Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Клинические и молекулярные факторы, ассоциированные с поражением костно-суставной системы при болезни Гоше I типа

На правах рукописи

Лукина Кира Анатольевна

КЛИНИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФАКТОРЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ПОРАЖЕНИЕМ КОСТНО-СУСТАВНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ БОЛЕЗНИ ГОШЕ I ТИПА

14.01.21 — гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 ОКГ 2013

Москва-2013

005535704

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Козинец Геннадий Иванович, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Научный консультант:

Судариков Андрей Борисович, доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Бирюкова Людмила Семеновна, доктор медицинских наук, ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ, научно-клиническое отделение полиорганной патологии и гемодиализа, заведующая отделением

Маянский Николай Андреевич, доктор медицинских наук, ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, заведующий лабораторным отделом

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « » 2013 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.135.01 при ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ

Автореферат разослан » 2013 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат медицинских наук Зыбунова Е. Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

Болезнь Гоше (БГ) — наиболее частая форма наследственных ферментопатий, объединенных в группу лизосомных болезней накопления. В основе БГ лежат мутации гена кислой р-глюкозидазы (глюкоцереброзидазы, ГЦБ) - лизосомного фермента, ответственного за катаболизм липидов. Присутствие двух мутантных аллелей гена ассоциируется со значительным (< 30% от нормального уровня) снижением каталитической активности глюкоцереброзидазы, что приводит к накоплению в цитоплазме антигенперерабатывающих макрофагов продуктов расщепления деградирующих клеток [Horowitz М. et al., 1989, Grabovvski G.A. et al., 1997, Воробьев А.И., 2003, Краснопольская К.Д., 2005, Futerman A.H. et al., 2007]. Следствием данного метаболического дефекта являются:

1. Хроническая активация макрофагальной системы;

2. Аутокринная стимуляция моноцитопоэза и увеличение абсолютного количества макрофагов в местах «физиологического дома»: селезенка, печень, костный мозг, следствием чего являются спленомегалия, гепатомегалия, инфильтрация костного мозга;

3. Нарушение регуляторных функций макрофагов, что, предположительно, лежит в основе поражения костно-суставной системы (нарушение ремоделирования костной ткани) [Boven L.A. et al., 2004; Futerman A.H. and Zimran A., 2007]. Выделяют 3 типа БГ:

Тип I — без неврологических проявлений; наиболее частый вариант заболевания, наблюдается у 94% больных [Mikosch Р., 2010];

Тип II (острый нейронопатический) - характеризуется прогрессирующим течением, тяжелым поражением центральной нервной системы, приводящим к летальному исходу в возрасте около 2 лет;

Тип 111 (хронический нейронопатический) — неврологические осложнения мог>т проявляться как в раннем, так и в подростковом возрасте.

Поражение костно-суставной системы является типичным проявлением БГ и варьирует от бессимптомной остеопении до тяжелейшего остеопороза с множественными патологическими переломами и ишемическими некрозами, ведущими к развитию вторичных остеоартрозов и, как следствие, необратимых

ортопедических дефектов. Именно поражение костно-суставной системы определяет тяжесть течения БГ и качество жизни пациентов [Лукина Е.А., 2011]. Однако причина выраженной гетерогенности клинических проявлений БГ, в том числе исключительной вариабельности характера и степени поражения костно-суставной системы, остается неясной.

В качестве основных патогенетических механизмов поражения костно-суставной системы при БГ рассматриваются: инфильтрация костного мозга макрофагами/клетками Гоше; нарушение ремоделирования костной ткани; асептические некрозы костей (остеонекрозы) [Wenstrup R.J. et al., 2002, Futerman A.H. et al., 2007, Weinreb N.J., 2007].

Ген ГЦБ локализуется в регионе q21 на 1 хромосоме [Bameveld R.A. et al., 1983, Horowitz M. et al., 1989]. К настоящему времени описано около 350 мутаций, из которых 4 (N370S, L444P, 84GG, IVS2+1) встречаются наиболее часто и составляют около 60% всех мутаций гена ГЦБ в популяции пациентов с БГ [Mistry Р.К., 1993, Futerman A.H. et al., 2007, Grabowski G.A., 2012]. Результаты предыдущих исследований не выявили достоверных корреляций тяжести поражения костно-суставной системы ни с типом мутации гена ГЦБ, ни с остаточной активностью фермента ГЦБ [Futerman A.H. et al., 2007].

Мы предположили, что в основе гетерогенности поражения костно-суставной системы при БГ могут лежать дополнительные генетические дефекты: мутации генов, кодирующих белки, участвующие в процессах ремоделирования костной ткани и/или белки свертывающей системы крови.

В случаях тяжелого остеопороза, в качестве причины нарушения метаболизма костной ткани может рассматриваться дополнительный генетический дефект -мутации гена, ответственного за синтез коллагена 1 типа (ген несовершенного остеогенеза) [Amheim Е. et al., 2008, Gervas-Arruga J. et al., 2012]. В настоящее время описано более 1000 мутаций в генах COLI AI и COL1A2, кодирующих составные части цепи коллагена 1 типа, который является главным компонентом матрикса кости [Надыршина Д.Д., 2011]. В результате синтеза дефектного коллагена нарушается формирование костного матрикса, изменяется баланс между резорбцией и формированием кости в сторону преобладания резорбции.

Патогенез остеонекрозов при БГ недостаточно изучен. В качестве одного из важных механизмов рассматривается ишемическое поражение костной ткани вследствие гиперкоагуляционного синдрома. Наличие наследственной тромбофилии, обусловленной мутациями генов системы свертывания крови, может служить важным дополнительным патогенетическим механизмом гиперкоагуляции [ЕЫет Б. е1 а!., 2000].

Поражение костно-суставной системы определяет тяжесть течения БГ и, как правило, является основной клинической проблемой при данном заболевании. Назначение заместительной ферментной терапии (ЗФТ) имеет целью предупредить развитие необратимого поражения костно-суставной системы и тяжелых ортопедических дефектов. Больные с высоким риском тяжелого поражения костно-суставной системы нуждаются в разработке индивидуальных программ лечения. В соответствии с этим, изучение факторов, ассоциированных с высоким риском поражения костно-суставной системы при БГ, является актуальной научной и практической задачей.

Цель исследования

Изучение клинических и молекулярных факторов, ассоциированных с поражением костно-суставной системы при болезни Гоше I типа. Задачи исследования

1. Характеристика клинических, лабораторных и радиологических данных пациентов с болезнью Гоше I типа, оценка тяжести поражения костно-суставной системы;

2. Молекулярный анализ мутаций генов, кодирующих кислую р-глюкозидазу, белки системы свертывания крови и коллаген 1 типа;

3. Анализ взаимосвязи между тяжестью поражения костно-суставной системы и изученными клиническими и лабораторными параметрами;

4. Разработка рекомендаций по использованию изученных параметров для прогнозирования тяжести поражения костно-суставной системы.

Научная новизна

Впервые в Российской Федерации проведен комплексный анализ клинических, лабораторных и радиологических данных 100 взрослых пациентов с болезнью Гоше I типа до начала заместительной ферментной терапии.

Статистический анализ полученных данных показал, что тяжелое поражение костно-суставной системы имеет достоверную связь с наличием спленэкгомии в анамнезе.

Охарактеризован генотип 100 пациентов с болезнью Гоше I типа; установлено, что наиболее частой мутацией в популяции российских пациентов является N3708, наиболее распространенным генотипом — Ю705/другая мутация.

На основании клинической и радиологической картины заболевания разработана шкала оценки тяжести поражения костно-суставной системы при болезни Гоше.

Впервые у пациентов с болезнью Гоше дана характеристика дополнительных генетических дефектов (наследственная тромбофилия, мутации гена коллагена I типа), предположительно, имеющих патогенетическую связь с тяжестью поражения костно-суставной системы.

Научная и практическая ценность

Охарактеризовано состояние костно-суставной системы у пациентов с болезнью Гоше I типа, в том числе сопоставлена тяжесть течения заболевания у спленэктомированных и неспленэктомированных больных.

Установлена диагностическая ценность скринингового метода - аллель-специфической полимеразной цепной реакции в реальном времени, для идентификации мутаций гена кислой р-глюкозидазы (молекулярная диагностика болезни Гоше).

Установлено, что частота наследственной тромбофилии — гетерозиготных мутаций генов протромбина и фактора V, гомозиготных мутаций генов метилентетрагидрофолатредуктазы и ингибитора активатора плазминогена 1, составила 1%, 1%, 7% и 33%, соответственно, что в общей сложности составляет 42%.

Показано, что спленэктомия ассоциируется с регрессом цитопенического синдрома, но является фактором риска тяжелого поражения костно-суставной системы.

Доказано, что у 95% нелеченых больных со сниженным уровнем гемоглобина анемия носит характер анемии хронических заболеваний, что является противопоказанием к лечению препаратами железа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Тяжелое поражение костно-суставной системы у взрослых пациентов с болезнью Гоше I типа имеет достоверную связь с наличием спленэктомии в анамнезе.

2. Статистический анализ не выявил взаимосвязи между тяжестью поражения костно-суставной системы, с одной стороны, и исследованными молекулярными факторами: _ генотипом болезни Гоше, наличием наследственной тромбофилии и мутаций гена коллагена 1 типа СОЫА1, с другой.

3. Молекулярный анализ 4 мутаций гена кислой (3-глюкозидазы с использованием скринингового метода (аллель-специфическая полимеразиая цепная реакция в реальном времени), позволяет идентифицировать 2 мутантных аллеля и, соответственно, верифицировать диагноз болезни Гоше, у 39% больных, что дает основание рекомендовать данный метод в качестве первого этапа диагностики при подозрении на болезнь Гоше.

4. У 95% нелеченых пациентов с болезнью Гоше со сниженным уровнем гемоглобина анемия носит характер анемии хронических заболеваний, маркером которой является перераспределительный дефицит железа, что является противопоказанием к лечению препаратами железа.

Внедрение в практику

Основные положения диссертационной работы внедрены в работу научно-клинического отделения орфанных заболеваний и лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ Гематологического научного центра МЗ РФ (Генеральный директор - академик РАМН, д.м.н., профессор Савченко В.Г.). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ: 4 в отечественной (из них 2 в журналах, одобренных ВАК) и 6 в зарубежной литературе. Апробация работы

Работа апробирована 03.06.2013 г. на заседании проблемной комиссии ГНЦ «Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)». Основные положения

диссертации доложены на 1st European Gaucher Leadership Forum (май 2009 г., Милан), на 9th International European Working Group on Gaucher Disease Meeting, (июнь 2010 г., Кельн), на 3rd European Gaucher Leadership Forum (сентябрь 2011 г., Будапешт), Всероссийских декадниках по гематологии (апрель 2011 г., апрель 2013 г., Москва), на 10th International European Working Group on Gaucher Disease Meeting (июнь 2012 г., Париж), на Всероссийской конференции «Аналитическая надежность и диагностическая значимость лабораторной медицины» (март 2013 г., Москва), на конференции, посвященной вопросам диагностики и терапии редких болезней (апрель 2013 г., Ярославль), на 18th Congress of the European Hematology Association (июнь 2013 г., Стокгольм).

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, главы собственных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиографический указатель содержит 150 источников литературы. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 27 рисунками.

Работа осуществлялась в период с октября 2010 г. по июнь 2013 г. на базе научно-клинического отделения орфанных заболеваний (зав. отд. — д.м.н., проф. Лукина Е.А.) и лаборатории молекулярной гематологии (рук. лаб. — д.б.н. Судариков А.Б.) при сотрудничестве с другими отделениями и лабораториями ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (Генеральный директор - академик РАМН, д.м.н., профессор Савченко В.Г.). Статистическая обработка данных проведена совместно с зав. лаб. биостатистики ФГБУ ГНЦ МЗ РФ, K.T.H. Куликовым С.М.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика больных

В настоящую работу вошли результаты исследований 100 пациентов с БГ I типа. Группу больных составили 36 мужчин и 64 женщины в возрасте от 16 до 79 лет (медиана возраста 30 лет).

У 3 больных диагноз БГ был установлен впервые. У 97 больных диагноз был установлен ранее (за 1-30 лет) до поступления в клинику.

Диагноз БГ устанавливали на основании клинической картины и результатов морфологического исследования костного мозга и/или ткани удаленной селезенки. У

всех больных диагноз был подтвержден ферментной диагностикой - определением активности кислой р-глюкозидазы в лейкоцитах крови и уровня хитотриозидазы в плазме крови.

Подавляющее большинство больных (86%) при поступлении под наше наблюдение не получали ЗФТ; 14 больных в прошлом получали ЗФТ эпизодически или в течение короткого промежутка времени (< 1 года), недостаточного для оценки динамики поражения кости о-су стан ной системы. Методы исследований

Больные обследовались по единому протоколу, который в соответствии с задачами настоящего исследования включал:

1. Стандартное обследование:

а) физикальное;

б) лабораторное, включавшее: клинический анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови, вирусологическое исследование крови, коагулограмма, включавшая определение волчаночного антикоагулянта, иммунохимическое исследование сыворотки крови, исследование параметров обмена железа;

в) инструментальное (электрокардиография, рентгенография органов грудной клетки, ультразвуковое исследование органов брюшной полости);

г) цитологическое исследование пунктата костного мозга (клинико-диагностическая лаборатория, зав. лаб. Двирнык В.Н.), гистологическое исследование костного мозга, препаратов удаленной селезенки (патологоанатомическое отделение, рук. отд., д.б.н. Ковригина A.M.).

2. Энзимодиагностика для верификации диагноза (у большинства больных была проведена до обращения в ГНЦ): определение активности кислой Р-глюкозидазы в лейкоцитах периферической крови и уровня хитотриозидазы в плазме крови (лаборатория наследственных болезней обмена веществ ФГБУ Медико-генетического научного центра РАМН, зав. лаб., д.м.н. Захарова Е.Ю).

3. Оценка степени тяжести поражения костно-суставной системы:

а) консультация ортопеда (зав. отд. гематологической ортопедии, к.м.н. Мамонов В.Е.);

б) рентгенологическое исследование бедренных костей с захватом тазобедренных и коленных суставов (отделение рентгенологии и компьютерной томографии, зав. отд., к.м.н. Костина И.Э.);

в) магнитно-резонансная томография бедренных костей, тазобедренных и коленных суставов (врач-рентгенолог, к.м.н. Яцык Г. А.);

г) компьютерная томография пораженных участков скелета по показаниям (отделение рентгенологии и компьютерной томографии, зав. отд., к.м.н. Костина И.Э.).

4. Молекулярно-генетические исследования:

а) скрининг на выявление четырех наиболее частых мутаций гена кислой ß-глюкозидазы (N370S, L444P, 84GG, IVS2+1G>A) методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Методика была разработана и осуществлялась в лаборатории молекулярной гематологии (рук. лаб., д.б.н. Судариков А.Б.) совместно с вед. н. сотр., к.б.н. Февралевой И.С.;

б) исследование полиморфизмов генов системы свертывания крови: мутации С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (МТГФР), G20210A гена протромбина, гена фактора V Лейден и 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена 1 (лаборатория молекулярной гематологии, рук. лаб., д.б.н. Судариков А.Б.; лаборатория «Постгеномные и нанотехнологические инновации» НИИ Физико-химической медицины, зав. лаб., к.б.н. Генерозов Э.В.);

в) Поиск мутаций в 17 экзоне гена COL1AI методом прямого секвенирования по Сэнгеру. Исследование выполнялось в лаборатории молекулярной гематологии (рук. лаб., д.б.н. Судариков А.Б.) совместно со ст. н. сотр., к.б.н. Бидерман Б.В.

5. Статистическая обработка данных выполнена на основе пакета статистических программ SAS (Statistical Analysis System) совместно с зав. лаб. биостатистики, к.т.н. Куликовым С.М.

Результаты исследования и обсуждение

Клиническая и лабораторная характеристика ¡00 пациентов с болезнью Гоше I типа

Клиническая картина БГ у всех исследованных больных характеризовалась органомегалией, поражением костно-суставной системы, у большинства больных -цитопенией (Табл. 1).

Таблица 1. Основные клинические и лабораторные признаки у 100 пациентов с болезнью Гоше I типа

Признак Количество больных, %

Спленомегалия 61

Гепатомегалия 94

Поражение костей 100

Анемия 43

Тромбоцитопения 67

У 39 из 100 больных до поступления под наше наблюдение (за 1 - 30 лет) с лечебной и/или диагностической целью была проведена спленэктомия. В связи с тем, что клиническая и лабораторная картина БГ существенно отличалась у спленэктомированных и неспленэктомированных больных, клиническая характеристика этих 2 групп больных представлена отдельно.

Группа неспленэктомированных больных характеризовалась цитопенией (тромбоцитопения - 100%, анемия - 51%, лейкопения - 56%), спленомегалией (100%) и гепатомегалией (92%) (Рис. 1).

В группе спленэктомированных больных у 97% имела место гепатомегалия, у 31%-анемия, у 15%-тромбоцитопения. (Рис. 1).

и СО неСЭ

Анемия ШШ 31% 51%

Тромбоцитопения 15%

100%

97%

Гепатомегаяия

92%

Спленомегалия

ШШ 100%

100%

Поражение костей

■ 100%

0% 25% 50% 75% 100%

Рисунок. 1. Сравнительная характеристика спленэктомированных и неспленэктомированных больных

При анализе биохимических показателей крови выявлены следующие характерные для спленэктомированных и неспленэктомированных больных изменения', гиперпротеинемия (у 41% и 16%, соответственно), гиперглобулинемия (у 82% и 44%), гипербилирубинемия за счет непрямой фракции (у 44% и 33%), повышение уровня щелочной фосфатазы (у 38% и 33%) и ACT (у 36% и 15%) (Рис. 2).

При исследовании уровней сывороточных иммуноглобулинов выявили повышение уровня IgA у 31% неспленэктомированных больных и 72% -спленэктомированных; повышение уровня IgG - у 21% и 67% больных, соответственно (Рис. 2).

■ аншшш

67%

тСЗ

Повышенный уровень IgG

НеСЭ

Повышенный уровень IgA

31%

Гнпергаммаглобулинемня

44%

Гнперпротеннемпя

ШШШ&ШШ 41°

о

16%

0% 25% 50% 75% 100° о

Рисунок 2. Биохимические показатели крови у спленэктомированных и неспленэктомированных больных

Частота поликлоиальной гаммапатии у пациентов с БГ составляет 14 - 64% (по данным разных авторов) [Mankin H.J. et al., 2001; Futennan A.H. and Zimran A., 2007; De Fost M. et al., 2008; Grosbois B. et al., 2009; Zimran A., 2011]. Предполагается, что в основе процесса лежит хроническая стимуляция макрофагов/клеток Гоше накопленным глюкоцереброзидом, продукция активированными макрофагами широкого спектра цитокинов, в том числе IL-6, что приводит к хронической стимуляции пролиферации B-лимфоцитов, и, как следствие, гиперпродукции иммуноглобулинов [Fnterman A.H. and Zimran A., 2007]. В литературе отсутствуют сведения о содержании иммуноглобулинов в сыворотке крови у спленэктомированных и неспленэктомированных пациентов с БГ. Однако, описано достоверное повышение уровней IgA и IgG у спленэктомированных больных с гомозиготной р-талассемией [Constantoulakis М. et al., 1978; Tovo P.A. et al., 1981]. В качестве возможных патогенетических механизмов авторы рассматривают повреждение печени и/или снижение катаболизма белков после сплензктомии. Повышение уровней сывороточных IgA и IgG отмечено также у больных, спленэктомированных по поводу травматических повреждений селезенки [Demeter J. et al., 1990].

Уровень IgM у большинства спленэктомированных и неспленэктомированных пациентов с БГ находился в пределах нормальных значений, однако, у

спленэктомированных больных средний уровень 1ёМ был достоверно ниже, чем у неспленэктомированных (р=0,002).

Селезенка является основным местом синтеза иммуноглобулинов, соответственно, спленэктомия должна приводить к уменьшению продукции антител. Достоверно более высокие показатели ^А и у спленэктомированных пациентов с БГ свидетельствует о том, что после удаления селезенки функцию продукции антител берут на себя другие органы лимфопоэза, вероятно, печень и висцеральные лимфатические узлы.

У 3 пациентов с БГ выявили моноклональную гаммапатию: у 1 — секрецию Ок 17,4 г/л, у 1 - Сл. 10 г/л, у 1 — следовую секрецию Ок.

По данным литературы, частота моноклональной гаммапатии у пациентов с БГ варьирует от 1 до 35% (по данным разных авторов) и рассматривается в качестве фактора риска развития множественной миеломы [Мапкт Н.1. &Х а1., 2001; ЛозепЫоот В.Е. е1 а1., 2005; Х'тгап А. й а1., 2005; ОЫеИо Я. е1 а!., 2006; Ри1егтап А.Н. апс! йтгап А., 2007; Бе Рое! М. е1 а1„ 2008; ЯозепЬаит Н. й а1., 2011]. Ни у одного из 3 больных с моноклональной гаммапатией за период наблюдения от 2 до 9 лет не выявлено признаков развития множественной миеломы; уровень сывороточного парапротеина остается стабильным.

У 2 пациентов с БГ диагностировали врожденный иммунный дефект: у 1 — полный селективный дефицит IgA; у 1 — полный селективный дефицит 1£М.

Наличие волчаночного антикоагулянта определяли у 82 больных, из них у 30 (37%) тест был положительным. При этом частота выявления волчаночного антикоагулянта была достоверно выше в группе неспленэктомированных больных (р=0,02).

У 15 больных выявили маркеры хронического вирусного гепатита (у 13 — НСУ+, у 2 — НВУ+); 10 из 15 больных хроническим вирусным гепатитом имели в анамнезе спленэктомию.

Сравнительный анализ клинических и лабораторных характеристик исследованных пациентов с БГ показал, что наличие спленэктомии в анамнезе ассоциируется с выраженной гиперпротеинемией, гипергаммаглобулинемией, повышением уровней поликлональных ^О и ^А, а также является фактором риска

инфицирования вирусами гепатитов В и С. У спленэктомированных больных достоверно реже имела место тромбоцитопения и анемия.

Анализ сывороточных показателей метаболизма железа выявил общие для неспленэктомированных и спленэктомированных больных изменения: повышение уровня сывороточного ферритина (у 61% и 74% больных, соответственно); нормальный уровень сывороточного железа (у 70% и 80% больных), ОЖСС (у 72% и 74% больных) и НТЖ (у 64% и 77% больных).

Исходно уровень гемоглобина был сниженным у 43 из 100 нелеченых пациентов с БГ. Для оценки характера анемии у этих больных был проведен анализ сывороточных показателей метаболизма железа. Результаты анализа показали, что лабораторные признаки истинного дефицита железа (снижение уровня ферритина, сывороточного железа, НТЖ, повышение ОЖСС) имели только 2 (5%) больных. У остальных 95% больных анемия носила характер анемии хронических заболеваний (АХЗ) (Рис. 3).

37%

■ Выше нормы •к В норме

■ Ниже нормы

63%

Рисунок 3. Сывороточные показатели обмена железа у больных с анемией (п=43)

АХЗ представляет собой сложный многокомпонентный процесс, в котором пусковую роль играет активация иммунной системы под воздействием различных стимулирующих факторов экзогенного (инфекция, токсины) или эндогенного происхождения (токсичные метаболиты, циркулирующие иммунные комплексы). Активация макрофагов и Т-лимфоцитов сопровождается продукцией провоспалительных цитокинов, биологические эффекты которых включают каскад

иммунопатологических реакций, приводящих, в конечном итоге, к дисбалансу между продукцией и разрушением эритроцитов. Важным механизмом, приводящим к нарушению продукции эритроцитов в костном мозге, являются глубокие изменения в метаболизме железа, которые приводят к снижению концентрации железа в сыворотке крови и повышению уровня сывороточного ферритина. В совокупности эти процессы приводят к развитию искусственного — перераспределительного, дефицита железа, который ведет к снижению доставки железа костномозговым эритроидным предшественникам, снижению синтеза гемоглобина и развитию анемии воспаления [Weiss G. and Goodnough L.T., 2005; Nairz M. and Weiss G., 2006; Wrighting D.M. and Andrews N.C., 2006; D'Angelo G., 2013].

Физиологическое значение перераспределительного дефицита железа состоит не только в ограничении биодоступности железа, необходимого для роста и развития патогенных микроорганизмов и опухолевых клеток. Свободные ионы железа обладают способностью подавлять активность интерферон-гамма (INF-y) — ключевого цитокина, запускающего активацию Т-клеток, цитотоксических клеток и макрофагов. Следовательно, удаление метаболически активного железа из циркуляции должно усиливать иммунный ответ через стимуляцию INF-7-зависимых иммунных реакций. В соответствии с этим, назначение ферротерапии при АХЗ является физиологически неоправданным и опасным мероприятием.

Следует отметить, что, по данным анамнеза, абсолютное большинство нелеченых пациентов с БГ и анемией в прошлом длительно получали лечение препаратами железа, т. к. анемия рассматривалась как железодефицитная.

Оценка степени тяжести поражения костно-суставной системы

Для характеристики степени тяжести поражения костно-суставной системы использовали следующие критерии:

- наличие инфильтрации костного мозга бедренных костей;

- наличие некрозов в диафизах и/или метафизах бедренных костей;

- наличие асептических некрозов головок бедренных костей с развитием вторичных артрозов;

- наличие патологических переломов костей.

По степени тяжести поражения костно-суставной системы 100 пациентов с БГ были разделены нами на 4 группы:

1. Легкое поражение костей (п, = 14):

а. Инфильтрация костного мозга бедренных костей

2. Умеренно тяжелое поражение костей (п2= 58):

a. Инфильтрация костного мозга бедренных костей

b. Очаги некрозов в диафизах и/или метафнзах бедренных костей

3. Тяжелое поражение костей (п3 = 25):

a. Инфильтрация костного мозга бедренных костей

b. Очаги некрозов в диафизах и/или метафизах бедренных костей

c. Асептические некрозы головок бедренных костей с развитием вторичных артрозов

d. Единичные патологические переломы

4. Сверхтяжелое поражение костей (114= 3):

a. Инфильтрация костного мозга бедренных костей

b. Очаги некрозов в диафизах и/или метафизах бедренных костей

c. Асептические некрозы головок бедренных костей с развитием вторичных артрозов

d. Множественные патологические переломы трубчатых костей, обусловленные тяжелым остеопорозом.

Для проведения анализа взаимосвязи тяжести поражения костно-суставной системы с основными клиническими и лабораторными показателями 3 больных со сверхтяжелым поражением костей объединили с группой с тяжелым поражением.

Статистический анализ показал, что спленэктомия повышает вероятность тяжелого поражения костно-суставной системы в 7 раз (р<0,0001, OR=6,97 (Cl 95% 2,64-18,45) (Табл. 2). Полученные нами данные согласуются с результатами предшествующих исследований, отметивших неблагоприятное влияние спленэктомии на последующее течение БГ [Павлова Е.В., 2004; Futerman А.Н. and Zimran А., 2007; Hughes D. et al., 2007; Сох T.M. et al., 2008; Deegan P.B. et al., 2011]. По данным ряда авторов, спленэктомия повышает риск развития остеонекрозов в 10 раз [Rodrigue S.W. et al., 1999].

Таблица 2. Сравнительная характеристика степени тяжести поражения костно-суставной системы у спленэктомированных и неспленэктомированных больных

Пациенты Поражение костно-суставной системы

Легкое и Тяжелое и

умеренное сверхтяжелое

НеСЭ (ih=61) 53 (87%) 8 (13%)

СЭ (п2=39) 19 (49%) 20 (51%)

OR 6,97 (С1 95% 2,64-18,45)

Р.2 <0,0001

Известно, что селезенка является основным резервуаром для макрофагов/клеток Гоше. Удаление селезенки приводит к накоплению перегруженных липидами клеток в других органах-мишенях, прежде всего, в печени и костном мозге, что ведет к нарушению структуры и функции этих органов [Futerman А.Н. and Zimran А., 2007].

Взаимосвязь тяжести поражения костно-суставной системы с основными клиническими и лабораторными показателями отдельно проанализировали в группах спленэктомированных и неспленэктомированных больных.

Установлено, что в группе спленэктомированных больных тяжелое поражение костно-суставной системы ассоциируется с:

- гипергаммаглобулинемией (р=0,003)

- повышенным уровнем сывороточного IgM (р=0,023)

- гиперферритинемией (р=0,023, OR=6,55 (С1 95% 1,17-36,61) Ферритин является преимущественно внутриклеточным железосвязывающим

белком, депонирующим железо и освобождающим его по мере необходимости. В сыворотке крови здоровых людей содержится небольшое количество ферритина, основными источниками которого, предположительно, являются моноциты крови и макрофаги печени и селезенки. В физиологических условиях уровень сывороточного ферритина отражает запасы железа в организме: снижение сывороточного ферритина < 40 мкг/л характерно для истинного железодефицига, повышение сывороточного ферритина > 1 ООО мкг/л - для первичных и вторичных гемохроматозов. При наличии

очага воспаления или опухолевого роста повышение уровня сывороточного ферритина носит характер острофазного ответа и отражает характер и степень активности воспалительного ответа организма на тот или иной активирующий стимул. Соответственно, уровень сывороточного ферритина может рассматриваться как информативный биомаркер БГ [Deegan P.B. et al., 2005; Hughes D. et al., 2007; Stein P. et al., 2010; Stimemann J. et al., 2010].

Проведенный анализ показал, что в группе неспленэктомированных больных тяжелое поражение костно-суставной системы чаще встречалось у больных с анемией (р=0,026, (OR=8,46 (С1 95% 0,97-73,63). Однако, учитывая широкий доверительный интервал, необходимы дальнейшие исследования на больших выборках больных. По данным А. Khan et al., анемия достоверно чаще встречалась у больных с асептическими некрозами [Khan А. et al, 2012].

Проведенный нами статистический анализ не выявил связи между тяжестью поражения костно-суставной системы и остаточным уровнем активности кислой ß-глюкозидазы в лейкоцитах крови, что согласуется с данными предшествующих клинических исследований [Goker-Alpan О. et al, 2005; Futerman А.Н. and Zimran A., 2007].

Анализ молекулярно-генетнческга факторов, ассоциированных с поражением костно-суставной системы

Молекулярно-генетические исследования включали: молекулярно-генетический анализ мутаций гена ГЦБ; генов системы свертывания крови и анализ мутаций гена COLI AI.

Для молекулярно-генетического анализа 4 мутаций гена ГЦБ был использован скрининговый метод — аллель-специфическая ПЦР в реальном времени. Данный метод позволил идентифицировать 2 мутантных аллеля у 39 (39%) больных. Были выявлены следующие генотипы: N370S/L444P — у 19 больных, N370S/N370S — у 17 больных, N370S/1VS2+1 - у 2 больных, L444P/84GG - у 1 больного.

У 57 больных идентифицировали только 1 мутантный аллель: Ш708/другая мутация — у 55 больных, Ь444Р/другая мутация - у 2 больных.

У 4 больных не обнаружили ни одной из 4 исследованных мутаций гена ГЦБ.

Таким образом, результаты проведенных молекулярно-генетических исследований показали, что:

- 93 из 100 исследованных больных имеют мутацию N370S;

- 55 из 100 исследованных больных имеют генотип Ш708/другая мутация, где второй аллель представлен мутацией, не входящей в число 4 наиболее частых мутаций гена ГЦБ.

По данным литературы, N370S является наиболее частой мутацией гена ГЦБ и встречается у 93% евреев ашкенази, у 76% пациентов с БГ в Чехии и Словакии, у 71% - в Венгрии, 69% - в Испании, у 62% - в Турции [Harmanci О. and Bayraktar Y., 2008]. Генотип №708/другая мутация наиболее часто встречается в Германии [Mankin H.J. et al., 2001]. По данным Т.М. Букиной, наиболее частыми мутациями у российских пациентов с БГ явились N370S, L444P и Rec Neil; в исследование были включены 55 больных с I, II и III типами БГ [Букина Т.М., 2005].

По данным ряда авторов, генотип N370S/N370S ассоциируется с более поздним дебютом заболевания и тяжелым поражением костно-суставной системы, в то время как у большинства пациентов с генотипом №708/другая мутация заболевание проявляется раньше и характеризуется преимущественным поражением селезенки, печени и цитопенией [Taddei Т.Н. et al., 2009]. Согласно данным других исследователей, генотип N370S/N370S, напротив, ассоциируется с более легким течением БГ [Zimran A. et al., 1992]. Проведенный нами статистический анализ не выявил достоверной корреляции генотипов БГ с тяжестью поражения костно-суставной системы.

Патогенез остеонекрозов при БГ недостаточно изучен. Одним из важных патогенетических механизмов может быть ишемическое повреждение костной ткани вследствие гиперкоагуляции, обусловленной патогенетическими факторами (активация макрофагальной системы, продукция цитокинов), а также сочетанным действием генетических - мутации генов системы свертывания крови, и эпигенетических факторов, например, дефицит фолиевой кислоты.

Молекулярный анализ мутаций 3 генов системы свертывания крови (мутация С677Т гена МТГФР, G20210A гена протромбина, гена фактора V Лейден) провели у 100 пациентов с БГ методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Наследственную тромбофилию выявили у 8 больных, из них у 7 больных — гомозиготную мутацию С677Т гена МТГФР; у 1 - гетерозиготную мутацию G20210A гена протромбина; у 1 - гетерозиготную мутацию Лейден гена фактора V.

Статистически достоверной взаимосвязи между идентифицированными мутациями генов системы свертывания крови и степенью тяжести поражения костно-суставной системы не выявили. Однако в группе больных с легким поражением костно-суставной системы, не имеющих остеонекрозов, наследственной тромбофилии не выявили ни в одном случае.

Причиной тромбофилии могут быть не только дефекты факторов свертывания крови, но и патология системы фибринолиза. Ген SERPINE1 (PAI-1) кодирует белок-ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1) — основной ингибитор тканевого активатора плазминогена и урокиназы. PAI-1 является быстродействующим ингибитором фибринолиза. По данным литературы повышенное содержание PAI-1 в плазме крови ассоциируется с увеличением частоты развития тромбофилических состояний и остеонекрозов [Naran N.H. et al., 2008]. Повышенный уровень PAI-1 приводит к подавлению фибринолиза путем ингибирования активатора плазминогена и ускорению образования тромба. Как результат, повышение внугрикостного венозного давления ограничивает приток крови к головке бедра и может приводить к развитию некроза.

Полиморфизм -675 4G/5G гена PAI-1 исследовали у 92 больных. Вариант 4G/4G был выявлен у 30 (33%) больных, вариант 4G/5G - у 41 (44%) больных, нормальный вариант 5G/5G — у 21 (23%) больных. Статистический анализ показал, что достоверные различия по частоте идентифицированных полиморфных вариантов гена PAI-1 у больных с различной степенью тяжести поражения костно-суставной системы в нашей группе отсутствуют.

По данным литературы, наследственная тромбофилия в общей популяции составляет 0,4 - 2,6% - для мутации Лейден фактора V; 1,7 — 2,0% - для мутации G20210A гена протромбина; 7,4 — 9,1% - для гомозиготной мутации С677Т гена МТГФР. Эти данные соответствуют частоте мутаций «тромбофилических» генов в нашей группе пациентов с болезнью Гоше: 1%, 1% и 7%, соответственно. Статистический анализ, проведенный для установления взаимосвязи степени тяжести

поражения костно-суставной системы с указанными генетическими признаками, достоверной связи не обнаружил. Однако следует отметить следующие факты:

- общая частота мутаций «тромбофилических» генов в нашей группе больных (п=100) составила 8%, это означает, что каждый 12 больной имел наследственную тромбофилию;

- гомозиготный вариант 4G/4G гена PAI-1 составил 33%, что выше, чем в общей популяции по данным литературы;

- в группе больных с легким поражением костей, т.е. без остеонекрозов, ни у одного больного не выявили мутаций «тромбофилических» генов.

Таким образом, наши данные согласуются с выводами D. Elstein и соавт. о том, что для установления закономерностей между тяжестью поражения костно-суставной системы и наличием наследственной тромбофилии необходимы дальнейшие исследования, на больших выборках больных, учитывая редкость наследственной тромбофилии в общей популяции [Elstein D. et al., 2000].

Результаты анализа литературы, посвященной изучению регуляции метаболизма костной ткани, позволили предположить, что в патогенезе тяжелого поражения костно-суставной системы при БГ могут участвовать генетические дефекты ремоделирования костной ткани, в частности, мутации гена коллагена I типа. Клиническая картина сверхтяжелого поражения костно-суставной системы при БГ имеет отчетливое сходство с клиническими проявлениями легких форм несовершенного остеогенеза. Согласно данным литературы, мутации в экзоне 17 гена COLJA1 могут обуславливать развитие легкого типа несовершенного остеогенеза (I или IV) с доминантной формой наследования, что послужило основанием для поиска указанных мутаций у 5 пациентов с БГ [Dalgleish R., 1997].

Методом прямого секвенирования по Сэнгеру был проанализирован экзон 17 гена COLI Л1 у 5 больных Гоше, в том числе у 3 - со сверхтяжелым, у 2 — с тяжелым поражением костно-суставной системы. Мутаций в данном экзоне выявлено не было. Несмотря на отрицательные результаты данного молекулярно-генетического исследования, мы полагаем, что вопрос о роли наследственных дефектов синтеза коллагена в развитии сверхтяжелого поражения костно-суставной системы при БГ нуждается в дальнейшем изучении.

Таким образом, нами проведен анализ клинических, лабораторных, радиологических и молекулярно-генетических характеристик у 100 пациентов с БГ I типа. В соответствии с особенностями клинической и радиологической картины заболевания, больные разделены на группы с легким, умеренным, тяжелым и сверхтяжелым поражением костно-суставной системы. Результаты статистического анализа полученных данных показали, что тяжелое и сверхтяжелое поражение костно-суставной системы у исследованных больных ассоциируется с наличием спленэктомии в анамнезе. Не выявлено достоверной взаимосвязи тяжести поражения костно-суставной системы с такими молекулярно-генетическими факторами, как мутации гена ГЦБ, мутации в 17 экзоне гена COLI AI, наличием наследственной тромбофилии. Вместе с тем, мы полагаем, что вопрос о роли дополнительных генетических дефектов в развитии тяжелого поражения костно-суставной системы при БГ нуждается в дальнейшем изучении с проведением статистического анализа на больших выборках больных.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ клинических, лабораторных, радиологических и молекулярно-генетических показателей у 100 взрослых пациентов с болезнью Гоше 1 типа. Разработана шкала оценки степени тяжести поражения костно-суставной системы. Установлено, что 28% больных имеют тяжелое и сверхтяжелое, 58% -умеренно тяжелое, 14% - легкое поражение костно-суставной системы.

2. Показано, что енленэктомия ассоциируется с регрессом цитопенического синдрома, но является фактором риска тяжелого поражения костно-суставной системы.

3. Молекулярно-генетический анализ 4 мутаций гена кислой ß-глюкозидазы с использованием скрипингового метода (аллель-специфическая полимеразная цепная реакция в реальном времени) позволил идентифицировать 2 мутантных аллеля у 39 (39%) больных, 1 мутантный аллель — у 57 (57%) больных. Достоверной связи между тяжестью поражения костно-суставной системы и генотипом болезни Гоше не установлено.

4. Частота наследственной тромбофилии - гетерозиготных мутаций генов протромбина и фактора V, гомозиготных мутаций генов МТГФР и РАМ,

составила 1%, 1%, 7% и 33%, соответственно, что в общей сложности составляет 42%. Достоверной взаимосвязи между тяжестью поражения костно-суставной системы и наличием указанных мутаций не выявлено. Однако у больных с легким поражением костно-суставной системы, характеризующимся отсутствием остеонекрозов, наследственной тромбофилии ни в одном случае не выявлено.

5. Показано, что у 95% нелеченых больных со сниженным уровнем гемоглобина анемия носит характер «анемии хронических заболеваний». Лабораторные признаки истинного дефицита железа выявлены лишь у 5% нелеченых больных с анемией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки тяжести поражения костно-суставной системы у взрослых пациентов с болезнью Гоше необходимо проведение рентгенографии и МРТ обеих бедренных костей, тазобедренных и коленных суставов; при наличии клинических признаков других поражений — рентгенографии и МРТ соответствующих участков костно-суставной системы.

2. При подозрении на диагноз болезни Гоше на первом этапе диагностики целесообразно проведение молекулярного анализа мутаций гена кислой глюкозидазы скрининговым методом (аллель-специфическая полимеразная цепная реакция в реальном времени). Данный метод позволяет верифицировать диагноз в 39% случаев.

3. При установленном диагнозе болезни Гоше проведение спленэктомии возможно только по абсолютным показаниям (например, травматический разрыв селезенки).

4. Назначение препаратов железа нелеченым пациентам с болезнью Гоше противопоказано, так как в 95% случаев анемия носит характер «анемии воспаления» и отражает системный воспалительный ответ на перегрузку макрофагальной системы неутилизированными липидами.

5. При необходимости проведения лечебно-диагностической спленэктомии у лиц с неясной спленомегалией и цитопенией, целесообразно исключить диагноз болезни Гоше.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лукина К.А., Февралева И.С., Сысоева Е.П., Судариков А.Б. Характеристика генотипов пациентов с болезнью Гоше I типа в РФ // Материалы XVIII Всероссийской конференции «Аналитическая надежность и диагностическая значимость лабораторной медицины», Москва, 2013, Лаборатория, 2013, № 1, с.40.

2. Лукина К.А., Сысоева Е.П., Левина А.А., Егорова М.О., Лукина Е.А. Характеристика анемии у взрослых пациентов с болезнью Гоше I типа // Материалы I Российской научно-практической конференции «Клинические и лабораторные аспекты современной гематологии», Москва, 2013, март, сЛ7.

3. Лукина К.А., Февралева И.С., Сысоева Е.П., Мамонов В.Е., Судариков А.Б., Лукина Е.А. Характеристика генотипов пациентов с болезнью Гоше I типа в Российской Федерации // Терапевтический архив, 2013, № 7, с.72-75.

4. Лукина Е.А., Мамонов В.Е., Лукина К.А., Хоменко В.А., Писецкий М.М., Яцык Г.А. Туберкулезный сакроилеит у пациента с болезнью Гоше // Терапевтический архив, 2013, № 7, с.87-89.

5. Lukina К., Bokareva М., Sysoeva Е., Chavinchak R., Mamonov V., Kulikov V., Lukina E. Clinical data of splenectomized and non-splenectomized Gaucher patients in Russia // The abstract book of the 9th International European Working Group on Gaucher Disease Meeting. 2010, P27.

6. Bokareva M., Lukina K., Levina A.. Mamukova Y., Sysoeva E., Chavinchak R., Kulikov V., Lukina E. Iron metabolism in treatment-naive Gaucher patients in Russia // The abstract book of the 9th International European Working Group on Gaucher Disease Meeting. 2010, P07.

7. Lukina K., Sysoeva E., Mamonov V., Yatsyk G., Lukina E., Sudarikov A. Inherited thrombophilia in Gaucher patients with avascular necrosis of the hip // The abstract book of the 10th International European Working Group on Gaucher Disease Meeting, 2012, p. 101.

8. Lukina K., Mamonov V., Sysoeva E., Pisetsky M., Yatsyk G., Lukina E. Severe bone involvement in Gaucher patient: tremendous results of combined treatment // The abstract book of the 10th International European Working Group on Gaucher Disease Meeting, 2012, p.82.

9. Lukina K., Fevraleva I., Mamonov V., Sysoeva E., Yatsyk G., Sudarikov A., Lukina E. Molecular factors associated with bone involvement in Gaucher patients // Haematologica, the abstract book of the 18th Congress of the European Hematology Association, 2013; 98 (I): abstr. № B1745, p. 679-680.

10. Fevraleva I., Lukina K., Sysoeva E., Lukina E., Sudarikov A. Screening method to detect most prevalent mutations in Gaucher disease // Haematologica, the abstract book of the 18th Congress of the European Hematology Association, 2013; 98 (1): abstr. № P964, p. 399.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АХЗ Анемия хронических заболеваний

БГ Болезнь Гоше

ГЦБ Глюкоцереброзидаза

ЗФТ Заместительная ферментная терапия

МРТ Магнитно-резонансная томография

МТГФР Метилентетрагидрофолатредуктаза

НТЖ Насыщение трансферрина железом

ОЖСС Общая железосвязывающая способность сыворотки

ГТЦР Полимеразная цепная реакция

IgA Иммуноглобулин А

IgG Иммуноглобулин G

IgM Иммуноглобулин М

INF-y Интерферон-гамма

PAI-1 Ингибитор активатора плазминогена 1

Отпечатано в типографии ООО «Дельта-Центр» Адрес: Москва, ул. Стромынка, д. Тел.: (495) 725-2203 E-mail: irifo@dcprmt.ru Бумага офсетная. Печ. л. 1,5

Гарнитура Times. Тираж 100 жз. Заказ № 136