Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Прогнозирование эффективности обработки пуповинной крови с трансплантационными целями

Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в последние годы стала важным компонентом лечения многих гематологических заболеваний, врожденных нарушений иммунной системы, наследственных анемий, некоторых болезней обмена и злокачественных новообразований (Thomas E.D., 1990; Афанасьев Б.В. и соавт. 1994; Bensinger W. et al., 1995; Schmitz N. et al., 1995; Савченко В.Г. и соавт. 1996; Румянцев А.Г., 1996; Птушкин В.В., 1997; Rubinstein P., 1999; Gluckman E., 2004); Стволовые гемопоэтические клетки для трансплантации получают из трех источников: костный мозг, периферическая кровь и пуповинная кровь (ПК). В последнее время возрастает количество трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови (ГСКПК) (Rubinstein Р., 1999; Gluckman Е., 2004, Rocha V., 2007). Большая часть трансплантаций ГСКПК приходится на детей и взрослых с низкой массой тела, из-за проблемы ограниченного объема доступной ПК, и как следствие ограниченного содержания в ней ГСК необходимых для трансплантации. Потери ГСК, на' различных этапах обработки и хранения ПК используемой в дальнейшем для трансплантации, могут быть несущественными для детей младшего возраста, но являются критическими для детей старшего возраста и взрослых (Gluckman Е., 2004, Laroche V, 2005, Rocha V., 2007).

Создание банков пуповинной крови (ПК) в значительной степени облегчает заготовку, хранение, а также поиск материала для трансплантации, что в сочетании с дешевизной получения такого материала и легкой его доступностью является предпосылкой для увеличения количества трансплантаций ГСК ПК (Wagner J. Е., 1992; Harris D. Т., 1996; Rubinstein P., 1999; Gluckman E., 2005, Rocha V., 2007).

Эффективность трансплантации во многом зависит от достаточного количества ГСК, поэтому, важным вопросом является совершенствование методов обработки клеток для обеспечения достаточного количества ГСК в трансплантате и разработка системы критериев отбраковки ПК перед началом ее обработки для помещения в хранилище

Rubinshtein P. et al. 1995; Rodriguez L. et al. 2004; Dazey В et al. 2005; Lapierre V. et al. 2007). Известно, что состав клеток ПК множества факторов и отражает течение беременности и родов, перенесенных заболеваний, а также зависит от пола и массы тела новорожденного, вида родоразрешения, сроков, прошедших после родов и сбора ПК до начала процесса обработки (Cairo M.S., 2005; Aravita S., 2005). Использование современных технологий сбора и обработки пуповинной крови в рамках международных стандартов NETCORD и FACT позволяет сократить потери клеток при сборе и обработке ПК, однако множество факторов, влияющих на клеточный состав, и, соответственно, на различную степень седиментации эритроцитов при обработке ПК (Sparrow RL., 2002; Askari S., 2005; Rocha V., 2007) делают актуальным определение прогностических факторов, на основании которых можно провести оценку пригодности ПК для хранения в качестве трансплантационного материала для неродственных трансплантаций, что позволит оптимизировать технологии заготовки трансплантационного материала банком ПК.

Цель исследования:

Усовершенствовать и внедрить критерии отбора ПК для проведения лейкоконцентрации и сохранения в банке стволовых клеток с целью получения максимально эффективного трансплантационного материала для неродственных трансплантаций.

Задачи исследования:

Определить влияние анте- и интранатальных факторов и антропометрических показателей и пола новорожденного на эффективность процедуры лейкоконцентрации ПК и сохранение в полученном материале лейкоцитов, мононуклеарных клеток, лимфоцитов и СБ34+клеток.

2.Определить влияние технологических параметров сбора и обработки ПК на количество и жизнеспособность лейкоцитов, мононуклеарных клеток, лимфоцитов и С034+клеток в полученном лейкоконцентрате ПК.

3.Изучить влияние клеточного состава ПК на эффективность процедуры лейкоконцентрации.

4.Разработать критерии прогнозирования получения стандартизованного концентрата ядерных клеток ПК.

Научная новизна

В работе впервые изучено влияние комплекса анте- и интранатальных факторов, пола и антропометрических характеристик новорожденного, технологических особенностей сбора и обработки ПК на эффективность процедуры лейкоконцентрации ПК, проводимой с целью уменьшения объема пуповинной крови для оптимального хранения в банках стволовых клеток, основанной на международных стандартах системы NETCORD. Показано, что эффективность процедуры лейкоконцентрации оптимальна при сборе крови в течение первых 5 минут после пересечения пуповины, сроке гестации от 38 до 40 недель, «чистом весе» образца ПК от 40 до 120 г и доле антикоагулянта в образце ПК от 20 до 40%. Гиперлейкоцитоз ПК более 20 х 106/мл ухудшает эффективность лейкоконцентрации, тогда как примесь нормобластов на эффективность лейкоконцентрации не влияет. Впервые показано, что на эффективность процедуры лейкоконцентрации ПК оказывает влияние количество родов в анамнезе — эффективность снижается при третьих и более родах. Другие изученные анте- и интранатальные факторы: многоплодная беременность, количество околоплодных вод, состояния хронической и острой гипоксии плода, масса плаценты, длительность безводного периода, способ родоразрешения, пол и масса тела новорожденного не оказывают влияния на эффективность процедуры лейкоконцентрации ПК.

Практическое значение

Научно-практическую значимость имеют данные о том, что сбор ПК в сроки более 5 минут после пересечения пуповины снижает эффективность процедуры лейкоконцентрации, при этом, длительное хранение (более 20 часов) собранной ПК перед проведением процедуры лейкоконцентрации увеличивает ее эффективность. Эффективность процедуры лейкоконцентрации выше при увеличении длительности периода изгнания плода более 30 минут. Большое практическое значение имеют данные о том, что образцы ПК с «чистым весом» более 120 г необходимо делить на две приблизительно равные части и обрабатывать как отдельные образцы. Научно-практическое значение имеет тот факто, что исследованные анте- и интранатальные факторы, технологические особенности с бора и обработки ПК не оказывают значимого влияния на изменение количества С034+клеток и колониеобразующей активности ПК после проведения процедуры лейкоконцентрации, а также на уровень спонтанного апоптоза и некроза лейкоцитов и ГСК.

Практическое значение выполненной работы заключается в возможности использования разработанных дополнительные критериев отбора образцов ПК для безвозмездного донорства, которые включены в относительный список противопоказаний, что позволяет оптимизировать процесс работы БСК и получать наиболее эффективный трансплантационный материал.

выводы

1. Анте- и интранатальные факторы: многоплодная беременность, количество околоплодных вод, состояния хронической и острой гипоксии плода, масса плаценты, длительность безводного периода, способ родоразрешения, пол и масса тела новорожденного не оказывают влияния на эффективность процедуры лейкоконцентрации ПК.

2. Эффективность процедуры лейкоконцентрации уменьшается при сборе ПК при третьих и более родах, увеличивается при наличии в анамнезе матери анемии беременных в первой половине беременности, угрозы прерывания беременности во второй половине и инфекционных заболеваний матери, не являющихся противопоказанием к донорству, во второй половине беременности. Максимальная эффективность выделения мононуклеарных клеток (80,11%±0,95, />=0,025) наблюдается при сроке гестации 39 недель, при сроке гестации менее 38 и более 40 недель эффективность процедуры лейкоконцентрации значительно ниже.

3. При сборе крови в сроки более 5 минут после пересечения пуповины эффективность процедуры лейкоконцентрации снижается, при этом, длительное хранение собранной ПК перед проведением процедуры лейкоконцентрации увеличивает ее эффективность. Эффективность процедуры лейкоконцентрации выше при увеличении длительности периода изгнания плода более 30 минут.

4. Эффективность процедуры лейкоконцентрации повышается при увеличении процентного содержания антикоагулянта в образце ПК. Максимальная эффективность процедуры лейкоконцентрации наблюдается при «чистом весе» образца ПК от 60 до 120 г и содержании антикоагулянта в образце в пределах 20 — 40%.

5. Эффективность процедуры лейкоконцентрации зависит от количества лейкоцитов и не зависит от количества нормобластов в ПК. Чем больше содержание лейкоцитов в ПК, тем меньше эффективность лейкоконцентрации, при количестве лейкоцитов в ПК более 20 х 10б/мл эффективность лейкоконцентрации снижается значительно.

6. Исследованные анте- и интранатальные факторы, технологические особенности с бора и обработки ПК не оказывают значимого влияния на изменение количества и уровня спонтанного апоптоза С034+клеток и колониеобразующей активности ПК после проведения процедуры лейкоконцентрации.

7. Разработаны дополнительные критерии отбора образцов ПК для безвозмездного донорства, которые включены в относительный список противопоказаний, что позволило оптимизировать процесс работы БСК и получать наиболее эффективный трансплантационный материал.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется включить в число относительных противопоказаний для безвозмездного донорства ПК, следующие особенности течения беременности и учитывать их при наличии большого количества доноров, когда число поступивших в БСК образцов превышает количество, обрабатываемое за одну смену (кроме истинных доноров): анемия беременных во второй половине беременности; угроза прерывания беременности в течение всего срока беременности; срок гестации менее 38 недель и более 40 недель беременности; вторая степень зрелости плаценты; наличие в анамнезе у матери инфекционного заболевания, не являющегося противопоказанием к донорству ПК, в течение первой половины беременности; возраст матери более 40 лет; 3-е и более роды.

2. При отборе доноров ПК рекомендуется учитывать, что наличие в анамнезе матери анемии в первой половине беременности, а также инфекционных заболеваний, не являющихся противопоказанием к донорству ПК, и угрозы прерывания беременности во второй половине беременности, не снижает эффективность выделения лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови.

3. Рекомендуется сбор пуповинной крови при сроке гестации от 38 до 40 недель. При этом сбор крови должен осуществляться не позднее 5 минут после пересечения пуповины.

4. При принятии решения об отбраковке образца пуповинной крови следует проводить контрольное взвешивание образцов ПК и учитывать «чистый» вес образца. Рекомендуемый «чистый вес» образца пуповинной крови для обработки составляет от 60 до 120 г, а процент антикоагулянта в образце должен находиться в пределах от 20 до 40%. Образцы пуповинной крови с «чистым» весом менее 60 грамм рекомендуется отбраковывать.

5. Образцы, «чистый вес» которых составляет более 120 г, рекомендуется делить пополам и обрабатывать каждую часть отдельно, как самостоятельный образец.

6. Рекомендуемое время между сбором и обработкой образца пуповинной крови составляет от 10 до 20 часов. Образцы ПК, длительность хранения которых превышает 36 часов, необходимо отбраковывать и утилизировать.