Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клеточный состав пуповинной крови при неосложненной и патологической беременности

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ДЕТСКОЙ ГЕМАТОЛОГИИ

. _ На правах рукописи

РГ Б ОД

; , г, и7 '¡С"'^

$ ии! АЛЕКСЕЕВ Игорь Викторович

КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ПРИ НЕОСЛОЖНЕННОЙ И ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ

14.00.09 - педиатрия

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских: наук.

Москва - 1995

Работа выполнена в НИИ Детской Гематологии (директор института: член-корр. РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев).

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Е.Б. ВЛАДИМИРСКАЯ Доктор медицинских наук, профессор H.H. ВОЛОДИН

Официальные оппоненты:

Член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Н.С.Кисляк. Доктор медицинских наук, профессор Л.Г.Ковалева.

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский Институт Педиатрии РАМН.

Защита диссертации состоится «_»_1995 г. в_час. на

заседании специализированного совета Д.084.61.01. в НИИ Детской Гематологии МЗ и МП РФ (117513, Москва, Ленинский проспект, л.117).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ Детской Гематолопш.

Автореферат разослан «_»_1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета Доктор медицинских наук, профессор. Заслуженный врач России

А.Ф.Бухны

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Пуповшшая кровь представляет интерес дня оценки кроветворения плода на последних неделях гестации и в связи с возможностью использования репопули-рующих кроветворных клеток пуповинной крови для трансплантации при некоторых гематологических заболеваниях (Кисляк Н.С., 1981; Broxmeyer Н. et al.,1989).

Первые положительные результаты таких трансплантаций способствовали развитию практических методов выделения и консервации гемопоэтическнх предшественников из пуповинной крови (Harris D. et al.,1994). Тем не менее, все еще отсутствует стандартизация в оценке содержании этих клеток в пуповиной крови и данные разных авторов значительно различаются, что может быть связано с использованием различных методик культивирования и делает результаты трудносопоставимыми (Торубарова Н.А. и ¿р., 1983; Knudtzon S., 1974; Broxmeyer Н. etal. 1993;Harris D. et al.,1994; Issagrissil S., 1984).

Среди факторов, влияющих на концентрацию гемопоэтическнх предшественников в пуповинной крови многие исследователи указывают на течение беременности, и, прежде всего, перенесенную гипоксию (Торубарова Н.А. и др.,1993), однако пока неясно каким образом другие виды патологии беременностн (нефропатия беременных, угроза выкидыша, скоррегированная железодефицитная анемия) сказывается на клеточном составе пуповинной крови и может ли пуповинная кровь при патологической берменности рассматриваться в качестве источника пригодных для трансплантации кроветворных клеток.

Противоречивые данные имеются в отношении клеточного состава пуповинной крови при преждевременных родах, соотношения форменных элементов, количества и свойств клеток пула кроветворных предшественников, используемых для трансплантации (Торубарова Н.А. и др.,1983; Knudtzon S., 1974; Issagrissil S., 1984; Broxmeyer H. et al. 1993).

Исходя из изложенного, нам представляется актуальным оценить клеточный состав пуповинной крови и определить количество и пролиферативный потенциал гранулоцитарио-макрофагальных пред-шественников пуповинной крови при неосяолсенной и патологической беременности, срочных и преждевременных родах, а также сравнить две культуральные методики исследования кроветворных предшественников пуповинной крови - культивирование в системе "агаровая капля - жидкая среда" и культивирование в меггилцешполозе.

Цель исследования

Оценить клеточный состав пуповшшой крови при неосложненной беременности и наиболее часто встречающихся видах патологии беременности, при срочных и преждевременных родах, и определить каким образом патологическая беременность и преждевременные роды сказываются на количестве и пролифера-тивном потенциале гранулоцитарно-макрофагальных предшественников пуповин-ной крови.

Задачи исследования

1. Определить взаимосвязь различных клеточных популяций пуповинной крови при неосложненной беременности.

2. Сравнить клеточный состав пуповинной крови при срочных и преждевременных родах.

3. Сравнить клеточный состав пуповинной крови при неосложненной беременности, скоррегированной железодефицитной анемии беременных, нефропатии беременных и угрозе выкидыша.

4. Оценить количество и пролиферативный потенциал гранулоцитарно-макрофагальных предшественников пуповинной крови при неосложенной и патологической беременности.

5. Оценить пригодность пуповинной крови при патологической беременности в качестве потенциального источника кроветворных предшественников для трансплантации.

6. Сравнить результаты исследования кроветворных предшественников пуповинной крови по методике клоногенного культивирования в системе "агаровая капля - жидкая среда" и в метилцеялюлозе с рекомбинантными ростовыми факторами.

Научная новизна

Впервые изучено влияние патологии беременности на клеточный состав, количество и пролиферативный потенциал гранулоцитарно-макрофагальных предшественников пуповинной крови.

Скоррегированная железодефицнтная анемия, нефропатия беременных и угроза выкидыша не влияют на клеточный состав пуповшшой крови и не сказываются как на количестве, пролиферативном потенциале гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, так и на морфолоши гранулоцитарно-макрофагальных колоний пуповинной крови.

Абсолютное количество клеток гранулоцитарного ряда в последнем триместре беременности увеличивается, а мононуклеарной фракции пуповинной крови уменьшается. Гранупоцитарно-макрофагальных предшественников в пуповинной крови преждевременных родов содержится достоверно больше по сравнению с пуповинной кровью срочных родов, и они обладают достоверно более высоким пролиферативным потенциалом. Преобладающими колониями в том и в другом случае являются гранулоцитарные, составившие почти половину всех колоний.

Впервые показано, что клоногенное культивирование как в агаровой системе, так и в метилцеллюлозе позволяет определять весь спектр клеток гранулоцитарного ряда пуповинной крови от полипотентных до унипотентных коммутированных. Чувствительность и точность обеих методик в отношении этих клеток одинакова.

Практическая ценность

Получены референтные данные для оценки количества и пролиферативного потенциала гемопоэтических клеток пуповинной крови.

Показано, что пуповинная кровь при осложненной беременности может рассматриваться в качестве потенциального источника гемопоэтических клеток для трансплантации.

Показана пригодность метода клоногенного культивирования кроветворных предшественников в системе "агаровая капля - жидкая среда" для оценки количества и пролиферативного потенциала кроветворных предшественников пуповинной крови.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты работы используются в НИИ Детской Гематологии и Республиканской Детской Клинической Больнице при подготовке кроветворных предшественников пуповинной крови дая трансплантаций. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Апробация работы

Работа обсуждалась на конференции лаборатории регуляции кроветворения НИИ Детской гематологии. Предварительные результаты работы были доложены на заседании ученого совета НИИ Детской Гематологии в мае 1995 г. Результаты работы были доложены на 25-м конгрессе Европейского Общества Детских Гематологов и Иммунологоа (г. Биирен, Германия) 23-26 августа 1995 г.

Материалы диссертации апробированы на совместной конференции сотрудников клинических и лабораторных отделов НИИ Детской Гематологии МЗ и МП РФ 25 сентября 1995 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание используемых материалов и методов исследований, 3 главы, посвященные результатам собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы. Работа

содержит _ таблиц и _ графиков, занимает _ страниц машинописного

текста. Библиография включает 37 источников отечественной и 187 источников иностранной литературы.

Работа выполнена в лаборатории регуляции кроветворения НИИ Детской Гематологии (зав. лабораторией: канд. мед. наук. Н.В. Замараева), Кафедре неонатологии Российского Государственного Медицинского Университета (зав. кафедрой - доктор мед. наук, проф. Н.Н.Володин), в 8-й больнице и родильном доме г. Москвы (гл.врач - Е.А.Степанова), в 4-м родильном доме г. Москвы (гл.врач - Т.А. Абаева).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

В соответствии с поставленной целью и для решения задач данного исследования мы изучали клеточный состав пуповинной крови при срочных и преждевременных родах, при неосложненной беременности и наиболее часто встречающихся видах патологии беременности.

Гестационный срок новорожденных детей определяли по времени последней менструации у матери и на основании клинической оценки зрелости недоношенных по шкале Дубонич с использованием средних статистических показателей основных параметров в зависимости от срока гестации и оценочным таблицам, построенным по принципу перцинтеяей (Абрамов Б.Д. и др., 1975). Дети с показателями массы тела, длины, окружности головы и груди в пределах средних величин (М±2 сигмы или от Рю до Р75 ) и гестационным сроком 39-40 недель отнесены в группу доношенных детей (п=38), а гестационным сроком 28-36 недель - в ipynny преждевременных родов (п=11).

При оценке состояния новорожденного учитывались оценка по шкале Ап-гар, тяжесть состояния ребенка после рождения, динамика в изменении состояния новорожденного в раннем неонатальном периоде, а также данные акушерского анамнеза матери, состояние ее здоровья, особенности течения беременности и родов (Дементьева Г., 1985).

В зависимости от особенностей течения беременности по данным медицинской документации случаи, вошедшие в группу срочных родов, были разделены на 4 подгруппы:

- Беременность, осложненная железодефицитной анемией (п=9).

В эту группу вошли случаи, при которых у женщин в I-III триместрах беременности наблюдалось снижение уровня гемоглобина до 90 г/л., подтвержденное снижением уровня сывороточного железа. Все женщины получали адекватное лечение препаратами железа. К моменту родов у всех женщин этой группы был нормальный уровень гемоглобина 128-179 г/л и эритроцитов 3.62-5.52*1012/л.

- Нефропатия беременных (умеренная форма) (п=б).

Диагноз ставился на основании:

- повышение диастолического давления от 80 до 100 мм рт. ст.

- протеинурня менее 0.6 г/л.

- нормальный уровнень креатинина сыворотки.

- отсутствие признаков задержки развития плода.

- отсутствие тромбоцитопении.

- Угроза выкидыша (п=б).

В эту группу отнесены женщины с гетерогенной патологией, которая реально могла привести к самопроизвольному прерыванию беременности. Диагноз устанавливался в соответствии с рекомендациями ВОЗ по безболезненным влагалищным кровотечениям на сроке до 24 недель.

- Неосложненная беременность (п=10).

Группа случаев, при которых течение беременности не сопровождалось какими-либо патологическими состояниями.

Взятие 20 мл. пуповинной крови производилось на 1-ой минуте после рождения ребенка с помощью шприца, объемом 20 мл., содержащего 2 мл. среды McCoy's и 600 ед. гепарина с соблюдением правил асептики. Отдельно набиралась пуповинная кровь в количестве 4 мл. в пластиковые пробирки объемом 4 мл., содержащие раствор ЭДТА.

Пробирки с кровью хранились при комнатной температуре не более 10 часов до начала работы.

Общий анализ крови производился одновременно двумя методами:

- С помощью автоматического счетчика Argos Cobos 5 с определением уровней эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, тромбоцитов и вычислением лейкоцитарной формулы (п=30).

- Под световым микроскопом с подсчетом уровня лейкоцитов в камере Го-ряева и определением лейкоцитарной формулы и уровня нормобласгов на препаратах-мазках (п=24).

Фракцию мононуклеаров, содержащую клетки-предшественники, получали путем центрифугирования при скорости 1800 об/мин. в течении 40 мин. при 4°С в градиенте плотности Ficoll-Paque (плотность 1,077 г/мл). Клетки отмывались однократно средой IMDM с 2% ЭТС, после чего производился подсчет мононуклеаров в суспензии в камере Горяева с определением их жизнеспособности при помощи окраски трипановым синим. Затем суспензию клеток разводили полной средой McCoy's с таким расчетом, чтобы в 1 мл. конечного объема взвеси содержалось 1*107 клеггок.

Для определения колониеобразующей способности кроветворных клеток в пуповинной крови применялся метод Pike, Robinson, модифицированный в систему "агаровая капля - жидкая среда" (Афанасьев Б.В. и др.,1983) и метод клоноген-ного культивирования в метилцеялюлозе с применением рекомбинантных ростовых факторов {Broxmeyer И., 1989).

Колониеобразующую способность (КОС) и кластеробразующую способность (КлОС) оценивали по числу колоний (малые, содержащие 20-40 клеток,

средние - 41-100 клеток и большие - более 100 клеток) и кластеров (большие кластеры - 10-19 клеток и малые кластеры - 5-9 клеток). По сумме числа колоний и кластеров определяли эффективность клонирования, расчитывая ее на 1*105 экс-плантированных клеток. Для вычисления абсолютного количества предшественников в 1 мкл. пунктата полученные величины эффективности клонирования умножали на количество клсток-миелокариоцитоп в 1 мкл. пунктата, деленное на 105. Дополнительно определялось отношение колоний и кластеров и процент больших колоний в культурах. По этим показателям оценивали пролиферативный потенциал тестируемых клеток.

Морфологию клеточных агрегатов изучали по методу 5.5а/отоп и Я.Вшк, 1979 в модификации М.А.Френкель и др.,1982.

Оценка результатов культивирования в метилделлюлозе производилась по методике Вгохтеуег Н.,1989. Данные о проведенных иссследованиях представлены в таблице 1.

Количество проведенных исследований колониеобразующей способности клеток-

предшественников гравуломоноцнтопоэза в пуиовннион крови новорожденных

Табдида 1_

Группы обследованных Агаровая капля-жидкая среда Метилцеллюлоза

Срочные роды (39-40 нед.) 41 10

Из них:

- скоррегированная железодефицитиая анемия 9 -

- нефропатия 6 _

- угроза выкидыша. 6 _

- неосложненная беременность. 10 _

- без учета патологии беременности. 10 10

Преждевр роды (28-36 нед). 11 -

Всего проведено 52 исследования в системе "агаровая капля - жидкая среда" и 10 исследований в метсэтцеллюлозе. Проведено 46 исследований морфологии колоний в системе "агаровая капля - жидкая среда" и 10 исследований морфологии колоний в метнлцеялюлозе

Статистический анализ данных проведен методом вариационной статистики с помощью программы Microsoft Excel 5.0 с определением средней величины, стандартного отклонения, критериев различия по Стыоденту, корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка клеточного состава пуповинной крови требует точного подсчета лейкоцитарной формулы и количества клеток мононуклеарной фракции. Это оказалось невозможным при использовании автоматического счетчика Argos Cobos 5, так как автоматический счетчик не распознавал нормобласты и молодые клетки гранулоцитарного ряда, относя их к группам нераспознаваемых клеток и лимфоцитов. Изучение клеточного состава пуповинной крови в нашей работе производился вручную с помощью светового микроскопа.

Сравнение абсолютных количеств клеток лейкоцитарного пупа пуповинной крови при преждевременных и срочных родах показало, что абсолютное количество клеток гранулоцитарного ряда перед родами увеличивается, а мононуклеарной фракции пуповинной крови уменьшается (таблица 2).

Состав лейкоцитарного пула пуповинной кр^ри при преждевременных и срочных родах (*№ /л)

Таблица 2_

Группы Показатели Преждевременные роды Срочные роды

Гранупоциты

- миелоциты 0.66±0.34 0.55±0.17

- палочкоядерные <№±1.14 1.83±0.57

- сегментоядерные 4.15±1.70 7.52±2.37

- эозинофильные 0.49±0.22 0.36±0.11

Мононуклеары

- лимфоциты 7.98±4.02 6.42±2.02

- моноциты 2.32±1.03 1.б5±0.52

CFU-GM (в 1 мл. крови) 25911+27541 6374±6876

Примечание: В таблице указаны средние значения исследуемого показателя ± сигма.

Таким образом, перед родами происходит уменьшение абсолютного количества клеток мононуклеарной фракции и увеличение абсолютного количества гранулоцитов, выполняющих защитную функцию, что, вероятно, имеет важное физиологическое значение. В целом, эти данные согласуются с показанным

ранее нарастанием количества гранулоцитов, особенно пыраженпмм с 31 недели гссгации (Davies N. et al.,1992).

Одновременно оказалось, что количество гранулоиитарных клеток иуповипной крови не коррелируют с уровнем лимфоцитов и клеток мононуклеарной фракции (г=0,435; р>0.05) и (i^0,392; р>0.05) соответственно. Следовательно, эти клеточные популяции пуповшшой крови не связаны между собой, т.е. соотношение этих клеток не определяется ни их способностью проходить через костно-мозюпой барьер, ни какими-либо общими механизмами регуляции кроветворения.

Уменьшение абсолютною количества клеток мононуклеарной фракции, по нашим данным, в последние исцели гестации сопровождается снижением количества гранулоцитарно-макрофагальных предшественников пуповинной крови. Гранулоцитарно-макрофагалышх предшественников в пуповинной крови преждевременных родов содержится достоверно больше по сравнению с пуповинной кровью срочных родов (25911±27541 и 6374±6876 соответственно (р<0.05)), что совпадает с данными других источников (Мшпюрова Л.,I9SS, Lynch D. et al., 1982).

Количество гранулоцитарно-макрофагальных предшественников пуповинной крови срочных родов очень сильно коррелирует с уровнем лимфоцитов (г=0,737; р<0.01). Несколько меньшая степень корреляции наблюдалась между гранулоцитарно-макрофагальными предшественниками и количеством клеток мононуклеарной фракции (г=0,б73; р<0.05). Связь между количеством гранулоцитарно-макрофагальных предшественников и уровнем лейкоцитов оказалась еще слабее (г=0,463; р<0.05). И, наконец, между количеством гранулоцитарно-макрофагалышх предшественников и уровнем гранулоцитов связи не было совсем (г=0,198; р>0.05).

В 6 случаях мы определили количество CD34+- клеток, являющихся самыми ранними кроветворными предшественниками. Их среднее количество оказалось равным 0,5% фракции монолуклеаров или 0,04*10'/л., что очень близко к данным литературных источников (Mayani Н. et al., 1993). Учитывая, что объем крови в системе "пуповина-плацента" составляет в среднем 160 мл. (Harris D. et al,1994), общее число CD34+ клеток достигло в исследованных случаях 6,4* 106 . Этого количества, по мнению многих исследователей (Bertolini F. et al., 1993; Broxmeyer H. et al 1992) достаточно для успешной трансплантации как детям, гак и взрослым.

Коэффициент корреляции между количеством гранулоцитарно-макрофагальных предшественников и количеством CD34+ клеток в наших случаях оказался хотя и ниже статистически значимого, но довольно близок к нему

(р=0.09). Видимо, здесь сыграло роль то обстоятельство, что методика культивирования "агаровая капля-жидкая среда" является селективной в отношении более зрелых предшественников кроветворения, не несущих этот маркер и это сказывается при сравнении получаемых результатов.

Пролиферативный потенциал гранулоцитарно-макрофагальных предшественников определялся с помощью двух индексов: процентного содержания больших колоний и соотношения числа колоний и кластеров. Гранулоцитарно-макрофагальные предшественники пуповинной крови преждевременных родов обладают достоверно более высоким пролиферативным потенциалом по сравнению со срочными родами как по процентному содержанию больших колоний, так и по отношению колоний и кластеров (таблица 3), что совпало с ранее опубликованными данными других источников (Митюрова Jl.,1988; Lynch D. et al., 1982).

Пролиферативный потенциал CFU-GM при преждевременных и срочных родах

Таблица 3

Показатель Преждевременные роды Срочные роды Достоверность различий

% больших колоний 13.3±5.6 5.8±3.4 р<0.05

колонии/кластеры 6.8±3.2 1.3+1.2 р<0.05

Данные разных авторов о морфологии грануломоноцитарных колоний в агаровых культурах расходятся. По некоторым сообщениям, в культуре преобладают колонии моноцитарно-макрофагального типа, хотя встречаются только гра-нулоцитарные или только эозипоф ильные колонии (Торубарова Н.А. и др. 1993; Ijima Н. et al, 1981; Lynch D. et al, 1982). Другие же источники указывают на преобладание грапулоцитарных колоний, а наличие большого количества макро-фагальных колоний объясняют несовершенством методики исследования (Fauser Л. et al. 1978; Knudtzon S. et al., 1974).

Сравнение, по нашим данным, морфологии гранулоцитарно-макрофагальных предшественников пуповинной крови срочных и прежде-временных родов показывает, что преобладающими колониямии в том и в другом случае являются гранулоцитарные, составившие почти половину всех колоний (график 1). Доля макрофагалшых и гранулоцитарно-макрофагальных колоний также оказалась практически равной как при срочных так и при преждевременных родах.

График 1. Морфология колоний СЩ-ОМ пуповинной крови при преждевременных и срочных родах

Преждевр. роды

Срочные . роды

а ^ -

27

В Грануяоцитарно-макрофагальные

□ Макрофагапъиыс

□ Гранулоцитарные

80%

100%

Таким образом, пуповинная кровь преждевременных родов содержит гораздо большее количество гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, которые, к тому же, обладают большим лролиферативиым потенциалом. Преобладающими среди предшественников гранулоцитарно-макрофагального ряда последнего триместра являются гранулоцитарные предшественники.

Для выяснения того, как влияет патология беременности на клеточный состав пуповинной крови, случаи исследования были разделены на 4 группы: скоррегированная жёлезодефицитная анемия (п=9), нефропатия беременных (п=6), угроза выкидыша (п=б) и группа контроля (п=10), которая не сопровождалась какими-либо отклонениями в течении беременности.

Сравнение уровней лейкоцитов в этих группах исследования показало, что различия между ними по этому признаку не являются статистически значимыми. Та же тенденция сохранилась и при сравнении уровней клеток мононуклеарной фракции в группах исследования. Ни в одной из них не было статистически достоверных различий с группой контроля.

Количество гранулоцитарно-макрофагальных предшественников во всех группах исследованияпо, по нашим данным, также достоверно не различалось (таблица 4).

Состав клеточного пула пупосшшой крови при патологических родах по сравнению с группой контроля

ТаСшипя 4_

Показатели Группы п Лейкоциты (109/л) Мононуклеары (109/л) CFU-GM (в 1 мл. кронн).

I. Анемия 9 16.9±2.3 8.733±.03 72484±041

II. Нефронатия 6 16.5±5.01 7.2±4.0 7644±1188

III. У/роза выкидыша 6 П.2±2.0 8.15±1.3 5381±5704

IV. Контроль 10 18.7+4.2 9 Л ±3.2 7726+3932

Достоверность различия

I : IV р>0.05 р>0.05 р>0.05

II: IV р>0.05 р>0.05 р>0.05

Ш : IV р>0.05 р>0.05 р>0.05

Примечание: В таблице указаны средние значения исследуемого показателя ± сигма и значение коэффициента р, ассоциированного с /-критерием Стьюдента.

Пролиферативный потенциал CFU-GM при патологической и неосложненной беременности

Таблица 5

Показатели Группы п % больших колоний колонии/кластеры

I. Анемия 9 4.5±2.3 0.8±0.4

II. Нефропатия 6 4.23±2.9 0.6±0.4

III. Угроза выкидыша 6 б.0±4.1 1.9±1.1

IV. Контроль 10 2.84±1.9 0.9±0.б

Достоверность различия

I : IV р>0.05 р>0.05

II : IV р>0.05 р>0.05

III : IV р>0.05 р>0.05

Примечание: В таблице указаны средние значения исследуемого показателя ± сигма и значение коэффициента р, ассоциированного с 1-кршперием Стьюдента.

Пролиферативиый потенциал гранулоцитарно-макрофагальных предшественников оценивался с помощью двух показателей: процентному содержанию больших колоний и соотношению колоний и кластеров (табл. 5). Статистически достоверных различий в пролиферативном потенциале гранулоцитарно-макрофагальных предшественников патологачесхих групп по сравнению с группой контроля найдено не было.

Морфологический состав колоний гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в исследованных группах существенно не различался (график 2).

График 2. Морфология гранулоцитарно-макрофагальных предшественников пуповинной крови патологических групп и группы контроля (%).

Угроза выкидыша

Нефропатия Анемия

I Гранулоцитарно-макрофагальные □ Макрофагалыше Q Гранулоцитарные

Контроль

20

40

60

80

Около половины всех колоний были гранулоцитарными, а среди остальных одинаково часто встречались как макрофагалыше, так и гранулоцитарно-макрофагальные колонии.

Данные литературы о влияния патологии беременности на количество и пролиферативный потенциал гранулоцитарно-макрофагальных предшест-венников скудны и противоречивы. По данным одних авторов (Дунцова Е.Ф.,1973) содержание железа в периферической крови значительно ниже у детей , родившихся от матерей с дефицитом этого элемента. По данным других авторов (Beck W.,1994) плод не страдает от железодефицитной анемии даже в случае глубокой железодефицитной анемии беременной.

Ках следует из наших данных, скоррегированная железодефицитиая анемия не сказывается на клеточном составе пуповинной крови. Данных в отношении влияния нефропатии беременных и . >.рсш>; выкидыша на количество и пролиферативный потенциал кроветворных предшественников в доступной литературе нам обнаружить не удалось.

Таким образом, на основании представленных данных можно сделать вывод, что исследованная патология беременности не влияет на клеточный состав пуповинной крови и не сказывается ни на количестве, ни на пролнферативном потенциале, ни на морфологии гранулоцитарно-макрофагальных колоний пуповинной крови.

Поскольку в настоящее время для исследования количества и функциональных свойств кроветворных предшественников используются 2 основные методики клоногенного культивирования - в агаровой системе, разновидностью которой является система "агаровая капля - жидкая среда" и культивирование в метилцеллюлозе, возникает вопрос о сопоставимости получаемых данных.

Чтобы ответить на него мы провели паралелльное исследование кроветворных предшественников в обеих системах (п=10). Оказалось, что эффективность клонирования кроветворных предшественников при культивировании в метилцеллюлозе достоверно выше, чем в агаровой системе: 10б75±4190 и 6288±4028 соответственно (р<0.05)). Столь существенные различия в результатах при исследовании одних и тех же случаев объясняются разными условиями культивирования по двум методикам. Культивирование в агаровой системе в нашем эксперименте позволяет определять количество гранулоцитарных, макрофагальных и гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, а в метилцеллюлозе с ростовыми факторами выявляются еще эритровдные и полипотентные предшественников. Можно полагать, что эти методы определяют клетки различной степени зрелости.

Чтобы проверить это предположение мы сопоставили данные по эффективности клонирования предшественников различных линий дифференцировки в агаровой системе и в метилцеллюлозе. Была выявлена статистически значимая корреляционная зависимость между числом предшественников, выращенных в агаровых культурах и количеством предшественников различных уровней, выращенных в тех же случаях в метилцеллюлозе.

Она была максимальной если учитывались все клетки гранулоцитарного ряда: полипотентные коммитированные (СГО-ОЕММ), частично коммитированные (СГО-СТЛ) и унипотентные - (СГО-О) (коэффициент корреляции составил 0.8; р<0.01). Зависимость несколько снижалась если нз этой группы исключались полипотентные предшественики (г=0.77; р=0.01), и становилась еще ниже при исключении частично коммитированных предшественников (г=0,б; р<0,05). Корреляция полностью отсутствовала при сопоставлении данных агаровых культур с количеством эритроидных (СП_Г-Е) и макрофагальных предшественников (СГО-М).

Кроме того, в абсолютных значениях данные по эффективности клонирования в агаровой системе практически совпали с суммой полипотентных коммитированных, частично коммитированных и унипотентных предшественников гранулоцитов по данным культивирования в метилцеллюлозе: 6288±4028 и 6561±3509 соответственно.

Таким образом, клоногенное культивирование как в агаровой системе, так и в метилцеллюлозе позволяет определять весь спектр клеток гранулоцитарного ряда от полипотентных до унипотентных коммитированных. Чувствительность и точность обеих методик в отношении этих клеток одинакова.

График 3. Морфология колоний СГО-СМ пуповинной крови при срочных родах (агаровые культуры)

Ш Гранулоцитарные В Макрофагалъные Я Гранулоцитарно-макрофагальные

Весьма близкими оказались результаты сравнения морфологии колоний кроветворных клеток по двум методикам культивирования (графики 3 и 4). Преобладающими и в том и в другом случае оказались гранулоцитарные колонии, которые составляют чуть меньше половины всех колоний и общее количество

макрогальных и гранулоцитарно-макрофагалышх' колоний в процентном отношении почти равнялось грапупоцитарным. Количество эритроидных и смешанных колоний по данным культивирования в мегилцелшолозе составило в сумме 10%.

График 4. Состав колоний кроветворных предшественников пуповинной крови (метнлцсллюлоза).

15%

8%

2%

31%

Ш СГО-О

■сгсш исри-вм

□ С№-£

■ СТи-вЕММ

ВЫВОДЫ

1. Пуповинная кровь срочных родов содержит в среднем 8.07*109/л. (44%) клеток мононуклеарной фракции, 12.26*10%. (56%) гранулоцитов и 12 нормобластов на 100 лейкоцитов. Дгш подсчета лейкоцитарной формулы пуповинной крови нельзя использовать автоматический счетчик, не распознающий молодые формы фанулоцитов и нормобластов.

2. Между количеством клеток гранулоцитарного ряда и мононуклеарной фракции пуповинной крови срочных родов отсутствует корреляция, что говорит об отсутствии общих механизмов регуляции выхода этих клеток из костного мозга.

3. Пуповинная кровь срочных родов при неосложненной беременности содержит 772б±3932 гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в 1 мл., из которых преобладающими (47%) являются гранулоцитарные предшественники; количество С034+ клеток пуповинной крови срочных рродов составляет 0,5 % от количества клеток мононуклеарной фракции.

4. Пуповинная кровь при преждевременных родах содержит достоверно больше клеток мононуклеарной фракции (10.3*109/л. - 63%) и гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (25911±27541), которые обладают также и более высоким пролиферативным потенциалом по сравнению с пуповинной кровью срочных родов.

5. Патологическая беременность (скоррегированная железодефицитная анемия, нефропатия и угроза выкидыша) не сказывается на клеточном составе пуповинной крови, количестве, пролиферативном потенциале и морфологии колоний гранулоцитарно-макрофагальных предшественников.

6. Методики клоногенного культивирования "агаровая капля - жидкая среда" и культивирование в метилцеллюлозе позволяет определять весь спектр коло-ниеобразующих клеток гранулоцитарного ряда пуповинной крови от полипотент-ных до унипотентных коммитированных и могут быть использованы в практической работе с пуповинной кровью.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пуповинную кровь патологических родов (скоррегированиая железодефицитная анемия, умеренная форма нефропагии беременных, угроза выкидыша) целесообразно использовать в качестве источника пригодных для трансплантации кроветворных предшественников.

2. Подсчет лейкоцитарной формулы пуповинной крови следует проводить вручную с помощью светового микроскопа.

3. Метод кпоногенного культивирования "агаровая капля - жидкая среда" может быть использован для подсчета количества и определения морфологии кроветворных предшественников пуповинной крови.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СГО-Е колониеобразующая единица эритроцитарная.

СШ-О колониеобразующая единица гранулоцигарная.

СРи-вЕММ колониеобразующая единица гранулоцигарно-

эригроцитарно- макрофагально-мегакариощггарная. Сри-вМ колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная.

СИ-Г-М колониеобразующая единица макрофагальная.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пуповинная кровь: клеточный состав и функциональные характеристики. Modern Trends in Human Leukemia IX. NEVA-WILSEDE, June 22-26, 1994. (в соавт. с Замараева Н.В., Вшынец M .Д., Осипова Е.Ю.)

2. Развитие кроветворения у плода человека (Обзор литературы). Гематология и трансфузиология (в печати), (в соавт. с Замараева Н.В., Владимирская Е.Б.).

3. Umbilical cord blood CFU-GM in pathological pregnancy. 15th Scientific Congress of the European Society for Pediatric Hematology and Immunology (ESPH1). Bingen, Germany, 23-26 August 1995. Abstract in Eur.J.Pediatr.(1995), 154, 761. (with Volynetz M.D., Osipova E.Yu., Zamarayeva N.V., Dyagterev D.N., Vladimirskaya E.B., Rumiantsev A.G.).

4. Umbilical cord blood CFU-GM after preterm and term deliveries. 15th Scientific Congress of the European Society for Pediatric Hematology and Immunology (ESPHI). Bingen, Germany, 23-26 August 1995. Abstract in EurJ.Pediatr.(1995), 154, 762. (with Volynetz M.D., Osipova E.Yu., Zamarayeva N.V., Kurmasheva N.A., Vladimirskaya E.B., Rumiantsev A.G.).

5. Umbilical cord blood as the source of hemopoietic progenitors for bone marrow transplantation in humans. XXI International Congress of pediatries. September 10-15, 1995, Cairo, Egypt, (with Vladimirskaya E.B., Volynetz M.D., Osipova E.Yu., Zamarayeva N.V., Rumiantsev A.G.).