Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Диагностикум на основе рекомбинантного десмоглеина 3 человека для выявления циркулирующих аутоантител при вульгарной пузырчатке

На правах рукописи

ДЗУЦЕВА ИРИНА РАМАЗАНОВНА

Диагностикум на основе рекомбинантного десмоглеина 3 человека для выявления циркулирующих аутоантител при вульгарной пузырчатке

14.00.11 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2005г.

Работа выполнена на кафедре кожных и венерических болезней лечебного факультета в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской федерации» и в отделе иммунологии Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Елена Владиславовна Матушевская

кандидат биологических наук Елена Викторовна Свирщевская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат биологических наук

Потекаев Николай Сергеевич Бухова Валентина Петровна

Ведущее научное учреждение:

Российский Университет Дружбы Народов

Защита диссертации состоится « » апреля 2005 года в часов дня на заседании диссертационного совета (Д-208.115.01) при ГУ «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Министерства Здравоохранения Российской Федерации» (107076, город Москва, ул. Короленко, д.З, корп. 4),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Министерства Здравоохранения Российской Федерации» по адресу: 107076, город Москва, ул. Короленко, д.З, корп. 4

Автореферат разослан « 20 » марта 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Н.К. Иванова

Актуальность работы

Пузырчатка (pemphigus) является тяжелым аутоиммунным заболеванием, этиология и патогенез которого до настоящего времени остаются окончательно не выясненными. Ряд зарубежных и отечественных исследователей показали, что в патогенезе истинной пузырчатки принимают участие как Т-клетки, так и аутоантитела [Anhalt, 1982, Stanley, 1982, Amagai, 1991, 2000]. Основной патогенный эффект вызван появлением IgG4 антител к белкам межклеточной адгезии клеток эпителия кожи и слизистых оболочек, входящих в состав десмосом и формирующих контакты между клетками - десмоглеину-3 и десмоглеину-1 [Fitzpatrick, 1980].

Лечение пузырчатки, как и других аутоиммунных заболеваний до настоящего времени вызывает большие затруднения. Для контроля аутоиммунного процесса длительно используют кортикостероиды [Пасечник, 1981]. Отмена кортикостероидов в большинстве случаев приводит к рецидиву заболевания.

Диагностика истинной пузырчатки и дифференциальная диагностика пузырных дерматозов представляют определенные трудности, так как часть общепринятых методов диагностики (гистологическое исследование, прямая иммунофлюоресценция), трудоемки, длительны, требуют высококвалифицированного персонала и сложного оборудования, а акантолитические клетки в мазках-отпечатках (метод Тцанка) выявляется только на ранних стадиях заболевания [Lever, 1953, Tzanck, 1948, Павлов, 1933]. Зачастую постановка диагноза - пузырчатка - требует длительного времени. Ранняя диагностика пузырчатки чрезвычайно важна, так как своевременное, массивное лечение кортикостероидными препаратами улучшает прогноз ранее смертельного заболевания. Поэтому улучшение методов диагностики истинной пузырчатки является актуальной задачей в дерматологии. Создание тест-системы на основе иммуно-ферментного анализа (ИФА) позволяет выявлять циркулирующие аутоантитела быстро (в течение 1 дня), что является важным при обсуждении вопроса диагностики пузырных дерматозов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ:

Основной целью данного исследования является разработка тест-системы на основе рекомбинантного десмоглеина 3 для выявления циркулирующих аутоантител к молекулам адгезии у больных пузырными дерматозами. Задачи исследования поставлены следующие:

1) разработать диагностикум на основе иммунно-ферментного анализа (ИФА) с использованием двух форм рекомбинантного десмоглеина 3 (ДСГЗ) для выявления циркулирующих аутоантител IgG класса;

2) изучить возможность использования для диагностики вульгарной пузырчатки ИФА на основе рекомбинантного ДСГЗ, для чего провести анализ репрезентативной выборки сывороток больных данной патологией;

3) изучить частоту выявления циркулирующих аутоантител к ДСГЗ у больных герпетиформным дерматозом Дюринга и буллезным пемфигоидом;

4) оценить уровень антител к десмоглеину 3 человека с помощью разработанного метода у больных пузырчаткой в зависимости от длительности и тяжести течения заболевания, а также до и после лечения.

Научная новизна

Разработана отечественная тест-система на основе ИФА с использованием рекомбинантного десмоглеина 3 человека для выявления аутоантител IgG класса у больных пузырными дерматозами. Для создания тест-системы впервые в мире получен белок десмоглеин 3, экспрессированный в дрожжах. Впервые в мире создан диагностикум на основе двух доменов десмоглеина 3, которые принимают участие непосредственно в формировании адгезии между кератиноцитами. Впервые проанализировано у больных вульгарной пузырчаткой и другими буллезными дерматозами наличие аутоантител в сыворотке крови к десмоглеину 3 с использованием дрожжевого белка, соответствующего двум дистальным доменам этого белка. Разработанная тест-система у 85% больных вульгарной пузырчаткой выявляет аутоантитела к ДСГЗ. Нами впервые показано, что уровень аутоантител к десмоглеину 3 не коррелирует с тяжестью заболевания и его длительностью. Выявлено снижение аутоантител к десмоглеину 3 в процессе лечения больных вульгарной пузырчаткой с применением кортикостероидной терапии. Показано, что у 17% больных дерматитом Дюринга и буллезным пемфигоидом выявляются аутоантитела к десмоглеину 3 с низким индексом.

Научно-практическое значение

Разработанная отечественная тест-система на основе рекомбинантного ДСГЗ позволяет проводить анализ уровня аутоантител в короткие сроки. Разработанный диагностикум может использоваться для изучения механизмов патогенеза пузырчырных дерматозов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) разработан диагностикум на основе иммунно-ферментного анализа с использованием дрожжевого рекомбинантного фрагмента десмоглеина 3, соответствующего двум дистальным доменам белка, для выявления циркулирующих аутоантител IgG класса;

2) показано, что у 85% больных вульгарной пузырчаткой уровень циркулирующих аутоантител к десмоглеину 3 превышает значения, выявляемые в норме у здоровых доноров;

3) показано, что у 17% больных герпетиформным дерматозом Дюринга и буллезным пемфигоидом выявляются аутоантитела к десмоглеину 3 с низким индексом;

4) показано, что уровень антител к десмоглеину 3 человека не зависит от длительности и тяжести течения вульгарной пузырчатки, но снижается в большинстве случаев в процессе лечения.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на XXII конгрессе Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии (Париж, 2003), на научно-практической конференции РГМУ (2004), на Московском научном обществе дерматовенерологов имени А.И.Поспелова (2004), на юбилейной научно-практической конференции памяти профессора М.МЖелтакова (2004). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 работ в отечественной и зарубежной печати.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Текст иллюстрирован 7 таблицами и 19 рисунками.

Клиническая характеристика больных

Под нашим наблюдением находились 40 больных вульгарной пузырчаткой, в возрасте от 25 до 79 лет, с преобладающим числом лиц в возрасте от 50 до 70 лет. Средний возраст во всей группе больных истинной пузырчаткой в целом составил 53 года. Из 40 больных 35 (87,5%) - лица женского пола, и только 5 пациентов мужского пола. Преобладание женщин среди больных пемфигусом хорошо известно, однако в нашем исследовании больные обследовались и лечились в основном в женском отделении больницы Короленко.

В данное исследование вошли только больные с вульгарной формой пузырчатки. Длительность заболевания была следующей: до 1 года - у 19 больных (47%), от 1 до 5 лет - у 15 пациентов (37%), свыше 5 лет - у 6 больных (15%), причем у 2-х из них продолжительность болезни составляла свыше 10 лет.

Диагноз пузырчатка был поставлен на основании клинической картины, цитологического (нахождение в мазках-отпечатках акантолитических клеток), иммунологического (прямая РИФ) и гистологического исследований.

У 17 больных вульгарной пузырчатой (42%) патологический процесс начинался с поражения слизистой оболочки полости рта, у остальных 23 больных (58%) - с поражения кожных покровов. Ни у одного больного процесс не возникал с поражения слизистых половых органов.

25 больным (63%) из наблюдавшихся 40 диагноз пузырчатка был поставлен впервые. До настоящего времени они не получали кортикостероидных или цитостатических препаратов по поводу настоящего или других сопутствующих заболеваний. Больные были длительно без соответствующего диагноза и лечения, так как первичная симптоматика -поражение слизистой полости рта, болезненность в горле при глотании, провоцировали обращение к другим специалистам. Так, 23 больных из 25 с поставленным нами диагнозом вульгарная пузырчатка лечились длительное время (от 2 месяцев до 4 лет) у стоматологов и лор-врачей с диагнозами - стоматит, фарингит. Чаще всего вовлечение в патологический процесс кожных покровов приводит больных к дерматологу.

15 больных до начала обследования получали кортикостероидную и цитостатическую терапию и находились до поступления в стационар на поддерживающей терапии. У этих больных длительность заболевания варьировали от 1 до 10 лет и дольше. У 13 больных обострение процесса произошло при снижении дозы кортикостероидных препаратов, а у 2-х больных - при отмене кортикостероидов в связи со стойкой ремиссией.

У всех больных, находившихся у нас под наблюдением, была типичная клиническая картина истинной пузырчатки. Все больные находились на момент обследования в фазе обострения, в фазе ремиссии больных не было.

У 3 больных из 40 больных вульгарной пузырчаткой общее состояние было тяжелое, у 8 - средней тяжести, что было обусловлено распространенностью и резким обострением патологического процесса, у остальных больных (29 человек) процесс носил относительно доброкачественное течение, общее состояние было удовлетворительным.

В группе больных вульгарной пузырчаткой у 25 пациентов были поражены как кожа, так слизистая оболочка рта и гортани, у 12 - высыпания отмечались только на коже, и у 4 больных процесс локализовался только на слизистой полости рта и гортани.

Наиболее тяжело протекал пемфигус у части больных впервые заболевших, которым долго не могли поставить диагноз, и не было проведено полноценного лечения. Таких больных было 12. Лечение их было начато ударными дозами кортикостероидов по классической схеме.

Обострение пузырчатки возможно при недостаточно осторожном и быстром снижении поддерживающей дозы кортикостероидов, особенно риск рецидива заболевания возрастает при приеме минимальных поддерживающих доз. Больным, у которых произошло

обострении процесса на фоне поддерживающей дозы кортикостероидов (от 5 мг до 20 мг), лечение проводили кортикостероидными препаратами пролонгированного действия в дозе 30-60 мг преднизолонового эквивалента, не увеличивая или не превышая дозу поддерживающей терапии.

К моменту обследования у 5 больных с пузырчаткой, у которых наблюдался рецидив заболевания, под влиянием длительного применения кортикостероидных препаратов (длительность заболевания от 5 до 12 лет) развились симптомы синдрома Кушинга: лунообразное лицо, увеличение подкожно-жировой клетчатки в области передней стенки живота, вздутие надключичных ямок. У 2 из этих больных развился стероидный диабет.

Среди сопутствующей патологии у больных истинной пузырчаткой преобладали заболевания сердечно-сосудистой системы и желудочно-кишечного тракта.

Больные пузырчаткой были подразделены на 2 группы. 1-ая группа включала больных, впервые заболевших и никогда до обследования не получавших кортикостероидных и цитостатических препаратов. Этим больным была назначена ударная доза кортикостероидных препаратов - 80-120 мг преднизолонового эквивалента

Таблица 1

Распределение больных по нозологическим формам

Диагноз Число больных

Вульгарная пузырчатка 40

Буллезный пемфигоид 6

Герпетиформный дерматит Дюринга (буллезная форма) 18

Красный плоский лишай (буллезная форма) 2

Многоформная экссудативная эритема (буллезная форма) 2

Атопический дерматит 15

2-ая группа состояла из больных, которые до нашего исследования уже длительно получали кортикостероидные препараты по поводу пузырчатки и на момент наблюдения находились на поддержива.ющей терапии (от 5 до 20 мг преднизолонового эквивалента). У всех больных этой группы отмечался рецидив заболевания на фоне снижения или отмены поддерживающей дозы кортикостероидных препаратов.

Кроме больных истинной пузырчаткой нами в целях дифференциальной диагностики, были обследованы еще 43 больных с другими дерматозами, при которых основными

кожными проявлениями были буллезные высыпания. Распределение по диагнозам больных, которые наблюдались в нашем исследовании представлено в таблице 1.

Для проведения дифференциальной диагностики были исследованы сыворотки больных другими не буллезными дерматозами. Под нашим наблюдением находились 15 больных атопическим дерматитом с характерным анамнезом и типичной клинической картиной заболевания. Контрольную группу составили 25 здоровых лиц в возрасте от 25 до 58 лет, среди них 17 женщин и 8 мужчин.

Методы исследования

Рекомбинантные белки на основе фрагментов десмоглеина 3 человека

В работе использовали два штамма E.Coli, в которых были экспрессированы плазмиды, содержащие либо всю внеклеточную часть десмоглеина 3 человека (Д1-5), либо только два дистальных домена этого белка (Д1-2). Клонирование гена Д1-5 и Д1-2 было выполнено О.Д. Коцаревой (ИБХ РАН, Москва). Вектора, содержащие гены Д1-5 и Д1-2 были переклонированы в дрожжи S. cerevisiae, штамм YBS 618 (МАТа Ieu2 Iys7 his4 итЗ). Клонирование фрагментов десмоглеина 3 в дрожжах выполнено А.Н.Марченко (ГосНИИ Генетика, Москва).

Продукция бактериальных рекомбинантных белков

Для продукции белков использовали клетки Е. coli, штамм BL 21, содержащие плазмиды с соответствующими вставками. Ni-аффинная хроматография

Хроматографическое выделение рекомбинантных белков осуществляли с использованием сорбента Ni- Agarose согласно рекомендациям производителей. Электрофорез в полиакриламидном геле

Для определения гомогенности выделенных препаратов, а также для определения молекулярной массы белков использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат Na. Иммунизация мышей

Для получения высокоактивных антисывороток мышей линии BALB/c иммунизировали подкожно 20 мкг рекомбинантных белков, смешанных с полным адъювантом Фрейнда. Иммунизацию проводили трехкратно с интервалом в неделю. Сыворотки собирали через неделю после последней иммунизации, пулировали, аликвотили и хранили при -20оС.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА)

Продукцию антиген-специфических IgG-антител оценивали методом твердофазного ИФА. В лунки 96-луночного планшета для ИФА (Linbro, Великобритания) вносили по 100 мкл раствора антигена в ФБ в концентрации 5 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем планшеты отмывали ФБ, содержащим 0,05% Tween-20 (Хеликон, Россия) (Т-ФБ). Здесь и далее отмывки проводили трижды Т-ФБ. Далее в лунки вносили блокирующий буфер: 1% бычий сывороточный альбумин в ФБ (БСА-ФБ). Через 30 минут планшет отмывали Т-ФБ, затем вносили разведенные в БСА-ФБ сыворотки больных. Планшеты инкубировали час при комнатной температуре, затем отмывали Т-ФБ. Далее проводили часовую инкубацию в присутствии антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma), разведенного в БСА-ФБ 1:2000. Проводили отмывку Т-ФБ, как описано ранее. Окрашивание производили раствором ортофенилендиамина (ОФД) (Sigma, США) 0,4мг/мл в натрий-цитратном буфере. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл/лунку 10% серной кислоты. Конечный результат оценивали по разности поглощения при 690 нм и 492 нм. Поглощение измеряли, используя прибор Multiskan МСС/340 (Titertec, Великобритания). Ставили контроль на неспецифическое связывание реагентов и неспецифическую реакцию субстрата. Определение индекса уровня антител

Для стандартизации результатов ИФА на различных планшетах ввели на каждом планшете стандарт из позитивной и негативной сывороток. Индекс уровня антител определяли по формуле: ОП опыт - ОП негативного контроля/ ОП позитивного контроля -ОП негативного контроля. Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка результатов проведена с помощью программы Excell no t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка тест-системы на основе иммуно-ферментного анализа (ИФА) с использованием рекомбинантных белков для определения антител к десмоглеину 3 человека.

В данной работе было использовано четыре белка, соответствующих фрагментам десмоглеина 3 человека. Ранее О.Д. Коцаревой были экспрессированы в E.Coli и получены белки Д1-5 и Д1-2. Белок Д1-5 соответствует всей внеклеточной части десмоглеина 3 и содержит пять доменов (Рис.1). Белок Д1-2 соответствует двум дистальным доменам десмоглеина 3 (Рис.1).

1 2 3 4 5 TM ВК

ШШШ МШИМ НЖЯШИВ! ШШ6Ш

Внеклеточная часть - домены 1-5

Рис.1. Структура молекулы десмоглеина 3 человека. Домены 1-5 относятся к внеклеточной части молекулы и экспонированы на поверхности кератиноцитов. ТМ - трансмембранная часть. ВК внутриклеточная часть молекулы входит в состав десмосомы и соединяется с цитоскелетом клетки.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 2. Гель-электрофорез дрожжевых белков Д1-2 (дорожка 1) и Д1-5 (дорожка 2) и бактериальных белков Д1-2 (дорожка 5) и Д1-5 (дорожка 7 ) . На дорожках 3 и 6 приведены контрольные экстракт дрожжей и E.Coli, не содержащие десмоглеин 3. Дорожка 4 - маркер молекулярной массы.

Различие между бактериальными и дрожжевыми белками возможно по степени гликозилирования белков и из-за посттрансляционного фолдинга белков на рибосомах. Как уже отмечалось в литературном обзоре, бактериальные белки на основе десмоглеина 3 не полностью адсорбируют патогенные аутоантитела из сывороток больных пузырчаткой. С другой стороны, также показано, что аутоантитела распознают белковую, а не углеводную часть десмоглеина 3. Предположительной причиной неполной адсорбции аутоантител на бактериальных рекомбинантных белках может являться изменение конформации белка при фолдинге в клетках млекопитающих и в бактериях. Дрожжи обладают способностью частично гликозилировать продуцируемые ими белки, а также приближены к клеткам насекомых по фолдингу. Поэтому нами была проведена работа по экспрессии гена десмоглеина 3 в дрожжах и использованию дрожжевых рекомбинантных белков для тест-системы. Полученные дрожжевые белки имели несколько большую молекулярную массу по сравнению с бактериальными, что показывает наличие гликозилирования фрагментов десмоглеина 3 в дрожжах (Рис. 2).

Для создания тест-системы на основе ИФА полученными белками иммунизировали мышей линии BALB/c. Пулированную сыворотку мышей использовали для подбора условий постановки ИФА реакции. В качестве контроля использовали сыворотку крови интактных мышей. На планшет наносили одновременно сыворотки иммунных мышей (левая половина планшета) и сыворотки больных пузырчаткой (правая сторона планшета). Сыворотки мышей использовали в качестве положительного (иммунные мыши) и отрицательного (интактные мыши) контролей. Сравнение титров сывороток мышей и больных позволило показать, что в сыворотке больных выявляются антитела G класса к рекомбинантным белкам Д1-2 и Д1-5, однако их титр низкий (Рис.3.).

В результате проведенной работы были подобраны условия культивирования, концентрации коньюгатов, субстрата, состав буферов.

Сравнительный анализрекомбинантныхбелков, соответствующихдоменамД1-2и Д1-5

Для сравнения анализа антител к десмоглеину 3 человека использовали 4 различных белка: Д1-2(б), Д1-2(д), Д1-5(б) и Д1-5(ц). Результаты анализа показали, что наблюдается корреляция между показания ИФА на основе Д1-2 и Д1-5 белков (Рис.4). Данные репрезентативного эксперимента приведены для 4-х больных. Трехкратный анализ 20 сывороток показал, что только у двух больных выявлялись антитела преимущественно к Д1-5 и практически не выявлялись к Д1-2, что означает локализацию сайтов связывания антител в проксимальных доменах Д1-5.

2,5-,

—PV55 -•-PV56

2 -

Иммунная -н-НМС

К

О 1 Н

0,5

О

10

100

1000

10000

разведение сыворотки

Рис.3. Сопоставление уровня антител в положительной (иммунной) и отрицательной (интактной) контрольных мышиных сыворотках и уровня антител к десмоглеину 1-2, экспрессированному в бактериях E.Coli, в сыворотках крови больных пузырчаткой PV55 и PV56. Мыпнй иммунизировали трижды этим белком, и спустя неделю после последней иммунизации получали сыворотку.

Сравнение уровня антител в сыворотках больных пузырчаткой и доноров показал, что специфичность была более высокой при использовании как бактериального, так и дрожжевого фрагмента Д1-2. Это связано, по-видимому, с тем, что у доноров антитела направлены преимущественно к непатогенным фрагментам ДЗ-5, что увеличивало показания по связыванию на белках Д1-5. Данные литературы также свидетельствуют, что основной патогенный эффект связан с распознаванием аутоантителами доменов 1-2, принимающих непосредственное участие в гомофильной адгезии между кератиноцитами. С учетом высокой корреляции между данным ИФА на основе Д1-5 и Д1-2 как в бактериальной, так и в дрожжевой системах, а также в связи с тем, что специфичность на белках Д1-2 была выше нами было принято решение использовать для разработки ИФА белков, соответствующих доменам Д1-2.

Рис. 4. Сравнение эффективности связывания белками Д1-2 и Д1-5 аутоантител больных вульгарной пузырчаткой № № 90, 92, 94 и 106.

Определение специфичности анализа аутоантител к десмоглеину 3 с помощью тест-системы на основерекомбинантныхфрагментов Д1-2(б) иД1-2(д)

Для определения специфичности мы использовали 40 сывороток больных пузырчаткой и 25 сывороток, полученных от здоровых доноров. Для определения титра антител в первом эксперименте сыворотки разводили в широком диапазоне концентраций: от 1:50 до 1:1600. Результаты показали, что при низком разведении сывороток 1:50 и 1:100 наблюдается ингибирование связывания, что означает низкую аффинность этих антител (Рис.5). Ингибирование наблюдалось как на дрожжевых, так и на бактериальных белках. При использовании разведения 1:200 - 1:800 наблюдалась линейная зависимость. Далее все измерения проводили при разведении 1:200.

Рис. 5. Сравнение титров антител к фрагменту десмоглеина 3 Д1-2(6), полученного в E.Coli, в сыворотках больных пузырчаткой (А) и доноров (Б).

Стандартизация тест-системы с помощью введение «серойзоны».

Далее требовалось стандартизовать получаемые результаты. Вариабельность результатов от планшета к планшету значительно варьировала, что не позволяло количественно сравнить данные, полученные для разных больных. Кроме того, значительная вариабельность также наблюдалась и при повторе тестирования в другой день, что, по-видимому, связано также с вариабельностью от планшета к планшету. Для стандартизации результатов были введены положительный и отрицательный контроль на каждом планшете. В качестве отрицательного контроля использовали пул 10 сывороток доноров. В качестве положительного контроля использовали сыворотку больного пузырчаткой со средним титром антител. Для стандартизации результатов мы ввели индекс уровня антител, который подсчитывали по формуле:

ОП позитивного контро.и ■ ОП негативного котроля

где ОП- оптическая плотность поглощения при длине волны 492 нм. ОП образца соответствует измеряемым данным для конкретного больного, ОП негативного контроля -данным, даваемым пулированной сывороткой доноров, ОП позитивного контроля - данные для контрольной сыворотки больного пузырчаткой, дающей средние значения среди пула сывороток больных. На рисунках 6 и 7 данные по связыванию пересчитаны в индексы уровня антител для разведения 1:200. Данные для бактериального белка (Рис.6) и дрожжевого (Рис.7) несколько различаются между собой. Эффективность связывания на дрожжевом белке значительно выше, что видно по высоте гистограмм на рисунках А, приведенными для больных. На рисунках Б приведены данные для доноров.

Для увеличения специфичности тест-системы далее нами была введена «серая зона», соответствующая условноположительным сывороткам. Индекс уровня антител для «серой зоны» был принят за 20 единиц (Рис.8).

При значениях «серой зоны» в 20 единиц специфичность тест-системы на основе бактериального белка составили 56%, а на основе дрожжевого белка - 85%. В мире имеющийся диагностикум разработан на основе рекомбинаных белков, полученных в клетках насекомых, в так называемой бакуловирусной системе. Экспрессия белков в бакуловирусной системе значительно сложнее и дороже по сравнению с бактериальной и дрожжевой системами. Специфичность бакуловирусной системы достигает 93-95%. Специфичность разработанной нами системы несколько ниже, однако достаточно высока для использования в клинике.

Оценкауровня антител кД1-2(б) иД1-2(д) у больных сразличными дерматозами.

Для проверки применимости данной тест-системы для дифференциальной диагностики провели сравнительное исследование титров антител к десмоглеину 3 в сыворотках больных герпетиформным дерматитом Дюринга (буллезная форма), буллезным пемфигоидом, красным плоским лишаем (буллезная форма), многоформной экссудативной эритемой (буллезная форма), а также в качестве дополнительного контроля использовали 15 сывороток больных атопическим дерматитом. Данные были получены с использованием положительного и отрицательного контролей на каждом планшете.

Результаты анализа приведены на рис.9. Все результаты для сывороток здоровых доноров попали в «серую зону» равную 20 единицам. Однако у больных с различными формами патологии кожи наблюдались антитела в низком титре, для которых индекс уровня антител превышал 20 единиц.

Рис.6. Титры антител к Д1-2, экспрессированном в E.Coli, в сыворотках больных пузырчаткой (А) и доноров (Б) . Данные приведены в виде индекса, посчитанного по формуле: ОП опыт - ОП негативного контроля/ ОП позитивного контроля - ОП негативного контроля.

Рис.7. Индексы антител к Д1-2, экспрессированном в дрожжах, у больных пузырчаткой (А) и доноров (Б) . Данные приведены в виде индекса, посчитанного по формуле: ОП опыт - ОП негативного контроля/ ОП позитивного контроля - ОП негативного контроля.

Рис.8. Специфичность распознавания Д1-2, полученного в E.Coli (A) и в дрожжах (Б), сыворотками больных вульгарной пузырчаткой. Данные приведены в виде индекса, посчитанного по формуле: ОП опыт ОП негативного контроля/ ОП позитивного контроля - ОП негативного контроля. Специфичность ИИА на основе бактериального белка составила 56%. Специфичность ИИА на основе дрожжевого белка составила 85%.

Поэтому для дифференциального диагностикума мы ввели «серую зону» в 40 единиц. При таком уровне «серой зоны» большинство сывороток больных попадало в диапазон значений индекса антител от 0 до 40 Однако у 1 из 6 больных буллезным пемфигоидом (17%) и у 3 из 18 больных дерматитом Дюринга (17%) наблюдалась достоверная продукция антител к десмоглеину 3.

Данные, полученные на бактериальном белке, значительно отличались от результатов, полученных на дрожжевом белке. Так, индекс антител у больных дерматитом Дюринга с повышенной продукцией антител к десмоглеину 3 был около 120 единиц на бактериальном белке и не более 90 единиц - на дрожжевом. Аналогичные данные были получены и для

Рис.9. Индекс антител к Д1-2, экспрессированном в E.Coli (А) и дрожжах (Б) , у больных пузырчаткой (ВП), дерматитом Дюринга (ДД), буллезным пемфигоидом (БП), прочими пузырными дерматозами (красный плоский лишай, эритема, токсидермия), атопически дерматитом (АД) и доноров. Данные приведены в виде индекса, посчитанного по формуле: ОП опыт - ОП негативного контроля/ ОП позитивного контроля - ОП негативного контроля.

больных буллезным пемфигоидом. Уровень индекса для таких больных на бактериальном белке достигал 80 единиц, а на дрожжевом - 68. Кроме того, на дрожжевом белке 85% сывороток больных пузырчаткой лежало выше значений индекса 40 единиц, тогда как на бактериальном белке только 53% сывороток давали значения, превышающие 40 единиц.

Таким образом, использование дрожжевого белка, соответствующего двум дистальным доменам десмоглеина 3 человека, является лучшей из исследованных тест-систем для диагностики пузырчатки.

Сравнение уровня антител к десмоглеину Д1-2 у больных вульгарной пузырчаткой- 1 и 2 групп.

Под нашим наблюдением находились 40 больных вульгарной пузырчаткой. Больные пузырчаткой были, условно, подразделены на 2 группы. Первая группа включала больных, впервые заболевших и никогда до обследования не получавших кортикостероидных и цитостатических препаратов. Вторая группа состояла из больных, которые до нашего исследования уже длительно получали кортикостероидные препараты по поводу пузырчатки и на момент наблюдения находились на поддерживающей терапии. Все больные получали традиционную терапию, включающую применение кортикостероидных препаратов или в комбинации с цитостатиками. Все больные до лечения находились в остром периоде. Проводимая терапия позволила в течение 14-20 дней получить положительный эффект. В таблице 2 приведены индексы уровня антител для больных 1 и 2 групп.

Таблица 2

Уровень антител к десмоглеину Д1-2, экспрессированному в дрожжевой системе.

Индекс антител Среднее + стандартное отклонение, доверительный диапазон

Группа 1 (впервые установленный диагноз) 0,4,12,45,60,88,90,93,111,115, 125,135,137,155,156,170,176, 180,180,195,203,210,226,245, 265 135+74 61*209

Группа 2 (леченые ранее больные) 0, 8,46,60,95,111,127,140,172, 188,197,229,232,234,300 143+90 53-233

Приведенные данные показывают, что достоверных различий между индексами антител в этих группах больных выявлено не было, так у больных 1 группы этот показатель составил 135+74, во 2 группе - 143+90.

Сравнение уровня антител к десмоглеину Д1-2 у больных в зависимости от длительности и тяжести заболевания.

Вопросом, важным для понимания патогенеза заболевания, является наличие связи между длительностью заболевания и уровнем антител. Для этого из группы больных, ранее получавших лечение, были отобраны 5 пациентов, страдающих пузырчаткой более 3 лет, и 10 больных, длительность заболевания у которых была менее 3-х лет. Анализ уровня антител у больных с разной длительностью заболевания показал, что достоверных отличий также не выявляется (Таб. 3).

Таблица 3.

Уровень антител к десмоглеину 3 у больных в зависимости от длительности заболевания. __

Длительность 0, 2, 8, 25, 25, 127, 140, 180, 180, 88+82

заболевания менее 3 190

лет (N=10)

Длительность 35, 111,113,125,188 114+54

заболевания более 3

лет (N=5)

Для выявления взаимосвязи между тяжестью заболевания и уровнем антител к десмоглеину 3 был проведен анализ клинической картины у пациентов с высоким и низким индексом антител. Для исследования этой зависимости были взяты две пациентки с высоким (Индекс=226) и низким уровнем антител (Индекс=60). У обеих больных диагноз был впервые установлен, длительность заболевания до постановки диагноза составляла у больной с высоким индексом 1 год, у больной с низким индексом - 2 года. До поступления в клинику лечения по поводу данного заболевания не получали. При поступлении состояние пациенток расценивалось как удовлетворительное. Кожный процесс был распространенный, однако у больной с высоким индексом в патологический процесс были вовлечены слизистые полости рта. У обеих больных симптом Никольского был резко положительный, найдены акантолитические клетки. В процессе лечения клиническое улучшение у обеих больных было достигнуто достаточно быстро. Патологический процесс полностью разрешился у обеих больных, у больной с высоким индексом сохранялись отдельные эрозии на слизистой полости рта в стадии эпителизации. Вероятно, при наличии высоких индексов антител к десмоглеину 3 лечение идет медленнее. Однако положительная динамика наблюдается в обоих случаях.

Анализ уровня антителу больных пузырчаткой до и после лечения.

Одним из практических вопросов применения данной системы является анализ связи между уровнем антител к десмоглеину 3 у больных до и после лечения. При наличии такой

связи эффективность лечения можно прослеживать по уровню антител в сыворотках больных в процессе лечения. Для анализа изменения уровня антител к десмоглеину 3 у больных в процессе лечения получали сыворотки на момент постановки диагноза, в процессе лечения и после достижения стабилизации или разрешения процесса. Всего было изучено 11 больных пузырчаткой в процессе лечения. Сыворотки получали с интервалом в две недели. Нами было показано, что в процессе лечения у большинства больных (7 пациентов) уровень антител достоверно снижался (Рис.10). У больных с низким индексом уровня антител (2 пациента) изменения не регистрировались, так как и до лечения индекс попадал с серую зону (больные ВП90 и ВП77). У больных с высоким индексом наблюдалось достоверное, хотя и не полное, снижение индекса (ВП54, ВП62, ВП79, ВП93). У отдельных больных снижение уровня антител было незначительным или отсутствовало (ВП73, ВП91, ВП92). Полученные результаты показывают, что продукция антител снижается значительно медленнее, чем происходит разрешение процесса.

В целом, можно сделать вывод о снижении уровня антител к десмоглеину 3 у больных вульгарной пузырчаткой в процессе лечения кортикостероидами.

Таким образом, нами разработана иммуно-ферментная тест-система на основе дрожжевого рекомбинантного белка, соответствующего двум дистальным доменам десмоглеина 3 человека. В процессе работы подобраны условия постановки реакции, введено понятие «серой зоны» и показана необходимость использования положительного и отрицательного контролей на каждом планшете. Нами проанализировано 40 больных вульгарной пузырчаткой, 43 больных другими дерматозами, из которых 28 больных с буллезными формами, а также 25 здоровых доноров. Было показано, что с помощью данной тест-системы выявляются аутоантитела к десмоглеину 3 человека у 85% больных вульгарной пузырчаткой по сравнению со здоровыми донорами. Тест-система также использована для проведения дифференциальной диагностики пузырчатки. Было показано, что примерно в 17% сывороток больных дерматитом Дюринга и буллезным пемфигоидом выявляются аутоантитела к десмоглеину 3. Анализ связи длительности и тяжести заболевания показал отсутствие корреляции индекса антител с этими параметрами, что позволяет сделать вывод о значительном участии в патогенезе пузырчатки прочих механизмов.

Рис.10. Снижение уровня антител к десмоглеину 3 в сыворотке крови больных пузырчаткой до и после лечения. У всех больных, за исключением ВП73 и ВП91, наблюдается 30-50% снижение индекса антител.

Элиминация активированных клеток, вызванная введением кортикостероидов, привела к постепенному снижению уровня антител у большинства больных. Однако снижение было выражено умеренно, что свидетельствует об отсутствии прямого эффекта кортикостероидов на В-клетки, синтезирующие аутоантитела к десмоглеину 3.

Поскольку основным классом антител, оказывающих патогенный эффект, являются ^04, то использование коньюгата к Ю человека, вероятно, позволит в дальнейшем увеличить специфичность и чувствительность данного диагностикума.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан диагностикум для выявления циркулирующих аутоантител на основе иммуно-ферментного анализа с использованием дрожжевого рекомбинантного белка, соответствующего доменам 1-2 десмоглеина 3 человека.

2. Показано, что циркулирующие аутоантитела к десмоглеину 3 выявляются у 85% больных вульгарной пузырчаткой по сравнению со здоровыми донорами.

3. При использовании разработанной тест-системы выявляются аутоантитела к десмоглеину 3 с низким индексом у 17% больных дерматитом Дюринга и буллезным пемфигоидом.

4. Установлено, что в процессе лечения уровень антител к десмоглеину 3 у больных пузырчаткой снижается, однако корреляции между титром антител и тяжестью, а также длительностью заболевания не выявлено.

Практические рекомендации.

1. Разработана тест-система для определения уровня аутоантител к десмоглеину 3 человека на основе рекомбинантного десмоглеина 3 человека.

2. Предлагаемая тест-система может быть использована для оценки уровня антител при других буллезных заболеваниях (дерматит Дюринга, буллезный пемфигоид). Наличие специфической тест-системы позволит более детально понять патогенез этих заболеваний.

3. Полученные антигены пузырчатки могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов патогенеза пемфигуса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Блокада акантолиза эпидермиса при вульгарной пузырчатке протективными антителами./ Свирщевская Е.В., Матушевская Е.В., Коцарева О.Д. и др//. Вестник дерматологии и венерологии.- 2003.- №4.с. 4-7.

2. High affinity antibodies to proximal domains of extracellular desmoglein 3 protect from acantholysis induced by pemphigus autoantibodies./Viskova N.Y., Kotsareva O.D., Matushevskaya E.V. et sX.ll. XXII Congress ofEAACI,- 2003,- 7-11 June, Paris, p.48

3. Свирщевская Е.В., Матушевская Е.В., Дзуцева И.Р/ Особенности патогенеза пузырчатки. Сборник научных работ кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета ГОУ ВПО РГМУ Минздрава России.//- 2004,-с. 15-17.

4. Разработка тест-системы для диагностики пузырчатки на основе рекомбинантных аналогов десмоглеина 3 человека/. Свирщевская Е.В., О.Д.Коцарева, Е.В.Матушевская и др.// Материалы юбилейной научно-практической конференции памяти профессора М.М.Желтакова. Москва, «Анахарсис»,- 2004,-с. 60.

5. Разработка иммуно-ферментной тест-системы на основе дрожжевого рекомбинантного десмоглеина 3 для серодиагностики вульгарной пузырчатки./

Дзуцева И.Р., Е.В.Свирщевская, А.Н.Марченко и др.//. Вестник дерматологии и венерологии. 2005, №4, XX.

Список сокращений:

БСА- бычий сывороточный альбумин

ВП - вульгарная пузырчатка (Pemfigus vulgaris)

ЛП - листовидная пузырчатка (Pemfigus foliaceus)

ЭД - экстраклеточный домен

ДСГ (ДСП, ДСГ2, ДСГЗ) - десмоглеины 1,2 иЗ

Д1-2 - белок, соответствующий доменам 1 и 2 десмоглеина 3 человека Д1-5 - белок, соответствующий доменам 1-5 десмоглеина 3 человека

Д1-26 - белок, соответствующий доменам 1 и 2 десмоглеина 3 человека, экспрессированый в бактериях Е. Coli.

Д1-56 - белок, соответствующий доменам 1 - 5 десмоглеина 3 человека экспрессированый в бактериях Е. Coli.

Д1-2д - белок, соответствующий доменам 1 и 2 десмоглеина 3 человека, экспрессированый в дрожжах S. Cerevisiae.

Д1-5д - белок, соответствующий доменам 1 - 5 десмоглеина 3 человека экспрессированый в

дрожжах S. Cerevisiae.

ФБ - фосфатный буфер

IgG - иммуноглобулины G класса

Заказ №834. Объем 1 п.л. Тирах 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». Г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

}} *?<n n t

Актуальность работы Пузырчатка (pemphigus) является тяжелым аутоиммунным заболеванием, этиология и патогенез которого до настоящего времени остаются окончательно не выясненными. Ряд зарубежных и отечественных исследователей показали, что в патогенезе истинной пузырчатки принимают участие как Т-клетки, так и аутоантитела. Основной патогенный эффект вызван появлением IgG4 антител к белкам межклеточной адгезии клеток эпителия кожи и слизистых оболочек, входящих в состав десмосом и формирующих контакты между клетками — десмоглеину-3 и десмоглеину-1. I Лечение пузырчатки, как и других аутоиммунных заболеваний до настоящего времени вызывает большие затруднения. Для контроля аутоиммунного процесса длительно используют кортикостероиды. Отмена кортикостероидов в большинстве случаев приводит к рецидиву заболевания.Диагностика истинной пузырчатки и дифференциальная диагностика пузырных дерматозов представляют определенные трудности, так как часть общепринятых методов диагностики (гистологическое исследование, прямая иммунофлюоресценция), трудоемки, длительны, требуют высококвалифицированного персонала и сложного оборудования, а акантолитические клетки в мазках-отпечатках (метод Тцанка) выявляется только на ранних стадиях заболевания. Зачастую, постановка диагноза — пузырчатка - требует длительного времени. Ранняя диагностика пузырчатки чрезвычайно важна, так как своевременное, массивное лечение кортикостероидными препаратами улучшает прогноз ранее абсолютно смертельного заболевания Поэтому улучшение методов диагностики истинной пузырчатки является актуальной задачей в дерматологии. Создание тест-системы на основе иммуно-ферментного анализа (ИФА) для выявления антител к десмоглеинам позволит проводить быструю (в течение 1 дня) дифференциальную диагностику пузырчатки по сыворотке крови больного, что, несомненно, ускорит постановку диагноза. Целью данной диссертации является разработка отечественной ИФА тест-системы для дифференциальной диагностики пемфигуса.ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ: Основной целью данного исследования является разработка тест-системы на I ! основе рекомбинантного десмоглеина 3 для диагностики вульгарной формы истинной пузырчатки и дифференциальной диагностики пузырных дерматозов.Задачи исследования поставлены следующие: 1) разработать диагностикум на основе иммунно-ферментного анализа (ИФА) с использованием двух форм рекомбинантного десмоглеина 3; 2) изучить возможность использования для диагностики вульгарной пузырчатки ИФА, для чего провести анализ репрезентативной выборки сывороток больных данной патологией; 3) изучить возможность использования ИФА на основе рекомбинантного десмоглеина 3 для дифференциальной диагностики различных форм пузырных дерматозов (ИФА анализ сывороток больных герпетиформным дерматозом Дюринга и буллезным пемфигоидом); 4) оценить уровень антител к десмоглеину 3 человека с помощью разработанного метода у больных пузырчаткой в зависимости от длительности и течения заболевания, а также до и после лечения.Научная новизна Разработаная отечественная тест-система на основе ИФА позволит проводить оценку уровня антител к аутоантигену пузырчатки по сыворотке крови, что является неинвазивной процедурой, а также требует значительно меньше времени (1 день вместо недели). Таким образом, данная работа является новой.Диагностикум создан на основе рекомбинантного дрожжевого белка, соответствующего доменам 1-2 десмоглеина 3 человека. Такой белок был впервые получен в мире. Основной конкурентный диагностикум, созданный в Японии группой M.Amagai, разработан на основе инсектного белка, представляющего всю внеклеточную часть ДСГЗ. Однако показано, что i патогенные антитела при пузырчатке связываются с двумя дистальными i I доменами как десмоглеина 1, так и десмоглеина 3. Таким образом, использование только дистальных доменов повышает специфичность тест-системы. В данной работе впервые создан такой диагностикум.Научно-практическое значение Диагностикумы на основе инсектных белков крайне дороги, так как экспрессия рекомбинантного белка проводится в условиях in vitro в клетках насекомых, требующих для своего роста поверхности (адгезии). В результате затраты на получение белков включают одноразовый пластик, сложные среды для культивирования клеток насекомых, а также фетальную сыворотку коров.Дрожжевые клетки наращиваются в ферментерах в объеме в среде без сыворотки, что позволяет значительно снизить стоимость рекомбинантных белков. Создание относительно дешевого отечественного диагностикума для определения аутоантител при пузырчатке, несомненно, имеет практическую значимость. Оснащение такими тест-системами кожных диспансеров, а также стоматологических клиник позволит проводить дифференциальную диагностику на ранней стадии заболевания, не травмирующим методом и быстро. В России аналогов таких тест-систем нет, в связи с чем очевидна и I научная значимость работы.Основные положения, выносимые на защиту: 1) разработан диагностикум на основе иммунно-ферментного анализа с использованием дрожжевого рекомбинантного фрагмента десмоглеина 3, соответствующего двум дистальным доменам белка, для выявления циркулирующих аутоантител IgG класса; 2) показано, что у 85% больных вульгарной пузырчаткой уровень циркулирующих аутоантител к десмоглеину 3 превышает значения, выявляемые в норме у здоровых доноров; 3) показано, что у 17% больных герпетиформным дерматитом Дюринга и буллезным пемфигоидом выявляются аутоантитела к десмоглеину 3 с низким индексом; 4) показано, что уровень антител к десмоглеину 3 человека не зависит от длительности и тяжести течения вульгарной пузырчатки, но снижается в большинстве случаев в процессе лечения.Апробация работы Основные положения диссертации представлены на XXII конгрессе Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии (Париж, 2003), на научно-практической конференции РГМУ (2004), на Московском научном обществе дерматовенерологов имени А.И.Поспелова (2004), на юбилейной научно-практической конференции памяти профессора М.М.Желтакова (2004).Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 работ в отечественной и зарубежной печати.Объем и структура диссертации Работа изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов. Текст иллюстрирован 7 таблицами и 19 рисунками. Указатель литературы содержит 93 работы отечественных и зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система для диагностики вульгарной пузырчатки на основе дрожжевого рекомбинантного белка, соответствующего доменам 1-2 десмоглеина 3 человека.

2. Показано, что аутоантитела к десмоглеину 3 выявляются у 85% больных вульгарной пузырчаткой по сравнению со здоровыми донорами.

3. При использовании данной тест-системы выявляются аутоантитела к десмоглеину 3 с низким индексом у 17% больных дерматитом Дюринга и буллезным пемфигоидом.

4. Было показано, что в процессе лечения уровень антител к десмоглеину 3 у больных пузырчаткой снижается, однако корреляции между титром антител и тяжестью, а также длительностью заболевания не выявлено. Практические рекомендации

1. Разработана тест-система для определения уровня аутоантител к десмоглеину 3 человека на основе дрожжевого рекомбинантного белка, соответствующего двум дистальным доменам белка. Специфичность тест-системы при диагностике вульгарной пузырчатки составляет 85%, что позволяет ее рекомендовать для использования в практическом здравоохранении.

2. Предлагаемая тест-система может быть использована для оценки уровня антител при других буллезных заболеваниях (дерматит Дюринга, буллезный пемфигоид). Наличие специфической тест-системы позволит более детально понять патогенез этих заболеваний.

3. Полученные антигены пузырчатки могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов патогенеза пемфигуса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пузырчатка является аутоиммунным заболеванием, сопровождающимся образованием пузырей и эрозий на коже и слизистых оболочках. В патогенезе пузырчатки принимают участие как Т-клетки, так и аутоантитела. Однако основную группу составляют больные, в сыворотке крови которых выявляют антитела преимущественно IgG4 класса к белкам адгезии десмоглеину 1 (листовидная пузырчатка) и десмоглеину 3 (вульгарная пузырчатка). Патогенные аутоантитела распознают, главным образом, два дистальных домена десмоглеинов - домены 1 и 2. Зачастую, постановка диагноза -пузырчатка — требует длительного времени. Основным инструментальным методом дифференциальной диагностики в России является прямая иммунофлюоресценция (ПИ), для чего требуется получение биоптата кожи больного. В данной работе создана тест-система на основе иммуно-ферментного анализа (ИФА) для выявления антител к десмоглеину 3 человека. Тест-система основана на использовании дрожжевого белка, соответствующего двум дистальным доменам Д1-2 десмоглеина 3 человека. Белок, используемый для нанесения на планшеты, получен генно-инженерным способом и очищен от дрожжевых примесей. Специфичность тест-системы на основе рекомбинантного белка составила 85%. Для количественного сравнения сывороток больных в работе предложено использование положительного и отрицательного контроля на каждом планшете, а также введено понятие индекса антител и серой зоны. При сравнительном анализе индекса антител у больных вульгарной пузырчаткой и прочими пузырными дерматозами было показано, что 17% больных буллезным пемфигоидом и дерматитом Дюринга содержат антитела к десмоглеину 3 в низком, но достоверно превышающем серую зону титре. Разработанная тест-система позволит проводить быструю (в течение 1 дня) диагностику пузырчатки по сыворотке крови больного, что, несомненно, ускорит постановку диагноза. Выявление аутоантител к десмоглеину 3 при других патологиях позволит изучить взаимосвязь между различными кожными заболеваниями.