Клинико-морфологические и иммунологические аспекты в ранней диагностике и лечении аутоиммунных буллезных дерматозов

Махнева, Наталия Викторовна

Диссертации по медицине → Кожные и венерические болезни

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Клинико-морфологические и иммунологические аспекты в ранней диагностике и лечении аутоиммунных буллезных дерматозов

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Махнева, Наталия Викторовна Москва 2009 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.11

Автореферат диссертации по медицине на тему Клинико-морфологические и иммунологические аспекты в ранней диагностике и лечении аутоиммунных буллезных дерматозов

На правах рукописи

МАХНЕВА Наталия Викторовна

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ В РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ АУТОИММУННЫХ БУЛЛЕЗНЫХ ДЕРМАТОЗОВ

14.00.11 - кожные и венерические болезни 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2009

003460800

Работа выполнена в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского и лаборатории трансплантационной иммунологии ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий

Научные консультанты:

Заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

Молочков Владимир Алексеевич Белецкая Людмила Вячеславовна

Кочергин Николай Георгиевич Бутов Юрий Сергеевич Резайкина Анна Васильевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов, г. Москва

Защита состоится » 2009 г. в ~~ часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.115.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУ «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий»

107076 г. Москва, ул. Короленко, д. 3, корп. 4

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий»

Автореферат разослан « А-м^е^р^ 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат медицинских наук Иванова Наталья Константиновна

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

За последние три-четыре десятилетия накоплены фундаментальные знания по поводу клиники и иммунопатологии аутоиммунных буллезных дерматозов. Несмотря на достигнутые успехи, изучение патогенеза этих дерматозов на уровне молекулярно-биологических исследований остается одной из важных проблем в дерматологии и в настоящее время. Это связано с необходимостью преодоления развития таких тяжких, порой угрожающих жизни, заболеваний как аутоиммунная пузырчатка, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпи-дермолиз.

Современная медицина обладает целым рядом эффективных средств, позволяющих успешно подавлять развитие иммунопатологического процесса при аутоиммунных состояниях [Уоллис Д. и др., 2000; Hertl М., 2005; Laffitte Е., Borradori L., 2005; Schmidt Е. et al., 2006]. Однако те же средства обладают нередко побочным действием, нарушающим функцию ряда физиологических систем организма. К ним, в частности, относятся кортикостероиды, азатио-прин, метотрексат, циклоспорин. Принцип лечения аутоиммунных заболеваний, при которых одним из основных патогенетических факторов являются аутоантитела, направленные к антигенам тканевых структур, сходен для многих аутоиммунных заболеваний. Однако разные формы патологии, включая аутоиммунные буллезные дерматозы, требуют различные схемы лечения, в частности разные дозировки, назначаемых препаратов. Учитывая возможные осложнения, необходимо подбирать оптимальные дозы, позволяющие достигать терапевтического эффекта, не нанося вред организму больного. Оптимальные дозы препаратов при таких заболеваниях как истинная пузырчатка, буллезный пемфигоид, приобретенный буллезный эпидермолиз и линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, также как и схемы их лечения, значительно отличаются друг от друга [Bystryn J-C., Rudolph J.L., 2005; Hertl М., 2005], в связи с чем необходима тщательная дифференциальная диагностика.

Нередко клиническое сходство буллезных дерматозов, а порой и атипичные их проявления на ранних этапах развития патологического процесса

с сомнительными результатами феномена Никольского не позволяют клиницисту у постели больного поставить с уверенностью клинический диагноз. Существующие данные [Цветкова Г.М. и др., 2003; Mihai S., Sitaru С., 2007] свидетельствуют о том, что применение гистологических и ряда иммунологических методов, в том числе метода меченых антител, в дополнение к клиническому обследованию, во многих случаях позволяет уточнить диагноз. Полученные нами результаты подтверждают эти наблюдения [Белецкая JI.B., Махнева Н.В., 2000]. Однако и эти методы имеют свои ограничения. Так, гистологическое исследование на основании определения уровня образования пузыря способствует диагностике и дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов только между различными их группами, такими как группа пузырчатки и группа буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения, но затрудняет проведению дифференциальной диагностики среди буллезных дерматозов одной группы, таких как буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз [Eming R., HertI М., 2006]. Сложности могут возникнуть и при использовании методов прямой и непрямой имму-нофлюоресценции [Millns J.L. et al., 1980; Coscia-Porzzi L. et al., 1985; Махнева H.B., Белецкая JI.B., 2007]. Это требует дополнительных методов диагностики.

Разнообразие клинических проявлений аутоиммунных буллезных дерматозов и поиск новых методов терапии заставляет специалистов продолжать исследования по изучению механизмов и факторов, способствующих как проявлению в латентной форме заболевания, так и развитию этих буллезных дерматозов de novo. Исследования по изучению молекулярно-биологической структуры кожи (система межклеточного и дермо-эпидермального соединений, белки поверхности кератиноцитов и десмосом) позволяют более полно выяснить состояние различных белковых структур и клеточных элементов кожи при различных аутоиммунных буллезных дерматозах. Известно, что молекулы адгезии вовлечены во все физиологические процессы, обеспечивая функциональную целостность кожи. В кожной патологии некоторые молеку-4

лы адгезии выступают в качестве мишеней для аутоиммунных антител, например, при пузырчатке, а другие страдают опосредованно - как при буллез-ном пемфигоиде [Kitajima Y., 2002; Koeser J. Et al., 2003; Getsios S. et al., 2004]. До сих пор дискутируется роль системы комплемента в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов [Dubelsteen Е., 1998; Yancey К.В., 2005; Leighty L. et al., 2007].

Принимая во внимание возможность участия самых различных моле-кулярно-биологических механизмов, эта проблема нуждается в дальнейшем изучении и развитии. При этом целесообразно изучение клинико-морфологических особенностей аутоиммунных буллезных дерматозов конкретно больных дерматозами в Московской области. В процессе исследования клинико-патогенетических особенностей буллезных дерматозов следует изучить: влияние величины титров циркулирующих аутоантител и степени интенсивности фиксации иммунных комплексов на течение аутоиммунных буллезных дерматозов; участие ранних компонентов комплемента в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов; степень экспрессии некоторых антигенов десмосом и цитоскелета как показателя характера поражения эпидермиса. Поскольку предметом исследований является патология, связанная с нарушениями в иммунной системе (аутоиммунные процессы) необходима оценка экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA I и II классов) на клетках тканей кожи, как одного из показателей участия антигенов гистосовместимости в развитии изучаемой патологии. Использование иммуногистохимических методов с целью изучения некоторых сторон патогенеза аутоиммунных буллезных дерматозов и антигенной структуры эпидермиса в норме и при патологии способствуют разработке дополнительных методов диагностики и тактики ведения больных.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение клинико-морфологических и иммунологических особенностей аутоиммунных буллезных дерматозов на примере больных Московской области и совершенствование способа их ранней диагностики и лечения.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить клииико-морфологические особенности аутоиммунных бул-лезных дерматозов, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз на современном этапе.

2. Научно обосновать сущность возникновения симптома Никольского с точки зрения иммунопатологии и оценить его прогностическую ценность при дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов.

3. Изучить роль и влияние циркулирующих аутоантител и фиксированных иммунных комплексов на течение аутоиммунных буллезных дерматозов.

4. Исследовать участие ранних компонентов комплемента (С4, C4d, СЗ) в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов.

5. Определить степень экспрессии некоторых антигенов десмосом (дес-мосомальный протеин, кадгериновый комплекс) и цитоскелета (цито-кератин 5) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.

6. Изучить экспрессию некоторых антигенов базальной мембраны эпидермиса (коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.

7. Провести оценку экспрессии антигенов главного комплекса гистосов-местимости (HLA I и II классов) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.

десмосомальный протеин десмоплакин, цитокератин 5, коллаген IV типа, протеиновый комплекс основного вещества базальной мембраны lamina densa, HLAI класса и HLA-DR антигены).

9. Разработать алгоритм ранней диагностики и контроля эффективности лечения аутоиммунных буллезных дерматозов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. На современном этапе в регионе Московской области выявлена следующая закономерность распространения аутоиммунных буллезных дерматозов. Среди 267 больных аутоиммунными буллезными дерматозами 61,4% составили больные, страдающие аутоиммунной пузырчаткой, 33,3% - буллезным пемфигоидом, 3,4% - приобретенным буллез-ным эпидермолизом и 1,9% - линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом. При этом у 6% больных из 267 выявлен аутоиммунный буллезный дерматоз, протекающий на фоне неоплазии (паранеопласти-ческая пузырчатка - 62,5%, буллезный пемфигоид - 25% и приобретенный буллезный эпидермолиз - 12,5%).

2. При аутоиммунных буллезных дерматозах патогенетическую роль могут играть аутоантитела, относящиеся к иммуноглобулинам классов G и/или А, и иммунные комплексы в растворимой и нерастворимой формах. При этом мишенями могут быть не только специфические антигены, характерные для определенной группы буллезного дерматоза, но и антигены ряда других структур органов и тканей. Наличие такого широкого спектра антител к различным антигенам-мишеням объясняет тяжесть и разнообразие клинических проявлений болезни, например, в частности при паранеопластической пузырчатке.

3. Установлен факт участия ранних компонентов комплемента как в местах локализации антител, так и вне зоны антигенов-мишеней. При этом C4d как наиболее стойкий компонент комплемента может служить дополнительным маркером гуморального ответа в оценке патологического процесса.

4. Наличие симптома Никольского (механическая отслойка эпидермиса) как одного из первых «инструментов» в диагностике аутоиммунной пузырчатки (71,9%) в случаях буллезного пемфигоида (3,4%) и приобретенного буллезного эпидермолиза (66,7%) обуловлено вовлечением в патологических процесс системы десмосомального аппарата.

5. Получена с помощью моноклональных и поликлональных антител к ряду антигенов кожи (кадгериновый комплекс, десмосомальный протеин, цитокератин 5, коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa, антигены главного комплекса гистосовместимо-сти) дополнительная молекулярно-биологическая характеристика изменений в коже при аутоиммунных буллезных дерматозах. Это позволило оценить глубину происходящих иммунопатологических процессов, эффективность проводимой терапии, а в ряде случаев получить дополнительный диагностический способ при дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

• Разработан алгоритм включения методов дифференциальной диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов: клинические проявления с определением симптома Никольского; цитологический метод с выявлением акантолитических клеток (клетки Тцанка); гистологический метод с определением уровня образования пузыря; иммунологический и иммуногистохимический методы исследования с определением наличия в сыворотке крови больных аутоантител и фиксированных иммунных комплексов в тканях; определение степени экспрессии ряда белковых компонентов в тканях.

• Для дополнительной характеристики иммунопатологического процесса при аутоиммунных буллезных дерматозах использован молекулярно-биологический подход с применением антител к антигенам тканевых структур кожи.

• Впервые детально изучена значимость вовлечения циркулирующих ау-тоантител, фиксированных иммунных комплексов и ранних компонентов комплемента и их взаимосвязь с особенностями клинического течения ряда аутоиммунных буллезных дерматозов.

• Впервые проведена оценка клинической специфичности и патогенеза симптома Никольского у больных, страдающих различными аутоиммунными буллезными дерматозами, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфигоид, линейный ^А-зависимый буллезный дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предлагаемый комплекс иммунологических и иммуноморфологических исследований для получения дополнительных сведений о патологических процессах, происходящих при аутоиммунных буллезных дерматозах, с целью установления и/или уточнения их диагноза будет способствовать назначению адекватной терапии (с учетом патогенетических механизмов) и оценки степени ее эффективности.

ВНЕДРЕНИЕ РАБОТЫ

Результаты работы внедрены в практику отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, на кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ, на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М.Сеченова, Московского областного кожно-венерологического диспансера. Опубликованы: монография «Меченые антитела в нормальной и патологической морфологии» (М., 2000); медицинская технология «Метод стабилизации растворимых иммунных комплексов в биоптатах кожи больных буллезными дерматозами» (Москва, 2008 г.). Получен патент № 2097768 на изобретение «Способ диагностики пузырчатки» от 27.11.1997 г. Получено решение о выдаче патента на изобретение № 2008108389/15 (009070) «Способ диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов» от 27.10.2008. В ФИПС подана заявка № 2008144767 на изобре-

тение «Способ прогнозирования возможности изменения клинической формы пузырчатки» от 13.11.2008.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Диссертация апробирована на научной конференции сотрудников отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии, кафедры дерматовенерологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, кафедры кожных и венерических болезней ФППО ММА им. И.М. Сеченова. Материалы диссертации доложены на VII Российском съезде дерматовенерологов (Россия, Казань, 1996 г.), VIII, IX и X Всероссийском съезде дерматовенерологов (Россия, Москва, 2001, 2005 и 2008 г.г.), научно-практической конференции, посвященной 75-летию ЦНИКВИ (Россия, Москва, 1996 г.), научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматоонкологии. Новые лекарственные препараты в практике дерматовенерологии» (Россия, Москва, 2002 г.), IV международной конференции «Экспериментальная и клиническая медицина» (Грузия, Тбилиси, 2002 г.), Первом Российском конгрессе дерматовенерологов (Россия, Санкт-Петербург, 2003 г.), конференции, посвященной памяти Машкиллейсона Асафа Львовича (Россия, Москва, 2004, 2008 г.г.), научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи» (Россия, Москва, 2006 г.), VI-VII научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика» (Россия, Москва, 2006 и 2008 г.г.), XIII-XIV-XV Российском национальном конгрессе «Человека и лекарство» (Россия, Москва, 2006, 2007 и 2008 г.г.), научно-практических конференциях «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии» (Россия, Москва, 2007 и 2008 г.г.), II Форуме Национального Альянса дерматологов и косметологов (Россия, Ростов-на-Дону, 2008 г.), I Международном Форуме медицины и красоты (Россия, Москва, 2008 г.).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 56 печатных работ, в том числе 1 монография.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 357 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 85 рисунками, заключающими в себе 231 микрофотографию.

Библиографический указатель включает 125 отечественных и 831 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на основании клинического обследования и изучения биопсийного материала больных аутоиммунными буллезными дерматозами. За период с 1992 по 2006 год установлен первичный диагноз буллезного дерматоза аутоиммунного происхождения 267 больным, из них 164 больным диагносцирована аутоиммунная пузырчатка (вульгарная, вегетирующая, листовидная, себорейная, паранеопластическая), 89 больным - буллезный пем-фигоид, 5 больным - линейный 1дА-зависимый буллезный дерматоз и 9 больным - приобретенный буллезный эпидермолиз. Обследование больных проводилось в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии ГУ МОНИКИ (Московский областной научно-исследовательский клинический институт) им. И.М.Владимирского, в Московском областном кожно-венерологиче-ском диспансере (МОКВД) и ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий (лаборатория трансплантационной иммунологии).

В каждом случае диагноз заболевания ставился на основании анамнестических сведений, клинической картины с определением симптома Николь-

ского, результатов цитологического, патоморфологического, иммунологического и иммуноморфологического исследований.

Цитологическое и патоморфологическое исследования проводились в лаборатории МОКВД и в отделении патоморфологии ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, соответственно. Иммунологические и иммуноморфологиче-ские исследования проведены лично автором на базе лаборатории трансплантационной иммунологии ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий (с 1988 по 2004 год заведующая, к.б.н. Баранова Ф.С.; в настоящее время заведующий, к.м.н. Абрамов В.Ю.). Метод определения симптома Никольского и оценка его чувствительности, специфичности и прогностической ценности для постановки клинического диагноза. Симптом Никольского вызывался стандартным способом [Глухенький Б.Т., С.А.Грандо, 1990]. При этом использовали две его модификации: «прямой» и «краевой» (маргинальный). В первом случае отслойка верхних слоев эпидермиса возникала на видимо «здоровой» коже при легком скользящем трении пальцем по ней. Во втором - при потягивании за обрывок покрышки пузыря отслойка эпителия происходила за пределы зоны поражения в виде постепенно суживающейся ленты по направлению к видимо здоровой коже. Необходимо отметить, что у всех обследуемых 267 больных симптом Никольского определялся в активной стадии патологического процесса до назначения глюкокортикостероидной и иммуносупрессивной терапии.

С целью определения специфичности, чувствительности и прогностической ценности симптома Никольского в диагностике пузырчатки учитывался ряд параметров, ранее предложенных Б.игип и М. Бигёи [№ип 8., Оигёи М., 2006] - 1) чувствительность (истинно положительный/ (истинно положительный + ложноотрицательный); 2) специфичность (истинно отрицательный/истинно отрицательный + ложноположителъный); 3) положительная прогностическая ценность (истинно положительный/ истинно положительный + ложноположительный) и 4) отрицательная прогностическая ценность (истинная отрицательная/(истинно отрицательная + ложноотрицательная).

Истинно положительным результат признавался при положительном симптоме Никольского у больных аутоиммунной пузырчаткой; ложнополо-жительным - при положительном симптоме Никольского у больных буллезным пемфигоидом, линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом и приобретенным буллезным эпидермолизом; истинно отрицательным результат -при отрицательном симптоме Никольского у больных с буллезным пемфигоидом, линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом и приобретенным буллезным эпидермолизом; ложноотрицательным - у больных пузырчаткой с отрицательным симптомом Никольского.

Метод выявления циркулирующих аутоантител. Метод непрямой имму-нофлюоресценции при исследовании циркулирующих в крови больных аутоантител был использован в принятой форме [Белецкая JI.B., Данилова Т.А., 1977; Beutner E.H., Jordon R.E., 1964]. При изучении циркулирующих в крови антител криостатные срезы готовили из тканей кожи человека и ряда видов лабораторных животных (мыши, крысы, кролики, обезьяны), так как аутоан-титела при акантолитической пузырчатке и буллезном пемфигоиде направлены к тканеспецифическим антигенам, имеющимся в органах большинства видов животных класса млекопитающих [Koch Н., Schaller J., Haustein U.F., 1992]. Различия в реакциях на срезах тканей разных видов животных носили лишь количественный характер. Наиболее чувствительными в наших опытах оказались ткани губы крысы и пищевода кролика. Криостатные нефиксированные срезы толщиной 5 мкм тщательно промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), pH 7,0-7,4, в течение 10 мин, затем срезы сначала обрабатывали исследуемой (промежуточной) немеченной сывороткой. Эту сыворотку применяли в максимально большом числе разведений. Учитывали самое большое разведение, которое давало четкую положительную реакцию. Обработку срезов проводили во влажной камере при комнатной температуре в течение 45-60 мин. Далее срезы промывали в течение 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,4), обрабатывали меченой сывороткой против иммуноглобулина (Ig) человека класса G в течение 30 мин, вновь промывали 3-5

мин PBS и заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Одновременно ставили положительный и отрицательный контроли. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку (человека или животного) в тех же разведениях и инкубировали на срезе столько же времени, как и испытуемую сыворотку, содержащую антитела. В качестве положительного контроля использовали сыворотку, содержащую антитела против изучаемого антигена.

Первичная обработка биопсийного материала. Под местной анестезией 2,0% раствором новокаина проводилась биопсия кожи (из пораженных и клинически непораженных участков) размером 0,3 х 0,5 см. Кусочки тканей кожи замораживали при минус 20°С. Срезы толщиной 4-5 мкм готовили в крио-стате (минус 20° С) и использовали часть серийных срезов в нефиксированном виде. Часть криостатных серийных срезов, фиксированных 96° этанолом, окрашивали гематоксилином и эозином с целью морфологического контроля. Метод выявления фиксированных антител (иммуноглобулинов) и полных иммунных комплексов. Применяли классические методы прямой и непрямой иммунофлюоресценции [Белецкая JI.B., Данилова Т.А., 1977; Beutner Е., Chorzelski Т.Р. et al., 1973] с использованием моноспецифических люминесцирующих сывороток против IgG, IgA, IgM (НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ; ИМТЕК, Москва), люминесцирующих сывороток против С4 и СЗ компонентов комплемента (НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ; CHEM1CON, Австралия), моноклональных антител против C4d компонента комплемента (QUIDEL, США) и сыворотки против фибриноген/фибрин (DAKO CY-TOMATION, Дания).

Серийные криостатные срезы помещали на предметное стекло, подсушивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывали PBS (рН 7,0-7,4) в течение 3-5 мин с целью удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывали люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против IgG, IgM, IgA и СЗ компонента комплемента в течение 30 мин (метод прямой иммунофлюоресценции).

С4 и C4d компоненты комплемента выявляли методом непрямой иммуноф-люоресценции. После нанесения антител срезы оставляли на 45 мин при комнатной температуре или на ночь при температуре 4°С, промывали PBS (35 мин) и обрабатывали 30 мин люминесцирующими антителами к Ig кролика или мышей (ИМТЕК, Москва), соответственно. Затем вновь промывали PBS в течение 3-5 мин и заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. С целью предохранения срезов от выгорания в люминесцентном микроскопе в глицерин добавляли пара-фенилендиамин [Лейси А., 1992]. Для контроля одновременно проводили изучение криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином в световом микроскопе. Мониторинг экспрессии некоторых белков кожи при аутоиммунных буллезных дерматозах осуществлялся с помощью методов непрямой имму-нофлюоресценции и ферментной метки с использованием моноклональных или поликлональных антител (табл. 1). В непрямой гшмунофлюоресцещии применяли люминесцирующие сыворотки против иммуноглобулинов мыши или кролика (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН РФ; ИМТЕК, Москва). В методе ферментной метки - сыворотки против иммуноглобулинов мыши или кролика, меченные пероксидазой (ИМТЕК, Москва).

Серийные криостатные срезы толщиной 4-5 мкм готовили в криостате (минус 20°С) и использовали в нефиксированном или фиксированном виде (см. табл. 1). Подсушивали, промывали PBS (рН 7,0-7,5) в течение 3-5 мин с последующим нанесением антител на срезы. После каждой инкубации препараты промывали в течение 3-5 мин PBS (рН 7,0-7,5), подсушивали и при использовании метода непрямой иммунофлюоресценции заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Исследовали препараты с помощью люминесцентного микроскопа LABORLUX фирмы LEIKA с объективом х 40.

При использовании метода ферментной метки после инкубации препаратов с сывороткой, меченной пероксидазой, промывали в течение 3-5 мин

Таблица 1.

НЕКОТОРЫЕ БЕЛКИ КОЖИ (АНТИГЕНЫ-МИШЕНИ) И УСЛОВИЯ ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ

Антигены Антитела Наименование Фирма производитель Разведе ние Условия обработки крио-статных срезов Условия обработки криостат-ных срезов МкАТ/ ПкАТ Условия обработки криостатных срезов люминесцирующей сывороткой/сывороткой, меченной пероксидазой

Антигены системы межклеточного соединения (десмосом) и цитоскелета ке* ратиноцитов МкАТ против кадгер и нового комплекса Anti-pan Cadherin1 SIGMA, США 1:500 Фиксация в 100% холодном (4°С) ацетоне в течение 10 мин 18 ч во влажной камере при 4°С 50-60 мин во влажной камере в термостате при 37,0-37,2°С

МкАТ против дес-мосомального протеина Anti-desmosomat protein1 SIGMA, США 1:500 Фиксация в 100% холодном (4°С) ацетоне в течение 20 мин 45 мин во влажной камере при комнатной температуре или в термостате при 37,0-37,2°С, или 18 ч при 4°С 30 мин во влажной камере при 37,0-37,2°С

МкАТ к цитокератину 5* A6/11 НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ, Москва 1:10 Без обработки 18 ч во влажной камере при 4вС 30 мин во влажной камере при комнатной температуре

Антигены базальной мембраны эпидермиса ПкАТ антитела к коллагену IV типа Сыворотка против коллагена IV типа человека2 ИМТЕК, Москва 1:10 Без обработки 45 мин во влажной камере при комнатной температуре или 18 ч при 4°С 30 мин во влажной камере при комнатной температуре

МкАТ к белково' му комплексу lamina densa базальной мембраны эпидермиса* Мб1 НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ, Москва 1:10 Без обработки 18 ч во влажной камере при 4°С 30 мин во влажной камере при комнатной температуре

Антигены главного комплекса гистосов-местимости (НЦ\) МкАТ к HLAI класса ICO-531 МЕДБИОСПЕКТР, Москва 1:50 Без обработки 18 ч во влажной камере при 4°С 30 мин во влажной камере при комнатной температуре

МкАТ к HLA II класса JCO-1* МЕД БИОСПЕКТР, Москва 1:50 Последовательная фиксация в 50% и 100% холодном (4°С) ацетоне по 10 мин 18 ч во влажной камере при 4°С 30 мин во влажной камере при комнатной температуре

Примечание: МкАТ - моноклональные антитела; ПкАТ - поликлональные антитела. 1) - мышиные антитела; 2) - кроличьи антитела * - МкАТ любезно предоставлены З.И.Дробышевской

PBS (pH 7,0-7,5), подсушивали и наносили свежеприготовленный раствор 3,3-диаминобензидина - DAB (SIGMA, США) на 10-15 мин. Затем вновь промывали в течение 3-5 мин PBS (рН 7,0-7,5) и наносили для усиления окрашивания 0,5% раствор осмия на 30 сек с последующей промывкой в течение 2-4 мин PBS (рН 7,0-7,5) и в течение 1 мин дистиллированной водой. Далее срезы докрашивали 1 % раствором альцнановым синим или гематоксилином и эозином и заключали под покровное стекло в канадский бальзам. Препараты изучали в световом микроскопе (МИКРОМЕД-2, Санкт-Петербург). Статистическая обработка. Статистическая обработка полученных данных проведена на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Office Excel 2003», «БИОСТАТ», «Statistica 6.0 for Windows».

Результаты представлены в абсолютных значениях и относительных частотах. В ходе работы были составлены таблицы сопряжения (частотные таблицы), результаты которых обрабатывали с помощью статистического анализа категорированных данных. Для выявления различий между группами использовали критерий %2 и точный критерий Фишера с построением четырехпольных таблиц. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

Применяли также корреляционный анализ по Пирсону. При анализе корреляции симптома Никольского с отложениями иммунных комплексов в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами считали ее незначимой при значении модуля коэффициента корреляции от 0 до 0,3; значимой - от 0,3 до 0,75; высокой - выше 0,75.

Для выявления зависимости клинической формы пузырчатки от локализации иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах и степенью интенсивности иммунофлюоресцентной реакции использовали однофактор-ный анализ с расчетом коэффициента корреляции (г) и его уровня значимости (р).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Аутоиммунные буллезные дерматозы - это хронические заболевания, связанные с иммунным ответом против собственных структурных белковых компонентов, которые участвуют в поддержании межклеточных и клеточно-матриксных контактов (адгезия) многослойного плоского эпителия.

На основании клинических, гистопатологических и иммунопатологических критериев, аутоиммунные буллезные дерматозы делят на три группы -пузырчатка, буллезный пемфигоид и приобретенный буллезный эпидермолиз [Ет^ Я., НегТ] М., 2006]. Однако такое деление аутоиммунных буллезных дерматозов условно, т.к. и до настоящего времени продолжаются поиски по изучению их патогенетических механизмов на молекулярно-биологическом уровне.

Группа аутоиммунной пузырчатки включает в себя угрожающие жизни буллезные дерматозы, характеризующиеся образованием внутриэпидермаль-ного пузыря в результате потери адгезии кератиноцитов, и ассоциируется с аутоантителами к антигенам десмосом (система межклеточных соединений или межклеточная субстанция по старой терминологии). Буллезный пемфигоид, линейный ^А-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз характеризуются наличием субэпидермального пузыря в результате потери прикрепления кератиноцитов базальното слоя к базаль-ной мембране и ассоциируется с отложениями иммунных комплексов в зоне базальной мембраны или дермо-эпидермальном соединении. Патогенетическая роль аутоантител, уже доказанная клиническими наблюдениями, окончательно подтверждена и продемонстрирована экспериментально. Эти ауто-антитела обладают высокой тканевой специфичностью и относятся к классу иммуноглобулинов в и/или А. Антигенами-мишенями при этом являются различные молекулы десмосомального аппарата (кадгерины, плакины) и белковые компоненты базальной мембраны эпидермиса (молекулы полудесмо-сом, ламинины, коллаген VII типа) при аутоиммунной пузырчатке и аутоим-

мунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения, соответственно.

Учитывая разнообразие клинических и нередко атипичных форм проявлений аутоиммунных буллезных дерматозов, клиницисты все чаще сталкиваются с необходимостью использования дополнительных методов исследования для постановки точного диагноза, а также дифференциальной диагностики с целью назначения адекватных схем лечения. Благодаря изучению аутоиммунных буллезных дерматозов на молекулярно-биологическом уровне стало возможным более широкое и углубленное исследование патогенеза этих заболеваний на современном этапе и расширение практических клинических знаний. Учитывая выше отмеченное, мы провели оценку чувствительности и специфичности клинического симптома Никольского, а также методов иммунофлюоресценции как наиболее перспективных методов диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов. На молекулярно-биологическом уровне с использованием специфических поликлональных и моноклональных антител к антигенам различных структур многослойного плоского эпителия были изучены некоторые стороны патогенеза аутоиммунных буллезных дерматозов и тем самым найдены дополнительные маркеры, позволяющие провести их дифференциальную диагностику при поэтапном обследовании больного.

Работа выполнена на базе данных клинического обследования и изучения биопсийного материала 267 больных аутоиммунными буллезными дерматозами, из них 164 больных аутоиммунной пузырчаткой, 89 - буллезным пемфигоидом, 5 - линейным ^А-зависимым буллезным дерматозом и 9 -приобретенным буллезным эпидермолизом. Каждое заболевание служило контролем по отношению друг к другу. Многолетняя динамика заболеваемости (1992-2006 г.г.) в Московской области продемонстрировала устойчивую тенденцию к постепенному увеличению роста числа больных аутоиммунными буллезными дерматозами (рис. 1).

25 ■ гЛ

20 \ /\ дД,

лДТ —♦—Аутоиммунные буллезные дерматозы

10 V

г / £ £ / & ^ # & # # / #

Рисунок 1. Многолетняя динамика общей заболеваемости аутоиммунными буллезными дерматозами на основе календарных лет.

Основную группу из них составляли больные с аутоиммунной пузырчаткой (61,4%) и буллезным пемфигоидом (33,3%). Линейный ^А-зависимый буллезный дерматоз (1,9%) и приобретенный буллезный эпидер-молиз (3,4%) диагносцировались крайне редко (рис.2).

Аутоиммунная пузырчатка

■ Буллезный лемфигоид

■ Линейный 1дА - зависимый буллезный дерматоз

И Приобретенный буллезный элидермолиз

Рисунок 2. Процентное соотношение аутоиммунных буллезных дерматозов по отношению друг к другу.

Среди больных, страдающих аутоиммунными буллезными дерматозами, были как мужчины, так и женщины в возрасте от 1В до 87 лет (средний возраст 61,8±14,5 лет). Женщины страдали чаще, чем мужчины (соотношение женщин к мужчинам составляет 2,5:1). При этом пик заболеваемости у женщин приходился на возраст от 61 года до 70 лет, а у мужчин - от 51 года до 60 лет (рис. 3).

1,9% 3,4%

—"—Жемцлны — *—Мухины

До 20 21-30 31-40 41-50 61-60 61-70 71-80 св.80

возраст

Рисунок 3. Заболеваемость аутоиммунными буппезными дерматозами среди мужчин и женщин с учетом возрастных категорий.

опластического процесса было выявлено у 16 (6%) больных из 267. При этом в структуре аутоиммунной пузырчатки частота сочетания с неоплазией составила 6,1% (рис. 4), буллезного пемфигоида - 4,5% (рис. 5), приобретенного буллезного эпидермолиза - 22,2% (рис. 6). При линейном 1§А-зависимом буллезном дерматозе неоплазии выявлено не было ни в одном случае.

10 чел. 6.1%-

120 чел 73.2%

□ Листовидная

□ Себорейная

а Гарлегиформная ■ Паранвопластнчвскэя

□ Вульгарная а Ввгегирующая

Рисунок 4. Клинические варианты аутоиммунной пузырчатки.

4 чеп. 4,5% ■ Классический пемфигоид

"72 ■ Рубцующийся пемфигоид ■ Пемфигоид беременных

г чел. 2,2% Ь-—

5 чел. □ Атипичные проявления

Ш 60 чел. 67,4 % буллезного лемфигоида □ Буллезный пемфигоид паранеопластического генеза

Рисунок 5. Клинические варианты буллезного пемфигоида.

Я классический или механобуллезный чел. 33,3% вариант

О Воспалительный или пймфигоидо-подобный вариант ■ Паранеопластического генеза

Рисунок 6. Клинические варианты приобретенного буллезного эпидермолиза.

Кроме того, при комплексном обследовании больных выявлена ассоциация аутоиммунных буллезных дерматозов с другими аутоиммунными заболеваниями и патологическими процессами, сопровождающимися аутоиммунными реакциями. Это сахарный диабет II типа (74 случая - 27,7%), аутоиммунный тиреоидит и ревматоидный артрит (по 33 случая - 12,4%), анемия (22 случая - 8,2%) и бронхиальная астма (18 случаев - 6,7%) (рис. 7). Необходимо отметить также, что все аутоиммунные буллезные дерматозы протекали на фоне патологии со стороны сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь) и/или желудочно-кишечного тракта (холецистит, панкреатит, гастродуоденит).

4 чел. 44,4%

Рисунок 7. Ассоциация аутоиммунных буллезных дерматозов с другими болезнями.

Постановка диагноза с момента проявления первых признаков заболевания составляла от 1 месяца до 5 лег, в среднем - около шести месяцев. У большинства больных аутоиммунными буллезными дерматозами патологический процесс локализовался преимущественно на коже (93,6%) с одновременным вовлечением слизистых оболочек органов в 53,2% случаев. В отдельных случаях (6,4%) было отмечено поражение только слизистой оболочки полости рта без клинических проявлений на коже. Кроме того, как и большинством авторов [Castanet J. et al., 1990; Hertl M., 2004; Vaillant L., 1991], нами отмечено, что клиническая картина аутоиммунных буллезных дерматозов на современном этапе претерпевает эволюцию. Нередко наблюдается не только клиническое сходство среди разных аутоиммунных буллезных дерматозов (например, как в случае линейного lgA-зависимого буллез-ного дерматоза и буллезного пемфигоида), но и клиническая имитация другими кожными заболеваниями, такими как многоформная экссудативная эритема, синдром Стивенса-Джонсона. синдром Лайела, пруриго, герпетиформ-ный дерматит Дюринга. Такое разнообразие клинических проявлений можно наблюдать и в случаях аутоиммунных буллезных дерматозов, протекающих на фоне неоплазии, и в период продромального развития буллезного пемфигоида с его атипичными проявлениями. Все это не способствует своевременной постановке клинического диагноза и вынуждает клинициста прибегать к использованию различных диагностических методов. Одним из первых методов является симптом Никольского в двух его модификациях («прямой» и

«косвенный»). Его сущность заключается в механической отслойке эпидермиса вследствие разрыва межклеточных контактов (акантолиз) и образования внутриэпидермальных пузырей, как следствие цитотоксического действия аутоантител. Высокая специфичность данного симптома позволяет непосредственно у постели больного заподозрить такое угрожающее жизни заболевание как аутоиммунная пузырчатка. Однако отрицательные результаты в ряде случаев аутоиммунной пузырчатки (28%) и выявление подобного симптома при других аутоиммунных буллезных дерматозах, таких как буллезный пем-фигоид (3,4%) и приобретенный буллезный эпидермолиз (66,7%) не позволяет провести дифференциальную диагностику между этими дерматозами. Подобные наблюдения описаны и другими авторами [Глухенький Б.Т. и др., 2003; Grunwald М.Н. et al., 1984; Polifka М„ Krusinski Р.А., 1980; Urbano F.L., 2000]. Такое «необычное поведение» феномена Никольского требует научно-обоснованного подхода к его оценке с точки зрения иммунопатологии. В стратегических целях это будет обсуждено ниже.

При сомнительных результатах симптома Никольского как первого диагностического «инструмента» в руках клинициста врач вынужден обращаться к лабораторно-диагностическим исследованиям. Наиболее простыми и доступными для лечебных учреждений являются цитологический и пато-морфологический методы исследования. Однако и здесь в ряде случаев возникают сложности в постановке точного диагноза. Так, на наш взгляд цитологическое исследование содержимого пузыря или мазков-отпечатков материала со дна эрозий недостаточно информативно, т.к. акантолитические клетки (клетки Тцанка), характерные для аутоиммунной пузырчатки, обнаруживаются не только при этой патологии (76,2%), но и при буллезном пем-фигоиде (9,9%) и приобретенном буллезном эпидермолизе (11,1%). Подобные наблюдения описывают и при других болезнях кожи [Глухенький Б.Т., Грандо С. А., 1990].

Патоморфологическое исследование биопсийного материала из очага поражения позволило выявить типичную морфологическую картину пузыр-

чатки в 79,9% случаев, буллезного пемфигоида в 83,1% случаев и ни в одном случае линейного ^А-зависимого буллезного дерматоза и приобретенного буллезного эпидермолиза. В двух последних случаях патоморфологическая картина соответствовала буллезному пемфигоиду. Наш диагноз основывался на иммунологических и иммуногистохимических критериях. Несмотря на достаточно высокую информативность гистологического метода, сходные морфологические изменения обязывают дерматологов обращаться к более совершенным и надежным методам исследования с использованием прямой и непрямой иммунофлюоресценции с целью выявления циркулирующих ау-тоантител и фиксированных иммунных комплексов.

Известно, что основную патогенетическую роль при аутоиммунных буллезных дерматозах играют циркулирующие аутоантитела, направленные к антигенам-мишеням межклеточной субстанции (десмосомального аппарата) и базальной мембраны многослойного плоского эпителия при аутоиммунной пузырчатке и аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения, соответственно (табл. 2). Эти аутоантитела, образуя иммунные комплексы в тканях, оказывают на нее цитотокси-ческое действие. При аутоиммунной пузырчатке это приводит к разрушению межклеточных контактов с последующим разрывом связей между отдельными клеточными элементами, развитию акантолиза и образованию внутриэпи-дермальных пузырей. При аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения (приобретенный буллезный эпидермо-лиз, линейный ^А-зависимый буллезный дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз) под действием специфических аутоантител и фиксированных иммунных комплексов происходит разрушение структурных компонентов базальной мембраны с последующим ее расщеплением и образованием подэпидермальных пузырей.

Некоторые авторы считают, что определение титров антител и выявление в тканях фиксированных иммунных комплексов во многих случаях позволяет не только подтвердить диагноз, но и прогнозировать дальнейшее

Таблица 2.

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ АУТОАНТИТЕЛА ПРИ АУТОИММУННЫХ БУЛЛЕЗНЫХ ДЕРМАТОЗАХ

Титры аутоантител к Диагноз

Аутоиммунная Пузырчатка Паранеопластическая Пузырчатка Буллезный пемфигоид Линейный 1дА-зависимый буллезный дерматоз Приобретенный буллезный элидермолиз Приобретенный буллезный элидермолиз паранеопласти-ческого генеза

антигенам межклеточной субстанции многослойного плоского эпителия (эпидермис, пищевод) 1:5-1:10240* 1:10-1:256* 1:10" 1:10"

антигенам базальной мембраны эпидермиса 1:10-1:20"* 1:10-1:40" 1:10-1:128* 1:20* 1:10-1:320* 1:10*

антигенам различных структур эпидермиса и дермы 1:20-1:80" 1:10" 1:10-1:80"

антигенам изотропных дисков скелетной мускулатуры 1:10-1:80" 1:10-1:320"

антигенам межклеточной субстанции телец Гассаля тимуса человека или животных 1:10-1:80* 1:10-1:80*

антигенам миоидных клеток тимоцитов 1:10-1:80"

Антинуклеарный фактор 1:40-1:320"

антигенам базальной мембраны гепа• тоцитов 1:10-1:80"

антигенам соединительнотканных структур печени 1:10-1:320**

антигенам дисков поперечнополосатой мускулатуры 1:5-1:10** 1:10-1:320"

антигенам капилляров миокарда 1:10-1:80" 1:10-1:320"

Примечание: * - циркулирующие аутоантитела, ответственные за развитие аутоиммунного буплезного дерматоза; ** - сопутствующие антитела к антигенам различных структур тканей и органов.

Достоверных различий по частоте встречаемости аутоантител к антигенам межклеточной субстанции и базальной мембраны при аутоиммунной пузырчатке и паранеопластической пузырчатке выявлено не было (р>0,05). Однако надо отметить, что титр аутоантител был достоверно выше при аутоиммунной пузырчатке (1:586 и 1:30 к антигенам межклеточной субстанции и базальной мембране, соответственно), чем при паранеопластической пузырчатке (1:40 к антигенам межклеточной субстанции). Частота выявления циркулирующих аутоантител к антигенам различных структур эпидермиса и дермы, изотропных дисков скелетной мускулатуры, миодных клеток тимоцитов, соединительно-тканных структур печени и ядрам ее клеточных элементов (АНФ), дисков поперечно-полосатой мускулатуры и капилляров миокарда была достоверно выше при паранеопластической пузырчатке, чем при аутоиммунной пузырчатке (р<0,05). При этом титр аутоантител к антигенам дисков поперечно-полосатой мускулатуры (1:118), капиллярам миокарда (1:118) и АНФ (1:25) при паранеопластической пузырчатке было достоверно выше (р<0,05), чем при аутоиммунной пузырчатке.

течение заболевания [Ежов Н.Я., 1974; Friedman Н. Et al., 1989; Sams W.M.Jr., Jordon R.E., 1971; Titzpatrick R.E., Newcomer V.D., 1980]. В наших исследованиях с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции специфические аутоантитела в сыворотке крови больных различными аутоиммунными бул-лезными дерматозами были выявлены в 80,3% случаев. При этом титры антител (от 1:5 до 1:10240) не всегда коррелировали с клиническими проявлениями. Это связано со способностью кожи сорбировать иммунные комплексы с целью их элиминации. Поэтому при обширных поражениях кожи, порой с захватом целых анатомических областей и слизистой оболочки, циркулирующие аутоантитела не всегда удается выявить, особенно в случаях аутоиммунной пузырчатки (65,8%) и буллезного пемфигоида (29,4%). И, наоборот, в случае локального патологического процесса титр аутоантител может достигать высоких цифр до 1:10240.

Кроме основных патогенетически значимых антител в ряде случаев были выявлены «дополнительные» антитела (см. табл. 2). Так, при паранеопла-стической пузырчатке выявлен широкий спектр антител к антигенам многих структур органов и тканей, таких как миоидные клетки тимуса, диски поперечнополосатой мускулатуры, капилляры миокарда, соединительнотканные структуры печени и ядра ее клеточных элементов (гепатоцитов). Это объясняет тяжесть и разнообразие клинических проявлений болезни, протекающей на фоне неоплазии. Кроме того, наличие «мозаики» антител при данной форме патологии позволяет рассматривать паранеопластическую пузырчатку как мультиорганный синдром. Об этом имеется ряд сообщений и других авторов [Lane J.E. et al., 2004; Nguyen V.T. et al, 2001].

В случаях приобретенного буллезного эпидермолиза выявлено, что патогенетическую роль могут играть или IgG, или IgG и IgA антитела одновременно. При этом антигенами-мишенями могут быть молекулярные соединения и lamina densa, и lamina lucida. Вовлечение последней, по-видимому, связано с опосредованным влиянием этих аутоантител на адгезивную функцию молекул.

Если циркулирующие аутоантитела при аутоиммунных буллезных дерматозах не всегда удается выявить в связи с иммунной сорбцией в тканях, то фиксированные иммунные комплексы были обнаружены во всех исследованных случаях (100%). При этом наряду с основными иммуноморфологи-ческнми диагностическими признаками каждого аутоиммунного буллезного дерматоза выявлен ряд дополнительных интересных фактов. Известно, что одним из диагностических маркеров аутоиммунной пузырчатки является обнаружение иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах эпидермиса (р<0,05) (рис. 8). При вульгарной и вегетирующей пузырчатке фиксация иммуноглобулина класса G наблюдается в межклеточных пространствах шиповатого слоя, а при себорейной и листовидной пузырчатке - в зернистом слое эпидермиса. Однако в наших исследованиях была выявлена несколько иная иммуногистохимическая картина. Так, при пузырчатке независимо от клинических форм ее проявления в патологический процесс всегда были вовлечены антигены десмосомального аппарата шиповатого слоя. При этом в случаях вульгарной пузырчатки в патологический процесс одновременно вовлекалось и межклеточное пространство базального слоя эпидермиса (р=0,032), а в случаях листовидной или себорейной пузырчатки - межклеточное пространство зернистого слоя с наиболее интенсивной иммуногисто-химической реакцией в ней (р=0,027 и р=0,000012, соответственно).

Многолетние клинические и иммунопатологические наблюдения позволили выявить следующий интересный факт. Так, вовлечение системы межклеточного соединения всех слоев эпидермиса у одного и того же больного сопровождается проявлением в течение всего периода болезни клинически разных форм пузырчатки (рис. 9). Это отражает мнение ряда авторов о возможном переходе одной клинической формы болезни в другую и, обратно [Hashimoto Т. et al., 1995; Kawana S. et al., 1994; Komai et al., 2001]. Кроме того, вероятно, этим можно объяснить формирование у таких пациентов одновременно поверхностных и глубоких внутриэпидермальных пузырей с участием иммунных комплексов как в растворимой (трудно выявляемой), так и нерастворимой формах.

Базальная мембрана эпидермиса

Межклеточное пространство базального слоя

Межклеточное пространство шиповатого слоя

Межклеточное пространство зернистого слоя

—♦—Вульгарная пузырчатка -»- Вегетирующая пузырчатка

Листовидная пузырчатка -С- Себорейная пузырчатка —♦—Паранеолластическая пузырчатка

1Я" -^6упл„„ый„,иф„га„я

—»—Линейный 1дА-зависимый буллезный дерматоз

—♦—Приобретенный буллезный элидермолиз

Рисунок В. Фиксированные иммунные комплексы (%) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.

Примечание: 1дС, 1дА, 1дМ - основные классы иммуноглобулинов; С4, С4с1, СЗ - ранние компоненты комплемента; Ф - фибрин/фибриноген

Разнообразие антигенов-мишеней было выявлено и при аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермадьного соединения. При буллезном пемфигоиде, линейном IgA-зависимом буллезном дерматозе установлено, что мишенью могут быть одновременно и lamina lucida, и lamina densa (р<0,05). При этом патогенетическую роль могут играть аутоантитела, относящиеся к IgG и/или IgA. В ряде случаев при приобретенном буллезном эпидермолизе и буллезном пемфигоиде, наряду с основными антигенами-мишенями (lamina densa и lamina lucida, соответственно) в патологический процесс опосредованно вовлекается и десмосомальный аппарат эпидермиса. Так, в 5% случаев буллезного пемфигоида и в 22,2% случаев приобретенного буллезного эпидермолиза выявлена дополнительная очаговая фиксация иммуноглобулина класса G в межклеточной субстанции базального и шиповатого слоев эпидермиса (р=0,028) (см. рис. 8). Данное наблюдение можно рассматривать и как проявление выделительной функции кожи больного.

Наряду с основным классом иммуноглобулина, характерного для той или иной патологии наличие иммуноглобулинов других классов, ранних компонентов комплемента и фибринозного экссудата в различных структурах эпидермиса и дермы можно объяснить у больных действием сопутствующих антител, которые могут являться отягощающими основное заболевание факторами и быть причиной глубоких нарушений в системе гомеоста-за. Так, при аутоиммунных буллезных дерматозах фиксация ранних компонентов комплемента выявлена не только в местах локализации антител, но и вне зоны антигенов-мишеней (см. рис. 8). При аутоиммунной пузырчатке выявлено дополнительно изолированная экспрессия ранних компонентов комплемента в зоне базальной мембраны эпидермиса; при буллезном пемфигоиде - в межклеточной субстанции и lamina densa; при приобретенном буллезном эпидермолизе - в lamina lucida (р<0,05). Это свидетельствует о сложных процессах развития аутоиммунных буллезных дерматозов с активацией системы комплемента одновременно как классическим, так и альтернативным

Рисунок 9. Переход одной клинической формы пузырчатка в другую, и обратно. Трансформация возникает на протяжении всего периода болезни в различные промежутки времени, от 1 года до 11 лет (в среднем 7,1 лет±3,3 года) и обусловлена изменением профиля антигенов-мишеней с фиксацией 1дб в месте их локализации, характерной для каждой клинической формы аутоиммунной пузырчатки. Так, в случае вульгарной пузырчатки наиболее выраженная иммунофлюоресцентная реакция наблюдается в межклеточной субстанции базального слоя, а в случае себорейной пузырчатки - зернистого слоя эпидермиса. При этом белки межклеточной субстанции шиповатого слоя являются общей мишенью для аутоантител при данных формах пузырчатки. Возможно, это связано с частичным перекрещиванием антигенов вульгарной и себорейной пузырчатки, имеющих сходные или общие детерминанты.

Примечание: (1) - реакция слабая; (2)- реакция умеренная; (3) - реакция выраженная. С помощью корреляционного анализа выявлена функциональная связь между степенью реакции и формой пузырчатки (г« 1,0).

путями. Необходимо отметить, что С4с1 компонент как наиболее устойчивый к каталитическим процессам компонент системы комплемента может быть свидетелем протекающей гуморальной реакции, в то время как другие участники иммунного комплекса разрушаются и вымываются из тканей. Такое свойство С4ё компонента комплемента может быть использовано в ряде случаев как диагностический маркер для оценки характера и состояния патологического процесса.

Данные иммунологических и иммуноморфологических исследований способствуют не только уточнению или постановке диагноза, но и изучению происходящих в организме иммунопатологических процессов. Последнее позволило расширить научное понимание ранее указанного феномена Никольского, который достоверно коррелирует (г=0,7-0,8 при р<0,05) с отложениями иммунных комплексов в межклеточной субстанции многослойного плоского эпителия. Так, наличие положительного симптома Никольского в ряде случаев буллезного пемфигоида (3,4%) и приобретенного буллезного эпидермоли-за (66,7%) можно объяснить проникновением в межклеточные пространства иммуноглобулина класса в и ранних компонентов комплемента, что свидетельствует об опосредованном вовлечении в патологический процесс молекул адгезии и десмосомального аппарата. Повреждение межклеточных контактов на молекулярном уровне без видимых морфологических изменений, возможно, является достаточным, чтобы механически вызвать нарушение целостности кожного покрова. Это можно рассматривать как один из механизмов развития феномена Никольского при упомянутых заболеваниях.

Правильно установленный диагноз способствует назначению адекватных схем лечения. В настоящее время, несмотря на клинически видимую эффективность проводимой терапии, риск развития обострения патологического процесса остается значительным. Данные иммунопатологического исследования показывают, что не всегда удается «подавить» процесс. Так, наличие специфических фиксированных иммуноглобулинов как в нерастворимой, так и растворимой формах и ранних компонентов комплемента в тканевых структурах свидетельствует об активно происходящих процессах в организме 32

человека и под действием дополнительных факторов возможно возникновение обострения болезни (аутоиммунного буллезного дерматоза). Это требует постоянного приема поддерживающих доз глюкокортикостероидов.

Отсутствие полного подавления патологического процесса с помощью широко используемых известных препаратов и методов лечения (плазмафе-рез, экстракорпоральный фотоферез), разнообразие клинической картины одного и того же буллезного дерматоза или сходство различных буллезных дерматозов заставляет специалистов продолжать углубленные исследования по изучению патогенеза аутоиммунных буллезных дерматозов с использованием молекулярно-биологических методов.

При использовании моноклональных и поликлональных антител к антигенам ряда тканевых структур кожи (молекулы клеточной адгезии кадгери-нового комплекса, десмосомальный протеин, цитокератин 5, коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa базальной мембраны, продукты генов главного комплекса гистосовместимости I и II классов) с целью изучения молекулярно-биологических сдвигов в тканях при аутоиммунных буллезных дерматозах были отмечены особенности, характерные для каждого из этих заболеваний (табл. 3).

При определении экспрессии молекул клеточной адгезии кадгериново-го комплекса с помощью моноклональных антител выявлено, что при аутоиммунных буллезных дерматозах происходит нарушение экспрессии кадге-ринового комплекса вплоть до его исчезновения и проявления в тех структурах эпидермиса, где в норме он отсутствует. Так, извращенная экспрессия кадгеринов в зоне базальной мембраны эпидермиса выявлена в большинстве случаев (72,7%) аутоиммунных буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения и в ряде случаев (26,1%) разных форм аутоиммунной пузырчатки, включая паранеопластического генеза.

Следует отметить, что при буллезном пемфигоиде (рис. 10) и приобретенном буллезном эпидермолизе (рис. 11) в месте образования подэпидер-мального пузыря экспрессия кадгеринового комплекса выявлена как на по-

Таблица 3.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АУТОИММУННЫХ БУЛЛЕЗНЫХ ДЕРМАТОЗОВ_

Диагноз Маркеры и их экспрессия Антигены ряда тканевых структур кожи

Базальная мембрана эпидермиса Межклеточное пространство эпидермиса Кератиноциты Эндотелий сосудов Клетки Лангерганса

Цитоплазма перицитоплаз-матически Перинук-леарно поверхность

Пузырчатка вульгарная Cadh *!■ +* +/- +Í- -

DPr *1- +Í- - -

СК5 -

Coll IV

Основное вещество lamina densa - - - •

HLAI - - +

HLAII +/- Н- - +Í- +/- +/-

Пузырчатка вегетирующая Cadh - - - - -

DPr ■ +* ■ - ■

CK5 ■ ■ - -

Coll IV +* - - - -

Основное вещество lamina densa +* ■ - - -

HLAI +* +

HLAII Н- +/- - +/- Ч-

Пузырчатка листовидная Cadh - +* - -

DPr + +« - ■

CK5 ■ -

Coil IV - - -

Основное вещество lamina densa - - - -

HLAI - ■ • +

HLA II - - - +1- М-

Пузырчатка себорейная Cadh +/- - +/- -

DPr +*

CKS +1- ■ -

Coll IV -

Основное вещество lamina densa

HLAI - - - + + -

HLA II - - - - +/- +/-

Пузырчатка Паранеопластическая Cadh + + - -

DPr + +* + - -

СК5 +/- +4- - -

ColllV - - - - -

Основное вещество lamina densa - - - - -

HLA 1 - ■ - +* + _

HLA 1) - - - -

Буллезный пемфигоид Cadh +/- - +/- - • -

DPr +* +<- - -

CK5 *t- - ■

ColllV - - - - -

Основное вещество lamina densa - - - ■ -

HLA l +Í+" + -

HLA II +/- - - +/- +1-

Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз Cadh + -

DPr + ■ - ■ ■

CKS - +* все слои -

ColllV ■ ■ -

Основное вещество lamina densa + • - - ■ -

HLA / - - - + + -

HLA II ■ ■ - ■ + +

Приобретенный буллезный злидермолиз Cadh +

DPr + + +/- -

CK5 - - ■ • ■

ColllV - - - -

Основное вещество lamina densa +* ■ - - ■ -

HLA 1 - - + -

HLA II - - +/- +

Примечание: +) - экспрессия сохранена; +*) - экспрессия нарушена, наряду с участками нормальной экспрессии отмечаются места ее подавпения вплоть до полного исчезновения иммуногистохимической реакции; -) - экспрессии нет.

Cadh - кадгериновый комплекс; DPr - десмосомальный протеин; СК5 - цитокератин 5; Coll IV - коллаген IV типа; HLA I - главный комплекс гистосовместимости I класса; HLA II - главный комплекс гистосовместимости II класса.

крышке пузыря, так и на его дне. Однако выраженная иммуногистохимиче-ская реакция наблюдалась в месте локализации антигена-мишени. Вероятно,

Буллезный пемфигоид

□ кадгерины q десмосомальныи протеин ■ синтез цитоквратина 5 □ коллаген IV типа

□ основное вещество Lamina Densa ■ HLA1 класса D HLA II класса

Рисунок 10. Мониторинг экспрессии ряда белков кожи в зоне базальной мембраны эпидермиса и в месте формирования подэпидермального пузыря при буллезном пемфигоиде. Частота экспрессии кадгеринового комплекса достоверно выше на дне и покрышке пузыря, чем на базальной мембране (р=0,034). Десмосо-мальный протеин обнаружен в достоверно меньшем количестве случаев на покрышке пузыря, чем на дне (р=0,023). Частота выявления коллагена IV типа на покрышке достоверно ниже, чем на базальной мембране (р=0,0045) и на дне пузыря (р=0,0014). Частота выявления белкового комплекса основного вещества lamina densa достоверно отличалась между покрышкой и дном пузыря (р=0,026) и базальной мембраной (р-0,012).

под действием патогенетических факторов происходит переключение экспрессии генов одних клеток на гены других (при подавлении одних и активации других). Кроме того, при аутоиммунной пузырчатке вопреки логическому мышлению выявлено парадоксальное явление усиления экспрессии кадгеринового комплекса в местах формирования внутриэпидермального пузыря. Возможно, это связано с компенсаторным эффектом этих молекул адгезии, т.е. исчезновение одних молекул и появление других.

Приобретенный буппезный эпидермопиз

базальная мембрана

100% I 100%® 100% 100% ЕЁ]

100% 100% 85,1% 77,8% 1

покрышка пузыря

□ кадгерины

■ синтез иитокератина 5 О основное вещество Lamina Densa

□ HLAII класса

■ десмосомальный протеин □ коллаген IV типа

■ HLA I класса

Рисунок 11. Мониторинг экспрессии ряда белков кожи в зоне базальной мембраны эпидермиса и в месте формирования подэпидермального пузыря при приобретенном буллезном эпидермолизе. По частоте выявления кадгеринов и десмосомального протеина достоверных различий выявлено не было. Достоверно чаще на базальной мембране, чем на покрышке пузыря выявлен коллаген IV типа (р=0,029) и основное вещество lamina densa (р=0,015).

Экспрессия данного протеина в зоне базальной мембраны эпидермиса отмечена во всех случаях паранеопластической пузырчатки и в ряде случаев (16,7%) вульгарной и листовидной пузырчатки. В случаях аутоиммунных буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения фиксация антител к десмосомальному протеину выявлялась на дне пузыря (lamina densa) (см. рис.10; см. рис.11; рис.12).

Линейный tgA-зависимый булпезный дерматоз

а кадгерины ■ десмосомальный протеин

■ синтез цитокератина 5 q коллаген IV типа

□ основное вещество Lamina Densa a HLA I класса

□ HLA II класса

Рисунок 12. Мониторинг экспрессии ряда белков кожи в зоне базальной мембраны эпидермиса и в месте формирования подэпидермального пузыря при линейном 1дА-зависимом буллезном дерматозе.

Кроме того, выявлено нарушение экспрессии десмосомального протеина вплоть до его полного разрушения в базальном и шиповатом слоях эпидермиса с разрывом межклеточных контактов не только в случаях аутоиммунной пузырчатки, но и в случаях аутоиммунных буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения (см. табл. 3). Все это свидетельствует о том, что десмосомальный протеин десмоплакин I может быть непосредственной мишенью для аутоантител как в случае пузырчатки или вовлекаться в процесс опосредованно как при буллезном пемфигоиде, линейном IgA-зависимом буллезном дерматозе и приобретенном буллезном эпидермолизе с проявлением его извращенной экспрессией в lamina densa ба-зальной мембраны эпидермиса. Подобную картину можно наблюдать и при пузырчатке паранеопластического генеза.

Повреждение «кадгерин-десмоплакинового» комплекса, по-видимому, приводит к нарушению процессов пролиферации и дифференцировки кера-тиноцитов. Этому свидетельствуют изменения локализации цитокератина 5 в коже больных, страдающих аутоиммунными буллезными дерматозами (см. табл. 3; рис. 12).

О Приобретенный буллезный эпидермолиз

■ Линейный 1дА-зависимый буллезный дерматоз

О Буллезный пемфигоид

И Паранеопластическая пузырчатка

а Себорейная пузырчатка

О Листовидная пузырчатка

■ Вегетирующая пузырчатка

□ Вульгарная пузырчатка

не нарушен нарушен распространен ослаблен отсутствует на все слои

Рисунок 12. Синтез цитокератина 5 в клетках базального слоя эпидермиса при аутоиммунных буллезных дерматозах.

Так, при определении синтеза цитокератина 5 клетками базального слоя эпидермиса больных аутоиммунной пузырчаткой и аутоиммунными

буллезными дерматозами с поражением дермо-эпидермального соединения с помощью моноклональных антител была выявлена иммуногистохимическая картина дефекта синтеза цитокератина 5 клетками камбиального слоя эпидермиса, выражающегося в одновременном проявлении участков отсутствия экспрессии цитокератина или его истощения (экспрессия остается только в местах соединения полудесмосом кератиноцитов с базальной мембраной) и «возбуждения» синтеза или сохранения ранее синтезируемого белка в цитоплазме не только клеток базального, но и дифференцированных слоев эпидермиса. Последнее явление наиболее выражено в случаях первично диагностируемой вульгарной пузырчатки. Снижение синтеза кератина 5 вплоть до полного его подавления на большем протяжении исследуемого материала наблюдали в случаях паранеопластической пузырчатки и буллезного пемфи-гоида. Такие дефекты синтеза цитокератина 5, возможно связаны с воздействием на структуры ткани аутоантител и комплемента с последующим вовлечением дополнительных патогенетических факторов (цитокины, ферменты, медиаторы). Последние в норме являются ответственными за процессы пролиферации и дифференцировки клеточных элементов.

При исследовании антигенов базальной мембраны (коллаген IV типа и белковый комплекс основного вещества lamina densa) кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами с помощью поликлональной сыворотки и моноклональных антител была выявлена разная иммуноморфологическая картина (см. табл. 3). Так, при исследовании биоптатов кожи относительно состояния коллагена IV типа базальной мембраны эпидермиса и сосудов практически во всех исследованных случаях выявлена картина нарушения локализации и, по-видимому, синтеза коллагена IV типа базальной мембраны эпителия и сосудов (р>0,05). Практически во всех случаях аутоиммунной пузырчатки независимо от ее клинических форм проявления на большом протяжении наблюдались разрыхление базальной мембраны с участками отсутствия реакции иммунофлюоресценции в зоне базальной мембраны и явлениями секвестраций коллагена на поверхность кожи. Это можно объяснить

цитотоксическим действием иммунных комплексов на различные структуры тканей, в частности базальной мембраны кожи. В результате чего происходит в большей или меньшей степени либо нарушение нормальной продукции коллагена мембраны эпителия, либо нарушение сборки коллагеновых волокон. При этом благодаря естественному пути элиминации белков, не связанных со структурами тканей, выявляется материал, положительно реагирующий с сывороткой к коллагену IV типа в эпителии и на его поверхности. Подобную картину наблюдали и при аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения. Однако наиболее интенсивное разрушение базальной мембраны эпидермиса наблюдали при буллезном пемфигоиде, т.к. при данной патологии аутоантитела направлены непосредственно к антигенами полудесмосом и lamina lucida базальной мембраны, прилегающей к коллагеновым волокнам. При этом в месте образования по-дэпидермального пузыря коллаген IV типа выявлялся на его дне (см. рис.10). При приобретенном буллезном эпидермолизе коллаген данного типа выявлялся как на дне, так и на покрышке подэпидермальных пузырей одновременно или раздельно (см. рис. 11).

При исследовании состояния белкового комплекса lamina densa во всех исследуемых случаях аутоиммунных буллезных дерматозов выявлено вовлечение в патологический процесс базальной мембраны эпидермиса в виде ее разрыхления или утолщения с участками отсутствия реакции иммунофлюо-ресценции с использованием специфических моноклональных антител в зоне базальной мембраны и явлением секвестрации этого белкового материала на поверхность кожи (р<0,05). Это можно объяснить повреждающим действием иммунных комплексов на клетки, синтезирующие основное вещество базальной мембраны, в результате которого нарушается нормальная продукция ее белков. Факт выявления в эпителии материала, положительно реагирующего с моноклональными антителами, подтверждает наличие выделительной функции кожи. Кроме того, в месте образования подэпидермальных пузырей при буллезном пемфигоиде и приобретенном буллезном эпидермолизе им-

муногистохимическая реакция отмечена в большинстве случаев только на дне пузыря, реже одновременно или раздельно на дне и покрышке пузыря (см. рис. 10; см. рис. 11).

При определении экспрессии антигенов главного комплекса гистосов-местимости класса 1 с помощью специфических моноклональных антител при аутоиммунных буллезных дерматозах, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфигоид, линейный 1§А-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз была выявлена разная степень экспрессии НЬА 1 класса на поверхности кератиноцитов и эндотелии сосудов вплоть до полного ее угнетения (см. табл. 3; рис. 13). По-видимому, нарушение экспрессии этих антигенов происходит не только под влиянием имму-носупрессивных препаратов, но и под влиянием цитотоксического действия аутоантител с вовлечением их в патологический процесс, сопровождающий-

□ Приобретенный буллезный эпидермолиз

■ Линейный 1дА-зависимый

буллезный дерматоз а Буллезный пемфигоид

□ Паранеопластическая пузырчатка

□ Себорейная пузырчатка

О Листовидная пузырчатка в Вегетирующая пузырчатка а Вульгарная пузырчатка

реакция реакция реакция

отсутствует нарушена сохранена

Рисунок 13. Степень экспрессии Н!_А I класса на поверхности кератиноцитов при аутоиммунных буллезных дерматозах. Реакция «сохранена» при себорейной пузырчатке выше, чем при вульгарной пузырчатке (р=0,028).

с я повреждением поверхности кератиноцитов, секвестрацией НЬА I положительного материала на поверхность кожи и появлением антигена в локализациях, где в норме он отсутствует. Так, при приобретенном буллезном эпи-дермолизе выявлена экспрессия антигенов НЬА I класса в зоне базальной мембраны эпидермиса (см. рис. И). Кроме того, в случаях аутоиммунных буллезных дерматозов паранеопластического генеза выявлено полное отсут-

ствие экспрессии данных антигенов на поверхности кератиноцитов, что может быть связано с выработкой при опухолевом процессе аутоантител, направленных к ряду тканевых антигенов, в том числе и к антигенам НЬА I класса.

При исследовании экспрессии антигенов главного комплекса гисто-совместимости класса II (НЬАФК) с помощью специфических монокло-нальных антител у больных, страдающих аутоиммунным процессом отмечена экспрессия НЬА-ЭЯ антигенов на эндотелиальных клетках сосудов дермы и клетках Лангерганса (см. табл. 3, рис. 14). При этом клетки Лангерганса выявлялись в разной степени активности с их неравномерным распределением по эпидермису и нередко в дермо-эпидермальном соединении, особенно в очагах поражения и в месте образования пузырей.

В большинстве случаев экспрессия НЬЛ-БЯ антигенов выявлялась на цитоплазматической мембране кератиноцитов и на поверхности кожи, что связано с выраженным нарушением механизмов регуляции экспрессии и в результате - изменением локализации белков данного класса гистосовмести-мости. В ряде случаев у пациентов с впервые выявленным аутоиммунным процессом обнаружено угнетение или полное подавление экспрессии НЬА-БЯ антигенов на эндотелии сосудов верхнего отдела дермы и клетках Лангерганса (см. рис. 14). Это позволяет предположить, что последние могут выступать в качестве мишени для аутореактивных Т-лимфоцитов и аутоантител. Нарушение регуляции экспрессии генов НЬА II класса и их белковых продуктов является одним из важных механизмов, лежащих в основе развития аутоиммунных процессов и иммунологической недостаточности. Подобную картину угнетения или подавления экспрессии НЬА-БЫ антигенов можно наблюдать и при наличии неопластического процесса, и при длительном приеме иммуносупрессивных препаратов.

клетки Лангергаиса

реакция реакция реакция реакция отсутствует слабая умеренная выраженная

□ Приобретенный буллезный эпидермолиз

■ Линейный 1дА-зээисимый буллезный дерматоз

О Буллезный пемфигоид

□ Паранеолластичесхэя пузырчатка

□ Себорейная пузырчатка

о Листовидная пузырчатка

■ Вегетирующая пузырчатка

эндотелий сосудов

реакция реакция умеренная выраженная

□ Приобретенный буллезный эпидерм 0-пиэ

■ Линейный 1дА-зависимый буллезный дерматоз

□ Буллезный пемфигоид

□ Паранеопласгическая пузырчатка

О Себорейная пузырчатка

□ Листовидная пузырчатка

в Вегетирующая пузырчатка

□ Вульгарная пузырчатка

Рисунок 14. Аутоиммунные буллезные дерматозы и экспрессия антигенов главного комплекса гистосовме-стимости I) (Н1_А-ОР) на клетках Лангерганса и эндотелии сосудов дермы.

ных молекулярно-биологических методов исследования, включая иммунологические и иммуногистохимические методы с использованием меченых антител. Результаты исследований являются основой для создания базы по изучению состояния молекулярных соединений кожи с целью разработки методов дифференциальной диагностики и осуществления контроля за качеством лечения и подбора лекарственных средств. Эффективность проводимой терапии можно контролировать выявлением и оценкой степени экспрессии различных белковых компонентов в структурах тканей. Приближаясь к генетическому уровню (выявление и оценки экспрессии генов), задачей современной медицины является вмешательство в геном с целью исправления синтеза того или иного вещества. Но эта проблема будущего.

выводы

1. Динамика заболеваемости первичным аутоиммунным буллезным дерматозом среди жителей Московской области продемонстрировала устойчивую тенденцию к постепенному увеличению роста числа больных данной патологией. В структуре аутоиммунных буллезных дерматозов частота аутоиммунной пузырчатки составила 61,4%, буллезного пемфигоида - 33,3%, приобретенного буллезного эпидермолиза - 3,4%, линейного ^А-зависимого буллезного дерматоза - 1,9%. Частота сочетания аутоиммунных буллезных дерматозов с неоплазией составила 6%. При этом в структуре аутоиммунной пузырчатки - 6,1%, буллезного пемфигоида - 4,5%, приобретенного буллезного эпидермолиза -22,2%.

2. При аутоиммунных буллезных дерматозах патогенетически значимую роль играют аутоантитела, представленные иммуноглобулинами классов О и/или А, и иммунные комплексы в растворимой и нерастворимой формах. При этом мишенями являются не только специфические антигены, характерные для определенной группы буллезного дерматоза, но и антигены многих структур органов и систем, особенно при паране-опластической пузырчатке. Наличие широкого спектра антител к антигенам-мишеням разных тканей объясняет не только тяжесть и разнообразие клинических проявлений болезни, но и является весомым аргументом для тщательного обследования больного с целью исключения неопластического процесса.

3. Наличие фиксированных иммунных комплексов (иммуноглобулина класса в и ранних компонентов комплемента) в системе межклеточных соединений многослойного плоского эпителия у больных аутоиммунной пузырчаткой (71,9%), а в ряде случаев буллезным пемфигоидом (3,4%) и приобретенным буллезным эпидермолизом (66,7%) способствует возникновению симптома Никольского.

4. Выявление ранних компонентов комплемента как в местах локализации антител, так и вне зоны антигенов-мишеней свидетельствует о

сложных механизмах развития аутоиммунных буллезных дерматозов с активацией системы комплемента одновременно как классическим, так и альтернативным путями. При этом C4d как наиболее стойкий компонент комплемента в отношении каталитического процесса может служить дополнительным маркером гуморального ответа в оценке патологического процесса.

5. При исследовании антигенов системы десмосом и цитоскелета керати-ноцитов при аутоиммунных буллезных дерматозах выявлены нарушения экспрессии кадгеринового комплекса, десмосомального протеина десмоплакина I и синтеза цитокератина 5 вплоть до их исчезновения и проявления в тех структурах эпидермиса, где в норме они отсутствуют. Извращенная экспрессия кадгеринового комплекса и десмосомального протеина десмоплакина I в зоне базальной мембраны эпидермиса обнаружена при аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения и в ряде случаев аутоиммунной пузырчатки, в частности паранеопластического генеза. Наличие цитокератина 5 в цитоплазме не только клеток базального, но и дифференцированных слоев эпидермиса, свидетельствуют о нарушениях полимеризации ци-токератиноцитов и дифференцировки кератиноцитов при аутоиммунных буллезных дерматозах. Снижение синтеза цитокератина 5 вплоть до полного его подавления отмечается в случаях паранеопластической пузырчатки и буллезном пемфигоиде.

6. При исследовании антигенов базальной мембраны (коллаген IV типа и белковый комплекс основного вещества lamina densa) выявлено вовлечение базальной мембраны в патологический процесс в виде ее разрыхления или утолщения с секвестрацией специфического материала на поверхность кожи. Наиболее резкие изменения целостности колла-геновых волокон, благодаря непосредственной фиксации антител в базальной мембране, выявлены при буллезном пемфигоиде и незначительное разрыхление волокон - при аутоиммунной пузырчатке.

7. При исследовании экспрессии антигенов главного комплекса гисто-совместимости выявлено вовлечение этих антигенов в патологический процесс, сопровождающийся разной степенью экспрессии антигенов НЬА I и НЬА II (НЬА-ЕЖ) классов вплоть до полного их угнетения и появления в тех структурах эпидермиса, где в норме они отсутствуют. Это свидетельствует о том, что при аутоиммунных буллезных дерматозах антигены главного комплекса гистосовместимости могут быть мишенями для аутоантител, а также подвергаться воздействию других факторов, в том числе иммуносупрессивных препаратов. Полное отсутствие экспрессии антигенов Н1А I и НЬА II (НЬА-ОЯ) классов наблюдалось при аутоиммунных буллезных дерматозах паранеопластическо-го генеза, а извращенная экспрессия - в зоне базальной мембраны эпидермиса при приобретенном буллезном эпидермолизе.

8. Использование молекулярно-биологической характеристики состояния различных структур тканей кожи при аутоиммунных буллезных дерматозах позволяет более точно оценить степень тяжести происходящих иммунопатологических процессов и провести тестирование эффективности проводимой терапии. Кроме того, особенности локализации антигенов (нарушение экспрессии генов, ответственные за синтез исследуемых белков) могут служить дополнительными маркерами при дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

4- Включение методов с использованием меченых антител, в частности прямой и непрямой иммунофлюоресценции, наряду с другими методами исследования в область дерматологии является важным шагом при ранней диагностике таких серьезных заболеваний как аутоиммунные буллезные дерматозы.

•4- Выявление и определение места локализации иммунных комплексов способствует диагностике аутоиммунной пузырчатки, буллезного пем-фигоида, линейного 1§А-зависимого буллезного дерматоза и приобретенного буллезного эпидермолиза.

При атипичных клинико-морфологических проявлениях аутоиммунных буллезных дерматозов или сомнительных результатах при использовании классического метода прямой иммунофлюоресценции по выявлению фиксированных иммунных комплексов показано использование метода диагностики, основанного на выявлении молекулярно-биологических мишеней кожи с помощью меченых антител. Оценка степени экспрессии и характера локализации того или иного гена, ответственного за синтез изучаемого белка позволят более точно определить природу и глубину происходящих патологических процессов.

4- Правильно и своевременно установленный диагноз способствует назначению адекватных схем лечения, уменьшению риска развития осложнений и сокращению сроков пребывания больных в стационаре.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Махнева Н.В., Молочков В.А., Белецкая Л.В. Случай серонегативного буллезного пемфигоида (иммунопатологическое исследование) // Вестник дерматологии и венерологии. - 1995. - № 4. - С. 36 - 39.

2. Белецкая Л.В., Махнева Н.В. Выявление растворимых иммунных комплексов в тканях биопсии // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. - 1995. -№11. -С. 545-547.

3. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Совершенствование морфологической диагностики акантолитической пузырчатки // Вестник дерматологии и венерологии. - 1996. - № 1. - С. 4 - 7.

4. Белецкая Л.В., Махнева Н.В. Способ выявления растворимых иммунных комплексов в биоптатах тканей // Клиническая лабораторная диагностика. - 1996. - № 2. -С. 40-42.

5. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Выявление растворимых иммунных комплексов в тканях биопсии при акантолитической пузырчатке и доброкачественной хронической пузырчатке Хейли-Хейли // Тезисы докладов VII Российского съезда дерматологов и венерологов, г.Казань, 1996. - С. 122 - 123.

6. Махнева Н.В., Молочков В.А., Белецкая Л.В. Использование моноклональных антител к цитокератинам многослойного плоского эпителия для дополнительной характеристики патологического процесса при дерматозах II Тезисы докладов. Научно-практическая конференция, посвященная 75-летию ЦНИКВИ, Москва, 1996. - С. 58 - 59.

7. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Способ диагностики пузырчатки. Патент № 2097768 от 27 ноября 1997 г.

8. Кряжева С.С., Молочков В.А., Махнева Н.В. lgA-зависимый линеарный дерматоз II Российский журнал кожных и венерических болезней. - 1998. - № 2. - С. 44 - 47.

9. Молочков В.А., Махнева Н.В., Арефьева H.A., Белецкая Л.В. Эффективность усовершенствованной методики реакции прямой иммунофлюоресценции при диагностике буллезных дерматозов // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 1998.-№ 5.-С. 11-14.

10.Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Деструкция базальной мембраны эпидермиса при буллезных дерматозах // Вестник последипломного медицинского образования. -1998.-С.12.

11 .Кряжева С.С., Махнева Н.В. Успешное лечение приобретенного буллезного эпи-дермолиза преднизолоном и сандиммуном II Российский журнал кожных и венерических болезней. - 1999. - № 1. - С. 38 - 41.

12. Белецкая Л.В., Махнева Н.В. Меченые антитела в нормальной и патологической морфологии (атлас). - М.: МНПИ, 2000. - 110 с.

13. Махнева H.B. Антигены главного комплекса гистосовместимости и иммунная система эпидермиса при заболеваниях кожи // Тезисы научных работ. Часть I. Дерматология. VIII Всероссийский съезд дерматовенерологов. - Москва, 2001. - С. 19 -20.

14.Махнева Н.В., Карзанов О.В. Куриозин в комплексной терапии акантолитической пузырчатки, осложненной язвенной пиодермией (наблюдение) II Материалы научно-практической конференции «Новые лекарственные препараты в практике дерматовенеролога». - Москва, 2001. - С. 71 - 72.

15. Махнева Н.В., Белецкая Л.В., Лезвинсная Е.М. Акантолитическая пузырчатка -ложносеронегативный случай II Вестник дерматологии и венерологии. - 2002. -№3,-С. 50 - 52.

16. Махнева Н.В., Белецкая П.В. Выделительная функция кожи по отношению к иммунным комплексам II Вестник дерматологии и венерологии. - 2002. - №4. - С. 4 - 9.

17. Махнева Н.В., Шувалова Т.М., Белецкая Л.В. Scabies, имитирующий буллезный пемфигоид // Материалы конференции, посвященной памяти профессора Маш-киллейсона А.Л. - МГМСУ, Москва, 2002. - С. 39 - 40.

18. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Влияние экстракорпорального фотофереза на гуморальный компонент при пемфигусе II Научно-практический журнал «Экспериментальная и клиническая медицина». -Тбилиси, 2002. - № 1-2. - С. 31 - 37.

19. Махнева Н.В., Карзанов О .В., Костенкова О.В., Белецкая Л.В. Паранеопластиче-ская пузырчатка в случае метастазирующей меланомы II Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматоонкологии. Новые лекарственные препараты в пракстике дерматовенеролога», ММА им.И.М.Сеченов. -Москва, 2002.-С. 75-76.

20. Махнева Н.В., Карзанов О.В.Мопочков В.А., Белецкая Л.В. Экстракорпоральная фототерапия в лечении акантолитического пемфигуса (иммуногистохимическое исследование) II Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2003. -№1. - С. 30-35.

21 .Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Ранние компоненты комплемента при патологии кожи II Тезисы научных работ первого Российского конгресса дерматовенерологов, Санкт-Петербург. - 2003. - Т. 1. - С. 72.

22. Махнева Н.В., Куприянова А.Г., Белецкая Л.В. C4d компонент комплемента в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов // Там же - С. 72 - 73.

23. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Болезни кожи и антигены главного комплекса гистосовместимости класса I (иммуногистохимическое исследование) // Вестник дерматологии и венерологии. - 2004. - № 2. - С. 12-16.

24. Махнева Н.В., Молочков В.А., Белецкая Л.В. Медикаментозная пузырчатка II Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2004. - № 3. - С. 14-18.

25. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Антигены главного комплекса гистосовместимости класса II (HLA II) на клеточных элементах кожи при дерматозах // Вестник дерматологии и венерологии. - 2004. - № 4. - С. 7 - 12.

26. Махнева Н.В., Романенко Г.Ф., Шибанов В.А. Изофон в комплексной терапии бул-лезных дерматозов // Тезисы научных работ на IV научно-практической конференции «Терапия социально значимых заболеваний в дерматовенерологии. Новые лекарственные препараты и средства в дерматологии косметологии». - Москва, 2004.-С. 111 - 112.

27. Третьякова Е.И., Махнева Н.В., Сухова Т.Е., Авербух Е.А., Панова Е.В. Препарат ВИУСИД в дерматологической практике // Там же - С. 194 - 195.

28. Махнева Н.В., Карзанов О.В., Белецкая Л.В. Случай ошибки в диагностике аканто-литической пузырчатки (клиническое и иммунопатологическое исследование) // Материалы конференции, посвященной памяти профессора Машкиллейсона Аса-фа Львовича. - Москва, 2004. - С. 100 - 101.

29. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Присутствие фиксированного иммуноглобулина в эпидермисе при аутоиммунных буллезных поражениях только слизистой оболочки полости рта // Там же - С. 102 - 103.

30. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Преимущество исследования непораженных участков кожи при аутоиммунных процессах II Тезисы научных работ IX Всероссийского съезда дерматовенерологов. - Москва, 2005. - Т. 1. - С. 23.

31. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Иммуногистохимия в диагностике аутоиммунных по-дэпидермальных буллезных дерматозов / / Там же - С. 23 - 24.

32. Молочное В.А., Махнева Н.В., Молочков A.B., Козлова Е.С., Капустина О.Г. Без-глютеновая диета в случае линейного lgA-зависимого буллезного дерматоза // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2005. - № 6. - С. 17 - 20.

33. Махнева Н.В., Молочков В.А., Капустина О.Г., Базовая Д.А., Белецкая Л.В. Случай IgA-, lgG-приобретенного буллезного эпидермолиза, ассоциированного с аутоанти-телами буллезного пемфигоида II Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2006. - № 1. - С. 7 - 11.

34. Махнева Н.В., Белецкая Л.В., Арутюнян Д.Б. Вульгарный псориаз и аутоиммунные буллезные дерматозы И Тезисы докладов на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». - Москва, 2006. - С. 208 - 209.

35. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Паранеопластическая пузырчатка: клиническое и иммунопатологическое исследования // Альманах клинической медицины, том IX «Пролиферативные заболевания кожи». - Москва, 2006. - С. 67 - 72.

36. Романенко Г.Ф., Махнева Н.В., Нефедова Е.Д. Паранеопластические дерматозы, по материалам отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ // Альманах клинической медицины, том IX «Пролиферативные заболевания кожи». -Москва, 2006.-С. 117-120.

37. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Случай приобретенного буллезного эпидермолиза (клиническое и иммунопатологическое наблюдение) // Вестник дерматологии и венерологии. - 2006, - № 2. - С. 16 - 21.

38. Махнева Н.В., Нефедова Г.Ф., Романенко Г.Ф. Аутоиммунные подэпидермальные буллезные дерматозы и их ассоциация с неоплазией среди дерматологических больных МОНИКИ им.М.Ф.Владимирского // Тезисы VI научно-практической конференции «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика». - Москва, 2006. - С. 112-113.

39. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Ларанеопластическая пузырчатка: аутоантитела и фиксированные иммунные комплексы // Тезисы докладов XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2007. - С. 149 - 150.

40. Махнева Н.В. Ранние компоненты комплемента при аутоиммунной пузырчатке // Альманах клинической медицины, том XV «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии». - Москва, 2007. - С. 215 - 219.

41. Махнева Н.В. Линейный lgA-зависимый буллезный дерматоз (клинико-имммунопатологическое исследование) II Сборник тезисов VII Всероссийской научно-практической конференции «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика». - Москва, 2007. - С. 62 - 63.

42. Махнева Н.В. Клинико-морфологическая и иммунологическая характеристика приобретенного буллезного эпидермолиза II Сборник тезисов XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2008. - С. 408 - 409.

43. Махнева Н.В. Десмосомальный протеин десмоплакин при патологии кожи II Там же -С. 409.

44. Махнева Н.В., Сухова Т.Е., ЧепикА.С. Ассоциация аутоиммунных буллезных дерматозов с вирусом герпеса простого типа // Материалы научных трудов II Форума Национального Альянса дерматологов и косметологов. - Ростоа-на-Дону, 2008. -С. 91-93.

45. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Фибрин как маркер цитотоксического действия иммунных комплексов при аутоиммунных буллезных дерматозах II Там же - С. 93 -94.

46. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Экспрессия ранних компонентов комплемента в структурах эпидермиса при иммунопатологических состояниях кожи II Вестник дерматологии и венерологии. - 2008. - Na 2. - С. 52 - 63.

47. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Метод стабилизации растворимых иммунных комплексов в биоптатах кожи больных буллезными дерматозами. Медицинская технология, Москва, 2008. - 12 с.

48. Махнева Н.В., Нефедова Е.Д., Понаморева А.Г., Молочков В.А. Заболеваемость и клинико-морфологические особенности аутоиммунных буллезных дерматозов у

жителей Московской области // Материалы конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии». - Москва, 2008. - С. 31 - 33.

49. Махнвва Н.В., Белецкая Л.В. Кадгериновый комплекс в диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов // Тезисы научных работ X Всероссийского съезда дерматовенерологов. - Москва, 7-10 октября, 2008. - С. 29.

50. Махнееа Н.В., Молочков В.А., Белецкая Л.В. Паранеопластическая пузырчатка как мультиорганный синдром // Материалы V научно-практической конференции памяти профессора Машкиллейсона А.П. - Москва, 2008 - С. 49 - 50.

51 .Махнееа Н.В., Молочков В. А., Белецкая Л.В. Аутоиммунные буллезные дерматозы и симптом Никольского с точки зрения иммунопатологии II Там же. - С. 51 - 52.

52. Махнееа Н.В. Симптом Никольского в клинике аутоиммунных дерматозов II Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2008. - № 5. - С. 26 - 29.

53. Махнееа Н.В., Молочков В.А., Белецкая Л.В. Антигены-мишени и их ассоциация с клиническими вариантами аутоиммунной пузырчатки // Материалы научных трудов I международного форума медицины и красоты. - Москва, 17-19 ноября, 2008 - С.

171-172.

54. Махнееа HB., Нефедова Е.Д., Понаморева А.Г. Клинико-морфологические особенности буллезного пемфигоида у жителей Московской области // Там же. - С.

172-173.

55. Махнееа Н.В., Белецкая Л.В. Способ диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов. Решение о выдаче патента на изобретение № 2008108389/15(009070) от 27 октября 2008 г.

56. Махнееа Н.В., Молочков В.А., Белецкая Л.В. Способ прогнозирования возможности изменения клинической формы пузырчатки. Заявка на изобретение Na 2008144767 от 13 ноября 2008 г.

Отпечатано в ООО «СТАТУС-ПРО» Адрес: 115280, г. Москва, ул. Восточная, д. 11/1 Тел.: (495) 679-36-43 Заказ № 159. Тираж: 150 экземпляров 31.12.2008 г.

Оглавление диссертации Махнева, Наталия Викторовна :: 2009 :: Москва

Введение-.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Общие проблемы этиологиии патогенеза аутоиммунных заболеваний.

1.1.1. Аутоиммунитет и естественные аутоантитела.

1.1.2. Аутоиммунные заболевания.I.•.

1.1.2.1. Этиология аутоиммунных заболеваний.

1.1.2.1.1. Генетические факторы риска.

1.1.2.1.2. Окружающая и внутренняя среда как фактор риска.

1.1.2.2. Патогенез аутоиммунных заболеваний.

1.1.2.2.1. Т-клетки и клеточный иммунный ответ.

1.1.2.2.2. В-кпетки и'гуморальный иммунный ответ.

1.2. Аутоиммунные буллезные дерматозы в свете современных представлений.

1.2.1. Классификация аутоиммунных буллезных дерматозов.

1.2.2. Аутоиммунная пузырчатка.

1.2.2.1. Эпидемиология, этиология аутоиммунной пузырчатки и ее ассоциация с другими заболеваниями.

1.2.2.2. Иммунопатология аутоиммунной пузырчатки.

1.2.2.2.1. Аутоантитела при аутоиммунной пузырчатке.

1.2.2.2.2. Система комплемента и его роль в акантолизе.

1.2.2.2.3. Антигены-мишени для аутоантител при аутоиммунной пузырчатке.

1.2.2.2.3.1. Ассоциация антигенов-мишеней (десмоглеинов) с клиническими вариантами аутоиммунной пузырчатки и десмоглеин-компенсирующая теория.

1.2.3. Буллезный.пемфигоид.

1.2.3.1. Эпидемиология, этиология буллезного пемфигоида и его ассоциация с другими системными заболеваниями.

1.2.3.2. Иммунопатология буллезного пемфигоида.

1.2.3.2.1. Аутоантитела при буллезном пемфигоиде.

1.2.3.2.2. Антигены-мишени при буллезном пемфигоиде.

1.2.4. Линейный lgA-зависимый буллезный дерматоз.

1.2.5. Эпидемиология, этиология линейного lgA-зависимого буллезного дерматоза и его ассоциация с другими системными заболеваниями.

1.2.5.1. Иммунопатология линейного lgA-зависимого буллезного дерматоза.

1.2.5.1.1. Аутоантитела при линейном lgA-зависимом буллезном дерматозе.

1.2.5.1.2. Антигены-мишени при линейном lgA-зависимом буллезном дерматозе.

1.2.6. Приобретенный буллезный эпидермолиз.

1.2.6.1. Эпидемиология, этиология приобретенного буллезного эпидермолиза и его ассоциация с другими системными заболеваниями.

1.2.6.2. Иммунопатология приобретенного буллезного эпидермолиза.

1.2.6.2:1. Аутоантитела при приобретенном буллезном эпидермолизе.

1.2.6.2.2. Антигены-мишени при приобретенном буллезном эпидермолизе.

Введение диссертации по теме "Кожные и венерические болезни", Махнева, Наталия Викторовна, автореферат

Актуальность проблемы. За последние три-четыре десятилетия накоплены фундаментальные знания в области клиники и иммунопатологии аутоиммунных буллезных дерматозов. Несмотря на достигнутые успехи, изучение патогенеза этих дерматозов на уровне молекулярно-биологических исследований остается одной из важных проблем в дерматологии и в настоящее время. Это связано с необходимостью преодоления* развития таких тяжких, порой угрожающих жизни, заболеваний как аутоиммунная пузырчатка, бул-лезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз.

Современная медицина обладает целым рядом эффективных средств, позволяющих успешно подавлять развитие иммунопатологического-процесса при аутоиммунных состояниях [22, 71, 114, 248, 249, 456, 547]. Однако те же средства обладают нередко побочным действием, нарушающим функцию ряда физиологических систем организма. К ним, в частности, относятся-корти-костероиды, азатиоприн, метотрексат, циклоспорин. Принцип лечения аутоиммунных заболеваний, при которых одним из основных патогенетических факторов являются аутоантитела, направленные к антигенам тканевых структур, сходен для многих аутоиммунных заболеваний. Однако разные формы патологии, включая аутоиммунные буллезные дерматозы, требуют различные схемы лечения, в частности разные дозировки, назначаемых препаратов. Учитывая возможные осложнения, необходимо подбирать оптимальные дозы, позволяющие достигать терапевтического эффекта, не нанося вред организму больного. Оптимальные дозы препаратов при таких заболеваниях как истинная пузырчатка, буллезный пемфигоид, приобретенный буллезный эпидермолиз и линейный IgA-зависимый буллезный* дерматоз, также как и схемы их лечения, значительно отличаются друг от друга, в связи с чем необходима тщательная дифференциальная диагностика [69, 71, 96, 111, 247, 300, 456].

Нередко клиническое сходство буллезных дерматозов, а порой и атипичные их проявления на ранних этапах развития патологического процесса с сомнительными результатами феномена Никольского не позволяют клиницисту у постели больного поставить с уверенностью клинический диагноз. Существующие данные свидетельствуют о том, что применение гистологических и ряда иммунологических методов, в том числе метода с использованием меченых антител, в дополнение к клиническому обследованию, во многих случаях позволяет уточнить диагноз [15, 19, 118, 119, 641, 866]. Полученные нами результаты подтверждают эти наблюдения [13]. Однако и эти методы имеют свои ограничения. Так, гистологическое исследование на основании определения уровня образования пузыря способствует диагностике и дифференциальной диагностике аутоиммунных t буллезных дерматозов только между различными их группами, такими как группа пузырчатки и группа буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения. Но затрудняет провести дифференциальную диагностику среди буллезных дерматозов одной группы, таких как буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермо-лиз [355]. Сложности могут возникнуть и при использовании методов прямой и непрямой иммунофлюоресценции [45, 52, 53, 63, 302, 643]. Это требует дополнительных методов для диагностики.

Разнообразие клинических проявлений аутоиммунных буллезных дерматозов и поиск новых методов терапии заставляет специалистов продолжать исследования по изучению механизмов и факторов, способствующих как проявлению в латентной форме заболевания, так и развитию этих буллезных дерматозов de novo. Исследования по изучению молекулярно-биологической структуры кожи (система межклеточного и дермо-эпидермального соединений, белки поверхности кератиноцитов и десмосом) позволяют более полно выяснить состояние различных белковых структур и клеточных элементов кожи при различных аутоиммунных буллезных дерматозах. Например, известно, что молекулы адгезии вовлечены во все физиологические процессы, обеспечивая функциональную целостность кожи. В кожной патологии некоторые молекулы адгезии выступают в качестве мишеней для аутоиммунных антител, например, при пузырчатке, другие страдают опосредованно - как при буллезном пемфигоиде [405; 532]. До сих пор дискутируется роль^ системы комплемента в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов [584, 688,931].

Принимая во внимание возможность участия самых различных молеку-лярно-биологических механизмов в развитии аутоиммунных буллезных дерматозов, эта проблема нуждается в дальнейшем изучении и развитии. При этом целесообразно изучение клинико-морфологических особенностей аутоиммунных буллезных дерматозов конкретно больных дерматозами в Московской области; В' процессе исследования клинико-патогенетических особенностей буллезных дерматозов следует изучить: влияние величины титров циркулирующих аутоантител и степени интенсивности фиксации иммунных комплексов на течение. аутоиммунных буллезных дерматозов; участие ранних компонентов* комплемента в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов; степень экспрессии некоторых антигенов десмосом и цитоскелета цитокератинов как показателя характера поражения эпидермиса. Поскольку предметом исследований является патология, связанная с нарушениями в иммунной системе (аутоиммунные процессы) необходима оценка экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA I и П классов) на клетках тканей кожи, как одного из показателей участия антигенов гистосовместимости в развитии изучаемой патологии. Использование иммуногисто-химических методов с целью изучения некоторых сторон патогенеза аутоиммунных буллезных дерматозов и антигенной структуры эпидермиса в норме и при патологии будет способствовать разработке дополнительных методов их диагностики и тактике ведения больных.

Цель настоящей работы: изучение клинико-морфологических и иммунологических особенностей аутоиммунных буллезных дерматозов на приг мере больных Московской области и совершенствование способа их ранней диагностики и лечения;

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи исследования:

1. Изучить клинико-морфологические особенности аутоиммунных бул-лезных дерматозов, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфи-гоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз на современном этапе.

2. Научно обосновать, сущность возникновения симптома Никольского с точки зрения иммунопатологии и оценить его прогностическую ценность при дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов;

5. Определить степень экспрессии некоторых антигенов десмосом (дес-мосомальный протеин, кадгериновый комплекс) и цитоскелета (цитокера-тин 5) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.

1. Провести оценку экспрессии антигенов главного комплекса гистосов-местимости (HLA I и П классов) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.

8. Разработать на основе полученной молекулярно-биологической характеристики состояния различных структур тканей кожи схему детального иммуноморфологического анализа биопсии кожи больных аутоиммунными буллезными- дерматозами с использованием моноклональных и поликло-нальных антител к белкам тканевых структур (кадгерины, десмосомальный протеин десмоплакин:, цитокератин 5, коллаген IV типа, протеиновый комплекс основного вещества базальной мембраны lamina densa, антигенов HLA I класса) и клеточным элементам (HL A-DR антигены).

9. Разработать алгоритм раиней диагностики; и контроля эффективности лечения аутоиммунных буллезных дерматозов:

Научная новизна исследования:

Разработан алгоритм включения методов для дифференциальной диагностики: клинические проявления с определением симптома Никольского; цитологический метод с выявлением акантолитических клеток (клетки Тцан-ка); гистологический метод с определением уровня образования пузыря; иммунологический и иммуIюгистохимический методы исследования: с определением наличия- в сыворотке крови- больных аутоантител различной специфичности и фиксированных иммунных комплексов в тканях; определение состояния ряда белковых компонентов в тканях.

Для дополнительной характеристики; иммунопатологического процесса' при аутоиммунных буллезных дерматозах использован молекулярно-биологический подход с применением набора антител к антигенам тканевых структур кожи;

Впервые детально изучена значимость вовлечения циркулирующих аутоантител, фиксированных иммунных комплексов и ранних компонентов комплемента и их взаимосвязь с особенностями клинического течения ряда-аутоиммунных буллезных дерматозов:

Впервые проведена оценка клинической специфичности и патогенеза симптома Никольского у больных, страдающих различными аутоиммунными буллезными дерматозами, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфигоид, линейный lgA-зависимый буллезный дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз.

Научно-практическая значимость:

Предлагаемый комплекс иммунологических и иммуноморфологических исследований для получения дополнительных сведений о патологических процессах, происходящих при аутоиммунных буллезных дерматозах, с целью установления и/или уточнения диагноза будет способствовать назначению адекватной терапии (с учетом патогенетических механизмов) и оценки, степени ее эффективности.

Положения, выносимые на защиту:

1. На современном этапе в регионе Московской области выявлена следующая закономерность распространения аутоиммунных буллезных дерматозов. Среди 267-больных аутоиммунными буллезными дерматозами 61,4% составили больные, страдающие аутоиммунной пузырчаткой, 33,3% - бул-лезным пемфигоидом, 3,4% - приобретенным буллезным эпидермолизом и 1,9% - линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом* При этом у 6% больных из 267 выявлен аутоиммунный буллезный дерматоз, протекающий на фоне неоплазии (паранеопластическая пузырчатка - 62,5%, буллезный пемфигоид - 25% и приобретенный'буллезный эпидермолиз - 12,5%).

2. При аутоиммунных буллезных дерматозах патогенетическую роль могут играть аутоантитела, относящиеся к иммуноглобулинам, классов G и/или А, и иммунные комплексы в растворимой и нерастворимой формах. При этом мишенями могут быть не только специфические антигены, характерные для определенной группы буллезного дерматоза, но и антигены ряда других структур органов и тканей. Наличие такого широкого спектра антител к различным антигенам-мишеням объясняет тяжесть и разнообразие клинических проявлений буллезного дерматоза, в частности при паранеопластической пузырчатке.

3. Установлен факт участия ранних компонентов комплемента как в местах локализации антител, так и вне зоны обнаружения антигенов-мишеней. При этом выявление C4d (наиболее стойкого компонента комплемента) может служить дополнительным маркером развития гуморального ответа при оценке патологического процесса.

4. Наличие симптома Никольского (механическая отслойка эпидермиса) как одного из первых «инструментов» в диагностике (при аутоиммунной пузырчатке в 71,9% случаев, буллезном пемфигоиде в 3,4%, приобретенном буллезном эпидермолизе в 66,7%) обусловлено вовлечением в патологический процесс системы десмосомального аппарата.

5. Получена дополнительная молекулярно-биологическая характеристика изменений в коже при аутоиммунных буллезных дерматозах с помощью иммуногистохимических методов с использованием моноклональных и по-ликлональных антител к ряду антигенов кожи (кадгериновый комплекс, дес-мосомальный протеин, цитокератин 5, коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa, антигены главного комплекса гистосовме-стимости). Полученные сведения позволяют оценивать глубину происходящих иммунопатологических процессов, эффективность проводимой терапии, а в ряде случаев получить дополнительный способ дифференциальной диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов. ь

Апробация работы: материалы диссертации доложены на VII Российском съезде дерматовенерологов (Россия, Казань, 1996 г.), VIII, IX и X Всероссийском съезде дерматовенерологов (Россия, Москва, 2001, 2005-и 2008 г.г.), научно-практической конференции, посвященной 75-летию ЦНИЬСВИ (Россия, Москва, 1996 г.), научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматоонкологии. Новые лекарственные препараты в практике дерматовенерологии» (Россия, Москва, 2002 г.), IV международной конференции «Экспериментальная и клиническая медицина» (Грузия, Тбилиси, 2002 г.), Первом Российском конгрессе дерматовенерологов (Россия, Санкт-Петербург, 2003 г.), конференции, посвященной памяти Машкиллейсона Асафа Львовича (Россия, Москва, 2004 и 2008 г.г.), научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи» (Россия, Москва, 2006 г.), VI-VII-VIII научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика» (Россия, Москва, 2006, 2007 и 2008 г.г.), ХШ-XIV-XV Российском нациаль-ном конгрессе «Человека и лекарство» (Россия, Москва, 2006, 2007 и 2008 г.г.), научно-практических конференциях «Актуальные вопросы дерматовег нерологии и дерматоонкологии» (Россия, Москва, 2007 и 2008 г.г.), II Форуме Национального Альянса дерматологов и косметологов (Россия, Ростов-на-Дону, 2008 г.).

Объем и структура диссертации.

Заключение диссертационного исследования на тему "Клинико-морфологические и иммунологические аспекты в ранней диагностике и лечении аутоиммунных буллезных дерматозов"

ВЫВОДЫ

1. Динамика заболеваемости первичным аутоиммунным, буллезным дерматозом среди жителей Московской области продемонстрировала устойчивую тенденцию к увеличению роста числа больных данной патологией. В структуре аутоиммунных буллезных дерматозов частота аутоиммунной пузырчатки составила 611,4%, буллезного пемфигоида -33,3%, приобретенного буллезного эпидермолиза - 3,4%, линейного IgA-зависимого буллезного дерматоза - 1,9%. Частота сочетания аутоиммунных буллезных дерматозов с неоплазией составила 6%. При этом в структуре аутоиммунной пузырчатки - 6,1%, буллезного пемфигоида - 4;5 %, приобретенного буллезного эпидермолиза -22,2%.

2. При аутоиммунных буллезных дерматозах патогенетически значимую роль играют аутоантитела, представленные иммуноглобулинами классов G и/или А, и иммунные комплексы в растворимой и нерастворимой формах. При этом мишенями являются не только специфические антигены, характерные для* определенной группы буллезного дерматоза, но и антигены многих структур органов и систем, особенно при паранеопластической пузырчатке. Наличие широкого спектра антител к антигенам-мишеням разных тканей объясняет не только тяжесть и разнообразие клинических проявлений болезни, но и является весомым аргументом для тщательного обследования больного=с целью исключения неопластического процесса.

3. Наличие фиксированных иммунных комплексов; (иммуноглобулина класса G и ранних компонентов комплемента) в системе межклеточных соединений многослойного плоского эпителия при аутоиммунной^ пузырчатке (71,9%), а в ряде случаев буллезном пемфигоиде (3,4%) и; приобретенном буллезном эпидермолизе (66,7%) является одним из важных факторов в возникновении симптома Никольского.

4. Выявление ранних компонентов комплемента как: в местах локализации антител, так и вне зоны антигенов-мишеней свидетельствует о сложных механизмах развития аутоиммунных буллезных дерматозов с активацией системы комплемента одновременно как классическим, так и альтернативным путями. При этом C4d как наиболее стойкий компонент комплемента в отношении каталитического процесса может служить дополнительным маркером гуморального ответа в оценке патологического процесса.

5. При исследовании антигенов системы десмосом и цитоскелета кератиноцитов при аутоиммунных буллезных дерматозах выявлены нарушения экспрессии кадгеринового комплекса, десмосомального протеина десмоплакина I и синтеза цитокератина 5 вплоть до их исчезновения и проявления в тех структурах эпидермиса, где в норме они отсутствуют. Извращенная экспрессия кадгеринового комплекса и десмосомального протеина десмоплакина I в зоне базальной мембраны эпидермиса обнаружена при аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения и в ряде случаев аутоиммунной пузырчатки, в частности паранеопластического генеза. Наличие цитокератина 5 в цитоплазме не только клеток базального, но и дифференцированных слоев эпидермиса, свидетельствуют о нарушениях полимеризации цитокератиноцитов и дифференцировки кератиноцитов при аутоиммунных буллезных дерматозах. Снижение синтеза цитокератина 5 вплоть до полного его подавления отмечается в случаях паранеопластической пузырчатки и буллезном пемфигоиде.

7. При исследовании экспрессии антигенов главного комплекса гисто-совместимости выявлено вовлечение этих антигенов в патологический процесс; сопровождающийся различной степенью экспрессии антигенов HLA I и HLA II (HLA-DR) классов вплоть до полного 1их угнетения и появления в тех структурах эпидермиса, где в норме они отсутствует. Это свидетельствует о том, что при аутоиммунных буллезных дерматозах антигены главного комплекса гистосовместимости могут быть мишенями для аутоантител, а также подвергаться воздействию других факторов, в том числе иммуносупрессивных препаратов. Полное отсутствие экспрессии HLA I и HLA II (HLA-DR) классов наблюдаются при аутоиммунных буллезных дерматозах паранеопластического генеза; а извращенная экспрессия - в зоне базальной мембраны эпидермиса при приобретенном буллезном эпидермолизе.

8. Использование.молекулярно-биологической характеристики состояния-различных структур тканей кожи при аутоиммунных буллезных дерматозах позволяет более точно оценить степень тяжести происходящих иммунопатологических процессов и провести тестирование эффективности проводимой терапии. Кроме того, особенности локализации антигенов (нарушение экспрессии генов, ответственные за синтез1 исследуемых белков) могут служить дополнительными маркерами при дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Аутоиммунные буллезные дерматозы - это хронические заболевания, связанные с иммунным ответом против собственных структурных белковых компонентов^ которые участвуют в поддержании межклеточных и клеточно-матриксных контактов (адгезия) многослойного плоского эпителия.

На основании клинических, гистопатологических и имлхунопатологиче-ских критериев, аутоиммунные буллезные дерматозы делят на три группы -пузырчатка, буллезный пемфигоид и приобретенный буллезный эпидермо-лиз. Однако такое деление аутоиммунных буллезных дерматозов условно, т.к. до настоящего времени продолжаются поиски по изучению их патогенетических механизмов на молекулярно-биологическом уровне.

Группа аутоиммунной пузырчатки включает в себя угрожающие жизни буллезные дерматозы, характеризующиеся образованием внутриэпидермаль-ного пузыря в результате потери адгезии кератиноцитов, и ассоциируется с . аутоантителами к антигенам десмосом (система; межклеточных соединений или межклеточная субстанция по старой терминологии). Буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз характеризуются наличием субэпидермального пузыря: в результате потери прикрепления кератиноцитов базального слоя к базальной мембране и ассоциируется с отложениями иммунных комплексов в зоне, базальной мембраны или дермо-эпидермальном соединении. Патогенетическая роль аутоантител, уже доказанная клиническими наблюдениями, окончательно подтверждена и продемонстрирована экспериментально. Эти аутоантитела обладают высокой тканевой специфичностью и относятся к классу иммуноглобулинов G и/или А. Антигенами-мишенями при этом являются различные молекулы десмосомального аппарата (кадгерины, плакины) и белковые компоненты базальной мембраны эпидермиса (молекулы полудесмо- . сом, ламинины, коллаген VII типа) при аутоиммунной пузырчатке и аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения, соответственно.

Учитывая разнообразие клинических и нередко атипичных форм проявлений аутоиммунных буллезных дерматозов, клиницисты все чаще сталкиваются с необходимостью использования дополнительных методов исследования для постановки точного диагноза, а также дифференциальной диагностики с целью назначения адекватных схем лечения. Благодаря изучению аутоиммунных буллезных дерматозов на молекулярно-биологическом уровне стало возможным более широкое и углубленное исследование патогенеза этих заболеваний на современном этапе и расширение практических клинических знаний. Учитывая выше отмеченное, мы провели оценку чувствительности и специфичности клинического симптома Никольского, а также использовали методы иммунофлюоресценции как наиболее перспективные способы диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов. На молекулярно-биологическом уровне с использованием специфических поликлональных и моноклональных антител к антигенам различных структур многослойного плоского эпителия были изучены некоторые стороны,патогенеза аутоиммунных буллезных дерматозов, на основании, чего выявлены дополнительные маркеры, позволяющие провести их дифференциальную диагностику при поэтапном обследовании больного.

Как указано в соответствующих разделах, работа выполнена на базе данных клинического обследования и изучения биопсийного материала 267 больных аутоиммунными буллезными дерматозами в Московской области, из них 164 больных аутоиммунной пузырчаткой, 89 - буллезным пемфигоидом, 5 - линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом и 9 - приобретенным буллезным эпидермолизом. Каждое заболевание служило контролем по отношению друг к другу. Многолетняя динамика заболеваемости (1992-2006 г.г.) продемонстрировала устойчивую тенденцию к постепенному увеличению роста числа больных, проживающих в Московской области, аутоиммунными буллезными дерматозами. Основную группу из них составляли больные с аутоиммунной пузырчаткой (61,4%) и буллезным пемфигоидом (33,3%). Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз (1,9%) и приобретенный буллезный эпидермолиз (3,4%) диагносцировались крайне редко. Среди больных, страдающих аутоиммунными буллезными дерматозами, были как мужчины, так и женщины в возрасте от 18 до 87 лет (средний возраст 61,8±14,5 лет). Женщины страдали чаще, чем мужчины (соотношение женщин к мужчинам составляет 2,5:1). При этом пик заболеваемости у женщин приходился на возраст от 61 года до 70 лет, а у мужчин - от 51 года до 60 лет.

Среди факторов, способствующих развитию аутоиммунных буллезных дерматозов, отмечены избыточная инсоляция (26,6%), стрессовые ситуации (22,1%) и прием лекарственных препаратов, в том числе и антибиотиков (17,2%). Учитывая, что одним из провоцирующих факторов возникновения данной патологии может быть неоплазия, всем больным было проведено комплексное обследование. При этом буллезный дерматоз на фоне неопластического процесса был выявлен у 16 (6%) больных из 267. Наиболее часто на фоне неопластического процесса диагносцировались паранеопластическая пузырчатка. (62,5%), реже буллезный пемфигоид (25%) и приобретенный буллезный эпидермолиз (12,5%). При линейном IgA-зависимом буллезном дерматозе неоплазии выявлено не было ни в одном случае. Кроме того, при комплексном обследовании больных выявлена ассоциация аутоиммунных буллезных дерматозов с другими аутоиммунными заболеваниями и патологическими процессами, сопровождающимися аутоиммунными реакциями. Это сахарный диабет. П типа (27,7%), аутоиммунный тиреоидит (12,4%), ревматоидный артрит (12,4%), анемия (8,2%) и бронхиальная астма (6,7%). Необходимо отметить также, что все аутоиммунные буллезные дерматозы протекали на фоне патологии со стороны сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь) и/или желудочно-кишечного тракта (холецистит, панкреатит, гастродуоденит).

Постановка диагноза с момента проявления первых признаков заболевания составляла от 1 месяца до 5 лет, в среднем — около шести месяцев. У большинства больных аутоиммунными буллезными дерматозами патологический процесс локализовался преимущественно на коже (93,6%) с одновременным вовлечением слизистых оболочек органов (53,2%). В отдельных случаях (6,4%) было отмечено поражение только слизистой оболочки полости рта без клинических проявлений на коже. Кроме того, как и большинство авторов [263,456; 876], нами отмечено; что клиническая картина азлтоиммунных буллезных дерматозов на современном этапе претерпевает эволюцию. Нередко наблюдается не только клиническое сходство среди разных аутоиммунных буллезных дерматозов (например, как в случае линейного IgA-зависимого буллезного дерматоза и буллезного пемфигоида), но и клиническая имитация другими кожными заболеваниями, такими как многоформная экссудативная эритема, синдром Стивенса-Джонсона, синдром Лайела, пру-риго, герпетиформный дерматит Дюринга. Такое разнообразие клинических проявлений можно наблюдать и в случаях аутоиммунных буллезных дерматозов, протекающих на фоне неоплазии, и в период продромального развития буллезного пемфигоида с его атипичными проявлениями. Все это не способствует своевременной постановке клинического, диагноза и вынуждает клинициста прибегать к использованию различных клинических и лабораторных диагностических методов. Одним из первых таким методом является симптом Никольского в двух его модификациях («прямой» и «косвенный»). Как указывалось в соответствующем разделе, его сущность заключается в механической отслойке эпидермиса вследствие разрыва межклеточных контактов (акантолиз) и образования внутриэпидермальных пузырей, как следствие ци-тотоксического действия аутоантител. Высокая специфичность данного симптома позволяет непосредственно у постели больного заподозрить такое угрожающее жизни заболевание как аутоиммунная пузырчатка. Однако отрицательные результаты в ряде случаев аутоиммунной пузырчатки (28%)-и-выявление подобного симптома при других аутоиммунных буллезных дерматозов, таких как буллезный пемфигоид (3,4%) и приобретенный буллезный эпидермолиз (66,7%) не позволяет провести дифференциальную диагностику между этими дерматозами. Подобные наблюдения описаны и другими авторами [23, 421, 727, 874]. Такое «необычное поведение» феномена Никольского требует научно-обоснованного подхода к его оценке с точки зрения иммунопатологии. В стратегических целях это будет обсуждено ниже.

При сомнительных результатах симптома Никольского, как первого диагностического «инструмента» в руках клинициста, врач вынужден обращаться к лабораторно-диагностическим исследованиям. Наиболее простыми и доступными для лечебных учреждений являются цитологический и пато-морфологический методы исследования. Однако и здесь в ряде случаев возникают сложности в постановке точного диагноза. Так, на наш взгляд цитологическое исследование содержимого пузыря или мазков-отпечатков материала со дна эрозий недостаточно информативно, т.к. аканто логические клетки (клетки Тцанка), характерные для аутоиммунной пузырчатки, были обнаружены, не только ■ при этой патологии (76,2%), но и при буллезном пемфигоиде (9,9%) и приобретенном буллезном эпидермолизе (11,1%). Подобные наблюдения описывают и при других болезнях кожи [22].

Патоморфологическое исследование биопсийного материала из очага поражения позволило выявить типичную морфологическую картину пузырчатки в 79,9% случаев, буллезного пемфигоида - в 83,1% случаев и ни в одном случае линейного IgA-зависимого буллезного дерматоза и приобретенного буллезного эпидермолиза. В двух последних случаях патоморфологиче-ская картина соответствовала буллезному пемфигоиду. В наших исследованиях диагностика основывалась на иммунологических и иммуногистохими-ческих критериях. Несмотря на достаточно высокую информативность гистологического метода, сходные морфологические изменения обязывают дерматологов обращаться к более совершенным и надежным методам исследования с использованием прямой и непрямой иммунофлюоресценции с целью выявления циркулирующих аутоантител и фиксированных иммунных комплексов.

I" ' . 277 та) и базальной мембраны многослойного плоского эпителия при аутоиммунной пузырчатке и аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального-соединения, соответственно. Эти аутоантитела, образуя иммунные комплексы в тканях, оказывают на ее структуры цитотоксиче-ское действие. При аутоиммунной пузырчатке это приводит к разрушению межклеточных контактов с последующим разрывом связей между отдельными клеточными элементами, развитшо акантолша и образованию внутриэпи-дермальных пузырей. При аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения (приобретенный буллезный эпидермолиз, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз) под действием цитотоксического действия специфических аутоантител и фиксированных иммунных комплексов происходит разрушение структурных компонентов базальной мембраны с последующим ее расщеплением и образованием подэпидермальных пузырей: Некоторые авторы считают, что определение титров специфических аутоантител и выявление в тканях фиксированных иммунных комплексов во многих случаях позволяет не только подтвердить диагноз, но и прогнозировать дальнейшее течение за' ! ' . болевания [32, 377, 772, 858]. Bf наших;исследованиях с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции специфические, аутоантитела в сыворотке крови больных различными аутоиммунными буллезными дерматозами были выявлены в 80,3% случаев. При этом титры антител (от 1:5 до 1:10240) не всегда коррелировали с клиническими проявлениями заболевания. Это связано со способностью кожи сорбировать иммунные комплексы с целью их элиминации. Поэтому при обширных поражениях кожи, порой с захватом целых анатомических областей и слизистой оболочки, циркулирующие аутоантитела не всегда удается выявить, особенно в случаях аутоиммунной пузырчатки (65,8%) и буллезного пемфигоида (29,4%). И, наоборот, в случае локального патологического процесса титр аутоантител может достигать высоких цифр до 1:10240. Кроме основных патогенетически значимых антител в ряде случаев были выявлены дополнительные антитела. Так, при паранеопластической пузырчатке выявлен широкий спектр антител к антигенам многих структур органов и тканей, таких как мйоидные клетки тимуса, диски поперечнополосатой мускулатуры, капилляры миокарда, соединительнотканные структуры печени и ядра ее клеточных элементов (гепатоцитов). Это объясняет тяжесть и разнообразие клинических проявлений болезни, протекающей на фоне неоплазии. Кроме того, наличие «мозаики» аутоантител при данной форме патологии позволяет рассматривать паранеопластическую; пузырчатку как мультиорганный синдром. Об этом имеется ряд сообщений и других авторов [574, 675]. В случаях приобретенного буллезного эпидермолиза выявлено, что патогенетическую роль могут играть или IgG, или IgG и IgA: антитела одновременно. При: этом антигенами-мишенями могут быть молекулярные соединения и lamina densa, и lamina lucida. Вовлечение последней, по-видимому, связано с опосредованным влиянием этих аутоантител на адгезивную функцию молекул. .

Если циркулирующие аутоантитела при аутоиммунных буллезных. дерматозах не всегда удается выявить в связи с иммунной сорбцией в тканях, то фиксированные иммунные комплексы были обнаружены во всех исследованных случаях в 100%. При этом наряду с основными иммуноморфологи-ческими диагностическими признаками каждого аутоиммунного буллезного дерматоза выявлен ряд дополнительных интересных фактов. Известно, что одним из диагностических маркёров аутоиммунной пузырчатки является обнаружение иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах эпидермиса. При вульгарной и вегетирующей пузырчатке фиксация иммуноглобулина класса G наблюдается в межклеточных пространствах шиповатого слоя, а при себорейной и листовидной пузырчатке - в зернистом слое эпидермиса. Однако в наших исследованиях была выявлена несколько иная им-муногистохимичёская картина: Так, при пузырчатке независимо от клинических форм ее проявления в патологический процесс всегда были вовлечены антигены десмосомального аппарата шиповатого слоя. При этом в случаях вульгарной пузырчатки в патологический процесс одновременно вовлекалось и межклеточное пространство базального слоя эпидермиса, а в случаях листовидной или себорейной пузырчатки - межклеточное пространство зернистого слоя с наиболее интенсивной иммуногистохимической реакцией в ней. Многолетние клинические и иммунопатологические наблюдения позволили выявить следующий интересный факт. Так, вовлечение системы межклеточного соединения всех слоев эпидермиса у одного и того же больного сопровождается проявлением в течение всего периода болезни клинически разных форм пузырчатки. Это отражает мнение ряда авторов о возможном переходе одной клинической формы болезни в другую и, обратно [446, 522, 523]. Кроме того, вероятно, этим можно объяснить формирование у таких пациентов одновременно поверхностных и глубоких внутриэпидермальных пузырей с участием иммунных комплексов как в растворимой (трудно выявляемой), так и нерастворимой формах.

Разнообразие антигенов-мишеней было выявлено и при аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения. При буллезном пемфигоиде, линейном IgA-зависимом буллезном дерматозе установлено, что мишенью могут быть одновременно и lamina lucida, и lamina densa. При этом патогенетическую роль могут играть аутоантитела, относящиеся к IgG и/или IgA. В ряде случаев при приобретенном буллезном эпи-дермолизе и буллезном пемфигоиде, наряду с основными антигенами-мишенями (структуры, локализующиеся в lamina densa и lamina lucida, соответственно), в патологический процесс опосредованно вовлекается и десмо-сомальный аппарат эпидермиса. Так, в 5% случаев буллезного пемфигоида и в 22,2% случаев приобретенного буллезного эпидермолиза выявлена дополнительная очаговая фиксация иммуноглобулина класса G в межклеточной субстанции базального и шиповатого слоев эпидермиса. Данное явление можно рассматривать и как результат выделительной функции кожи больного.

Наряду с основным классом иммуноглобулина, характерным для той или иной патологии, наличие иммуноглобулинов других классов, ранних компонентов комплемента и фибринозного экссудата в различных структурах эпидермиса и дермы можно объяснить у больных действием сопутствующих антител, которые могут являться отягощающими основное заболевание факторами и быть причиной глубоких нарушений в системе гомеоста-за. Так, при аутоиммунных буллезных дерматозах фиксация ранних компонентов комплемента выявлена не только в местах локализации антител, но и вне зоны антигенов-мишеней. При аутоиммунной пузырчатке выявлена дополнительная изолированная экспрессия ранних компонентов комплемента в зоне базальной мембраны эпидермиса; при буллезном пемфигоиде — в межклеточной субстанции и lamina densa; при приобретенном буллезном эпи-дермолизе - в lamina lucida. Это свидетельствует о сложных процессах развития аутоиммунных буллезных дерматозов с активацией системы комплемента одновременно как классическим, так и альтернативным путями. Необходимо отметить, что C4d" компонент как наиболее устойчивый, к каталитическим процессам компонент системы комплемента может служить свидетелем , протекающей гуморальной реакции, в то время как другие участники иммунного комплекса разрушаются и вымываются из тканей. Такое свойство C4d компонента комплемента может быть использовано в ряде случаев как диагностический маркер для оценки характера и состояния патологического процесса.

Данные иммунологических и иммуноморфологических исследований способствуют не только уточнению или постановке диагноза, но и изучению ^ происходящих в организме иммунопатологических процессов. Последнее позволило расширить научное понимание ранее указанного феномена Никольского, который достоверно коррелирует (г=0,7-0,8 при р<0,05) с отложениями иммунных комплексов в межклеточной субстанции многослойного плоского эпителия. Так, наличие положительного симптома Никольского в ряде случаев буллезного пемфигоида (3,4%) и приобретенного буллезного эпидермолиза (66,7%) можно объяснить проникновением в межклеточные пространства иммуноглобулина класса G и ранних компонентов комплемента, что свидетельствует об опосредованном вовлечении в патологический процесс молекул адгезии и десмосомального аппарата. Повреждение межклеточных контактов на молекулярном уровне без видимых морфологических изменений, возможно,, является достаточным, чтобы механически вызвать нарушение целостности кожного покрова. Это можно рассматривать как один из механизмов развития феномена Никольского при упомянутых заболеваниях.

Правильно установленный диагноз способствует назначению адекватных схем лечения. В настоящее время, несмотря на клинически видимую эффективность проводимой терапии, риск развития обострения патологического процесса остается значительным: Данные, иммунопатологического исследования показывают, что не всегда удается «подавить» процесс. Так, наличие специфических фиксированных иммуноглобулинов как в нерастворимой, так и растворимой формах и ранних компонентов комплемента в тканевых структурах свидетельствует об активно происходящих процессах в организме человека и под действием дополнительных факторов возможно возникновение обострения болезни; (аутоиммунного буллезного дерматоза). Это требует постоянного приема поддерживающих доз глюкокортикостероидов.

При использовании моноклональных и поликлональных антител к антигенам ряда тканевых структур кожи (молекулы клеточной адгезии кадгеринового комплекса, десмосомальный протеин, цитокератин 5, коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa базальной мембраны, продукты генов главного комплекса гистосовместимости I и II классов) с целью изучения молекулярно-биологических сдвигов в тканях при аутоиммунных буллезных дерматозах были отмечены особенности, характерные для каждого из этих заболеваний.

При определении экспрессии молекул клеточной адгезии кадгеринового комплекса с помощью моноклональных антител выявлено, что при аутоиммунных буллезных дерматозах происходит нарушение экспрессии кадгеринового комплекса вплоть до его исчезновения и проявления в тех структурах эпидермиса, где в норме он отсутствует. Так, извращенная экспрессия кадге-ринов в зоне базальной мембраны эпидермиса выявлена в большинстве случаев аутоиммунных буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения и в ряде случаев разных-форм аутоиммунной пузырчатки, включая паранеопластического генеза. Следует отметить, что при буллезном пемфигоиде и приобретенном буллезном эпидермолизе в месте образования подэпидермального пузыря экспрессия кадгеринового комплек- ■ са выявлена как на покрышке пузыря, так и на его дне. Однако выраженная иммуногистохимическая реакция наблюдалась в месте локализации антигена-мишени. Вероятно, под действием патогенетических факторов происходит переключение экспрессии генов одних клеток на гены других (при подавлении одних и активации других). Кроме того, при аутоиммунной пузырчатке вопреки логическому мышлению выявлено парадоксальное явление усиления экспрессии кадгеринового комплекса в местах формирования внутриэпидермального пузыря. Возможно, это связано с компенсаторным эффектом этих молекул адгезии, т.е. исчезновение одних молекул и появление других.

При определении экспрессии десмосомального протеина десмоплакина изоформы I с помощью моноклональных антител выявлено, что при аутоиммунных буллезных дерматозах наблюдается нарушение экспрессии десмоплакина в виде изменения интенсивности иммуногистохимической реакции в десмосомах вплоть до ее исчезновения и появления извращенной экспрессии данного десмосомального протеина в цитоплазме кератиноцитов и в зоне базальной мембраны эпидермиса, где в норме он отсутствует. Экспрессия данного протеина в зоне базальной мембраны эпидермиса отмечена во всех случаях паранеопластической пузырчатки и в ряде случаев вульгарной и листовидной пузырчатки. В случаях аутоиммунных буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения фиксация антител к десмосо-мальному протеину выявлялась на дне пузыря (lamina densa). Кроме того, выявлено нарушение экспрессии десмосомального протеина вплоть до его полного разрушения в базальном и шиповатом слоях эпидермиса с разрывом межклеточных контактов не только в случаях аутоиммунной пузырчатки, но и в случаях аутоиммунных буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения, особенно при приобретенном буллезном эпи-дермолизе. Все это свидетельствует о том, что десмосомальный протеин дес-моплакин I может быть непосредственной мишенью для аутоантител как в случае пузырчатки или страдать опосредованно как при буллезном пемфи-гоиде, линейном IgA-зависимом буллезном дерматозе и приобретенном буллезном эпидермолизе с проявлением его извращенной экспрессией в lamina densa базальной мембраны эпидермиса. Подобную картину можно наблюдать и при пузырчатке паранеопластического генеза.

Повреждение «кадгерин-десмоплакинового» комплекса, по-видимому, приводит к нарушению процессов пролиферации и дифференцировки кератиноцитов. Об этом свидетельствуют изменения локализации цитокератина 5 в коже больных, страдающих аутоиммунными буллезными дерматозами. Так, при определении синтеза цитокератина 5 клетками базального слоя эпидермиса больных аутоиммунной пузырчаткой и аутоиммунными буллезными дерматозами с поражением дермо-эпидермального соединения с помощью моноклональных антител была выявлена иммуногистохимическая картина дефекта синтеза цитокератина 5 клетками камбиального слоя эпидермиса, выражающегося в одновременном проявлении участков отсутствия экспрессии цитокератина или его истощения (экспрессия остается только в местах соединения полудесмосом кератиноцитов с базальной мембраной) и «возбуждения» синтеза или сохранения ранее синтезируемого белка в цитоплазме не только клеток базального, но и дифференцированных слоев эпидермиса. Последнее явление наиболее выражено было в случаях первично диагносци-руемой вульгарной пузырчатки. Снижение синтеза кератина 5 вплоть до полного его подавления на большем протяжении исследуемого материала наблюдали в случаях паранеопластической пузырчатки и буллезного-пемфигоида. Такие дефекты синтеза цитокератина 5, возможно связаны с воздействием на структуры ткани аутоантител и комплемента с последующим вовлечением дополнительных патогенетических факторов (цитокины, ферменты, медиаторы). Последние в норме являются ответственными за процессы размножения (пролиферация) и созревания (дифференцировка) клеточных элементов.

При исследовании антигенов базальной мембраны (коллаген IV типа и белковый комплекс основного вещества lamina densa) кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами с помощью поликлональной сыворотки против коллагена IV типа и специфичных моноклональных антител была выявлена разнообразная иммуноморфологическая картина. Так, при исследовании биоптатов кожи относительно состояния коллагена IV типа базальной мембраны эпидермиса и сосудов практически во всех исследованных случаях выявлена картина нарушения локализации, а также, по-видимому, и синтеза коллагена IV типа базальной мембраны эпителия и сосудов. Практически во всех случаях аутоиммунной пузырчатки независимо от ее клинических форм проявления на большом протяжении наблюдались разрыхление базальной мембраны с участками отсутствия реакции иммунофлюоресценции в зоне базальной мембраны и явлениями секвестрации коллагена на поверхность кожи. Это можно объяснить цитотоксическим действием иммунных комплексов на различные структуры тканей; в частности базальной мембраны кожи. В результате чего происходит в большей или меньшей степени либо нарушение нормальной продукции коллагена мембраны эпителия, либо нарушение сборки коллагеновых волокон. При этом благодаря естественному пути элиминации белков, не связанных со структурами тканей, выявляется материал, положительно реагирующий с сывороткой к коллагену IV типа в эпителии и на его поверхности. Подобную картину наблюдали и при аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпндермального соединения. Однако наиболее интенсивное разрушение базальной мембраны эпидермиса наблюдали при буллезном пемфигоиде, т.к. при данной патологии аутоантитела направлены непосредственно к антигенами полудесмосом и lamina lucida базальной мембраны, прилегающей к коллагеновым волокнам. При этом в месте образования подэпидермального пузыря коллаген IV типа выявлялся на его дне. При приобретенном буллезном эпидермолизе коллаген данного типа выявлялся как на дне, так и на покрышке подэпидермальных пузырей одновременно или раздельно.

При исследовании состояния белкового комплекса lamina densa во всех исследуемых случаях аутоиммунных буллезных дерматозов выявлено>вовлечение в патологический процесс базальной мембраны эпидермиса в виде ее разрыхления или утолщения с участками отсутствия реакции иммунофлюоресценции с использованием специфических моноклональных антител в. зоне базальной мембраны и явлением секвестрации этого белкового материала на поверхность кожи. Это можно объяснить повреждающим действием иммунных комплексов на клетки, синтезирующее основное вещество базальной мембраны, в результате которого нарушается нормальная продукция ее белков. Факт выявления в эпителии материала, положительно реагирующего со специфическими моноклональными антителами, подтверждает наличие выделительной функции кожи. Кроме того, в месте образования подэпидермальных пузырей при буллезном пемфигоиде и приобретенном буллезном эпидермолизе иммуногистохимическая реакция отмечена в большинстве случаев только на дне пузыря, реже одновременно или раздельно на дне и покрышке пузыря.

При определении экспрессии антигенов главного комплекса гистосовме-стимости класса I с помощью специфических моноклональных антител при аутоиммунных буллезных дерматозах, включая аутоиммунную пузырчатку, 286 буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз была выявлена разная степень выраженности экспрессии антигенов HLA I класса на поверхности кератиноцитов и эндотелии сосудов вплоть до полного ее угнетения. По-видимому, нарушение экспрессии этих антигенов происходит не только под влиянием иммуно-супрессивных препаратов, но и под влиянием цитотоксического действия аутоантител с вовлечением их в патологический процесс, сопровождающийся повреждением поверхности кератиноцитов, секвестрацией HLA I специфического материала на поверхность кожи и появлением антигена в локализациях, где в норме он отсутствует. Так, при приобретенном буллезном эпидер-молизе выявлена экспрессия HLA антигенов I класса в зоне базальной мембраны эпидермиса: Кроме того, в случаях аутоиммунных буллезных дерматозах паранеопластического генеза выявлено полное отсутствие экспрессии данных антигенов' на поверхности кератиноцитов, что может быть связано с выработкой при опухолевом процессе аутоантител, направленных к ряду тканевых антигенов, в том числе и к антигенам HLA I класса.

При исследовании экспрессии антигенов главного комплекса гистосов-местимости класса II (HLA-DR) с помощью специфических моноклональных антител у больных, страдающих аутоиммунным процессом отмечена экспрессия HLA-DR антигенов на эндотелиальных клетках сосудов дермы и клетках Лангерганса. При этом клетки Лангерганса выявлялись в разной степени активности с их неравномерным распределением по эпидермису и нередко в дермо-эпидермальном соединении, особенно в очагах поражения и в месте образования пузырей. В большинстве случаев экспрессия HLA-DR антигенов выявлялась на цитоплазматической мембране кератиноцитов и на поверхности кожи, что связано с выраженным нарушением механизмов регуляции экспрессии и в результате - изменением локализации белков данного класса гистосовместимости. В ряде случаев у пациентов с впервые выявленным аутоиммунным процессом обнаружено угнетение или полное подавление экспрессии HLA-DR антигенов на эндотелии сосудов верхнего отдела дермы и клетках Лангерганса. Это позволяет предположить, что последние могут выступать в качестве мишени для аутореакгивных Т-лимфоцитов и аутоантител. Нарушение регуляции экспрессии генов HLA II класса и их белковых продуктов, является одним из важных механизмов, лежащих в основе развития аутоиммунных процессов; и иммунологической недостаточности. Подобную картину угнетения или=подавления экспрессии HLA-DR антигенов можно наблюдать и при наличиишеопластического' процесса, и при длительном приеме иммуносупрессивных препаратов;

Таким образом, результаты приведенного исследования свидетельствуют о том, чтоаутоиммунные буллезныедерматозыпредставляют собой гетерогенную группу заболеваний с вовлечением в общий иммунопатологический' процесс, различных; структур тканей кожи; в частности; ее клеточных элементов: Вовлечение одновременно разных антигенов-мишеней приводит к широкому спектру клинических проявлений» аутоиммунных буллезных, дерматозов: Некоторые исследователи высказывают мысль о существовании смешанных аутоиммунных буллезных дерматозов [514; 704]. Такое разнообразие проявлений болезни, даже у одного и того же больного требует постановки точного диагноза с использованием современных молекулярно-биологических методов исследования, включая методы меченых антител. Все это подводит к созданию базы по изучению состояния молекулярных соединений кожи с целью разработки методов дифференциальной диагностики и осуществления контроля за качеством лечения. и подбора лекарственных средств. Эффективность проводимой терапии можно контролировать выявлением и оценкой степени экспрессии различных белковых компонентов, в структурах тканей. Приближаясь к генетическому уровню (выявление и оценки экспрессии генов), задачей современной медицины- является вмешательство в.геном с целью исправления синтеза того или иного вещества. Но эта проблема будущего.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Махнева, Наталия Викторовна

1. Адаскевич В.П., Мяделец ОД. Дерматозы эозинофильные и нейтрофильные М.: Медицинская книга, 2001.

2. Андреенко Г.В. Фибринолиз (биохимия, физиология, патология). М., 1979.-320 с.

3. Ашмарин И.П., Корозеева Е.П., Лелякова Т.В. Эффективность ультрамалых доз эндогенных биорегуляторов и иммуноакгивных соединений / / Микробиология, эпилепсия и иммунология. 2005. - № 3. - С. 109115.

4. Ашмарин И.П. История и практические перспективы нового понимания роли аутоиммунитета 11 Тезисы докладов 1-й Московской международной конференции «Естественный аутоиммунитет в норме и патологии». Москва, 2005. - С. 44-45.

5. Балдуев И.А Вакцины на основе дендритных клеток в лечении злокачественных опухолей / / V Российская онкологическая конференция. Москва, 2001.

6. Банченко Г.В., Кряжева С.С. Сочетание поражения слизистой оболочки полости рта и кожи. Атлас. М., 1994.-155 с.

7. Белецкая Л.В., Гнездицкая Э.В. Реакция сывороток больных вульгарной пузырчаткой с антигенами склеивающей субстанции эпителия телец Гассаля тимуса человека и животных / / Бюл. экспер биол. 1974. -№6.-С. 87-90.

8. Белецкая Л.В., Данилова Т.А. Метод иммунофлюоресценции в иммунопатологии. / В кн. Иммунолюми-несценция в медицине; под ред. Е.Н Левиной М : Медицина, 1977. - С.145-183.

9. Белецкая Л.В., Верболович П.А., Полосухина Т.Я. Экспериментальная стрептококковая инфекция (основные итоги и перспективы исследований). Алма-Ата: НАУКА, 1978.-278 с.

10. Белецкая Л.В , Дмитриев А А., Петрова Г.Н., Бухова В.А., Мудренко И.Ю., Бекгимиров Р.А. Иммунопатология кожи и гемосорбция / / Вести, дерматол. 1985. - № 5. - С. 15-18.

11. Белецкая Л.В., Махнева Н.В. Меченые антитела в нормальной и патологической морфологии (атлас). -М.:МНПИ, 2000-109 с.

12. Беренбейн Б.А. Буллезные дерматозы / В рук-ве для врачей «Дифференциальная диагностика кожных болезней»; под ред.Б.А Беренбейна, А.А. Студницына. М.: Медицина, 1989. - С. 218-270.

13. Беренбейн Б.А. Общие принципы диагностики кожных заболеваний / В рук-ве для врачей; под ред.Ю.КСкрипкина. -М.: Медицина, 1995.-Т. 1.-С. 123-156.

14. Браун Э.Д., Джойнер К А., Франк М.М. Комплемент: Пер. с англ / В кн. Иммунология: в 3 т.; под ред.У.Пола. М.: Мир, 1989. - Т. 3. - С. 89-125.

15. Быков В.Л. Цитология и общая гистология. СПб: СОТИС, 2003. - 519 с.

16. Вавилов A.M., Белецкая Л В., Дробышевская Э.М., Персина И.С. Нарушение дифференцироваки кератиноцитов при эпидермальных опухолях и грибовидном микозе / / Вестн. дерматол. 1989. - № 1. - С. 2629

17. Вульф К., Джонсон Р., Сюрмонд Д. Пузырные дерматозы / В кн. Дерматология по Т.Фицпатрику (атлас-справочник). М.: Практика, 2007. - С. 138-167.

18. Галактионов В.Г. Иммунология. М.: Изд-во «РИЦ МДК», 2000 - 488с

19. Гантиевская Ю.А., Селявко В.В. Дендритные клетки: роль в системе иммунитета / / Иммунопатология, аллергология, инфекгология. -2001. № 4 - С. 5-23.

20. Глухенький Б.Т., С А.Грандо Иммунозависимые дерматозы: экзема, атопический дерматит, истинная пузырчатка, пемфигоиды. Киев: Здоровья, 1990.-479 с.

21. Глухенький Б.Т, Грандо С А., Коляденко В.Г., Степаненко В.И., Глухенькая А.Б. История и клиническое значение симптома Никольского в диагностике пузырных дерматозов / / Украинский журнал дерматологии, венерологии, косметологии. 2003. - №4. - С.6-12.

22. Грабарь П.Н. / В кн. Проблемы реактивности в патологии; под ред. Адо АД М.: Медицина, 1968. - С. 35-52.

23. Грандо С.А. Вульгарная пузырчатка и буллезный пемфигоид' иммунопатогенез и индивидуализированная терапия больных: автореф дис .д-ра мед.наук. М., 1989. - 32 с.

24. Гребенников В.А., Беляевский А Д Изучение иммунокоррегирующего и детоксициирующего действия ге-мосорбции, плазмафереза и энтеросорбции при пузырчатке / / Вестн. дерматол. 1990. - № 5. - С. 33-37.

25. Долгих В.Т. Основы иммунопатологии. М.: Медицинская книга, 2000. -201 с.

26. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. М.: МИА, 2003. - 603 с.31.

Автореферат диссертации по медицине на тему Клинико-морфологические и иммунологические аспекты в ранней диагностике и лечении аутоиммунных буллезных дерматозов

Оглавление диссертации Махнева, Наталия Викторовна :: 2009 :: Москва

Введение диссертации по теме "Кожные и венерические болезни", Махнева, Наталия Викторовна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Махнева, Наталия Викторовна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций