Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Клиническая, гормональная и молекулярно-генетическая диагностика неклассической формы 21-гидроксилазной недостаточности в женской популяции

На правах рукописи

оозоев134

ФОМИНА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА

КЛИНИЧЕСКАЯ, ГОРМОНАЛЬНАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА НЕКЛАССИЧЕСКОЙ ФОРМЫ 21-ГИДРОКСИЛАЗНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ В ЖЕНСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

14.00.03 - Эндокринология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Самара-2007

003068134

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Тюменской государственной медицинской академии Росздрава

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор СУПЛОТОВА Людмила Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

СОЛУН Мирра Наумовна ТРУСОВ Виктор Васильевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская медицинская академия имени И М. Сеченова» Росздрава

Защита состоится «11» апреля 2007 г в 1100 часов на заседании диссертационного совета К 208.085.02 при ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (443079, г Самара, ул К Маркса, 165 «Б»)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан «09» марта 2007 г. Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Захарова И.О.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Неблагоприятная демографическая ситуация, сложившаяся в нашей стране, представляет собой не только серьезную социальную, но и медицинскую проблему. Возрастающее год от года количество бесплодных браков, репродуктивные потери определяют актуальность сохранения каждой желанной беременности [Э.К. Айламазян., 1990, Е С. Ляшко , 2000; Т.В. Боткина., 2001, В.П. Сметник., 2002].

В структуре репродуктивных нарушений значительная роль принадлежит эндокринным заболеваниям. Гиперандрогения - одна из основных причин репродуктивной патологии, приводящих к бесплодию и невынашиванию беременности [Т.В. Овсянникова., 2000, Т.Б. Боткина., 2001; Е.М. Вихляева., 2002, Э.Р. Дуринян., 2002; Т.А. Назаренко., 2004] Наиболее частой причиной гиперандрогении надпочечникового генеза является врожденная дисфункция коры надпочечников, в 95 % случаев обусловленная снижением активности фермента 21-гидроксилазы, необходимого для синтеза кортизола и альдостерона [М И Балаболкин., 2002; В.А Петеркова., 2003; И.И. Дедов., 2005; P.C. White, P.W. Speiser, 2000]. Частота ее неклассической формы достигает в общей популяции от 0,3 до 4 % [И.И Дедов , 2002, В.А Петеркова , 2003]

В литературе подробно освещены аспекты этиологии, патогенеза, клинической картины, представлены сведения о генетических нарушениях классической формы заболевания, разработаны методики пренатальной диагностики и неонатального скрининга 21-гидроксилазного дефицита [В А Петеркова., 2003; ИИ. Дедов., 2004; М.А. Карева., 2004; Н.Ю. Калинченко., 2005; ОБ Макарова, 2006]. Наряду с этим наибольшую сложность в диагностике представляют стертые, «неклассические» формы ВДКН. Трудность диагностического поиска обусловлена отсутствием специфических клинических проявлений заболевания [М.И. Балаболкин., 2002; P.W. Speiser., 2004].

Современные подходы к диагностике неклассической формы недостаточности фермента 21-гидроксилазы предполагают определение уровня промежуточного продукта стероидного синтеза выше ферментативного блока - 17-ОНР, интерпретация которого осуществляется с учетом стадии пубертата и фазы менструального цикла [KB Краснопольская, 2004; Blanche Н., 1997] Однако изолированное исследование основного биохимического маркера врожденной ферментопатии не всегда помогает в диагностике заболевания, особенно когда его концентрация находится на верхней границе нормы или незначительно ее превышает. По данным зарубежной и отечественной литературы, проведение пробы с аналогом адренокортикотропного гормона короткого действия считается оптимальным тестом для диагностики неклассической формы ВДКН [И.И. Дедов., 2002; Т.А. Bachegal., 2002; W. Phyllis, 2003]. Необходимо отметить, что в России проведение пробы в соответствии с выработанными международными критериями невозможно, из-за отсутствия препарата на отечественном фармацевтическом рынке. Используемая модификация пробы с применением высокой дозы синтетического аналога АКТГ (синактен-депо) не имеет отработанных критериев оценки и интерпретируется разными авторами неоднозначно. Диагностика мутаций, характерных для неклассического варианта ВДКН, и поиск новых специфических мутаций в гене CYP21 расширяет возможности верификации неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы [И И. Дедов, 2004, М.А. Карева., 2004; Н.Ю. Калинченко., 2005; G. Ohlsson., 1999, N. Weintrob, 2000; С. Deneux., 2001; S Koyama , 2002, S. Lajic., 2002]

В последние годы возрос научный интерес к патологическому влиянию неклассической формы Р450с21 на репродуктивную функцию женщины [Е С Ляшко , 2000, Т.В Боткина, 2001] Провоцирующим фактором, впервые выявляющим скрытую дисфункцию стероидогенеза, является беременность, наступившая спонтанно у половины женщин с неклассической формой дефицита 21-гидроксилазы [ВП Сметник, 2002, В А Петеркова, 2003]

Адекватная оценка метаболитов стероидного синтеза 17-ОНР и ДГЭА-С в период гестации затруднена вследствие особенностей гормональной секреции плаценты и высокой активности адреналового стероидогенеза матери и гшода [Н П. Гончаров , 2004], а проведение пробы с синтетическим аналогом АКГГ у беременных не представляется возможным Референтные интервалы, предлагаемые на сегодняшний день справочной литературой для 17-ОНР и ДГЭА-С в гестационный период, не учитывают особенности метаболизма стероидов в течение беременносги [С С К Йен, 1998; Н У Тиц, 2003, ЗАО «Алкор Био», 2003, DRG Diagnostics, 2003] Ошибки в интерпретаци значений стероидов приводят к завышенной диагностике неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы в период беременности Изучение методов клинико-гормональной и молекулярно-генетической диагностики неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы позволит оптимизировать верификацию заболевания вне и в период гестации с целью сохранения беременности и рождения здорового потомства

Цель исследования

Определить значимость методов клинико-гормональной и молекулярно-генетической диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы для верификации заболевания вне и в период гестации

Задачи исследования

1 Оценить диагностическую значимость определения повышенных уровней 17-ОНР и ДГЭА-С для выявления неклассической формы дефицита 21-гидроксмазы в период гестации

2. Оценить значимость клинических и гормональных маркеров гиперандрогении в диагностике неклассической формы ВДКН у женщин вне гестации

3 Определить диагностическую ценность стимуляционной пробы с синтетическим аналогом АКТГ продленного действия для верификации неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы у женщин вне гестации

4 Исследовать характер и частоту мутаций в гене CYP21 в женской популяции г Тюмени для оптимизации диагностики неклассической формы ВДКН

Научная новизна

Впервые определена чувствительность, специфичность и прогностическая ценность лабораторных методов диагностики врожденной ферментопатии Р450с21 во время беременности Доказана низкая информативность гормональных показателей ДГЭА-С и 17-ОНР в качестве диагностических критериев неклассической формы ВДКН в период гестации

Впервые определена прогностическая значимость базального уровня 17-ОНР, а также эффективность и чувсгвительность гормональной пробы с синтетическим аналогом АКТГ длительного действия для диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы у женщин вне гестации

Выявлена низкая диагностическая ценность базальной концентрации 17-ОНР как основного патогенетического маркера неклассической формы ВДКН Доказана высокая информативность стимулированного показателя 17-ОНР в верификации неклассической формы дефицита 21 -гидроксилазы.

Разработан алгоритм диагностики неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы с использованием стимуляционной пробы с синтетическим аналогом АКТГ длительного действия и молекулярно-генетического анализа

Впервые определены наиболее характерные мутации гена CYP21 при неклассической форме дефицита 21-гидроксилазы в женской популяции г.Тюмени Впервые определена распространенность врожденной ферментопатии в группе женщин с лабораторными маркерами адреналовой гиперандрогенией в период гестации

Практическая значимость

Селективный скрининг беременных женщин на неклассическую форму дефицита 21-гидроксилазы, основанный на определении промежуточных метаболитов стероидного синтеза (ДГЭА-С и 17-ОНР), приводит к завышенной диагностике врожденной ферментопатии во время беременности Гестационный период характеризуется значительными изменениями адреналового стероидогенеза, и повышение концентрации стероидных гормонов не является отражением нарушенного стероидогенеза

Диагностика неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы должна проводиться на этапе планирования беременности с формированием групп риска по наличию врожденной ферментопатии среди женщин с репродуктивными нарушениями (раннее адренархе, нарушение менструальной функции, первичное бесплодие) и клиническими признаками гиперандрогении

Обоснована необходимость оценки уровня 17-ОНР на пике стимуляции синтетическим аналогом АКТГ длительного действия, как высокочувствительного маркера неклассической формы 21-гидроксилазной недостаточности.

Для верификации неклассической формы 21-гидроксилазной недостаточности во время беременности методом выбора является молекулярно-генетический анализ

Определен спектр наиболее частых мутаций у женщин с неклассической формой недостаточности 21-гидроксилазы Причиной нарушения активности фермента при проведении стимуляционной пробы с аналогом АКТГ у данной группы явилось наличие сочетанных мутаций в гене CYP21 (V281L/30kb del, P453S/30kb del, V281L/V237E) Наиболее специфичными для неклассической формы дефицита 21-гидрокислазы в женской популяции являются гомозиготные или сочетанные гетерозиготные мутации, приводящие к аминокислотным заменам в следующих позициях: V281L, P453S

Основные положения, выносимые на защиту

1. Диагностика неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников должна проводиться на этапе планирования беременности. У женщин группы риска по неклассической форме недостаточности 21-гидроксилазы в спектр диагностических методов должна быть включена стимуляционная проба с синтетическим аналогом адренокортикотропного гормона продленного действия вне зависимости от уровня базального 17-ОНР.

2 Диагностика врожденной ферментопатии в ранние сроки гестации требует проведения молекулярно-генетического анализа, так как повышение метаболитов стероидного синтеза 17-ОНР и ДГЭА-С в период беременности свидетельствует не о заболевании, а об изменении стероидогенеза в этот период

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации представлены на областной научно-практической конференции «Клиническая эндокринология- достижения и перспективы» (Тюмень, 2004 г.), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» в рамках Международного симпозиума «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 2004 г); на терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики наиболее распространенных заболеваний внутренних органов», в рамках которого совместно с соавторами принимали участие в конкурсе молодых ученых (Тюмень, 2005 г), на региональной научно-практической конференции «Детская и подростковая эндокринология перспективы и пути развития» (Омск, 2005 г), на «Национальных Днях Лабораторной Медицины России» (Москва, 2005 г ), на региональной научно-практической конференции акушеров-гинекологов (Тюмень, 2006 г) Внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в работу многопрофильной клиники ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава, используются в учебно-педагогической работе кафедры терапии с курсом эндокринологии ФПК и ППС ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ В соавторстве опубликовано 2 методических пособия для врачей «Неклассические формы врожденной дисфункции коры надпочечников» и «Дифференциальная диагностика гиперандрогении у женщин», утвержденных УМО-53 по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России от 01.02 2005 г Объем и структура работы

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии Работа содержит 20 таблиц и 22 рисунка Список литературы включает 209 наименований, в том числе 58 отечественных и 151 зарубежный источник

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Настоящая работа является частью программного исследования ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава «Эпидемиология, скрининг, диагностика врожденной дисфункции коры надпочечников в женской популяции Тюменского региона» В соответствии с поставленными задачами в структуре нашей работы выделены два основных фрагмента

Первый фрагмент включает анализ скрининга 11 260 беременных женщин на неклассическую форму недостаточности 21-гидроксилазы. Программа осуществляется с 2002 г по рекомендации кафедры акушерства и гинекологии ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава (ректор, дмн, профессор Э А Кашуба) и при поддержке Управления по здравоохранению г Тюмени Беременные женщины при наличии отягощенного акушерского анамнеза и развитии угрозы прерывания настоящей беременности

направлялись на дополнительное гормональное обследование В качестве маркеров неклассической формы ВДКН было использовано определение уровня ДГЭА-С, 17-ОНР крови За период 2002 - 2004 гг в рамках скрининга уровень ДГЭА-С исследован у 3 869 беременных женщин, концентрация 17-ОНР определена 445 беременным Из индивидуальных карт беременных женщин и родильниц фиксировались данные возраста, национальности, срока беременности, в котором проводилось гормональное исследование Гормональное обследование осуществлялось в клинико-диагностической лаборатории Перинатального центра при Тюменском областном центре охраны материнства и детства (главный врач, к.м н Е.В Кашуба)

Второй фрагмент работы посвящен вопросам диагностики неклассической формы ВДКН с дефицитом 21-гидроксилазы у женщин вне гестации Селективный скрининг беременных женщин позволил сформировать группу женщин с подозрением на неклассическую форму недостаточности 21-гидроксилазы. Формирование выборки осуществлялось с применением открытой таблицы случайных чисел среди женщин с повышенными метаболитами адреналового стероидогенеза в период гестации (рис 1) Критерии включения - повышенный уровень ДГЭА-С и/или 17-ОНР в период гестации относительно рекомендуемых лабораторных норм для беременных женщин Критерии исключения - наступление беременности после экстракорпорального оплодотворения, стимуляции овуляции, уровень ДГЭА-С и/или 17-ОНР в референтном интервале Дальнейшее обследование женщин на неклассическую форму недостаточности 21-гидроксилазы вне гестации проходило при наличии информированного согласия на амбулаторном приеме Многопрофильной клиники ГОУВПО ТюмГМА Росздрава (главный врач, д. м.н., профессор Л А Суплотова).

В рамках скринингового исследования уровень ДГЭА-С во время беременности был определен у 3869 женщин

В рамках скринингового исследования уровень 17-ОНР во время беременности был определен у 445 женщин

_V

В рамках скринингового исследования повышенный уровень ДГЭА-С в период гестации наблюдался у 2792 женщин

<=3

_V_

В рамках скринингового исследования повышенный уровень 17-ОНР в период гестации наблюдался у 47 женщин

V

V

Вне гестации — репрезентативная выборка из 134 женщин с повышенным уровнем во время беременности ДГЭА-С и/шш 17-ОНР ЛГЭА-С и/или 17-ОНР

Рис 1. Алгоритм формирования группы исследования на неклассическую форму недостаточности 21-гидроксилазы вне гестации

Диагностический поиск врожденной ферментопатии у женщин вне гестации включал использование комплекса клинических, гормональных и молекулярно-генетических методов исследования При общеклиническом обследовании оценивали характер жалоб пациенток, анамнез, рост, вес, индекс массы тела, особенности телосложения, состояние кожи (пигментации, стрии, acne vulgaris), степень выраженности гирсутизма [Femman D, Gallwey J, 1961] Изучены особенности генеалогического анамнеза наличие нарушений менструальной и репродуктивной функции у матери и ближайших родственников по женской линии, особенности течения беременности и родов у матери, наличие у матери и ближайших родственников эндокринных заболеваний, гирсутизма Проведена оценка репродуктивного анамнеза (последовательность этапов полового созревания, возраст menarche, цикличность менструаций) Ретроспективно проанализированы андрогензависимые осложнения гестационного периода (угроза невынашивания беременности, формирование истмико-цервикальной и хронической маточно-плацентарной недостаточности, аномалии родовой деятельности)

Исследование гормонального профиля в репрезентативной в выборке проходило в клинико-диагностической лаборатории Многопрофильной клиники ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава (зав лабораторией, кмн НЮ Южакова) и включало определение базатьного уровня кортизола, 17-ОНР и ДГЭА-С. Стимуляционная проба с аналогом АКТГ пролонгированного действия - тетракозактидом («Синактен-депо», Novartis, Швейцария) в модификации, разработанной в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН [ИГ Дзенис и др , 1995], была проведена 53 женщинам Препарат длительного действия синактен-депо - вводился в дозе 1 мг в/м в 8 00 часов утра Забор крови с определением уровня кортизола, 17-ОНР и ДГЭА-С производили из локтевой вены до и через 9 часов после введения АКТГ (на пике действия)

Содержание в крови кортизола, 17-ОНР и ДГЭА-С определялось методом ИФА с использованием тест-систем «Стероид ИФА-кортизол-01», «17-а-ОН Progesteron ELISA», «Стероид ИФА-ДГЭА-сульфат» производства ЗАО «Алкор Био», г Санкт-Петербург Результаты определения содержания гормонов выражались в международной системе СИ кортизол - нмоль/л, ДГЭА-С - мкг/мл, 17-ОНР -нмоль/л

Базальный уровень 17-ОНР выше 6 нмоль/л рассматривался как пограничный для диагностики недостаточности 21-гидроксилазы, более 15 нмоль/л -диагностическим [Е В Панфилова, 2005, Т A Bachega, 2000] Результаты гормональной пробы оценивались по степени увеличения уровня маркеров ферментативного дефекта Повышение стимулированного показателя 17-ОНР выше 50 нмоль/л являлось доказательством 21-гидроксилазного дефицита при неклассическом варианте Концентрация стимулированного 17-ОНР до 30 нмоль/л исключала ферментативный дефект, значения в диапазоне 30-50 нмоль/л указывали на гетерозиготное носительство мутаншого гена дефицита 21-гидроксилазы (CYP21) [Т A Bachega, 2002, R Huerta, D. Dewailly, 2000, W Phyllis, 2003]

Молекулярно-генетическое исследование проведено 44 женщинам в лаборатории генетики (зав лабораторией С А Прокофьев) Эндокринологического научного центра РАМН, г Москва (директор, академик РАМН и РАН И И Дедов) Геномная ДНК выделена из лейкоцитов периферической крови с использованием стандартных методов (Сэмбрук с соавт, 1989). Селективно амплифицировали фрагменты гена CYP21, используя экзон-специфические праймеры, подобранные на основании анализа нуклеотидной последовательности генома человека Р4, Р55, Р92С,

Р92Т, Р168, 8G; Р168, 8Т; Р258, 4С, Р258, 4Т Режимы амплификации большого и малого фрагментов ДНК включали преденатурацию - 30 циклов, денатурацию, отжиг праймеров, элонгацию и финальную элонгацию Полученные в результате амплификации специфические фрагменты ДНК использованы для генотипирования методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции

Статистическая обработка материала проведена на ПК Pentium Ш с применением пакета программ STATISTICA, версия 6.0, а также программ статистического анализа Microsoft Excel, версия 7 0 Количественные показатели представлены в виде медианы (Me), 2,5 - 97,5 процентилей [95 % ДИ]. Сравнения двух независимых групп осуществлялось с применением критерия Манна-Уитни, более двух с помощью теста Краскела-Уоллиса. Анализ взаимосвязи количественных признаков проведен с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена Критерий статистической значимости при проверке гипотез для данной работы р < 0,05 Анализ точности диагностических методов проводился по формулам Специфичность = (истинно-отрицательный результат / истинно-отрицательный

результат + ложно-положительный результат) х 100 % Чувствительность = (истинно-положительный результат / исгинно-

положительный результат + ложно-отрицательный ре зультат) х 100 % Эффективность = (число правильных результатов исследования (и положи тельных, и отрицательных) / общее количество исследований х 100 %. Распространенность = (количество обследованных / количество выявленных больных) х 100 %

Прогностическая ценность положительного результата = (истинно-положительный результат / истинно-положительный результат + ложно-положительный результат) х 100 %

Прогностическая ценность отрицательного результата = (истинно-отрицательный результат / ложно-отрицательный результат + истинно-отрицательный результат) х 100%

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ результатов селективного скрининга беременных на неклассическую форму недостаточности 21-гидроксилазы показал превышение нормативных значений ДГЭА-С и 17-ОНР относительно рекомендуемых референтных интервалов у 72 % и 10,5 % обследованных соответственно Развитие физиологической беременности характеризуется специфическими изменениями концентрации стероидных гормонов В исследовании установлено статистически значимое снижение концентрации ДГЭА-С к концу периода гестации, тогда как уровень 17-ОНР имеет тенденцию к возрастанию, свидетельствуя о высокой активности стероидогенеза в этот период Предлагаемые в настоящее время референтные интервалы ДГЭА-С (0,2 -1,2 мкг/мл) и 17-ОНР (норматив для третего триместра гестации 2-12 нг/мл) не учитывают возраст и особенности стероидного синтеза во время беременности, что привело к постановке диагноза врожденной ферментопатии у 25 % женщин от общей популяции беременных. Однако является ли повышение концентрации метаболитов стероидного синтеза относительно лабораторной нормы отражением нарушенного стероидогенеза у беременных?

С целью верификации заболевания после завершения периода гестации проведен клинический осмотр женщин, имевших высокие концентрации метаболитов

стероидного синтеза В период беременное™. Каждая четвертая пациентка предъявляла жалобы па избыточный рост волос на теле (23,1 %), значительно реже (2,2 %) на жирную себорею и aene vulgaris.

Проведен анализ частоты симптомов, характерных для неклассической формы дефицита Я-гидроксилазы. Нарушение этапов полового развития в виде раннего адренархй наблюдалось и 12,7 % случаев, у 5,2 % женщин наступление менархе отмечало«, после 15 лет Половое созревание протекало с элементами аспе vulgaris у 20,9 % и развитием гирсугизма - 14,2 %. 11арушейие менструального цикла по типу олигомепареи диагностировано 20,9 % обследованных, недостоверно Чаще ;шеменорея вс'дечалась среди лиц с поздним начатом менструаций, Каждая пятая женщина из группы (19,4 %) имела самое тяжелое нарушение репродуктивной функций - бесплодие, длительность кото]юго составила от 2 до 17 лег. В большинстве случаен имело место первичное бесплодие (61,5 %). Максимальное количество репродуктивных нарушений, по дашшм анамнеза, приходилось на невынашивание предыдущих беременностей: частота са мопроизволЕЩ^Х выкидышей составила 27,6 % случаев, репрессирующих беременностей 5,2 % При ггом большое количес тво репродуктивных потерь (72,7 %) приходилось на ранние сроки геетации.

i 1ри изучении акушерского анамнеза установлено, что 97,6 % женщин были поставлены на учет в женской консультации п 1-м триместре беременности (до 12 недель). Настоящая беременность в исследуемой группе была первой у 62 человек (46,3 %), первородящие - 105 (78,4 %), из которых 41,9 % повтор:юбеременные, о;шако предыдущая беременность в 13,7 % случаев закончилась регрессом, а количество самопроизвольных и искусственных абортов практически одинаково (47,7 % и 38,6 % случаев соответственно) Возникновение угрозы прерывания настоящей беременности наблюдалось у абсолютного большинства - 88,8 %. Все женщины доносили беременноегь и били родоразрешены без случаев материнской и детской смертности.

Клинический осмотр женщин показал отсутствие специфических проявлений заболевания: нее пациентки имеют женский фенотип без признаков маскулинизации, гйреушое число н пределах пограничных значении (индекс Ферримана-Голшея от 7 до 12 баллов). Большая часть - 59,7 % с нормальным показателем индекса массы тела (рис. 2)

14,9% 0,7%

■ дефицит массы тела анормальная масса тела

□ избыток массы тела Шожирение

Рис. 2. Индекс массы тела у женщин обследуемой группы

Следовательно, данные анамнеза и клинического осмотра позволяют лишь с некоторой долей вероятности сформировать группу риска по наличию врожденных нарушений стероидогеиеза, требующей дальнейшего лабораторного обследования.

Промежуточным продуктом стероидного синтеза выше ферментативного Шока является 17-GHP, высокий уровень которого определился как патогномопичпыи биохимический нришак недостаточности 21 -гидроксшшзы у 34,3 % женщин (более 6,1 тюль/л), при этом лини, у 3,8 % соответствовал диагностическому значению неклассической формы 21-гидроксилазного дефицита (рис. 3). Необходимо отметить, что йизких показателей кортизола зафиксировано не бьшо, медаана (шггеркваргильный размах) составила 525 (400-710) пмоль/л, что исключает гипофункцию надпочечников. Повышение основного адренилового андрогепа -ДГЭА-С диагностировано только у 5,7 % женщин, при этом не установлено корреляционной сиязи между высокими концентрациями метаболитов стероидной! синтеза (р>0.()5). Вместе е тем, значения медианы и 95 % ДИ для 17-0HP и ДГ)А-С располагаются в пределах нормальных лабораторный интервалов соответственно - 3,9: [4,78-6,401 нмоль/л и Ш); [ 1,88-2,25 ¡ мкг/мл

Ъ.7%

о Уровень ДГЭА-С Более 3,9 м кг/w л В Уровень ДГЭА-С 0,8 - 3.S «кг/мл

□ Уровень 17-ОНР менее е.О имоль/п а Уровень 17-ОНР 8.1 - 15,0 ныопьУл

□ Уровень 17-ОНР бопее 15,1 киспь/л

Рис. 3. Структура распределения базальных уровней 17-ОНР и Д1'ЭА-С в группе исследования

Используемая па втором этапе диагностики стамуляционная проба с применением сиптетическй о аналога АКТГ (синактеп - депо) выявила 9,4 % женщин с диагност чески значимым подъемом 17-ОНР па пике стимуляции для врожденной ферментопатии (более 50,! нмоль/л), 5,7 % пациенток с уровнем стимулированного 17-ОПР в Интервале 30,1 - 50,0 нмоль/л, что соответствует гетерозиготному носительству дефектного аляеля гена СУР21 и 84,9 % обе ле до на пн I.IX с концентрацией стимулированного ! 7-ОНР в интервале лабораторной нормы (до 30,0 нмоль/л).

С целью диагностики заболевания использован метод молекулярно-генетического анализа, позволяющий исключить ложпоположителыше случаи врожденной ферментопатии при положительном результате гормонального тесга, Характеристика выявлеЙгых мутаций представлена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика детектированных мутаций гена |ЩР21___

мутация аминокислотная замена нуклеотидиая замена

30 Vb del сдвиг рамки считывания делеция

Р1051, замена нролина на лейцин С ••> т

V281I, замена намина па лейцин G -» Т

P453S замена нролина на серии С -> Т

п

Проведенный молекулярно-генетический анализ выявил 13 случаев одной из мутаций Р105Ь, У281Ь, либо делецию 30 тысяч пар нуклеотидов и 5 случаев аминокислотных замен при сочетанном нахождении химерного гена ЗОкЬ с1е1/У281Г,, ЗОкЬ с1е1/Р453й, ЗОкЬ с1е1/Р105Ь, У281Ь/У237Е (таблице 2)

Таблица 2

Спектр и частота мутаций в группе исследования_

мутация всего, чел. всего, %

P105L 8 18,2

30kb del 4 9,1

V281L 1 2,3

ЗОкЬ del/V281L 2 4,5

ЗОкЬ del/P453S 1 2,3

ЗОкЬ del/P105L 1 2,3

V281L/V237E 1 2,3

Наиболее распространенными дефектами гена CYP21 в популяции женщин г. Тюмени явились мутации, приводящие к аминокислотным заменам V281L, P453S при сочетанном нахождении химерного гена (30kb del) По нашему мнению, достаточно убедительным критерием диагностики неклассической формы врожденной ферментопатии следует считать сочетание высокого стимулированного уровня 17-ОНР (более 50,1 нмоль/л) и детектированной мутации в гене CYP21, выявленное у 4 женщин в исследовании (таблице 3) Показатели медианы базального и стимулированного синактеном-депо уровня 17-ОНР значительно превышают интервал лабораторной нормы (10,3 нмоль/л и 60,3 нмоль/л), а также у всех прослеживается несколько мутаций в одном аллеле

Таблица 3

Показатели 17-ОНР у пациенток с неклассической формой

__недостаточности 21-гидроксилазы_

№ пациентки Мутация Базальный уровень 17-ОНР, нмоль/л Стимулированный уровень 17-ОНР, нмоль/л

27 V281L/V237E 6,36 60,6

58 30kb del/V281L 7,3 60,0

73 ЗОкЬ del/P453S 18,2 60,0

18 ЗОкЬ del/V281L 13,3 58,2

У 13,6 % пациенток, имеющих высокие базальные и/или стимулированные уровни 17-ОНР, рассматриваемые в качестве биохимического критерия диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы, мутаций в кодирующей части гена CYP21 обнаружено не было Возможно, причиной дефекта стероидного биосинтеза в данном случае являются более редкие мутации, которые не определялись в нашем исследовании Из числа обследованных, у 32 % женщин в отсутствии клинических признаков гиперандрогении, имеющих уровни базального и стимулированного 17-ОНР менее 15 нмоль/л и менее 30 нмоль/л соответственно, выявлены мутации P105L, 30kb del, V281L в гене CYP21 Данные гетерозиготные мутации являются проявлением нормального полиморфизма гена 21-гидроксилазы

Таким образом, неклассическая форма недостаточности 21-гидроксилазы зарегистрирована по результатам исследования базальной концентрации 17-ОНР в 34,3 % случаев, на основании гормональной пробы только у 9,4 % женщин

Стимулированный уровень 17-ОНР более 50,1 нмоль/л 1! 80 % случаев подтверждает наличие дефекта в гене СУР2! и может рассматриваться в качестве значимого критерия даапюстики недостаточности 21-гидроксилаты Рашрострапешюсть неклассической формы ВДКН с дефицитом 21-гидроксилазы среди женщин с повышатыми маркерами гиперандрогенш ВО время беременности (рис. 4) на основашш выявленных мутаций я гене СУР21 составила 9 %, что согласуется с данными Е.В. Панфиловой (2006), где в исследовании пеклассическая форма 21-гидроксилазтой недостаточности была установлена у 8,6 % девочек с потере ндрогени ей.

Рис. 4. Лабораторные этапы диагностического поиска неклассической формы недостаточ] юсти 21 -гидрохеидазы у женщин репродуктивного возраста

1} пашем исследовании изучены вопросы первичной диагностики заболевания вне гестаI иш до проведения стимул яцишшоЙ пробы с аналогом АКТГ я молекулящо-генетичеекото анализа; на ранних сроках гестащи и особенности течения беременности у женщин с доказанной врожденной ферментопати©!. Для этого из числа женщин с повышенным уровнем сывороточных маркеров адреналовой / и; ¡ерандрогенни по прсыя беременности и проще/щшх. тшшто-гормоналыюч обследование вне гестации сформированы фи группы женщин:

1 группа (4 человека) - с доказанной некяассической формой Р450с21 на основании гормональной пробы и молекулярнс^-Генегического анализа;

2 группа (14 человек) - гетерозиготные носительницы мугантного гена СУ!^ 1 гю данным Ш ЗР-даагносТики;

3 группа (22 человека) - не имеющие дефекта 21 -гидроксилазы (с отрицательным результатом сгамуляционной пробы и 1ЖЦ3-диагностика).

Все группы женщин сопоставимы по возрасту и национальному составу (р>0,05). Несмотря па отсутствие достоверности различий между группами (р]-э>0,0|| у женщин с доказаш-юЙ некяассической формой, по данным анамнеза, наблюдается только раннее адреиархе при отсутствии нарушений в ре1гроду ктивной сфере. V гетерозиготных носительниц мутантного гена в отличие от здоровых женщин чаще встречается нарушение менструального цикла, развитие гирсугичма в период полового созревания и первичное беишодие. Равно как и в общей группе исследования, нами не выявлено клинических признаков гиперандрогещщ у женщин

Гест ¡щи я

И Пйвытшгный уровень

17-ОНР и ДГЭА-С

В» гесшии

_-----__

ЩЦ Стимулировании и уровень 17-ОНР более 50Л нмоль/л

ЩхЛалскуляр-ный анализ

ЦЩ Повышенный базальный уровень 17-ОНР

как с доказанной ферментопатией, так и среди гетерозиготных носительниц мутантного гена (р1.3>0,05)

Принимая во внимание, что основным методом диагностики врожденной ферменгопатии является АКТГ-стимулирующая проба, в группах исследования проведена оценка содержания исходного и стимулированного синактеном-депо 17-ОНР. Несмотря на более высокие базальные показатели медианы 17-ОНР в группе женщин с недостаточностью 21-гидроксилазы (рис 5), сравнительный анализ с помощью критерия Краскела-Уоллиса не показал достоверных отличий между группами (Н (2,К=40)=4,136730, р=0,1264)

При сравнении стимулированного уровня 17-ОНР мы получили достоверные различия во всех трех группах женщин (критерий Краскела-Уоллиса, Н(2,Ы=39)=11,24258, р=0,0036) Достоверно более высокий уровень 17-ОНР на пике стимуляции аналогом АКТГ у женщин с доказанной врожденной ферменгопатией является отражением ферментативного блока в стериодогенезе коры надпочечников

1 2 3

группы сравнения по базапьному 17-ОНР

1 2 3

группы сравнения по стимулированному 17-ОНР

Рис 5 Медиана базального и стимуляционного уровня 17-ОНР в трех группах исследования

В плане диагностики заболевания в период гестации проведен сравнительный анализ течения беременности и родов между группами Следует сказать, что у женщин с доказанной врожденной ферментопатией в большем проценте случаев отмечены такие андрогензависимые осложнения как угроза невынашивания беременности во 2-м триместре, истмико-цервикальная недостаточность и аномалия родовой деятельности, однако полученные различия не имеют достоверного уровня значимости (р>0,05)

Возможно ли диагностировать неклассическую форму 21-гидроксилазной недостаточности у беременных женщин методом селективного скрининга с использованием существующих норм содержания 17-ОНР и ДГЭА-С?

Изменения концентрации 17-ОНР в течение беременности у женщин с доказанной ферментопатией и женщин, не имеющих дефекта стероидного синтеза, имеют одинаковые тенденции (р>0,05) Необходимо отметить, что производителями лабораторных тест-систем предложен референтный интервал 17-ОНР только для

третьего триместра беременности (2,0-12,0 нг/мл), что вызывает затруднения в интерпретации врачами-клиницистами результатов определения данного стероида в ранние сроки гестации с целью диагностики заболевания Более того, медиана 17-ОНР в первом триместре беременности превышала точку разделения «норма/патология» 12 нг/мл как в группе женщин с дефектом в гене СУР21, так и в группе здоровых женщин, а в третьем триместре значения медианы во всех группах находятся в пределах референтного интервала, рекомендованного для третьего триместра гестации

Концентрация ДГЭА-С как у женщин с нарушенным стероидогенезом, так и у здоровых женщин не имела достоверных различий (р>0,05), снижаясь в динамике к окончанию срока гестации, превышая при этом верхнюю границу референтного интервала для беременных во всех триместрах (рис 6)

р=0,57

р=0,42

р=0,84

Лабораторная норма 0,2-1,2 мкг/мл

1 Беременные с дефектом в гене СУР 21 Беременные без дефекта в гене СУР 21

1-й триместр

2-й триместр

3-й триместр

Рис 6 Сравнительный анализ медианы ДГЭА-С в гестационный период в зависимости от дефекта ОУР21

С целью оптимизации диагностического поиска неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы проведена оценка значимости основных методов диагностики вне гестации На сегодняшний день в диагностике неклассической формы Р450с21 не существует единого лабораторного метода «золотого стандарта» В связи с чем результаты молекулярного анализа в нашем исследовании использованы в качестве эталона сравнения, как наиболее соответствующими действительности

Несмотря на то, что все женщины с доказанным ферментативным дефектом в исследовании имели базальный уровень 17-ОНР более 6,1 нмоль/л, диагностика неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы по изолированному его определению не представляется возможным вследствие высокого отрицательного прогностического результата (-РУ) - 92,6 % (рис 7)

Рис 7. Диагностическая ценность определения базального уровня 17-ОНР с целью верификации неклассической формы ВДКН с дефицитом 21 -гидроксилазы

Уровень 17-ОНР на пике симуляции в диапазоне 30,1 - 50,0 нмоль/л также не может рассматриваться в качестве критерия диагностики врожденной ферментопатии, так как прогностическая ценность положительного результата (+РУ) теста составляет 50 %, а молекулярно-генетический анализ не выявил в этой группе женщин мутаций, характерных для неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников с дефицитом 21-гидроксилазы

Достаточно высокой ценностью в верификации неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы обладает показатель стимулированного уровня 17-ОНР (рис 8) В нашем исследовании максимальная диагностическая специфичность 96,2 % наблюдается при уровне 17-ОНР более 50,1 нмоль/л, что с высокой вероятностью свидетельствует о неклассической форме ВДКН (+РУ) - 80 %

Рис 8 Диагностическая ценность стимулированного уровня 17-ОНР в верификации неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы

Несмотря на высокую специфичность (8р=93,8 %) и общую точность (ТА=70,4 %) сочетанного определения уровней базального и стимулированного 17-ОНР выше 6,1 нмоль/л и выше 50,1 нмоль/л соответственно, прогностическая цешюсть положительного результата (+РУ) составляет также 80 %, не увеличивая, таким образом, прогностическую цешюсть положительного результата при изолированном определении стимулированного уровня аналита более 50,1 нмоль/л

Основываясь на полученных данных о наличии неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы у женщин вне гестации, нами проведена оценка диагностической значимости определения 17-ОНР и ДГЭА-С в первом триместре беременности

Специфичность определения 17-ОНР в этот период для диагностики заболевания составляет 25 % (рис 9) Низкий показатель специфичности свидетельствует о значительном количестве ложноположительных результатов при проведении диагностики неклассической формы Р450с21 в 1-й триместр беременности с использованием существующей лабораторной нормы Определение концентрации 17-ОНР в 1-й триместр беременности более 12,1 нг/мл, по нашему мнению, не является значимым биохимическим критерием неклассической формы ВДКН, обладая высоким отрицательным прогностическим результатом - 83,3 % и малой диагностической эффективностью - 23,8 %

Рис. 9 Ценность определения 17-ОНР в 1-й триместр гестации в диагностике неклассической формы 21-гидроксилазной недостаточности

Специфичность определения ДГЭА-С в первом триместре, как маркера адреналовой гиперандрогении, составляет только 15 %. Высокая диагностическая чувствительность метода - 80 %, прогностическая ценность отрицательного результата 85,7 %, не позволяют верифицировать неклассическую форму при повышении данного стероида относительно существующей лабораторной нормы

Таким образом, диагностика неклассической формы 21-гидроксилазной недостаточности должна проводиться на этапе планирования беременности с обязательным включением следующих этапов (рис 10)

Базальный уровень 17-ОНР N Гдо 6,0 нмоль/л)

4

Стимулированный 17-ОНР до 50,0 нмоль/л

Стимулированный 17-ОНР более 50,1 нмоль/л

I

Мо некулярно-генетический анализ

Другие виды гиперандрогении

Гетерозиготное носительство недостаточности Р450с21

Неклассическая форма ВДКН с дефицитом 21 -гидрокси лазы

Рис 10 Алгоритм диагностики неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников при недостаточности 21-гидроксилазы

Выводы

1 Значения ДГЭА-С и 17-ОНР, рассматриваемые в качестве гормональных критериев диагностики неклассической формы ВДКН в период гестации, обладают низкой специфичностью (15 % и 25 % соответственно для каждого метаболита) Прогностическая ценность отрицательного результата для 17-ОНР составляет 83,3 %, для ДГЭА-С - 85,7 % Изменение концентрации метаболитов следует рассматривать как следствие физиологических особенностей стероидогенеза в этот период

2 В исследовании не выявлены достоверно значимые клинические маркеры неклассической формы ВДКН у женщин вне гестации Изолированное определение базального уровня основного патогенетического маркера недостаточности 21-гидроксилазы 17-ОНР не позволяет диагностировать неклассическую форму заболевания в 92,6 %

3. Эффективным методом диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы следует считать проведете стимуляционной пробы с синтетическим аналогом АКТГ продленного действия Вероятность наличия заболевания при стимулированном аналогом АКТГ уровне 17-ОНР более 50,1 нмоль/л составляет 80 % Сочетанное определение высокого базального уровня 17-ОНР (более 6,1 нмоль/л) и высокого стимулированного уровня 17-ОНР (более 50,1 нмоль/л) не повышает диагностическую ценность метода

4 Наиболее распространенными мутациями в гене СУР21 в женской популяции г Тюмени являются" 30 кЪ сЫ, Р105Ь, Р281Ь, Р453Б, У237Е. На основании выявленных мутаций частота неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы у беременных женщин с лабораторными признаками гиперандрогении составила 9%

Практические рекомендации

1. Диагностика неклассической формы ВДКН должна проводиться на этапе планирования беременности среди женщин с ранним адренархе в анамнезе, нарушением менструальной функции, первичным бесплодием

2 Биохимическая диагностика неклассической формы ВДКН вне периода гестации должна основываться на проведении гормональной пробы с пролонгированным аналогом АКТГ (синактен-депо в дозе 1 мг) с определением концентрации 17-ОНР до и через 9 часов после стимуляции Стимулированный уровень 17-ОНР более 50,1 нмоль/л при любом значении базальной концентрации 17-ОНР в 80% подтверждает наличие неклассической формы ВДКН у пациентки

3 Проведение молекулярно-генетического исследования для уточнения наличия неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы следует рекомендовать пациенткам с уровнем 17-ОНР на пике стимуляции аналогом АКТГ в диапазоне от 30,1 до 50,0 нмоль/л

4. Молекулярно-генетический анализ является методом выбора при диагностике неклассической формы 21-гидроксилазной недостаточности в период гестации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Уровень дегидроэпиандростерон-сульфата у беременных женщин г Тюмени / Л А Суплотова, Е Б Храмова, О.Б Макарова, И.И. Кукарекая, Н С Брынза, О.Б Старкова, С В Фомина, Н Ю. Южакова // Медицинская наука и образование Урала - 2004. - № 3 - 4. - С. 92

2. Возрастная динамика дегидроэпиандростерон-сульфата у лиц женского пола г Тюмени / Н.Ю Южакова, Е Б. Храмова, С Н Суплотов, О Б Макарова, О Б Старкова, С В Фомина // Медицинская наука и образование Урала -2004 -№3-4 - С 106

3. Возрастная динамика дегидроэпиандростерон-сульфата в женской популяции г Тюмени / Л.А. Суплотова, Е.Б. Храмова, Н Ю Южакова, О Б Макарова, О Б Старкова, С В Фомина, Н В Аксенова // Материалы терапевтического форума Тезисы докладов. - Тюмень -2005.-С. 71.

4. Скрининг беременных женщин на врожденную дисфункцию коры надпочечников результаты и перспективы / Л.А Суплотова, Е Б Храмова, О Б Макарова, И И. Кукарекая, Н С Брынза, О Б Старкова, С В Фомина // Проблемы эндокринологии -2005.-№ 6.-С 12-14

5 Дифференциальная диагностика гиперандрогении у женщин / Л А Суплотова, Е.Б Храмова, О.Б Старкова, ОБ Макарова, С.В Фомина // Издательский центр «Академия» - Тюмень - 2005. - 48 с. (пособие для врачей)

6. Неклассические формы врожденной дисфункции коры надпочечников / Л А Суплотова, ЕБ Храмова, ОБ Старкова, ОБ Макарова, С В Фомина // Издательский центр «Академия» - Тюмень. - 2005. - 48 с. (пособие для врачей).

7 Влияние повышенного уровня дегидроэшандростерона-сульфата как основного маркера гиперандрогении надпочечникового генеза на течение беременности и родов / Л А Суплотова, Е.Б Храмова, О Б Старкова, С В Фомина, И И Кукарекая // Медицинская наука и образование Урала - 2006 -№ 1 -С 61 -62

8 Молекулярная диагностика неклассической формы недостаточности фер мента 21-гидрокасилазы первые результаты / Е.Б. Храмова, Л.А Суплотова, С В Фомина, С А Прокофьев // Медицинская наука и образование Урала -2006 - № 4. - С 84 - 86.

Список сокращений

АКТГ адренокортнкотропный гормон

ВДКН врожденная дисфункция коры надпочечников

ДГЭА-С дегидроэпиандростерон-сульфат

ДИ доверительный интервал

ицн истмико-цервикальная недостаточность

ПЦР полимеразная цепная реакция

хмпн хроническая маточно-плацентарная недостаточность

17-ОНР 17-гидроксипрогестерон

Р450с21 микросомальный фермент 21 -гидроксилазы

Se диагностическая чувствительность (Sensitivity)

Sp диагностическая специфичность (Specificity)

ТА общая точность метода (Total Accuracy)

Me медиана

-PV прогностическая ценность отрицательного результата

(Negative Prognostic Vaiue)

+PV прогностическая ценность положительного результата

(Positive Prognostic Vaiue)

ФОМИНА Светлана Викторовна

КЛИНИЧЕСКАЯ, ГОРМОНАЛЬНАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА НЕКЛАССИЧЕСКОЙ ФОРМЫ 21-ГИДРОКСИЛАЗНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ В ЖЕНСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

14.00.03 - Эндокринология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 21 02 2007 Формат 60x84/16 Бумага Xerox PerfectPrint Печать Riso Уч-изд л 1,0 Тираж 100. Заказ 86

Типография «Автограф-VIP». ОКВЭД 22.22 (полиграфическая деятельность). Свидетельство ОГРН № 1067203347420 от 12. 09 2006 г.

Отпечатано с готового набора в типографии «Автограф-W». 625000, г. Тюмень, ул Луначарского, 53 Тел : (3452) 43-50-63,78-43-02