Автореферат и диссертация по медицине (14.01.29) на тему:Клиническая и молекулярная оценка эффективности высокодозной химиотерапии анапластической крупноклеточной АЛК-позитивной лимфомы взрослых

На правах рукописи

Горенкова Лилия Гамилевна

Клиническая и молекулярная оценка эффективности высокодозной химиотерапии анапластической крупноклеточной АЛК-позитивной лимфомы

взрослых

14.00.29 — гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

16 МАЙ

005058^э

Москва — 2013

005058249

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Минздрава России

Научные руководители: к.м.н. Кравченко Сергей Кириллович

к.б.н. Мисюрин Андрей Витальевич

Официальные оппоненты:

Д.м.н., Тумян Гаяне Сепуговна, ФГБУ "Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина" РАМН, ведущий научный сотрудник отделения химиотерапии гемобластозов.

Д.м.н., профессор Новичкова Галина Анатольевна ФГБУ Федеральный научно-кинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева, заместитель директора по лечебной работе.

Ведущее научное учреждение: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П. А. Герцена" Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «22» мая 2013 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Минздрава России по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Гематологического научного центра Минздрава России

Автореферат разослан «_»_2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Зыбунова Е.Е.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AKKJI - анапластическая крупноклеточная лимфома AJIK (ALK) - киназа анапластических лимфом

AKKJI AJIK+ - анапластическая крупноклеточная AJIK-позитивная лимфома МДБ - минимальная диссеминированная болезнь МРБ - минимальная резидуальная болезнь

BFM - интернациональная исследовательская группа Берлин-Франкфурт-Мюнстер

ECOG - Восточная Кооперативная Онкологическая Группа (Eastern Cooperative Oncology Group)

EMA - эпителиальный мембранный антиген

FISH - флюоресцентная гибридизация in situ

GELA - Groupe d'Etude des Lymphomes de l'Adulte

(Группа по Изучению Лимфом Взрослых)

JAK - Janus Kinase

NPM - nucleophosmin

RQ-PCR - количественная полимеразная цепная реакция TCR - Т-клеточный рецептор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Анапластическая крупноклеточная AJlK-позитивная лимфома составляет от 15 до 30% всех неходжкинских лимфом у детей, и, всего лишь, 5% у взрослых пациентов. Вследствие редкой встречаемости заболевания до настоящего времени не разработаны единые протоколы лечения, не выделены достоверные значимые факторы прогноза, и, соответственно, дифференцированный подход к лечению взрослых пациентов.

Наиболее часто в лечении AKKJI АЛК-позитивной лимфомы взрослых применяют химиотерапию СНОР-21. Эффективность ПХТ не высока: удается достичь полной клинико-гематологической ремиссии в среднем у 60% больных, 5-летняя общая выживаемость составляет 40-50%. Программа СНОР-21 наиболее эффективна при I стадии после хирургического удаления опухолевого очага (обычно - 1 - 4 лимфоузла одного региона) и II стадии заболевания (по Ann Arbor). Недостаточную эффективность режимов СНОР-21 подтверждают исследования Семеновой A.A. с соавт. (2008г.): полные ремиссии получены у 40% больных (64% с 1-Й стадией заболевания, 24% - с III-IV стадией). У 50% с продвинутыми стадиями развились ранние рецидивы заболевания.

В связи с недостаточной эффективностью химиотерапии по программам СНОР-21, особенно в распространенных стадиях заболевания предпринимаются попытки улучшить результаты лечения путем интенсификации химиотерапевтического воздействия. Fanin R, Sperotto А, Silvestri F et al, 1999 г. применили химиотерапию по программе F-MACHOP с последующей лучевой терапией (полная ремиссия была достигнута у 80% больных, 5-летняя общая выживаемость составляла 70%); программе СНОР-21 с последующей трансплантацией аутологичных стволовых гемопоэтических клеток - полная ремиссия была достигнута у 69% пациентов, 5-летняя общая выживаемость составила 70%. Применяли также высокодозную терапию по программе LNH-87 (высокие дозы метотрексата), эффективность которой составила до 68-82% полных ремиссий с 5-летней общей выживаемостью 60-78 %.

В педиатрической практике группа немецких авторов (BerlinFrankfurt-Munster) путем интенсификации терапии короткими импульсными курсами с большим количеством циклоспецифичных цитостатических препаратов создала протокол (NHL BFM) для лечения агрессивных лимфом детского возраста, в том числе АККЛ. Общая 5-летняя выживаемость детей с АККЛ АЛК+ III-IV стадии с наличием факторов неблагоприятного прогноза составляет 75-80%, а рецидивы (в основном ранние) развиваются в 20% случаев. Прогностически неблагоприятным считают поражения кожи, подкожной клетчатки, яичек, костного мозга, центральной нервной системы (ЦНС). У детей трансплантацию аутологичных стволовых клеток крови применяют в качестве терапии второй линии в рецидиве, либо при

рефрактерности заболевания, что позволяет у части больных достичь длительной полной ремиссии.

Основываясь на успехах лечения детей по программе NHL BFM-90, есть основания применить протокол немецких авторов в лечении взрослых пациентов. Также, требуется дальнейший поиск дифференциации подходов к лечению, так как выделение неблагоприятных форм заболевания для определения групп высокого риска развития рецидива или прогрессии болезни только по клиническим фактором прогноза (B-симптомы, стадия заболевания, экстранодальная локализация) в настоящее время является недостаточным.

Интересным является тот факт, что у детей в периферической крови и/или аспирате костного мозга удалось обнаружить присутствие химерных транскриптов, образуемых в результате специфических транслокаций, при отсутствии гистологических признаков поражения костного мозга. Для детекции был использован метод полимеразной цепной реакции в реальном времени. Данное открытие, возможно, позволит определить молекулярные критерии риска развития рецидива. Так, например, наличие данного транскрипта в костном мозге и/или крови на момент установления диагноза у детей увеличивает риск развития рецидива на 50%.

Таким образом, обнаружение минимальной диссеминированной болезни (минимальная детекция специфического химерного транскрипта в образцах периферической крови и/или костного мозга методом ПЦР в реальном времени при отсутствии лабораторных изменений и гистологического поражения костного мозга) и мониторинг минимальной резидуальной болезни при помощи полимеразной цепной реакции количественным методом, позволит идентифицировать пациентов с высокой вероятностью развития рецидива и имеет большую прогностическую ценность, определяя новый критерий ремиссии. Цель исследования

Определение эффективности и безопасности высокодозной терапии анапластической крупноклеточной AJlK-позитивной лимфомы у больных старше 18 лет по протоколу NHL BFM-90; детекция и мониторинг минимальной резидуальной болезни иммуногистохимическим методом и методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Задачи

1) Выделить клинические и молекулярные факторы неблагоприятного прогноза.

2) Определить эффективность и токсичность терапии по программе NHL BFM-90.

3) Оценить результаты детекции минимальной диссеминированной болезни с использованием иммуногистохимического метода и полимеразной цепной реакции в реальном времени.

4) Определить возможность осуществления мониторинга минимальной резидуальной болезни методом количественной оценки химерных продуктов AJ1K.

Новизна исследования

Впервые применен протокол NHL BFM-90 в лечении взрослых пациентов с анапластической Т-крупноклеточной АЛК-позитивной лимфомой.

Разработана методика определения минимальной диссеминированной болезни с детекцией химерного гена NPM-ALK и других редких химерных генов, образуемых в результате вариантных транслокаций.

В случае обнаружения химерных транскриптов в костном мозге и/или периферической крови произведен мониторинг минимальной резидуальной болезни для выявления прогностически неблагоприятной группы пациентов.

Оценена роль иммуногистохимического метода выявления минимального поражения костного мозга в дебюте заболевания на парафиновых блоках с использованием антител к CD30 и ALK.

Произведена оценка токсичности проводимого протокола в зависимости от дозы метотрексата в лечении взрослых пациентов. Научно-практическая ценность работы

Разработаны методы количественной оценки экспрессии химерных транскриптов (NPM-ALK, ATIC-ALK, TPM4-ALK, TPM3-ALK, CTCL-ALK, SEC31A-ALK, MYH9-ALK, MSN-ALK, ALO 17-ALK) с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Показана целесообразность использования показателей экспрессии химерных транскриптов ALK для выявления минимального диссеминированного поражения с последующим мониторингом минимальной резидуальной болезни у больных AKKJI AJ1K+.

Разработан алгоритм мониторинга минимальной резидуальной болезни.

Оценены результаты иммуногистохимического метода определения минимальной диссеминированной болезни.

Определена высокая эффективность протокола NHL BFM-90 в лечении

взрослых пациентов.

Проанализирована токсичность программы NHL BFM-90 у пациентов старше 18 лет.

Положения, выносимые на защиту

1. Применение протокола NHL BFM-90 показало высокую эффективность в лечении взрослых пациентов с анапластической крупноклеточной АЛК-позитивной лимфомой: полные ремиссии достигнуты у 96% больных, 5-летняя общая и бессобытийная выживаемость составила 90±6% и 78±21: соответственно.

2. Использование методики ПЦР в реальном времени на наличие химерных транскриптов с целью детекции минимальной

диссеминированной болезни позволяет существенно увеличить возможность выявления поражения костного мозга в сравнении со стандартными методами исследования (57,1% против 8%).

3. Наличие минимальной резидуальной болезни после завершения лечения является крайне неблагоприятным фактором риска развития рецидива.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, 8 в журналах рекомендованных ВАК.

Апробация работы. Основные положения диссертации использовались в лекциях для клинических ординаторов и практических врачей, проходивших стажировку в ГНЦ, результаты работы доложены на Гематологическом декаднике (Москва 2009-2012 гг.), III форуме медицины и красоты (2010 г), съезде гематологов России (2012 г), международных конференциях: American Society of Hematology (Сан-Диего, декабрь 10-13, 2011).

Апробация диссертации состоялась на проблемной комиссии ФГБУ ГНЦ Минздрава России "Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)" 8 октября 2012 г. (Протокол №6).

Объем и структура диссертации: диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав собственных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 4 отечественных и 191 иностранных источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами, 23 рисунками.

Диссертация выполнена в научно-клиническом отделении химиотерапии и интенсивной терапии гематологических заболеваний (заведующий отделением к.м.н., доцент Кравченко С.К.) ФГБУ ГНЦ Минздрава России (директор - академик Савченко В.Г.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Из 291 больных с нодальными Т-клеточными лимфомами, наблюдавшихся в научно-клиническом отделении химиотерапии и интенсивной терапии гематологических заболеваний ФГБУ ГНЦ МСРЗ РФ с 2000 по 2012 год у 8,6% (25 больных) пациентов установлен диагноз AKKJI AJIK+. Возраст больных от 17 до 65 лет (медиана возраста 31 год), из них 16 мужчин и 9 женщин.

Молекулярный анализ на выявление минимальной диссеминированной болезни, которую определяли по наличию химерных транскриптов в образцах крови и/или костного мозга проведен у 21/25 (84%) пациентов. Определение МДБ иммуногистохимическим методом выполнено на 40 парафиновых блоках трепанобиоптатов (24 пациента).

У всех 25 пациентов включенных в исследование оценена эффективность и токсичность программы NHL-BFM-90. Общая характеристика больных представлена в таблице 2.

Молекулярно-генетическое исследование.

Молекулярное исследование выполнено на 64 биологических образцах, взятых у 21 пациента с диагнозом АККЛ АЛК+ (в этой группе исследовались образцы периферической крови и костного мозга), а также на 23 парафиновых блоках лимфоузлов или другого опухолевого субстрата (кожа, мягкие ткани и др) и 2 нативных материалов лимфоузлов.

С целью формирования группы контроля проводилось молекулярное исследование у пациентов с другими заболеваниями: анапластическая крупноклеточная АЛК-негативная лимфома (3 пациента), кожная анапластическая Т-крупноклеточная лимфома (1 пациент), фолликулярная лимфома (2 пациента), лимфогранулематоз (1 пациент), болезнь Сезари (1 пациент), диффузная В-крупноклеточная лимфома с Т-клеточным микроокружением (1 пациент). Также, были получены лимфоциты крови от 11 здоровых добровольцев в возрасте от 19 до 50 лет (медиана 27 лет), популяция лимфоцитов из 2 образцов доноров костного мозга.

Для всех пациентов и доноров определялся уровень экспрессии мРНК генов NPM-ALK, ATIC-ALK, TPM4-ALK, TPM3-ALK, CTCL-ALK, SEC3IA-ALK, MYH9-ALK, MSN-ALK, AL017-ALK.

Уровень экспрессии генов определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Выделение РНК из крови или костного мозга. Выделение РНК проводилось гуанидин-тиоционат хлороформ-фенольным методом из периферической крови и костного мозга больных АККЛ АЛК+. Кровь бралась объемом 10-15 мл, костный мозг - объемом до 5мл минимально, в качестве консерванта использовали 6% раствор динатриевой соли ЭДТА. Клинический материал помещали в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл, добавляли гемолизирующий раствор (0,84% раствор хлорида аммония) до 50 мл, смешивали перевертыванием и оставляли на 15-20 минут при +4°С для лизиза эритроцитов. Нелизированные ядерные клетки осаждали на центрифуге со скоростью 1500 об/минуту 15 минут при +4°С. Супернатант удаляли, к осадку клеток добавляли 1 мл гемолизирующего раствора, ресуспендировали и переносили в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл. Выдерживали 5 минут, затем центрифугировали 15 секунд со скоростью 13000 об/минуту при +4°С. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 500 мкл буфера STE. Центрифугировали 15 секунд со скоростью 13000 об/минуту, удаляли супернатант. Осадок ядерных клеток лизировали в 500 мкл гуанидин-тиоционатного буфера, для улучшения процедуры лизиса и

фрагментации ДНК раствор пропускали 5-10 раз через иглу шприца объемом 2 мл до того момента, пока раствор не становился менее вязким и более гомогенным. К лизированному образцу (при необходимости предварительно размороженному) добавляли 500 мкл раствора фенола для РНК, 125 мкл 2М ацетата натрия (pH 4,5), 250 мкл хлороформа. Интенсивно перемешивали на вортексе до получения однородного раствора молочно-белого цвета, выдерживали 5 минут при комнатной температуре, центрифугировали 12 минут со скоростью 13000 об/минуту при +4°С. Верхнюю водную фазу, содержащую РНК, аккуратно переносили в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Добавляли 500 мкл изопропилового спирта, оставляли минимум на 1 час при температуре -70°С. Размораживали содержимое пробирки при комнатной температуре, центрифугировали 15 минут со скоростью 13000 об/минуту при+4°С. Осадок РНК дважды промывали 80% этанолом, затем спирт удаляли, осадок высушивали в течение 5-10 минут при комнатной температуре.

Реакция обратной транскрипции. При реакции обратной транскрипции к раствору РНК 1 мкг добавляли 6 мкл гексамеров (концентрация 50 нМ) и проводили отжиг 30 сек. при 95°С с последующим быстрым охлаждением. Далее добавляли реакционную смесь 14 мкл, содержащую 75 гпМ KCl, 50 mM Трис, 10 гпМ DTT, 3 мМ MgC12, 1 mM каждого дезоксирибонуклеотида, 20 ед. рназина-ингибитора РНКаз, 100 ед. обратной транскриптазы M-MLV и инкубировали в течение 1-1,5 часов при 37°С.

Реакция ПЦР в реальном времени. Для проведения ПЦР в реальном времени использовался прибор AB 7500 (Applied Biosystems ,США). Прибор для проведения ПЦР в реальном времени состоит из амплификатора, блока анализа флуоресценции и компьютерного блока со специальным программным обеспечением, с помощью которого можно проанализировать полученный результат и выразить количество определяемого транскрипта, как в абсолютном количестве молекул, так и по отношению к уровню экспрессии контрольного гена.

TaqMan ПЦР основана на 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. ДНК-зонд, имеющий флуоресцентный краситель на 5'-конце и гаситель флуоресценции на 3'-конце, комплементарен участку амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу. При отжиге зонд количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до зонда начинает расщеплять его за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может быть детектировано. Увеличение флуоресценции будет прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта. Количество ПЦР-продукта увеличивается с каждым циклом реакции вдвое, поэтому зависимость количества продукта ПЦР от количества циклов выражается экспонентой.

Наклон стандартной кривой теоретически должен быть равен -3,3, что соответствует эффективности амплификации 100%, тем не менее, наклон в интервале от -3,0 до -3,9 является приемлемым, так же как и коэффициент корреляции >0,95. Для коррекции стандартной кривой из анализа исключали точки (дубликаты) с большой разницей Ct в каждой тройке образцов. Для каждой тройки образцов рассчитывалась средняя концентрация. Разница Ct не более чем в 1 цикл была допустима в каждой тройке повторов на ранних циклах (до 30). Допускалась разница Ct до 1,5 на более поздних циклах. Если значение Ct одного из повторов значительно отличалось от других, этот повтор исключался из анализа. Контрольным геном выбран ABL, т.к. он определяется во всех тканях организма на примерно одинаковом уровне.

Образцы, в которых экспрессия гена ABL оказывалась меньше, чем 10 копий, исключалась для анализа, как имеющие неудовлетворительное количество к-ДНК. Для проведения амплификации были синтезированы оригинальные пары праймеров с местами посадки в разных экзонах генов NPM, ALK, ATIC, ТРМЗ, ТРМ4, MYH9, CLTC, AL017, SEC31A, MSN.

Использовалась программа Vector NTI 10.1.1 (Invitrogen Corporation), с помощью которой были анализированы и подобраны праймеры.

Размеры ПЦР фрагмента, который содержит точки разрыва химерного продукта составляли:

TPM4-ALK - 107 нуклеотидов TPM3-ALK- 108 нуклеотидов AL017-ALK- 95 нуклеотидов MSN-ALK - 79 нуклеотидов MYH9-ALK - 85 нуклеотидов SEC31A-ALK - 118 нуклеотидов CLTC-ALK - 171 нуклеотидов NPM-ALK - 97 нуклеотидов ATIC-ALK - 97 нуклеотидов.

Для информация о точках разрыва использовались следующие литературные источники: Laurence Lamant et al. A New Fusion Gene TPM3-ALK in Anaplastic Large Cell Lymphoma Created by a (I;2)(q25;p23) Translocation, Brigitte Maes et al. The NPM-ALK and the ATIC-ALK Fusion Genes Can Be Detected in Non-Neoplastic Cells, Xiayuan Liang et al. Assessment of t(2;5)(p23;q35) Translocation and Variants in Pediatric ALK+ Anaplastic Large Cell Lymphoma, Katrien Van Roosbroeck et al. ALK-positive large B-cell lymphomas with cryptic SEC31A-ALK and NPM 1-ALK fusions, Laurence Lamant et al. Non-Muscle Myosin Heavy Chain (MYH9): A New Partner Fused to ALK in Anaplastic Large Cell Lymphoma; Jan Cools et al. Identification of Novel Fusion Parneprtnersof ALK, the Anaplastic Lymphoma Kinase, in Anaplastic Large-Cell Lymphoma and Inflammatory Myofibroblastic Tumor.

Последовательности генов и мРНК нами были взяты из базы данных Genbank, номера доступа были следующие для каждого гена:

1) ген ALK - NC 000002.11, mPHK-NM_004304

2) ген A TIC - NG_013002.1 RefSeqGene, мРНК - NM_004044.6

3) ген NPM - NG 016018.1 RefSeqGene, мРНК - NM_199185.3 (v2), NM 002520.6 (vl), NM 001037738.2 (v3)

4) ген CTLC - NC_000017.10 Reference GRh37.p9 Primary Assembly, АС 000149.1 Alternate huRef, мРНК - NM_004859.3

5) ген SEC31A - NG_029569.1 RefSeqGene, мРНК - NM 001077207.2 (vl), NM_016211.3 (v2), NM 001077208.2 (v3), NM_001077206.2 (v4), NM_001191049.1 (v5)

6) ген MYH9 - NC 000022.10 Reference GRh37.p9 Primary Assembly, АС 000154.1 Alternate huRef, мРНК - NM_002473.4

7) ген MW-NG_012516.1 RefSeqGene, мРНК - NM 002444.2

8) ген AL017 - NG_031980.1 RefSeqGene, мРНК - NM_001256071.1 (v3), NM_020954.3 (v2)

9) TPM4-ALK - мРНК - AF 186110.1 (vl), AF 310722.1 (v2), AF 186109.1 (v3), AF 362887.1 (v4), AF 362886.1 (v5)

10)TPM3-ALK-mPHK-AF 112866.1.

Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов представлены ниже. Праймеры:

NPMf GGGCCAGTGCATATTAGTGGA ALKr TGTACTCAGGGCTCTGCAGCT ATICf CTGTAC ACACTGC AGCCC AAG M YH9f AAGAACCGGGACGAAGCCAT MSNf A AGG AGAGTGAGGCTGTGGA AL017 GATGTGTGGGAACGTGAAAC CLTCf TCATCCAGGTCATGAAGGAG SEC31 Af GGAACAACAGGTACACTGCC TPM3f AGAGATCGGTAGCCAAGCTG TPM4f GAG A ACGGTTGC A AA ACTGG

Зонды:

Зонд для NPM-ALK (N/A probe)

F AM - AGCACTTAGTAGTGTACCGCCGGAAGCACC- BHQ1 Зонд для ATIC-ALK (А/A probe) FAM - CCATCACAGTGTA CCGCCGGAAGC- BHQ1 Зонд для MYH9/A probe

R6G - AGCTGCAGGTCCTGCAAGCCATGCA - BHQ1 Зонд для MSN/A probe

R6G - CAGCAGAAGCAGGAGCTGCAAGCCA- BHQ1 Зонд для ALO 17-ALK

R6G - ACAAGTGTACCGCCGGAAGCACCAG- BHQ1 Зонд для CLTC/A probe

R6G - CACAACCCATTGTTTATGTGTACCGCCG - BHQ1 Зонд для SEC31A/A probe

R6G - CGTCCCAAAGAACAGTGTACCGCCG - BHQ1 Зонд для TPM3-4/A probe

R6G - CAATTGATGACCTGGAAGTGTACCGCCG - BHQ1 Условия для проведения циклов количественной реакции ПЦР были следующие: 95°С — 10 мин, затем 50 циклов: 95°С — 15 сек, 60°С — 60 сек. Для каждого образца ПЦР-реакция проводилась одновременно в трех лунках (трипликаты). Соотношение матрицы и реагентов было следующим: 5 мкл кДНК и 20 мкл реакционной смеси.

Состав реакционной смеси на 1 пробу: Н20 4,3 мкл, буфер 12,5 мкл, праймер №1 (ALK) 1 мкл, праймер №2 (NPM или другие партнерные гены) 1 мкл, зонд 1 мкл, Taq pol 0,2 мкл.

Количественную оценку уровня экспрессии химерных онкогенов осуществляли с использованием разведений плазмид со вставками соответствующих фрагментов химерных ALK-содержащих генов. Фрагменты генов NPM1-ALK и ATIC-ALK были получены при помощи ОТ ПЦР с использованием РНК положительных по экспрессии этих генов

образцов больных. Фрагменты генов CLTC-ALK, SEC31A-ALK, MSN-ALK, MYH9-ALK, AL017-ALK, TMP3-ALK, TMP4-ALK были синтезированы искусственно при помощи фосфоамидитного твердофазного метода синтеза ДНК на автоматическом синтезаторе Клонирование фрагментов генов осуществлялось с использованием вектора pGEM®-T Easy (Promega) по стандартной методике производителя. Для очистки полученных плазмид, содержащих вставку соответствующего гена, использовали набор Wizard* Plus SV Minipreps DNA Purification System того же производителя. Очищенные плазмиды были линеаризованы, измерена их концентрация на спектрофотометре, рассчитано число копий в мкл раствора. Последовательность вставок фрагментов генов, содержащихся в плазмидах, была подтверждена секвенированием. Плазмиды разводились в буфере ТЕ (TrisHCI ЮмМ, EDTA 1мМ, pH 8,0) до необходимых концентраций и использовались в качестве положительных контролей. Для определения уровня экспрессии ALK-позитивных генов использовали серии разведений контрольных плазмид с концентрациями 10б, 105, 104, 103 и 102, для оценки уровня экспрессии гена ABL использовались контрольные плазмиды с концентрациями 10б, 105, 104.

Компоненты реакционной смеси и температурный профиль ПЦР в реальном времени были подобраны таким образом, чтобы контрольный образец, содержащий 3 копии плазмиды с соответствующей вставкой в 5 мкл, воспроизводимо приводил к положительному результату ПЦР не менее чем в 5 повторах из 10. Оценку относительного уровня экспрессии ALK-содержащих генов проводили с использованием соотношения (число копий X-ALK/число копий ABL)* 100%, где X - NPM1, ATIC, CLTC, SEC31A, MSN, MYH9, AL017, ТРМЗ, ТРМ4. Чувствительность определения относительного уровня экспрессии ALK-содержащих генов во всех случаях была не менее 0,0032%.

Иммуиогистохилшческий метод.

Иммуногистохимическое исследование с помощью иммунопероксидазного метода проводилось на срезах парафиновых блоков толщиной 3-4 мкм.

После депарафинизации и обезвоживания в целях блокирования эндогенной пероксидазы срезы обрабатывали 0,3% Н2О2 в течение 20 мин, промывали в дистиллированной воде и с целью демаскировки антигенных детерминант подвергали температурной обработке в буферах с рН=6,0 (Target Retrievel solution, DAKO) на"водяной бане" в течение 30 мин при температуре 98°С. После отмывания в TBS 3 раза по 5 мин наносились первичные мышиные антитела (CD30 и CD246). Инкубацию с первичными антителами проводили во влажной камере в течение 30-60 мин (в зависимости от маркеров -цитоплазматических, мембранных или ядерных) при комнатной температуре. После инкубации с первичными антителами срезы промывали в TBS 3 раза по 5 мин, затем на 30 мин при комнатной температуре наносился авидин-

биотиновый комплекс, конъюгированный с пероксидазой, с использованием полимеразной высокочувствительной системы детекции.

Полихимиотерапия больных. Все 25 пациентов, включенных в исследование, получили лечение по протоколу с мая 2003 по май 2012 гг.

Протокол представлен тремя ветвями (Kl, К2, КЗ) лечения, выбор которых зависит от стадии заболевания и/или наличия факторов неблагоприятного прогноза. Трансплантация аутологичных стволовых клеток крови выполнялась после 6 курсов химиотерапии у больных с III-IV стадиями заболевания и наличием факторов неблагоприятного прогноза (поражение костного мозга, экстранодальных областей - кожи, подкожной клетчатки, яичек). Режимом кондиционирования был выбран BEAM.

Оценка эффективности терапии проводилась согласно критериям Международной Рабочей Группы (International Working Group (IWG)) 2007 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты терапии по протоколу NHL-BFM-90.

Эффективность. При проведении обследования 25 пациентов по протоколу для анапластической крупноклеточной АЛК-позитивной лимфомы у взрослых получены следующие результаты: отмечено преобладание генерализованных форм заболевания: II стадия диагностирована у 6 пациентов (24%), III-IV стадии - у 19 пациентов (76%). У всех пациентов были вовлечены в основной процесс лимфоузлы, у 13 (52%) наблюдалось поражение селезенки и печени, у 8 (32%) - поражение органов средостения, изолированное поражение легких наблюдалось у 4 пациентов (16%). Перечень и частота поражения экстранодальных областей распределилось следующим образом: поражение мягких тканей в 24% случаев (6 пациентов), кожи в 16% (4 пациента), органов желудочно-кишечного тракта в 8% (2 пациента). Поражение костного мозга стандартными гистологическими исследованиями было выявлено у 2 пациентов (8%).

Полная ремиссия достигнута у 24 (96%) пациентов с диагнозом АККЛ АЛК+. В одном случае (4%) не была получена полная ремиссия. Больная поступила в ГНЦ с двусторонней пневмонией и умерла во время проведения предфазы вследствии прогрессирования пневмонии и острой дыхательной недостаточности. Первично резистентных больных к проводимому лечению зарегистрировано не было.

Рецидивы констатированы у 3 (12%) пациентов: в двух случаях зарегистрирован ранний и у 1 пациента - поздний рецидив через 3,5 года от момента завершения терапии. Один пациент умер во время проведения противорецидивной терапии от прогрессирующего течения заболевания, у 2 пациентов получена вторая полная ремиссия.

5-летняя общая выживаемость при АККЛ равна 90%, 5-летняя бессобытийная выживаемость 78% (рис. 1,2).

100%

Я

ь

о

5 75%

го m

_Q * 50%

m

к

го 25%

ю

О

О 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Время от начала лечения (мес.)

Рисунок 1. Общая выживаемость больных с АККЛ АЛК+

75%

50%

25%

пр. NHL BFM-90

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Время от начала лечения (мес.)

Рисунок 2. Бессобытийная выживаемость больных С АККЛ АЛК+ Токсичность протокола NHL BFM-90.

Все курсы ПХТ (блоки АА, Аа, ВВ, Вв, С) сопровождались развитием миелотоксического агранулоцитоза, средний период которого составил 3 дня (от 1 до 14 дней) после блока А, 0,9-3,5 дней (от 1 до 18 дней) после блока В и 3,6 дней (от 1 до 7 дней) после блока С. В 64% случаев после 2 блока Аа (что, как правило, является 4 курсом лечения) миелотоксический агранулоцитоз зафиксирован не был.

Стоит отметить, что наибольшая гематологическая токсичность наблюдалась после 6 курса ПХТ (блок С), что вероятно связано с предществующим проведением не менее 5 курсов химиотерапии, а также высокими дозами цитозара, и в ряде случаев осуществлением сбора стволовых клеток крови, и как следствие, отсутствие стимуляции гранулоцитопоэза до самостоятельного минимального снижения количества лейкоцитов. Также, отмечено, что использование высоких доз метотрексата в блоках АА и ВВ не сопровождалось развитием тяжелой нефротоксичности (повышение уровня креатинина более 5 норм, олиго- или анурия),

требующей проведения гемодиализа, а разница в частоте выявления повышенного уровня креатинина среди пациентов, получающих лечение по ветви КЗ или по ветви К2 была статистически незначима (у 12% пациентов в блоках АА и ВВ и у 8% пациентов в блоках Аа и Вв). Введение высоких доз цитозара (блок С) в 28% случаев сопровождалось повышением уровня печеночных ферментов до 2,5-5 значений верхней границы нормы, а развитие острой печеночной недостаточности с значительным повышением уровня общего билирубина более 3 значений верхней границы нормы, не отмечено ни в одном случае. Из 25 больных - у 5 вирусные гепатиты до начала лечения: в 3 случаях гепатит С, в 2- гепатит В. Только в одном случае (гепатит С) отмечено повышение уровня ACT, AJ1T 3-4 ст, и общего билирубина 1-2 ст после 1 курса блока Аа. Наиболее частыми инфекционными осложнениями, развившимися после ПХТ были стоматит и некротическая энтеропатия (в 45,7% и 25,7% соответственно). Оценивая, частоту выявления стоматита и некротической энтеропатии в зависимости от дозы метотрексата, выявлено, что при применении последнего в дозе 5 г/м2 частота развития стоматита была несколько ниже, чем при введении метотрексата в дозе 1 г/м2 (12% и 4% против 24% и 25% соответственно). Сепсис чаще констатировали после блока С (16% случаев). Герпетические инфекции (появление везикулезных высыпаний на губах, обнаружение ДНК герпес вируса простого типа или цитомегаловируса в крови) одинаково часто выявлялись после любых курсов химиотерапии. Кожно-геморрагические осложнения (носовые, десневые, меноррагии, петехеи, экхимозы) наблюдались в 30% случаев и требовали проведения заместительной трансфузионной терапии тромбоконцентратом. Наибольшая потребность в трансфузии тромбоконцентрата отмечалась после блока С (в 52% случаев выявлялась глубокая тромбоцитопения), в среднем 16 доз (после блока А — 10 доз, после блока В — 4 дозы).

Результаты иммуногистохимического исследования. Оценка минимальной диссеминированной болезни иммуногистохимическим методом в нашем исследовании проводилась на срезах парафиновых блоков 40 трепанобиоптатов у 24 пациентов. Для детекции МДБ использовалось окрашивание срезов с использованием антител к AJ1K (Dako) и CD30 (Dako). За наличие минимального поражения костного мозга принималось обнаружение более одной клетки, коэкспрессирующей AJTK и CD30, так как экспрессия CD30 в норме отмечается и на активированных клетках. Специфической экспрессией CD30 считалось мембранное, цитоплазматическое окрашивание и "dot-like" реакция в области аппарата Гольджи. Внутренний позитивный контроль - плазматические клетки (рис. За). Антитела к AJIK протеину давали ядерное и/или ядерно-цитоплазматическое окрашивание (рис. 36). Использовался "внешний позитивный" контроль.

Рисунок 3. а) характерная "dot-like" экспрессия CD30 с детекцией 1-2 опухолевых клеток в трепанобиоптате (увеличение 40); б) ядерно-цитоплазматическая экспрессия AJ1K в опухолевой клетке в костном мозге (увеличение 40).

При иммуногистохимическом исследовании поражение костного мозга идентифицировано у 4-х пациентов с генерализованной формой заболевания, у двух из них вовлечение костного мозга установлено морфологически.

Детекция минимальной диссемиинированной болезни и мониторинг минимальной резидуальной болезни.

Как уже отмечалось, в работе по определению минимальной диссеминированной болезни исследовались 64 биологических образца (периферическая кровь и/или костный мозг), взятых у 21 больного. Всем пациентам проведено лечение по унифицированной программе NHL BFM-90. Изначально биологические образцы от каждого больного исследовались в дебюте заболевания до начала специфического лечения. В случае обнаружения одного из химерных транскриптов в крови и/или костном мозге проводился мониторинг минимальной резидуальной болезни (МРБ) методом количественной ПЦР в реальном времени на следующих этапах: после 2 курса XT, после 6 курса XT, после выполнения трансплантации аутологичных стволовых клеток крови, каждые 3 месяца в первые 1,5 года наблюдения и раз в полгода в последующие 3,5 года. Таким образом, из 21 больного детекция МРБ удалось выполнить 14 пациентам (у остальных -отсутствовал материал), из которых у 8 выявлено минимальное диссеминированное поражение костного мозга (МДБ).

Таблица 1.

Результаты мониторинга МРБ у больных AKKJI AJIK+

№ пациента материал Химерный ген Относительный уровень экспрессии (ген/АВЬх100%) до лечения После 2 курса ХТ После 6 курса ХТ Период наблюдения (от 10 до 28 мес)

Пациент №1 кровь NPM-ALK 0,03% 0% 0% 0%

Пациент №2 кровь ATIC-ALK 7,43% 0,01% 0% 0%

к/м 11,03% 0,01% 0%

Пациент №3 кровь NPM-ALK 20,88% 0,33% 0% 0%

к/м 24,03% 1,23% 0%

Пациент №4 кровь NPM-ALK Отсутствовал материал Отсутствовал материал Отсутствовал материал 1,12%

Пациент №5 кровь ATIC-ALK 0,46% - - -

Пациент №6 к/м MSN-ALK 0,83% 0% 0% 0%

Пациент №7 к/м TPM4-ALK 6,16% - - -

Пациент №8 кровь MSN-ALK 4,51% - - -

Выявление МДБ в костном мозге проводилось с целью обнаружения всех известных химерных генов, образуемых в результате специфических для данного заболевания транслокаций: NPM-ALK, ATIC-ALK, TPM4-ALK, ТРМЗ-ALK, CTCL-ALK, SEC31A-ALK, MYH9-ALK, MSN-ALK, AL017-ALK.

Таким образом, у 3 пациентов был выявлен транскрипт NPM-ALK (один из самых часто встречающихся, образуется в результате транслокации t(2;5)(p23;q35)), у 2 - транскрипт ATIC-ALK (встречается не более, чем в 2% случаев, образуется в результате инверсии 2 хромосомы inv (2)(p23;q35)), в 2 случаях - MSN-ALK (t(2;X)(p23;ql 1-12)), в одном случае - TPM4-ALK (t(2;19)(p23;pl3).

Среднее время наблюдения составило 27±4 месяца. У всех 8 пациентов была достигнута клинико-гематологическая ремиссия при использовании протокола NHL BFM-90. Двум больным (пациент №2 и №4) с целью консолидации полученной ремиссии выполнена трансплантация аутологичных стволовых клеток крови. Выявление клинических факторов неблагоприятного прогноза отображены в таблице 2. Еще раз стоит отметить, что гистологически видимое поражение костного мозга не было обнаружено ни в одном случае.

Таблица 2. Соотношение клинических факторов неблагоприятного прогноза и результатов терапии с с выявлением химерных генов

пациенты Клинические факторы неблагоприятного прогноза и стадия МДБ МРБ после окончания лечения Исход

Пациент №1 Поражение мягких тканей, IV стадия + Полная ремиссия (срок наблюдения 33 месяца)

Пациент №2 Изолированное поражение легких, III стадия + Полная ремиссия (срок наблюдения 14 месяцев)

Пациент №3,5 Отсутствуют, IV стадия + Полная ремиссия (срок наблюдения 28,20 месяцев)

Пациент №6,8 Отсутствуют, III стадия + Полная ремиссия (срок наблюдения 6,9 месяцев)

Пациент №4 Поражение подкожной клетчатки, IV стадия + + (выявление химерного транскрипта NPM-ALK после окончания лечения) Достигнута полная ремиссия, через 21 мес- рецидив заболевания

Пациент №7 Изолированное поражение легких, III стадия + Полная ремиссия (срок наблюдения 8 месяцев)

Из представленных в таблице 2 данных видно, что после 2 курса XT (первая "точка" мониторинга) выявление транскрипта сохранялось во всех исследуемых случаях, но отмечалась быстрая регрессия опухолевого клона при количественной оценке в отличие от других гемобластохов, например острых Т-лимфобластных лейкозов (Давидян Ю.Р. Детекция и мониторинг специфической реаранжировки генов иммуноглобулинов в процессе лечения острых лимфобластных лейкозов) (рис. 22). После же 6 курса XT (как правило, последний этап терапии) исследуемые химерные гены не выявлялись.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анапластическая крупноклеточная АЛК-позитивная лимфома выделена в отдельную нозологическую форму из группы гетерогенных заболеваний периферических Т-клеточных лимфом, благодаря клиническим, морфологическим и молекулярно-биологическим особенностям.

Эффективность лечения данной нозологии зависит от интенсивности химиотерапевтического воздействия. При использовании режимов химиотерапии по программе CHOP частота достижения полных ремиссий не превышает 52%, а 5-летняя общая выживаемость составляет 40-50% (при развернутых стадиях заболевания). Основываясь на позитивном опыте применения протокола NHL BFM-90 в педиатрической практике, явилась целесообразной попытка использования данной программы в лечении взрослых пациентов. Помимо оценки эффективности применения протокола NHL BFM-90 в лечении взрослых пациентов с АККЛ АЛК+ в нашем исследовании оценена токсичность данного режима химиотерапии. В

доступной нам литературе, исследований по использованию протокола во взрослой когорте больных, обнаружить не удалось.

В наше исследование включены 25 пациентов, у всех пациентов иммуногистохимическим методом выявлена экспрессия протеина АЛК в опухолевых клетках и при общем цитогенетическом и/или исследовании методом FISH выявлена перестройка гена ALK.

Из 25 больных 13 была проведена терапия по протоколу NHL BFM-90 по ветви К2, 12 - по ветви КЗ, ветвь К1 (что соответствует I или II резецированной стадии заболевания) не проводилось ни одному пациенту, в связи с отсутствием таковых.

Медиана возраста больных АККЛ АЛК+ составила 31 год (разброс 1765 лет). У 76% диагностированы генерализованные формы заболевания (III-IV стадии), помимо вовлечение в процесс лимфатических узлов (наблюдалось у всех пациентов), отмечена высокая частота экстранодальных поражений: мягкие ткани в 24% случаев (6 пациентов), кожа в 16% (4 пациента), органы желудочно-кишечного тракта в 8% (2 пациента). Поражение костного мозга стандартными гистологическими исследованиями было выявлено у 2 пациентов (8%).

Токсичность протокола NHL BFM-90 была оценена по каждой ветви проводимого лечения (ветвь Kl, К2, КЗ), что позволило определить переносимость высоких доз метотрексата (5 г/м2 и 1 т/и2). Использование высоких доз метотрексата в блоках АА и ВВ не сопровождалось развитием тяжелой нефротоксичности, требующей проведения гемодиализа, а разница в частоте выявления повышенного уровня креатинина среди пациентов, получающих лечение по ветви КЗ или по ветви К2 была статистически незначима (у 12% пациентов в блоках АА и ВВ и у 8% пациентов в блоках Аа и Вв). Наиболее частыми инфекционными осложнениями были стоматит и некротическая энтеропатия. Также, оценивая, частоту выявления данных осложнений в зависимости от дозы метотрексата, выявлено, что при использовании высоких доз препарата частота развития стоматита и некротической энтеропатии была даже несколько ниже, чем при введении меньших доз (12% и 4% против 24% и 25% соответственно).

Тяжелые инфекционные осложнения (сепсис, пневмония) отмечались не более чем в 16% случаев, летальность от осложнений составила 4%.

В нашем исследовании 5-детняя общая выживаемость у больных АККЛ АЛК+ при использовании протокола NHL BFM-90 составила 90±6%, а 5-летняя бессобытийная выживаемость - 78±21%. Полученные данные показывают, что данный протокол является высокоэффективной программой ПХТ для лечения взрослых пациентов, однако для выделения исходных

факторов, способствующих увеличению риска развития, очевидно недостаточным является выделение только клинических признаков.

В связи с этим, одной из задач нашего исследования явилась оценка минимального диссеминированного поражения костного мозга с дальнейшим мониторингом минимальной резидуальной болезни, как дополнительного и значимого фактора неблагоприятного прогноза. Данная задача была выполнена нами несколькими методами: иммуногистогистохимическое исследование на парафиновых блоках трепанобиоптатов и методом полимеразной цепной реакции в реальном времени в образцах костного мозга и/или периферической крови.

Использование иммуногистохимического исследования для детекции МДБ позволило увеличить процент выявления поражения костного мозга: идентифицировано у 4-х пациентов, у двух из них вовлечение костного мозга установлено морфологически. То есть, при использовании стандартного гистологического исследования поражение костного мозга выявлено у 8% в сравнении с 16% при применении ИГХ.

При исследовании поражения костного мозга методом ПЦР в реальном времени проводилась качественная и количественная оценка экспрессии одного из видов химерных генов, образуемых в результате специфических хромосомных транслокаций для данного заболевания. Данный метод позволяет определить одну опухолевую клетку на 10000 исследуемых.

В это исследование было включено 21 из 25 больных с диагнозом анапластическая крупноклеточная AJIK-позитивная лимфома. Для оценки минимальной диссеминированной болезни исследовались образцы костного мозга и/или периферической крови на момент обнаружения одного из химерных онкогенов, образуемых в результате специфических транслокаций: NPM-ALK, ATIC-ALK, TPM4-ALK, TPM3-ALK, CTCL-ALK, SEC31A-ALK, MYH9-ALK, MSN-ALK, AL017-ALK.

Итальянскими исследователями было показано преимущество применения ПЦР для выявления минимального вовлечения костного мозга в сравнении со стандартным гистологическим и иммунофенотипическим исследованием: в 61% случаев было выявлено поражение костного мозга при использовании полимеразной цепной реакции против 15% при исследовании рутинными методами. [125] В данной работе, выполненной в педиатрической группе больных, исследовался только один из самых часто встречаемых транскриптов NPM-ALK.

В нашем исследовании проведен анализ 9 известных химерных генов, а также впервые выполнен мониторинг МРД. В 57,1% случаев выявлена минимальная диссеминированная болезнь. В 21,4% обнаружен химерный ген NPM-ALK, в 14,2% (2 пациента) - редкий химерный транскрипт ATIC-ALK,

образуемый в результате инверсии 2 хромосомы inv (2)(p23;q35), также у пациентов (14,2%) - MSN-ALK (t(2;X)(p23;ql 1-12)), в одном случае (7,1%) -ТРМ4- ALK (t(2;19)(p23;pl3).

При оценке мониторинга минимальной резидуальной болезни в тех случаях, когда был выявлен тот или иной химерный ген, выявлено соответствие с наличием клинических факторов неблагоприятного прогноза - генерализованные стадии заболевания, поражение подкожной клетчатки, мягких тканей, органов средостения.

Мониторинг МРБ осуществлялся по нескольким точкам: дебют заболевания, после 2 курса ХТ, после 6 курса ХТ, в периоде наблюдения (каждые 3 месяца в первые 1,5 года после снятия с лечения, каждые 6 месяцев в последующие 3,5 года до 5 лет). В нашем исследовании отмечена быстрая регрессия опухолевого клона на проводимом лечении: после 2 курса ХТ во всех случаях определялся ген, но в значительно сниженном количестве при количественной оценке. Уровень экспрессии генов выражался в нормализованных процентах относительно уровня экспрессии гена ABL.

В единственном случае, когда после окончания лечения отмечено сохранение минимальной резидуальной болезни в период клинических признаков ремиссии заболевания, пациент рецидивировал.

Таким образом, важно подчеркнуть, что детекция и мониторинг химерных генов позволили выявить ряд особенностей динамики химерного продукта во время проведения лечения и дополнительные молекулярные критерии высокого риска развития рецидива. Учитывая существенно малое количество пациентов, участвующих в данной работе, необходимо дальнейшее продолжение исследования для окончательных выводов.

ВЫВОДЫ:

1. Протокол NHL BFM-90 высоко эффективен в лечении взрослых пациентов с анапластической крупноклеточной АЛК-позитивной лимфомой и позволяет достичь полных ремиссий у 96% больных, 5-летней общей и бессобытийной выживаемости 90±6% и 78±21% соответственно.

2. Иммуногистохимическое исследование на парафиновых блоках трепанобиоптатов с использованием антител к CD30 и АЛК позволяет выявить минимальное вовлечение костного мозга дополнительно у 8% пациентов в сравнении с гистологическим исследованием (16% против 8%).

3. Применение методики ПЦР в реальном времени на наличие химерных транскриптов гена ALK с целью детекции минимальной диссеминированной болезни позволяет существенно увеличить возможность выявления поражения костного мозга в сравнении со стандартными методами исследования (57,1% против 8%).

4. Наличие химерного гена в костном мозге и/или периферической крови совпадает с клиническими факторами неблагоприятного прогноза, такими как генерализованные стадии заболевания, поражение подкожной клетчатки, мягких тканей, органов средостения.

5. Высокодозная химиотерапия по протоколу NHL BFM-90 приводит к быстрому снижению в костном мозге и/или периферической крови количества химерного продукта после 2 курсов лечения.

6. Наличие минимальной резидуальной болезни после завершения лечения является крайне неблагоприятным фактором риска развития рецидива, даже при сохранении клинических признаков ремиссии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аитова (Горенкова) Л.Г, Виноградова Ю.Е., Капланская И.Б., Луценко И.Н., Звонков Е.Е., Момотюк К.С., Кравченко С.К., Кременецкая A.M., Воробьев А.И. Высокодозная полихимиотерапия у больных с прогностически неблагоприятной формой анаплазированной Т/0-крупноклеточной лимфосаркомы АЛК+. Терархив. 2009 т.81 стр. 53-57

2. Аитова (Горенкова) Л.Г., Виноградова Ю.Е., Момотюк К.С., Звонков Е.Е., Кравченко С.К., Кременецкая A.M., Воробьев А.И. Применение высокодозной терапии NHL-BFM-90 с трансплантацией аутологичных стволовых клеток крови у взрослого больного с прогностически неблагоприятной формой анаплазированной Т/О-клеточной крупноклеточной АЛК+-лимфосаркомой. Гематология и трансфузиология. 2009, т.54 №3 стр 4-6.

3. Горенкова Л.Г., Виноградова Ю.Е., Кравченко С.К., Кременецкая A.M., Воробьев А.И. Анаплазированная Т-крупноклеточная АЛК-положительная лимфосаркома с изолированным поражением кожи и мягких тканей у пожилой больной. Гематология и трансфузиология №1 2011. стр. 31-33.

4. Горенкова Л.Г., Виноградова Ю.Е., Плюшкина Е.А., Кравченко С.К., Кременецкая A.M. Сложности дифференциальной диагностики анапластических Т-клеточных CD30+ лимфом с поражением кожи. Материалы научных трудов III форума медицины и красоты. 2010 стр.55-56.

5. Горенкова Л.Г., Кравченко С.К., Мисюрин A.B., Ковригина A.M., Гемджян Э.Г., Кременецкая A.M. Клиническая и молекулярная оценка эффективности высокодозной химиотерапии при анаплазированной Т-крупноклеточной АЛК-позитивной лимфоме у взрослых. Гематология и трансфузиология. 2012; 3: стр 43.

6. Горенкова Л.Г., Кравченко С.К. Протокол интенсивного лечения анаплазированной Т-крупноклеточной АЛК-позитивной лимфомы у взрослых. Клиническая и молекулярная оценка эффективности высокодозной полихимиотерании. Программное лечение заболеваний системы крови: Сборник алгоритмов диагностики и протоколов лечения заболеваний системы крови под редакц. В.Г. Савченко. -М.:Практика,2012.стр. 735-749.

7. Плюшкина Е.А., Виноградова Ю.Е., Аитова (Горенкова) Л.Г., Капланская И.Б. Случай первичной кожной Т-клеточной анаплазированной CD30+ лимфомы с внекожной диссеменацией. Гематология и трансфузиология №3 т.54. 2009. Стр 12-14.

8. Плюшкина Е.А., Звонков Е.Е., Магомедова А.У., Морозова А.К., Горенкова Л.Г., Кравченко С.К., Кременецкая A.M. Применение программы mNHL-BFM-90 у пациентов с первичными диффузными В-крупноклеточными лимфосаркомами кожи. Материалы научных трудов III форума медицины и красоты. 2010 стр.63-64.

9. Магомедова А.У., Волкова Я.К., Кравченко С.К., Кременецкая A.M., Звонков Е.Е., Барях Е.А., Моисеева Т.Н., Зыбунова Е.Е., Лорие Ю.Ю., Марголин О.В., Марьин Д.С., Савенко Т.А., Гилязитдинова Е.А., Егорова Е.К., Джулакян У.Л., Габеева Н.Г., Губкин A.B., Воробьев

B.И., Красильникова Б.Б., Аитова (Горенкова) Л.Г., Плюшкина Е.А.Профилактика нейролейкемии у взрослых больных диффузной В-крупноклеточной лимфосаркомой лимфоидных органов. Научно-практический журнал. Кровь №2 (8). с. 77.

Ю.Кравченко С.К., Аль-Ради Л.С., Моисеева Т.Н., Магомедова А.У., Барях Е.А., Горенкова Л.Г., Звонков Е.Е., Зыбунова Е.Е., Марголин О.В., Замятина В.И., Кременецкая A.M., Воробьев А.И. Тромботические осложнения у больных опухолями лимфатической системы. Гематология и трансфузиология №2 2011, т56. стр. 3-10.

11. Н.Г. Чернова, Ю.Е. Виноградова, Е.А. Гилязитдинова, Л.Г. Горенкова,

C.К. Кравченко, A.M. Ковригина. Проблемы диагностики и лечения ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы. Гематология и трансфузиология. 2012; 3: 43.

12.Пересторонина Т.Н., Кравченко С.К., Губкин A.B., Аитова (Горенкова) Л.Г., Звонков Е.Е., Аграчева Н.С., Галстян Г.М., Машков А.Ю., Горгидзе Л.А., Готман Л.Н., Капланская И.Б., Клясова Г.А., Обухова Т.Н., Кременецкая A.M., Воробьев А.И. Повторная ремиссия раннего рецидива в ЦНС первичной диффузной В-крупноклеточной лимфосаркомы яичка. Описание случая. Гематология и трансфузиология №3. 2009 стр 54-55.

13.Gorenkova L., Vinogradova J., Kravchenko S., Lucenko I., Marjin D., Ilyushkina T., Zvonkov E., Kremenezkaya A. The efficacy of high-dose therapy NHL BFM-90 in adults with anaplastic large cell lymphoma ALKpositive". EJC SUPPLEMENTS, April 2010. CTp.25.

14. Gorenkova L., Vinogradova U., Kravchenko S., Ilyushkina E., Zvonkov E., Misyurin A. Clinical and molecular evaluation of the efficacy of the highdose polychemotherapy in adult patients with anaplastic large-cell ALKpositive lymphoma". Haematologica, June 2011 cTp 568.

15. Gorenkova L., Kravchenko S., Vinogradova Y., Misurin A., Ilyushkina E., Savchenko V. The Evaluation of Clinical and Molecular Response to HighDose Chemotherapy Protocol NHL BFM-90 in Adults with Anaplastic Large Cell ALK-Positive Lymphoma. Blood. 2011; volume 118, number 21:705.

16. Gorenkova L., Vinogradova Y., Kravchenko S., Ilyushkina E., Misurin A. Clinical and molecular evaluation of the efficacy of the high-dose polychemotherapy in adult patients with anaplastic large-cell ALK-positive lymphoma. Cellular Therapy and Transplantation journal. 2011; 3(12):47.

17. Yulia E. Vinogradova, Irina B. Kaplanskaya, Rimma S. Samoilova, Ivan A. Vorobiev, Boris V. Zingerman, Yulia V. Sidorova, Nikita E. Shklovskiy-Kordi, Lilija G. Aitova, Dmitri C. Maryin, John C. Morris, Lyuba Varticovski and Andrei I. Vorobiev. "Clinicopathological features and outcomes of T- and NK-cell lymphomas in European Russia. Clinical Medicine Insights: Blood Disorders 2012:51-13.