных антител двух серий (А6/1 и А4) была отмечена различная иммуноморфологическая картина в эпидермисе серийных срезов одного и того же больного, что свидетельствует о существовании разных белков в скелете клеток базального слоя эпидермиса [Белецкая Л.В. и др., 1991]. Так, при аутоиммунном акантолитическом пемфигусе четко определяется картина дефекта синтеза кератина №5 кератиноцитами камбиального слоя эпидермиса, выражающегося в одновременном проявлении участков отсутствия экспрессии кератина или истощения (экспрессия остается только в местах соединения полудесмосом кератиноцитов с ба-зальной мембраной) и "возбуждения" синтеза или сохранения ранее синтезирован-

ного белка в цитоплазме не только клеток базального, но и частично шиповатого слоя. При этом экспрессия кератина №14 не была нарушена (наличие реакции в цитоплазме клеток только базального слоя). В противоположность этому заболеванию при семейной доброкачественной пузырчатке Хейли-Хейли отмечена четкая картина нарушения синтеза кератина №5 в виде экспрессии его в цитоплазме клеток не только базального слоя, но и всех дифференцированных слоев эпидермиса. При этом синтез кератина №14 полностью отсутствовал. Идентичная иммуноморфологи-ческая картина наблюдалась при токсикодермии и псориазе, что свидетельствует о нарушении нормальных циклов дифференцировки эпителия кожи при этих заболеваниях.

При аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермально-го соединения было отмечено, что при буллезном пемфигоиде полностью отсутствовал синтез кератина №5 клетками базального слоя эпидермиса и было снижено в клетках количество кератина №14. При дерматите Дюринга наблюдалась экспрессия кератина №5 в цитоплазме клеток как базального, так и шиповатого слоев, причем сосредоточение материала было вокруг ядер клеток, что свидетельствует о нарушении нормальной структуры цитоскелета. С помощью моноклональных антител, определяющих кератин №14, при данной патологии в сочетании с витилиго выявлено отсутствие синтеза кератина на протяженных участках эпидермиса и присутствие его на незначительных участках в клетках рогового слоя и на поверхности кожи. При линейном 1дА-зависимом дерматозе экспрессия кератина №5 выявлена в цитоплазме базального и шиповатого слоев эпидермиса, в противоположность этому синтез другого полярного ему кератина не был нарушен.

Так, можно констатировать различный характер нарушения синтеза кератинов при разной патологии, что дает возможность использовать это наблюдение для дальнейшего изучения характера патологического процесса. В ряде случаев эти различия могут быть использованы для диагностических целей.

При исследовании в срезах биоптатов кожи больных акантолитической пузырчаткой и другими дерматологическими заболеваниями синтеза цитокератинов клет-

ками более дифференцированных супрабазальных слоев эпидермиса с помощью моноклональных антител серий В5/1 и ММ было установлено незначительное снижение образования кератинов, характерных для этих слоев, по-видимому, в результате нарушения димеризации кислых и основных цитокератинов.

При исследовании антигенов базальной мембраны (антиген lamina densa и коллаген IV типа) кожи больных с различной кожной патологией с помощью моноклональных антител серии Мб и поликлональной сыворотки против коллагена IV типа была выявлена разная иммуноморфологическая картина при разных патологических состояниях.

Так, при исследовании биоптатов кожи больных акантолитической пузырчаткой с помощью антител серии Мб практически во всех случаях были отмечены разрыхление или утолщение базальной мембраны, а также места отсутствия реакции им-мунофлюоресценции в зоне базальной мембраны с явлениями секвестрации белкового материала на поверхность кожи. Это можно объяснить повреждающим действием иммунных комплексов на клетки, синтезирующее основное вещество базальной мембраны, в результате которого нарушается нормальная продукция ее белков. Факт выявления материала, положительно реагирующего с моноклональными антителами серии Мб, в эпителии подтверждает наличие выделительной функции кожи [Beletskaya L., Baranova F., 1993]. Сходная иммуноморфологическая картина наблюдалась и при других аутоиммунных буллезных дерматозах таких как приобретенный буллезный эпидермолиз, красная волчанка, а также при системной склеродермии, токсикодермиях и псориазе.

При семейной доброкачественной пузырчатке Хейли-Хейли, буллезном пемфи-гоиде, очаговой склеродермии и линейном lgA-зависимом дерматозе синтез основного вещества базальной мембраны (lamina densa) не был нарушен.

Исследования по состоянию коллагена IV типа базальной мембраны эпидермиса и сосудов кожи с помощью антиколлагеновой сыворотки практически во всех исследуемых случаях выявили нарушение синтеза коллагена IV типа базальной мембраны эпителия и сосудов.

Так, практически во всех исследуемых случаях акантолитической пузырчатки наблюдались на большом протяжении разрыхление базальной мембраны, а местами - участки отсутствия реакции иммунофлюоресценции в зоне базальной мембраны с явлениями секвестрации коллагена на поверхность кожи. При доброкачественной семейной пузырчатке Хейли-Хейли в большинстве случаев синтез и структура коллагена IV типа базальной мембраны эпидермиса и сосудов кожи был сохранен.

Наиболее интенсивное разрушение коллагеновых волокон базальной мембраны эпидермиса и скопление белкового материала в эпителии с явлениями его элиминации на поверхность кожи при одновременном сохранении базальной мембраны сосудов кожи наблюдали при буллезном пемфигоиде. При этом отмечено, что в случаях, когда в области базальной мембраны имеются значительные количества гранул иммунных комплексов, коллаген IV типа либо выявляется лишь в небольших количествах, либо не выявляется вовсе.

В результате токсического действия иммунных комплексов на различные структуры тканей, в частности на базальную мембрану, происходит в большей или меньшей степени либо нарушение нормальной продукции коллагена мембраны эпителия, либо нарушение сборки коллагеновых волокон. При этом благодаря естественному пути элиминации белков, не связанных с тканевыми структурами, выявляется положительно реагирующий с антисывороткой материал в эпителии и на его поверхности. Разрыхление и утолщение базальной мембраны эпителия с небольшими участками секвестрации коллагена IV типа наблюдали при токсикодермиях, псориазе, системной склеродермии, различных формах красной волчанки, приобретенном буллезном эпидермолизе, линейном 1дА-зависимом дерматозе. Причем наряду с деструкцией базальной мембраны эпителия констатировали утолщение стенок сосудов при псориазе и системной склеродермии. Последнее также наблюдали в случаях дерматита Дюринга при полном сохранении структуры коллагена IV типа базальной мембраны эпителия.

Поскольку при буллезном пемфигоиде аутоантитела направлены непосредственно к антигенам базальной мембраны, то и картина разрушения структур, связан-

ных с коллагеном IV тала, при этом заболевании наиболее выражена. Это может быть использовано в качестве дополнительных признаков при дифференциальной диагностике заболеваний.

При исследовании экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимо-сти класса I с помощью моноклональных антител серии ИКО-53 во всех исследуемых случаях (акантолитический пемфигус, дерматит Дюринга, системная красная волчанка, рецидивирующий герпес, распространенный псориаз) отсутствовало выраженное угнетение синтеза антигенов. При исследовании экспрессии антигенов класса II (Н1А-01Ч) с помощью моноклональных антител серии ИКО-1 практически во всех исследованных случаях больных аутоиммунным процессом в дендритных клетках (Лангерганса) отмечено либо снижение экспрессии антигенов (при буллез-ном пемфигоиде, диссеминированной красной волчанке), либо полное подавление (при акантолитическом пемфигусе, дискоидной красной волчанке). В эндотелиаль-ных клетках сосудов дермы нарушение экспрессии ША-ОИ отметить не удалось. Возможно, что клетки Лангерганса, таким образом, отражают нарушения в иммунной системе больного и сами также не способны полноценно выполнять свою функцию. Отчасти подавление экспрессии Н1_А-01Ч может быть связано с иммуносупрессант-ным действием лечебных препаратов. Учитывая, что исследования по экспрессии Н1А I и II класса на клеточных элементах кожи проводились на небольшом количестве больных (19 человек) с аутоиммунными дерматозами, другими кожными заболеваниями мы не можем сделать определенных выводов, но считаем необходимым продолжение этого направления исследования в дерматологии, что должно способствовать пониманию ряда сторон патогенеза заболеваний. Это, возможно, также подскажет пути разработки дополнительных диагностических методов.

Таким образом, для постановки точного диагноза наряду с клиническими данными необходимо как можно более широко использовать дополнительные методы исследования, включая методы иммунофлюоресценции и его модификацию для выявления в тканях фиксированных иммуноглобулинов и иммунных комплексов, а также использовать и другие признаки для дифференциальной диагностики, например,

определение характера синтеза цитокератинов и оценка состояния белков базаль-ной мембраны эпидермиса и сосудов кожи.

ВЫВОДЫ:

1. С помощью метода прямой иммунофлюоресценции при изучении серийных криостатных срезов биоптата кожи 39 больных Московской области разными формами акантолитической пузырчатки (вульгарной, вегетирующей, листовидной и себо-рейной) в разные периоды от 77,8% до 87,1% случаев в межклеточной склеивающей субстанции эпидермиса выявлена фиксация иммуноглобулина класса в - локализации типичной для данного заболевания.

2. В случаях трудно доступного для исследования локального патологического процесса только на слизистых оболочках полости рта, носа, гениталий для выявления иммунных комплексов в тканях использовали интактные участки кожи больных. При этом во всех случаях в межклеточной склеивающей субстанции эпидермиса выявлена фиксация иммуноглобулина класса С, что свидетельствует о системном поражении органов, покрытых многослойным плоским эпителием, и возможности использования этого подхода в практических целях.

3. С помощью разработанного метода прямой иммунофлюоресценции, заключающегося в предварительной короткой (1-2 мин) обработке серийных криостатных срезов биоптатов кожи 50% водной смесью этанола удалось повысить в группе из 27 больных акантолитическим пемфигусом процент положительных реакций в межклеточной склеивающей субстанции с 77,8% (выявленных без дополнительной обработки) до 100% (при р=0,001).

Применение модифицированного метода прямой иммунофлюоресценции позволило в 10-ти из 12-ти случаев у больных доброкачественной семейной пузырчаткой Хейли-Хейли выявить иммуноглобулин класса в в межклеточных пространствах эпидермиса. Этот иммуноглобулин входит, по-видимому, в качестве антител в состав растворимых иммунных комплексов, исчезающих из срезов при использовании классического метода иммунофлюоресценции благодаря вымыванию в физиологическом растворе при обработке препаратов.

4. При молекулярно-биологической характеристике кожи больных с помощью моноклональных антител к ряду тканевых антигенов (коллаген IV типа, антиген lamina densa, цитокератины камбиального и надбазальных слоев эпидермиса) удалось отметить особенности нарушений состояния базальной мембраны и диффе-ренцировки кератиноцитов при акантолитической пузырчатке, буллезном пемфигои-де и других буллезных дерматозах. Наиболее резкие изменения целостности колла-геновых волокон благодаря непосредственной фиксации антител в базальной мембране выявлены при буллезном пемфигоиде и только незначительные - при пузырчатке и других буллезных дерматозах. Наиболее выраженные нарушения полимеризации цитокератинов в процессе дифференцировки кератиноцитов наблюдались при доброкачественной пузырчатке Хейли-Хейли, токсикодермии и псориазе. Результаты этих наблюдений могут быть использованы в качестве дополнительных признаков при дифференциальной диагностике заболеваний.

5. При использовании классического метода иммунофлюоресценции и его модификации наряду с клиническими, цитологическими, патоморфологическими исследованиями удалось провести дифференциальную диагностику и определить точную нозологию пузырных дерматозов в 106 случаях, при этом коррекции диагноз был подвергнут в 28,3% случаев.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Махнева Н.В., Молочков В.А., Белецкая Л. В. Случай серонегативного бул-лезного пемфигоида (иммунопатологическое исследование) II Вестн.дерма-тол., 1995, N4, с.36-39.

2. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Метод выявления растворимых иммунных комплексов в тканях при доброкачественной хронической пузырчатке Хейли-Хей-ли II Тезисы докладов. V Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике, Москва 24-26 мая, 1995 г.

3. Белецкая Л.В., Махнева Н.В. Выявление растворимых иммунных комплексов в тканях биопсии // Бюл.эксп.Биол.и Мед., 1995, N 11, с.545-547.

4. Махнева Н.В., Белецкая Л. В. Совершенствование морфологической диагностики акантолитической пузырчатки //Вестн.дерматол., 1996, N 1, с.4-7.

5. Белецкая Л.В., Махнева Н.В. Способ выявления растворимых иммунных комплексов в биоптатах тканей //Клин.лаб.диагн., 1996, N 2, с.40-42.

6. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Выявление растворимых иммунных комплексов в тканях биопсии при акантолитической пузырчатке и доброкачественной хронической пузырчатке Хейли-Хейли //Тезисы докладов VII Российского съезда дерматологов и венерологов, г.Казань 5-7 июня, 1996 г.

7. Махнева Н.В., Молочков В.А., Белецкая Л.В. Использование моноклональ-ных антител к цитокератинам многослойного плоского эпителия для дополнительной характеристики патологического процесса при дерматозах //Тезисы докладов. Научно-практическая конференция, посвященная 75-летию ЦНИК-ВИ, Москва, 1996 г.

8. Изобретение "Способ диагностики пузырчатки" (заявка N94036174/14).

Работа была инициирована в 1992 году руководителем отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ доктором медицинских наук, профессором БОРИСОМ АРОНОВИЧЕМ БЕРЕНБЕЙНОМ.