Автореферат и диссертация по медицине (14.01.05) на тему:Клеточно-цитокиновый комплекс и реакция апоптоза лимфоцитов периферической крови при остром коронарном синдроме

На правах рукописи

СМАКАЕВА Элина Равилсвна

КЛЕТОЧНО-ЦИТОКИНОВЫЙ КОМПЛЕКС И РЕАКЦИЯ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ОСТРОМ КОРОНАРНОМ СИНДРОМЕ

14.01.05 - кардиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 АВГ 2013

Пермь, 2013

005532192

Работа выполнена в Государственном бюджетном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ректор - д.м.н., профессор В.Н. Павлов).

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РБ и РФ, доктор медицинских наук, профессор кафедры терапии и клинической фармакологии ИПО ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения

Российской Федерации Митазетдинова Лира Набиевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кафедры госпитальной терапии № 1 ГБОУ ВПО

«Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения

Российской Федерации Хлыпова Ольга Витальевна

доктор медицинских наук,

главный врач МБУЗ «Поликлиника № 33» ГО г. Уфа Республики Башкортостан,

Заслуженный врач РБ Сыртланова Эльза Раифовна

Ведущая организация: Государственное бюджетное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « » сентября 2013 года в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.067.02 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени ак. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Петропавловская, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Автореферат разослан « » августа 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Щекотав Владимир Валерьевич

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Высокая распространенность и тяжесть течения острого инфаркта миокарда (ОИМ), его лидирующее положение в структуре заболеваемости, смертности и инвалидности населения экономически развитых стран определяют актуальность научных исследований во всем мире, направленных на углубленное изучение патогенеза, профилактики и лечения сердечнососудистых заболеваний, в том числе ОИМ (Бойцов С.А. и др., 2010; Чазов Е.И., 2002). Ожидается, что к 2020 году сердечно-сосудистые заболевания прочно займут первое место в структуре смертности в развивающихся странах (Натт С.\У. е1 а1., 2011; Бох К.А. е! а!., 2010). Несмотря на современное лечение, частота развития острого коронарного синдрома (ОКС) и госпитализаций остаются высокими (Рекомендации Европейского общества кардиологов по лечению острого коронарного синдрома, 2012).

Понятие ОКС получило широкое распространение в связи с общностью морфологического субстрата нестабильной стенокардии (НС) и ОИМ, такого как надрыв атеросклеротической бляшки или эрозия эндотелия, тромбоз коронарной артерии, дистальная тромбоэмболия с ухудшением перфузии миокарда (Коег^ \¥., Юшзеутоуа Ы., 2007; 1лЬЬу Р., ТЬегоих Р., 2005).

В последние годы появились работы, указывающие на участие процессов воспаления в развитии атеросклероза и ишемической болезни сердца (ИБС). При ОКС уже выявляется повышение в крови С-реактивного белка, сиаловых кислот, являющихся маркерами воспаления (А1уаго-Оо1ка1е5 Ь.С. е! а1., 2002; А1Ьег Н.К а а1., 2005; Сите СЛ. е1 а1., 2008; Spagnoli Ь. а а1„ 2007). В то же время была показана исключительная значимость цитокинов - медиаторов межклеточных коммуникаций на местном и системном уровне, определена их роль в формировании воспалительного процесса (Ярилин А.А. и др., 2000; Назаров П.Г., 2001; Симбирцев А.С., 2004), а иммунологические нарушения сопутствуют тяжелому течению ОИМ и определяют неблагоприятный прогноз

(Чазов Е.И., 2002; Мухаметрахимова А.Р., 2003; Born G., 1997). Это свидетельствует о существенной роли воспалительных реакций и активации иммунной системы в развитии ишемии миокарда и ассоциированных с ней состояний, таких как НС и ОИМ.

Исследования, где течение заболеваний сердечно-сосудистой системы рассматриваются с позиции участия апоптоза, единичны, и основное место в них отводится антиапоптотическим механизмам как регуляторам апоптоза (Васина Л.В., 2004; Шляхто Е.В., 2002).

Таким образом, ОКС как угрожающее жизни атероскперотическое состояние, требует дальнейшей разработки критериев стратификации риска, которые помогут врачам своевременно выбрать тактику индивидуализированного лечения. Учитывая, что выбор методов лечения при ОКС во многом определяется временем, прошедшим от начала заболевания, все большее значение придается изучению причин, которые вызывают эти изменения (Сторожаков Г.И., Утешев Д.Б., 2000; Abbate A. et al., 2006; Buffon A. et al., 2002; Bossowska A. et al., 2007). С изложенных позиций изучение функции эндотелия, определение факторов, оказывающих влияние на развитие дисфункции эндотелия, состояние иммунной системы с активацией Т-лимфоцитов и повышением чувствительности эндотелиальных клеток к опосредованному апоптозу становится чрезвычайно актуальной.

Хотя имеются данные о роли иммунного воспаления в развитии ишемии миокарда, однако оценка клинических показателей связи иммунной системы с параметрами окислительного стресса в развитии острого коронарного синдрома ограничена. Остается не изученной система иммунных предикторов и реакции апоптоза в возникновении и течении ОКС (Hansson G.K., 2001). Таким образом, высокая распространенность сердечно-сосудистых заболеваний, потребность уточнения влияния иммунного воспаления и активации клеток с реакцией апоптоза на исход ОКС послужили основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования - изучить субпопуляционную структуру лимфоцитов периферической крови с оценкой их апоптотической реактивности, показателей иммуноферментных белков ангиогенеза (УЕОР, МСР-1) для уточнения их роли в патогенезе острого коронарного синдрома и его исхода. Задачи исследования:

1. Изучить клинико-гемодинамические проявления у больных острым коронарным синдромом.

2. Исследовать уровни липидов сыворотки крови, продуктов перекисного окисления липидов и активность показателей антиоксидантной защиты у больных острым коронарным синдромом.

3. Изучить структуру основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови, цитокиновую регуляцию по уровню провоспалительных цитокинов (11-1(3, ТЫР-сх) и моноцитарно-макрофагальных факторов (УЕОР и МСР-1) при остром коронарном синдроме.

4. Оценить апоптотическую реактивность лимфоцитов периферической крови, интенсивность активационной экспрессии СО 95 (РаБ-апоптоз) лимфоцитов в развитии острого коронарного синдрома.

5. Изучить взаимосвязь дисфункции эндотелия и факторов ангиогенеза при остром коронарном синдроме.

Научная новизна. Впервые проведены комплексные исследования развития острого коронарного синдрома путем оценки количественных и функциональных показателей иммунной системы. Установлены особенности иммунного реагирования у больных острым коронарным синдромом в виде снижения функциональной активности клеток иммунной системы (Т- и В-лимфоциты). Впервые у больных острым инфарктом миокарда показано значение апоптотической реактивности в качестве активатора оксидативного процесса с дисбалансом активационных механизмов в отношении лимфоцитов с угнетением пролиферации Т-лимфоцитов. Повышенная апоптотическая реактивность лимфоцитов при ОИМ отражает нарушения Ра5-зависимого

апоптоза активированных лимфоцитов в миокарде, ассоциируется с достаточно высоким уровнем растворимого FaS-рецептора и, вероятно, становится одним из механизмов развития острого инфаркта миокарда, определяя его тяжесть. Установлена сопряженность признаков активации иммуноферментов ангиогенеза (VEGF и МСР-1) с развитием острого коронарного синдрома.

Практическая значимость. Показана необходимость исследования Т-клеточного иммунитета и уровня провоспалительных цитокинов (Il-ip и TNF-a) у больных острым коронарным синдромом для выявления локального воспаления эндотелия и реакции апоптоза в прогнозе течения и своевременной коррекции. Предложено включить определение факторов ангиогенеза (VEGF и МСР-1) в набор обследования больных при динамическом наблюдении. Показаны дополнительные факторы риска, такие как ранняя активация лимфоцитов путем повышения уровня CD25, нарастание комплекса HLA-DR лимфоцитов и высоко значимого повышения провоспалительного цитокина TNF-a в снижении потенциала эндотелиоцитов с развитием эндотелиальной дисфункции.

Основные положения, выиосимыс па защиту.

1. При остром коронарном синдроме наблюдается снижение систолической и диастолической функции левого желудочка с замедленной его релаксацией, повышение оксидативного стресса, нарушение липидного обмена с нарастанием атерогенных липидов.

2. Острый коронарный синдром характеризуется снижением Т-клеточного звена иммунитета, нарастанием признаков ранней активации лимфоцитов, провоспалительных цитокинов (11-1Р и TNF-a) и фактора роста эндотелия VEGF.

3. При остром коронарном синдроме возрастает Fas-зависимый апоптоз со значимым увеличением содержания CD95 (Fas) лимфоцитов, что становится одним из механизмов развития острого инфаркта миокарда.

Внедрение результатов исследования п практику. Полученные результаты используются в практической работе кардиологического отделения ГБУЗ РКБ им. Г.Г. Куватова. Основные теоретические положения диссертации внедрены в обучение врачей терапевтического профиля на кафедре терапии и клинической фармакологии ИПО, студентов лечебного факультета на кафедре факультетской терапии БГМУ.

Личный вклад диссертанта в исследование. Автором лично проведено обследование больных, включенных в исследование, проведена оценка клинического течения больных острым коронарным синдромом, анализ иммунологического статуса, статистическая обработка полученных результатов, формирование выводов и практических рекомендаций.

Апробация диссертации и публикации. Основные положения работы представлены на конгрессе кардиологов РФ (Москва, 2009), доложены на научно-практической конференции молодых ученых БГМУ (Уфа, 2010), Диссертация обсуждена на межкафедральном заседании кафедр госпитальной терапии №1, терапии и клинической фармакологии ИПО, поликлинической терапии БГМУ совместно с проблемной комиссией по кардиологии Башкирского государственного медицинского университета (март, 2013), на заседании кафедры госпитальной терапии № 1 Пермской государственной медицинской академии им. академика Е.А. Вагнера (16 апреля 2013 года).

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе работ в рекомендованных ВАК изданиях 4.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии, состоящей из 198 источников (81 отечественных и 117 иностранных). Работа иллюстрирована 16 таблицами и 15 рисунками.

Материалы и методы исследования

Это было простое открытое контролируемое исследование, которого представлен на рис. I.

дизайн

Группа сравнения п=22

Больные острым коронарным синдромом п=82

Клиническое обследование

ЭКГ, ЭХОКГ, ферменты

Иммунологическое исследование

КСР, КДР, КСО,

УЕ, УА Субпопуляция Т-лимфоцитов

СБ4, СО8, СБ16, СБ25, РБТЛ

СБ95, НЬАОК. В-лимфоциты

^А, ^М, цитокины реакция 11-1Р, ТКТа, №N-7 МСР-1, УЕОР

Рис. 1. Дизайн исследования

Обследовано 82 больных (28 женщин и 54 мужчин) с ОКС, поступивших через 12-24 часа от начала болевого приступа и проходивших лечение в кардиореанимационном отделении и кардиологическом отделении РКБ.

Диагноз ОКС был выставлен на основании данных клинических, биохимических, инструментальных исследований, где принимались во внимание типичность ангинозного приступа (характер болей, локализация, иррадиация, связь с физической нагрузкой, реакция на прием нитроглицерина), частота приступов стенокардии, продолжительность прогрессирования, данные анамнеза, изменения кардиоспецифических ферментов и трононина I в крови, типичность изменений ЭКГ.

Все обследованные были в возрасте от 38 до 60 лет (средний возраст женщин - 52,8±6,5 г. и мужчин - 49,6±5,3 г.). Отягощенную наследственность по ИБС имели 49 человек - 59,7%, у 48 больных (58,5%) в анамнезе гипертоническая болезнь. В группу сравнения вошли 22 относительно здоровых лиц (12 мужчин и 10 женщин) без признаков ИБС и гиперлипидемии.

Критериями включения были: возраст до 60 лет, наличие длительной ангинозной боли (более 20 минут) в покое, развившейся на протяжении последних 48 часов, впервые возникшая стенокардия, прогрессирование ранее стабильной стенокардии (стенокардия crescendo), внезапное увеличение частоты, усиление тяжести и продолжительности приступов в течение последнего месяца, наличие изменений конечной части желудочкового комплекса на ЭКГ в день поступления в стационар (депрессия сегмента ST не менее чем на 1 мм в двух и более смежных отведениях, инверсия зубца Т глубиной более 1 мм, отсутствие зубца Q), кратковременный (12-24 часа) подъем содержания кардиоспецифических ферментов (КФК МВ), тропонина I в момент поступления или через 12 часов.

Критериями исключения для всех групп больных были возраст старше 65 лет, перенесенный в анамнезе инфаркт миокарда, мозговой инсульт, выраженные клинические проявления атеросклероза периферических сосудов, обострение хронических заболеваний легких, печени, почек; больные, леченные в последние годы иммуномодуляторами, а также сохраняющаяся

блокада различной степени, хроническая фибрилляция предсердий, клапанные пороки сердца, сахарный диабет.

Все больные ОКС были рандомизированы по анамнестическим, клинико-инструментальным признакам и разделены на две группы методом случайной выборки. В первую группу вошли больные НС I класса В (по классификации Hamm С. W., Braunwald Е., 2000), у которых отсутствовали биомаркеры некроза — 37 человек, вторую группу составили больные с ОИМ без подъема сегмента ST - 45 человек, у которых сохранялись изменения конечной части желудочкового комплекса и высота зубца R на серийно снятых ЭКГ более 12 часов.

Все больные получали базисное лечение антикоагулянтами, дезагрегантами, нитратами, ингибиторами АПФ, бета-блокаторами. По анамнестическим и клиническим данным больные были сопоставимы.

Методы исследования. С момента поступления в стационар больным проводился мониторинг ЭКГ, параметры внутрисердечной гемодинамики оценивались по данным ЭХОКГ на аппарате Sonos-100, фирма HewlettPackard, США, по стандартной методике Американской ассоциации эхокардиографии.

Оценку диастолической функции ЛЖ проводили с помощью импульсной допплерэхокардиографии с измерением параметров трансмитрального кровотока: максимальная скорость раннего пика диастолического наполнения (VE, см/сек.), максимальная скорость позднего диастолического наполнения во время систолы предсердия (VA, см/сек.) ЛЖ, их соотношение VE/VA, время замедления раннего диастолического потока dTE (мсек). Диастолическую функцию ЛЖ считали нормальной при VE/VA < 2, dTE>130 м/сек. Критериями концентрического (ригидного типа) считали VE/VA<1, критериями рестриктивного типа - VE/VA>2 или VE/VA> 1 в сочетании с dTE<130 мсек.

Для оценки степени поражения миокарда определяли активность кардиоспецифических ферментов в сыворотке крови - креатинфосфокиназа (КФК), КФК-МВ, тропонин I.

Определение субпопуляции лимфоцитов периферической крови проводилось методом проточной цитофгаоорометрии с использованием моноклональных антител меченых различными флюорохромами.

Оценку функциональной активности лимфоцитов проводили в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), позволяющей оценить способность клеток к неспецифической стимуляции (реакция с неспецифическими митогенами). В качестве исследуемого материала использовали выделенные на градиенте плотности мононуклеары периферической крови человека, культивируемые в питательной среде с добавлением соответствующих митогенов. Мононуклеары выделяли по методу Воуит А. е1 а1. (1968). Результат РБТЛ выделял: М - регион всех мононуклеаров, 1*2 - регион покоящихся лимфоцитов, Ю - регион клеток, находящихся на различных стадиях митогенеза, т.е. бластов.

Анализ клеточного цикла проводили с использованием метода окрашивания ДНК клетки с помощью проточного цитофлюориметра йодистым пропидием. В работе использовали метод оценки апоптоза по структурным изменениям ядерной ДНК путем окрашивания клеток йодистым пропидием (С. В. Сибиряк с соавт., 2008). Покоящиеся клетки (СО) и клетки, находящиеся в предсинтетической фазе клеточного цикла (01), содержат количество ДНК, соответствующее диплоидному набору хромосом; в премитотической фазе (в2) и фазе митоза (М) число хромосом и содержание ДНК удваиваются. Содержание ДНК в сравнении с клетками, находящимися в СО и С1 фазах клеточного цикла, снижается, что выражается появлением гиподиплоидного типа (<2Ы).

Определение количества иммуноглобулинов ^О, IgA и ^М проводили методом иммунохимической реакции с помощью биохимического анализатора 8УМС1ШЖСХ5 Р1Ю.

Исследовали иммуноферменты МСР-1 (моноцитарно-хемотаксический белок-1) и УЕйР (фактор роста эндотелия) в сыворотке крови у больных НС и

ОИМ методом ИФА с использованием коммерческих тест-наборов (производство «Вектор Бест», Новосибирская область).

Количественное определение провоспалительных цитокинов (ТИБ-а, II-1Р) в сыворотке крови определяли в анализаторе АССЕСБ2 (ВесктапСоиИег). Для измерения уровня продукции цитокинов клетками крови, интерферона-у применяли трехфазный иммуноферментный метод с использовшшем тест-систем Гамма-Интерферон-ИФА-Бест производства Вектор-Бест.

Показатели окислительного статуса определяли по концентрации малонового диальдегида (МДА) по реакции с тиобарбитуровой кислотой на спектрофлуориметре, концентрацию белковых сульфгидрильных групп (ЯН) по реакции с динитробензойной кислотой.

С целью оценки состояния антиоксидантной системы определяли активность эритроцитарных ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГПО) на спектрофотометре БРЕК01Ш 50 (Германия).

Статистический анализ результатов исследования выполнен с использованием аналитического пакета 81а11я1лса 7.0. и программы MedCalcStatistica 10.2.00. Для проверки нормального распределения изучаемых признаков применяли тест Колмогорова-Смирнова. Для сравнения количественных признаков, имеющих нормальное распределение, использовался (-критерий Стьюдента. При сравнении исследуемых групп по количественным признакам, имеющим распределение, отличающееся от нормального, использовался ранговый анализ вариаций по Крускалу-Уоллису, проводилось парное сравнение групп с использованием непараметрического теста для проверки достоверности различий изучаемых признаков в независимых выборках — и-тест Манна-Уитни с поправкой Бонферонни. Различия считались высоко значимыми при р<0,01, значимыми - при р<0,05. Анализ достоверности различий относительных величин выполнялся по критерию X 2. Для выявления корреляционных взаимосвязей использовался метод ранговых корреляций Спирмена (Реброва О.Ю., 2002).

Результаты исследования и их обсуждение

При анализе результатов обследования нами были установлены определенные различия между группами исследуемых.

У всех больных ОКС отмечались ангинозные боли, характеризующиеся увеличением частоты, продолжительности болевых приступов, снижением толерантности к физической нагрузке, повышением количества потребляемого нитроглицерина. На ЭКГ были выявлены изменения в виде депрессии сегмента ST более 2 мм в двух и более смежных отведениях у 49 (59,2%) больных, у 33 (40,8%) отмечались изменения желудочкового комплекса с депрессией сегмента ST не менее 1 мм и инверсией зубца Т. При дальнейшем анализе ЭКГ к 3 суткам ни у одного больного не определялся зубец Q, что позволило исключить крупноочаговый инфаркт миокарда. Определение кардиоспецифических ферментов выявило повышение КФК МБ у 62,2% больных, тропонина I - у 76,2% пациентов, что позволило повысить специфичность и чувствительность при диагностике повреждения миокарда. При анализе данных эхокардиографии в обеих группах исходно отмечена умеренная дилатация полости левого желудочка и ухудшение сократительной способности миокарда.

Сравнительный анализ показателей систолической функции левого желудочка выявил снижение ФВ и скорости укорочения циркуляторных волн у больных ОИМ по сравнению с данными при НС.

При оценке диастолической функции левого желудочка как одного из ранних проявлений ишемических изменений наблюдалось изменение индекса VE/VA с его понижением при НС до 0,60±0,11 и при ОИМ - до 0,50±0,10 и характеризовалось как проявление 1 типа диастолической дисфункции левого желудочка.

Были изучены показатели оксидантно-антиоксидантной системы в сыворотке крови больных НС и ОИМ, обеспечивающих защиту клеток от агрессивного действия свободных радикалов (МДА, СОД, ГПО). Высоко

значимо нарастала концентрация малонового диальдегида (р<0,01), являющегося маркером окислительного стресса. Снижение активности СОД и ГПО (р<0,05) свидетельствовало о мобилизации антирадикальной зашиты у больных НС с последующим истощением при ОИМ (р<0,01), что указывало на снижение активности СОД в эритроцитах при НС на 4,1%, при ОИМ на 19,8% (р<0,05) и напряженность состояния антиоксидантной защиты.

При анализе липидного спектра у больных ОКС наблюдалось значительное повышение ОХС, ХС ЛПНП и атерогенного коэффициента со снижением ХС ЛПВП, у каждого третьего больного ОИМ выявлялся II Б тип гиперлипидемии.

При исследовании субпопуляции лимфоцитов при ОКС наблюдалась депрессия клеточного звена иммунитета со снижением популяции Т-хелперов (СВ4), ростом цитотоксических Т-лимфоцитов (СБ8) и снижением иммунорегуляторного индекса (ИРИ=СВ4/С08) до 1,16±0,02 при ОИМ (р<0,05).

Изучение провоспалительных цитокинов выявило значительное повышение уровня цитокина 1Ь-1|3, уровень его при ОИМ составил 1,22±0,55 нг/л против 0,77±0,15 нг/л (р<0,01), несколько ниже был уровень 1Ь-1р при НС (р<0,05), ИТ^-у по своему содержанию мало отличался от средних показателей и только при ОИМ значимо превышал контрольные величины (р<0,05). Значимо повышался уровень ТКР-а, что свидетельствует о наибольшем участии его в апоптозе, но высоко значимое нарастание 1Ь-1р в обеих группах позволяет предполагать возможность развития вначале воспаления с последующей активацией апоптоза и свидетельствует о напряженности иммунной реакции в зоне патологического процесса (табл. 1). Эти данные согласуются с материалами других исследований (Лопатина Е.В. и др., 2008; Сторожаков и др., 2000; Бттекг Б. ег а1., 1998; 1]сЫ(1е N. е1 а1„ 2002).

Таблица 1

Содержание провоспалитсльных цитокинов у больных острым коронарным синдромом

Показатели Группа сравнения НС ОИМ

(п=22) (п=37) (п=45)

1Ь-1|3, нг/л 0,77±0Д5 1,16±0,67* 1,22+0,55**

ТОТ-а, нг/л 0,48+0,07 0,42+0,11 0,88±0Д0*

№N-7, нг/л 2,17+0,30 2,37±0,54 2,53±0,47*

Примечание: статистическая значимость различий с данными группы сравнения: * - р<0,05; ** -р<0,01

Уровень инициаторов апоптотической реакции - клеток СБ 16 (ЫК) был достаточно высоким (р<0,05), но не выходил за пределы нормальных величин. Уровни клеток СБ25+, активированные 1Ь-2, колебался у больных ОИМ на уровне 14,2±0,9% кл/мкл (р<0,05), был ниже у больных НС, но не достиг нижней границы нормы. Концентрация СБ95 (РаБ-апоптоз) не опускалась ниже нормальных величин, в обеих группах значимо превышала контрольные величины в 2-2,3 раза.

Ключевой молекулой, опосредующей апоптоз, является С095+(РаБ) рецептор, а РаБ опосредованный апоптоз лимфоцитов становится важнейшим механизмом иммунного гомеостаза. Отмечено значимое увеличение содержания СБ95+(Ра5) лимфоцитов у больных ОКС. При ОИМ С095+(Ра8) был в 2,3 раза выше группы сравнения (р<0,01) (табл. 2).

Таблица 2

Содержание СБ95+ (ТРа8) лимфоцитов в периферической крови

у больных острым коронарным синдромом

Показатель Группа сравнения (п=22) НС (п=37) ОИМ (11=45)

СБ95 (РаБ), % 16,9+2,8 32,6+3,4* 38,7+4,7**

Примечание: статистически значимые различия больных с группой сравнения: *-р<0,05; ** -р<0,01

Показатели готовности к пролиферации и апоптозу были также выше при ОИМ, что проявилось снижением доли покоящихся (СО) лимфоцитов, нарастанием лимфоцитов в предсинтетической фазе (61) и значимым повышением активационного коэффициента при ОИМ (табл. 3).

Таблица 3

Показатели клеточного цикла у больных острым коронарным синдромом

Показатели Исследуемые группы

Группа сравнения (п=22) НС (п=37) ОИМ (п=45)

Лимфоциты с морфологическими признаками фрагментации ядра М1-пик, % 0,62±0,07 0,50+0,07 0,88+0,05

Покоящиеся лимфоциты (вО-фаза) М2-пик, % 95,96+3,62 94,37+4,18 91,6+4,32*

Лимфоциты с увеличением количества ДНК (И-фаза) МЗ-пик, % 3,29±0,32 3,ЗОЮ,41 3,85±0,10*

Активационный коэффициент (ИРАК-М, МЗ) 0,282±0,18 0,243±0,4 0,493±0,03**

Примечание: различия в группах статистически значимы относительно группы сравнения: * -р<0,05; ** -р<0,01

В целом, у больных ОИМ отмечался дисбаланс активационных механизмов в отношении лимфоцитов. Сниженная способность Т-лимфоцитов отвечать на фагоцитарную реакцию свидетельствовала об угнетении пролиферации Т-лимфоцитов. Полученные результаты позволяют предполагать, что повышенная апоптотическая реактивность лимфоцитов периферической крови при ОИМ отражает нарушения РаЯ-зависимого апоптоза

16

активированных лимфоцитов в миокарде, ассоциируется с достаточно высоким уровнем растворимого БаБ-рецептора в периферической крови и, вероятно, становится одним из механизмов развития ОИМ, определяя его тяжесть. Гибель активированных СБ4+Т-лимфоцитов, мигрировавших в миокард, осуществляется по РаЗ-РаБЬ-зависимому механизму при контакте с РаБЬ-рецепторами, экспрессированными на мембране кардиомиоцитов, параллельно с развитием некроза.

Также были изучены изменения содержания в крови у больных ОКС иммуноферментов, регулирующих фактор роста эндотелия сосудов (УЕСР) и функциональные состояния клеток фагоцитарного звена иммунитета (МСР-1).

Повышение уровня УЕОР у больных НС было в 2,2 раза, а при ОИМ - в 3,2 выше по отношению к группе сравнения и на 43,0% - по отношению к уровню у больных НС.

Если учесть, что экспрессия УЕОР усиливается под влиянием проангиогенных факторов, включая гипоксию, а агрегация тромбоцитов сопровождается высвобождением этого фактора роста, то повышение УЕОР при ОКС становится важным маркером гиперкоагуляции и ангиогенеза.

При исследовании моноцитарно-хемотоксического протеина МСР-1 нами получено снижение его уровня у больных ОИМ на 64% и на 16,5% у больных с НС (63,86±4,10 и 89,4± 16,87 пг/мл соответственно по отношению к группе сравнения 143,82±48,07 пг/мл). Причем, различия между группами были значимы, а у больных ОИМ уровень МСР-1 в сыворотке крови был на 40,8% ниже, чем при НС (р<0,05) (рис. 2).

Снижение МСР-1 определяло понижение реакции нейтрофилов и Т-клеточного звена иммунитета с нарастанием ишемии миокарда.

Пониженный уровень МСР-1, слабая связь с основными показателями и связь средней силы с регуляторами апоптоза СЭ95+(Ра5) (г=0,48); ТОТ-а (г=0,57) позволяют рассматривать МСР-1 как возможный триггер запуска реакции повышенной гибели клеток внутри атеросклеротической бляшки при

воздействии свободных радикалов (МДА) и снижении антиоксидантной защиты (г=-0,36).

Рис. 2. Содержание VEGF и МСР-1 в сыворотке крови больных острым коронарным синдромом

Примечание: * - различия в группах значимы при р<0,05 по сравнению с контролем

Оценка корреляции VEGF с изученными показателями иммунной системы выявила положительные связи с клетками, ответственными за апоптоз. Высокий уровень VEGF характеризовался наличием корреляции с NK (CD16), CD95+(FaS) и провоспалительными цитокинами IL-ip и TNF-a. Параллельно при ОИМ отмечалась корреляция уровня VEGF с нарушениями гемодинамики, развившимися при остром коронарном синдроме. Это проявилось связями фермента с КСР и КДР (р<0,05), фракцией выброса. Причем, высокий уровень VEGF при ОИМ выявил прочную связь с показателями Т-лимфоцитов и цитокинов как активаторов клеточной фазы и повышенного апоптоза. У больных ОИМ определены слабые связи МСР-1 с показателями диастолической функции — VE/VA и массой миокарда, более сильная связь с участниками апоптоза (CD95) и цитокином TNF-a. Взаимодействия и взаимоотношения показателей иммунной системы при ОКС связаны с напряжением иммунной системы, с нарастанием процессов апоптотической реакции, а показатели активации ферментов VEGF можно рассматривать как возможный триггер

запуска реакции повышенной гибели нежизнеспособных клеток, их обновления,замены и дифференцировки.

По современным данным гемодинамические нарушения относятся к основным индукторам апоптоза эндотелиоцитов in vivo наряду с оксидативным стрессом и провоспалительными цитокинами. Увеличение напряженности иммунной системы, вероятно, приводит к ослаблению или потере контактов эндотелиальных клеток с базальной мембраной (Пальцев М.А., Иванов A.A., Северин С.Е., 2003; Dignat George F., 2003).

Суммируя вышеизложенное, можно сделать заключение о том, что в развитии ОКС участвует иммунная система с повышением апоптотической реакции, медиаторов межклеточного взаимодействия (цитокинов), триггеров эндотелиальной дисфункции (ферментов VEGF и МСР-1) и направленностью иммунного ответа на активацию клеток. Маркеры активации апоптоза в большей степени определены в группах с ОИМ. Было установлено, что среди иммунологических показателей у больных НС и ОИМ наиболее значимыми для диагностики являются CD16+ (NK), CD25+ и CD95+ лимфоциты, повышенная экспрессия цитокинов TNF-a и IL-lß, повышение VEGF, при выявлении которых необходимо проведение обследования больных с использованием методов эндотелиальной дисфункции.

Полученные нами данные позволили выделить статистически значимые корреляции между показателями иммунной системы у больных острым инфарктом миокарда (рис. 4).

Таким образом, проведенные исследования состояния иммунной системы у больных ОКС позволили установить особенности иммунного реагирования, проявляющиеся активацией факторов апоптоза, депрессией Т-клеточного звена, повышением фактора роста эндотелия VEGF и нарастанием суммарного содержания клеток в фазе клеточного цикла, т.е. увеличивалось число активированных клеток по механизму FaS-зависимого апоптоза.

0,67

С04+СБ25+

УЕСР

С04+ 0

НЬА-ОЯ+

С025

"'2

0,68

С016+ (Ж)

С095+(Ра8)

-0,54

УО,63

-ТОТ-а

СОД

Примечание: -прямая связь,-----обратная связь

Рис. 4. Статистически значимые корреляции между показателями иммунной системы у больных острым инфарктом миокарда

Апоптотические клетки выделяют в циркуляцию мембранно-связанные микрочастицы - прокоагулянты, высвобождают цитокины, привлекая моноциты и макрофаги (Адоева Е. Я., 2001). Повышение ХС ЛПНП в циркуляции при ОКС, вероятно, препятствует фагоцитозу апоптотических клеток (Давтян Т. К., 2001).

Корреляционный анализ показал наличие множества прямых статистически значимых связей между основными субпопуляциями лимфоцитов, показателями гемодинамики и активаторами апоптоза.

Таким образом, нами установлены выраженные клинико-гемодинамические нарушения у больных ОКС, свидетельствующие о гемодинамической нагрузке и снижепии работы сердца вследствие обострения ИБС. Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что при ОКС, наряду с нарушениями структурно-функциональных показателей сердечной мышцы, происходит реагирование иммунной системы, проявляющееся активацией

линии защиты СБ4, ЫК СБ16 лимфоцитов, медиаторов воспаления (И-1Р, Т№-а), УБвР в периферической крови.

Выводы

1. Клинико-гемодинамические особенности острого коронарного синдрома проявляются нарастанием дилатации полости левого желудочка, снижением фракции выброса и параметров раннего диастолического трансмитрального кровотока, развитием диастолической дисфункции с замедленной реакцией на фоне выраженного оксидативного стресса при нестабильной стенокардии с последующим истощением антиоксидантной системы у больных острым инфарктом миокарда.

2. У больных с острым коронарным синдромом активизируются процессы перекисного окисления липидов, снижается активность антиоксидантных ферментов на фоне значимого повышения содержания липопротеидов низкой плотности и коэффициента атерогенности.

3. У больных с острым коронарным синдромом отмечаются изменения факторов иммунной системы: увеличение числа естественных киллерных клеток (ЫК СБ 16), нарастание содержания в крови провоспалительных цитокинов - интерлейкина 1(3, фактора некроза опухоли-а, интерферона-у со снижением концентрации моноцитарно-хемотаксического белка-1, особенно при остром инфаркте миокарда.

4. Острый коронарный синдром сопровождается усилением клеточного апоптоза в результате гемодинамических нарушений, что определяется повышением индукторов апоптоза СБ95+ (РаБ) лимфоцитов, фактора некроза опухоли-а, нарастанием клеток в пресинтетической стадии апоптоза (01-фаза) и активационного коэффициента.

5. При остром коронарном синдроме у больных наблюдается статистически значимое повышение содержания в крови фактора роста эндотелия сосудов (УЕвР), коррелирующее с показателями гемодинамики, что

отражает высокую чувствительность этого маркера при оценке эндотелиальной дисфункции, тяжести поражения и исхода заболевания.

Практические рекомендации

1. При остром инфаркте миокарда целесообразно определение фактора МСР-1 как показателя снижения иммунного ответа на фоне активации перекисного окисления липидов с истощением антиоксидантной системы и снижения гемодинамических показателей, что определяет исход острого коронарного синдрома.

2. В прогнозировании течения острого коронарного синдрома целесообразно определение содержания в крови показателей иммунной активации (NK CD16) клеток, пролиферативной активности Т-лимфоцитов в реакции бласттрансформации (CD95), степень повышения которых отражает тяжесть поражения и исход заболевания, а активация васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) при остром инфаркте миокарда становится триггером в развитии эндотелиальной дисфункции.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Молекулы адгезии и клеточно-цитокиновый комплекс в ремоделировании сосудов при артериальной гипертонии с метаболическими факторами риска / Искандарова JL Р., Муталова Э. Г., Смакаева Э. Р., Мингазетдинова Л. Н., Сахаутдинова Г. М. // Российский кардиологический журнал. - 2008. - №5 (73). - С. 14-20.

2. Артериальная гипертония в ремоделировании левого желудочка у больных пожилого возраста / Бакунина И. А., Муталова Э. Г., Хусаинова Л. Н., Мустафин X. М., Садикова Р. И., Мингазетдинова Л. Н., Смакаева Э. Р. // Российский кардиологический журнал. - 2009. - №3 (77) - С. 40-45.

3. Клеточно-цитокиновый комплекс в апоптотической реактивности у больных острым коронарным синдромом / Мингазетдинова Л. Н., Смакаева Э. Р., Хасанова А. Р., Турышева О. Е., Галлямова В. Р. // Успехи современного естествознания. - 2009. - № 2. - С. 48-50.

4. Ремоделирование сердца и функциональное состояние периферических артерий при инфаркте миокарда / Смакаева Э. Р., Хусаинова Л. Н., Садикова Р. И., Мингазетдинова Л. Н., Сахаутдинова Г. М. // Фундаментальные исследования. - 2009. - № 7. - С. 59-62.

5. Маркеры воспаления при остром коронарном синдроме / Смакаева Э. Р., Хасанова А.Р., Галлямова В.Р., Мингазетдинова Л. Н. // Материалы XI Всероссийского научно-образ. форума «Кардиология - 2009». - Москва, 2009. -С. 269 - 270.

6. Кардиометаболический синдром как предиктор течения артериальной гипертонии / Беляева И. Г., Смакаева Э. Р., Грицаенко Г. А., Мингазетдинова Л. Н. // Российский кардиологический журнал. - 2011. - №4 (90). — С. 19-22.

7. Клеточные маркеры апоптоза при острой ишемии миокарда / Хусаинова Л. Н., Смакаева Э. Р., Садикова Р. И., Муталова Э. Г., Мингазетдинова Л. Н. // Медицинский вестник Башкортостана. - 2013. - №3. -С. 78-81.

Принятые сокращения

АПФ - ангиотензинпревращающий фермент, ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, ГПО - глутатионпероксидаза, ИБС - ишемическая болезнь сердца, КДО - конечный диастолический объем, КДР - конечный диастолический размер. КСО - конечный систолический объем, КСР - конечный систолический размер, КФК МВ - креатинфосфокиназа МВ, ЛПВП - липопротеины высокой плотности, ЛПНП - липопротеины низкой плотности, МДА - малоновый диальдегид, НС - нестабильная стенокардия, ОИМ - острый инфаркт миокарда, ОКС - острый коронарный синдром, ОХС - общий холестерин, РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов, СОД - супероксиддисмутаза, ЭКГ -электрокардиография, ЭХОКГ - эхокардиография, ФВ - фракция выброса, 1Ш-у - интерферон-у, в - иммуноглобулин в, 11-1(3 - интерлейкин-1 р, МСР-1 -моноцитарно-хемотаксический белок-1, ЮТ-а - фактор некроза опухоли-а, УА - скорость потоков позднего диастолического наполнения, УЕ - скорость

потоков раннего диастолического наполнения, УЕвР - васкулоэндотелиальный фактор роста.

Подписано к печати 05.06.13г. 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать плоская. Гарнитура «Тайме». Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 339 ФГБОУ ВПО Уфимский государственный авиационный технический университет Центр оперативной полиграфии 450000, Уфа-центр, ул. К. Маркса, д. 12