Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Картирование непрерывных В-эпитопов искусственного белка альбебетина и его биологически активных вариантов

На правах рукописи

БОЧАРОВА Ольга Владимировна

КАРТИРОВАНИЕ НЕПРЕРЫВНЫХ В-ЭПИТОПОВ ИСКУССТВЕННОГО БЕЛКА АЛЬБЕБЕТИНА И ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВАРИАНТОВ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

Научные руководители:

- д.б.н. Д.А. Долгих

- к.б.н. Е.Ф. Колесанова

Официальные оппоненты:

- д.б.н., профессор A.A. Михайлова

- д.м.н., профессор A.A. Ярилин

Ведущая организация - НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится «15» марта 2002 г. в 10 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.007.01. в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан » у-< С/4И/Ц 2002 г

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н., профессор

Р Я 2 / ■ / е "" V

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Распознавание белковых молекул лежит в основе практически всех биологических процессов. Имитирование их сайтов связывания делает возможным создание новых молекул для использования в биотехнологии, терапии и диагностике. В этом случае белковые конструкции de novo (искусственные белки, сконструированнные под заранее заданную третичную структуру и уникальную топологию, не встречающуюся в природных белках) могут являться неким каркасом, в который можно ввести сайт распознавания природного белка, тем самым открывая подход к созданию новых миметиков и антагонистов природных молекул.

Пептидные препараты, удобные для исследований in vitro, порой невозможно успешно применять в клинической практике, так как пептиды обычно быстро инактивируются в организме благодаря нескольким механизмам, включая гломерулярную фильтрацию в почках, рецепторно-опосредованный эндоцитоз, протеолиз сывороточными протеазами (O'Kelly Р. и соавт., 1985; Rostaing L. и соавт., 1998). Главным механизмом из перечисленных является последний. Учитывая также, что белковые фармакологические препараты разрушаются при введении per os, и поэтому вводятся внутримышечно, подкожно или внутривенно, поддержание терапевтически активной концентрации в кровотоке является важным фактором при клиническом использовании этих препаратов.

Одним из путей преодоления этого препятствия является увеличение молекулярного веса путем ковалентного свазывания с биологически инертной матрицей (Shechter Y. и соавт., 2001). Представляется вполне вероятным, что присоединение активного пептида к белковой молекуле носителя приведет к возникновению иммунного ответа как против носителя, так и против самого пептида. В этом случае новые конструкции, предназначенные для длительного курса лечения, будут инактивироваться и элиминироваться иммунной системой.

Любой новый белковый препарат после экспериментов in vitro, подтверждающих требуемую биологическую активность в отсутствии нежелательных побочных активностей и токсичности, должен рассматриваться в качестве потенциального антигена. Поэтому белковый препарат, который планируется применять парэнтерально в течение длительного курса лечения, должен обладать низкой иммуногенностью, т.к. возникновение иммунного ответа приведет к возникновению тяжелых побочных эффектов у пациента и будет препятствовать проявлению активности препарата. Он не должен иметь перекрестной реакции с собственными белками организма, чтобы не вызывать у пациента аутоиммунные реакции.

Гипотезы, касающиеся иммуногенности искусственных белков, могут быть проверены только экспериментально, так как теоретический анализ возможной антигенности, основанный на поиске Т- и В-эпитопов, встречающихся в последовательностях природных белков, все еще недостадочно точен и в данном случае малоэффективен, поскольку последовательности искусственных белков отличаются от природных по определению.

Цель исследования: Целью настоящей работы является изучение иммуногеннности искусственного белка альбебетина и его трех биологически активных вариантов, а также изучение специфичности и межвидовой вариабельности гуморального иммунного ответа на эти белки.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать мышиные сыворотки и препараты иммуноглобулинов из желтка куриных яиц против альбебетина и его трех биологически активных вариантов, имеющих в своем составе пептидные фрагменты интерферона-а2 и инсулина человека.

2. С применением пиновой технологии синтезировать гексапептиды, перекрывающие последовательность белка с фрагментами интерферона-а2 и инсулина.

3. Определить линейные антигенные детерминанты белковых конструкций методом сорбционного ИФА гексапептидов последовательности белка с фрагментами интерферона-а2 и инсулина, используя полученные антисыворотки и препараты иммуноглобулинов.

4. Сравнить внутри- и межвидовые антигенные карты, определить иммунодоминантные участки.

5. Определить, как влияет на иммуногенность исследуемых белков присоединенние к альбебетину биологически активных фрагментов.

6. Сопоставить расположение антигенных детерминант с известными структурными элементами исследуемых белков.

Научная новизна и практическая значимость работы.

1. Впервые проведено детальное исследование иммуногенности искусственного белка альбебетина и его производных, несущих биологически активные фрагменты интерферона-а2 и инсулина человека. Получены данные об иммунодоминантных В-эпитопах четырех (альбебетин, альбеферон, альбебетин-инсулин, альбеферон-инсулин) молекул.

2. Впервые показано влияние присоединенных фрагментов интерферона-а2 и инсулина человека на иммуногенность искусственных белков.

3. Впервые проведено сопоставление данных антигенного картирования искусственных белков с их трехмерной структурой. Данные антигенного картирования косвенно свидетельствуют о значительном сходстве пространственной структуры четырех исследуемых белков.

4. Впервые показано, что специфичность иммунного ответа на исследуемые искусственные белки практически не зависит от видовых особенностей иммунной системы.

Полученные данные об иммуногенности и иммунодоминантных В-эпитопах искусственных белков целесообразно учитывать в дальнейшем при создании новых искусственных белковых конструкций.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), на 7-м Международном конгрессе по аминокислотам и белкам (Вена, Австрия, 2001).

Аппробация диссертации состоялась на заседании коллоквиума лаборатории спектральных методов анализа Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 30 января 2002 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 94 страницах печатного текста, включая 2 таблицы и 16 рисунков и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение» и «Выводы». Библиография содержит список из 120 источников литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Препараты искусственных белков альбебетина (ABB), альбеферона (ABBI), альбебетина с фрагментом инсулина (АВВ-Ins) и альбеферона с фрагментом инсулина (ABBI-Ins) были экспрессированы в E.coli, штамм BL21(DE3)pLysS и очищены поэтапно на ионообменной колонке Mono Q HR 16/10 ("Pharmacia", Швеция), колонке с никель-нитрилацетат-агарозой ("Qiagen", США) согласно протоколам фирм-производителей. Затем проводили протеолиз фактором Ха и последующее разделение тиоредоксина и целевого белка металл-аффинной хроматографией на колонке с никель-нитрилацетат агарозой. Дополнительную очистку

альбебетина и альбеферона с фрагментом инсулина проводили на колонке Mono Q HR ("Bio-Rad", США). Выход очищенных альбебетина и альбеферона составлял 12-15 мг/л клеточной культуры; альбебетина и альбеферона с фрагментом инсулина - 810 мг/л.

Для получения поликлональных антител против исследуемых белков иммунизировали кур и мышей линии BALB/c. Сыворотки получали посредством центрифугирования свернувшейся цельной

воспроизводимости метода пептидного сканирования. Оптическая плотность в лунках с гексапептидами из повторяющихся фрагментов представлена на рисунке в виде среднего арифметического двух значений оптических плотностей идентичных участков. Отклонение этих двух значений от их среднеарифметического значения составляло не более 9%. Гексапептид, полностью перекрывающий первые 6 а.к.о. ABB и ABB-Ins имеет номер 10(45). Гексапептид, полностью перекрывающий последние 6 а.к.о. ABB и ABBI имеет номер 73(38). Остальные N- и С-концевые гексапептиды частично перекрывают первые и последние 6 а.к.о. этих конструкций.

Предел для отсечения незначимых величин связывания рассчитывали так, как описано в Материалах и методах. Пептиды, у которых величина оптической плотности в ИФА на взаимодействие с антителами превышала линию отсечения, считались обладающими антигенной активностью.

Результаты связывания гексапептидов с куриными антителами обобщены в таблице 1, где показаны антигенные гексапептиды и антигенные сайты, сформированные ими. Нужно заметить, что в молекуле альбебетина непрерывные В-эпитопы не были найдены.

Увеличение концентрации антител с 25 до 8 0 мкг/мл не выявляло дополнительных антигенных детерминант, поэтому концентрацию 25 мкг/мл использовали в дальнейшем в экспериментах по конкурентному ингибированию. Выявленные антигенные сайты составляют 28 а.к.о. для ABBI-Ins и ABBI, что составляет 32 и 35% их последовательностей, соответственно. Из таблицы 1 видно, что разные антигенные детерминанты обладают разными иммуногенными потенциалами. Они индуцируют образование анти-пептидных антител различной аффинности. Сайт, состоящий из аминокислот 6-10 (KYSPD) можно считать истинным непрерывным В-эпитопом. Его можно считать иммунодоминантным, т.к. он индуцирует наиболее эффективное образование антител в составе двух различных белковых конструкций - ABBI и ABBI-Ins.

Таблица 1.

Антигенные гексапептиды и антигенные сайты, выявляемые

антителами кур. Жирным шрифтом обозначен фрагмент ИФН-а2._

Номер Антиген. Позиция в Послед-ть Гексап-ды, связывающие антитела против

гексап-да сайт послед-ти гексапептида _конструкций'_

ABBI-Ins ABBI ABBI-Ins ABB

4

5

6

7

8 9

10(45) 34(69) 35(70) 36(71)

43

44

4-9

5-10

6-11

7-12

8-13

9-14 10-15(45-50)

34-39(69-74)

35-40(70-75)

36-41(71-76)

43-48

44-49

EKKYSP KKYSPD KYSPDP YSPDPG SPDPGD PDPGDP DPGDPE GGTVHV GTVHVE TVHVEV PEDPGD EDPGDP

+

++++ I I I 1 +

++ + ++ + + + +

Степень превышения линии отсечения: "-" А405 <(М+5о); "+" (М+5а)< А«з< 2(М+5а); "++" 2(М+5а)< А«5< 3(М+5а); "+++" 3(М+5а)< А«5< 4(М+5а); "++++" 4(М+5о)< A4os< 5(М+5а);

А4о5=А4о5Эксперимента-А|,вконтроля.

+

Чтобы подтвердить специфичность связывания антител с пептидами, был проведен конкурентный ИФА препарата 1дУ против альбеферона на взаимодействие с гексапептидами в присутствии альбеферона и рекомбинантного человеческого ИФН-а2, выступающих в качестве конкурирующих агентов. Ингибирование связывания антител с гексапептидами в присутствии альбеферона наблюдали для всех выявленных антигенных сайтов в различной степени. Присутствие рекомбинантного человеческого ИФН-а2 не ингибировало связывание антител против альбеферона с гексапептидами. Мы проверили связывание препаратов против АВВ1 и ТЕХ-АВВ1-1пз с ИФН-а2, сорбированным на пластик. Оба препарата и контрольный препарат преиммунных 1дУ не связывались с ИФН-а2.

Непрерывные антигенные детерминанты ABB и конструкций на его основе, выявляемые при иммунизации мышей линии BALB/c. Для

того, чтобы при сравнении иммуногенности 4 белков (ABB, ABBI, ABB-Ins и ABBI-Ins) исключить проявления индивидуальной иммунореактивности, в следующей серии экспериментов использовали мышей линии BALB/c, которых разделяли на группы и

крови. Препараты IgY из желтков куриных яиц выделяли, осаждая липопротеиды декстран-сульфатом, а затем высаливанием белков сульфатом натрия (Jensenius J.С. et al, 1981).

Взаимодействие антисывороток и иммунных препаратов IgY с соответствующими антигенами тестировали посредством

сорбционного ИФА. В качестве ферментной метки для антивидовых антител использовали пероксидазу хрена.

Синтез связанных с твердофазным носителем пептидов, перекрывающих последовательность ABBI-Ins, проводили методом активированных эфиров по пиновой технологии (Multipin™) фирмы Mimotopes (Австралия). Пептиды синтезировали на поверхности полиэтиленовых игл, объединенных в блоки по 96 штук с габаритами 96-луночных иммунологических планшетов. Для выявления непрерывных В-эпитопов четырех белков синтезировали 82 гексапептида, перекрывающих последовательность белка ABBI-Ins с шагом в один а.к. остаток.

После каждого ИФА иглы с пептидами отмывали от свзавшихся антител в растворе детергента при обработке ультразвуком (Finnsonic, Финляндия), затем горячей водой и этанолом.

Полученные в ИФА на связывание пептидов с антителами значения оптической плотности хранили в виде электронных таблиц программы Microsoft Excel. Величину А405, соответствующую линии отсечения значимых величин от фоновых, определяли следующим образом: для половины минимальных значений оптической плотности рассчитывали среднее значение (М) и величину стандартного отклонения (ст) . За высоту линии отсечения принимали значение, равное М+5о. Расчет проводили для каждого эксперимента в отдельности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Непрерывные антигенные детерминанты ABB и конструкций на его основе, выявляемые при иммунизации кур. Чувствительность препаратов IgY при детекции соответствующих белков была определена методом ИФА и составляла 0.625, 0.625, и 5 мкг/мл

для TRX-ABBI-Ins, ABBI и ABB, соответственно. От иммунных кур одновременно с забором яиц были получены сыворотки и определены титры антител в них. Титры IgY против TRX-ABBI-Ins, ABBI и ABB составляли 1:16000, 1:8000 и 1:2000, соответственно. Таким образом, эффективность продукции желточных и сывороточных антител приблизительно одинакова, если учесть, что концентрация сывороточных антител составляет около 10 мг/мл. Присутствие фрагмента интерферона в молекулах приводит к формированию антител с большей аффинностью к ABBI и TRX-ABBI-Ins по сравнению с антителами к ABB. В дальнейшем для антигенного картирования использовали только очищенные препараты антител из желтков яиц иммунных кур.

В эксперименте по выявлению перекрестной реактивности исследуемых белков с препаратом IgY против альбебетина выяснили, что ABBI и ABB проявляют практически полную перекрестную реактивность, что означает, что все В-эпитопы, экспонированные на ABB, доступны также и на молекуле ABBI. С другой стороны, антигенная структура TRX-ABBI-Ins значительно отличаются от таковых для ABBI и ABB. Низкая перекрестная реактивность TRX-ABBI-Ins (обладающего наибольшей

иммуногенностью среди изучаемых конструкций) может являться результатом экспонирования антигенных сайтов на его поверхности, которые отсутствуют у ABBI и ABB, тогда как их общие антигенные сайты супрессированы.

Связывание преиммунных и иммунных препаратов антител с синтезированными гексапептидами, полностью перекрывающими последовательность белка с фрагментом а2-интерферона на N-конце и инсулина на С-конце (с шагом в один а. к. о.) тестировали в ИФА. При использовании этого набора гексапептидов возможно картирование четырех белков: альбебетина, альбеферона, альбебетина с фрагментом инсулина и альбеферона с фрагментом инсулина. Так как в аминокислотной последовательности альбебетина есть повторяющийся участок из 33 а.к.о. (гексапептиды 10-38 и 45-73), в каждом эксперименте присутствовал своеобразный внутренний контроль

каждой группе вводили по 10, 50 или 100 мкг одного из четырех белков. Сыворотки, полученные от каждой из мышей, тестировали на взаимодействие с соответствующим белком и определяли титр, после чего рассчитывали средние значения титра в группе. Для нормирования и сравнения значений между экспериментами вводили положительный контроль, которым служило разведение 1:5000 сыворотки, полученной от мыши из группы, иммунизированной 50 мкг альбеферона.

На рис. 1 показана динамика иммунного ответа при иммунизации мышей различными белками.

Для всех антигенов наблюдается дозозависимое увеличение антителообразования, но наиболее иммуногенным из четырех исследуемых белков является белок с двумя активными пептидными фрагментами, ABBI-Ins. Исходный белок ABB и его производное с инсулиновым фрагментом ABB-Ins являются, по-видимому, антигенами примерно одинаковой силы. При увеличении доз до 50 и 100 мкг становится очевидным отличие ответа на введение ABBI-Ins, по сравнению с ответом на другие белки.

В сыворотках групп, полученных на 14 день после второй иммунизации белками в дозе 100 мкг на животное (итоговые сыворотки для эпитопного картирования), был определен титр препарата антител. Титры препаратов антител против ABB и ABB-Ins имеют практически одинаковую величину 1:128000. Титр антител в антисыворотке против альбеферона в 2 раза больше и составляет 1:256000. Антисыворотка против альбеферона с фрагментом инсулина является гораздо более активней трех предыдущих: ее титр равен 1:1250000.

День после иммунизации

День после иммунизации

День после иммунизации

Рис. 1. Динамика иммунного ответа при введении 10 мкг (а), 50 мкг (б) и 100 мкг белка (в) на одно животное. Разведение антител 1:5000. Антигены: ABBI-Ins (о), ABBI (•) , ABB-Ins (▼), ABB (V) . Контроль - связывание объединенной сыворотки контрольной группы с ABBI-Ins (■) . Стрелкой отмечена вторая иммунизация. Величина стандартного отклонения составляла 1634% от среднего значения A492 в группе.

Изучение перекрестной реактивности белков показало, что все антисыворотки примерно одинаково связываются с белками ABBI, ABB и ABB-Ins и слабее всего взаимодействуют с ABBI-Ins. Этот факт понятен для антисывороток против ABBI, ABB и ABB-Ins, т.к. они получены против других антигенов. Уменьшение же связывания антисыворотки против ABBI-Ins с самим этим белком может происходить за счет того, что при сорбции ABBI-Ins на пластик некоторые его антигенные детерминанты изменяют свою конформацию и/или оказываются недоступными для антител. Тем не менее, полученные результаты свидетельствуют о том, что во всех четырех белках имеются одинаковые антигенные детерминанты. В то же время очевидно, что специфичность антител в сыворотке против ABBI-Ins отличается от специфичностей антител в антисыворотках против ABB, ABBI и ABB-Ins.

Результаты связывания гексапептидов с мышиными антителами обобщены в таблице 2, где показаны антигенные гексапептиды и антигенные сайты, сформированные ими.

В данных условиях иммунизации антитела образуются к пептидам из двух линейных участков - 6-18 (45-53) и 18-28 (53— 63). Первый активный участок состоит из 3 эпитопов, включающих в себя С-концевой участок интерферонового фрагмента и прилегающую к нему часть молекулы альбебетина. То, что его антигенность в белке ABBI-Ins сильно отличается от таковой в составе ABBI, может быть обусловлено тем, что присоединение к ABBI фрагмента инсулина изменяет третичную структуру молекулы ABBI-Ins и, как следствие, иммунологические свойства конструкции. Поэтому этот эпитоп можно рассматривать как линейный, но конформационно-зависимый. В составе второго активного участка, кодируемого гексапептидами 18-23 (53-58) находится общий для всех конструкций минорный эпитоп, но в антисыворотке против ABBI-Ins авидность антител, связывающихся с этим эпитопом, выше. Презентация данного участка иммунной системе в составе ABBI-Ins более предпочтительна, вероятнее всего, за счет доступности для взаимодействия с антителами.

Таблица 2.

Антигенные гексапептиды и антигенные сайты, выявляемые мышиными антителами. Жирным серым шрифтом обозначен фрагмент ИФН-а2, жирным черным - гексапептиды, соответствующие максимуму пика активности. Данные приведены для разведения

сывороток 1:5000._

Номер Антиген. Позиция в Послед-ть Гексап-ды, связывающие антитела против гексап-да сайт послед-та ABBI- гексап конструкций'

Ins _

ABBI ABBI-Ins ABB ABB-Ins

6 1 £-11 KYSPDP 1 3

7 1 7-12 YSPDPG 4

8 1 8-13 SPDPGD 7 1

9 1 9-14 JPDPGDP 1 10 2 1

10 1 10-15 DPGDPE 9 2 1

11 1 11-16 PGDPEC 1 1

12 1 12-17 GDPECL 1 1 1

13 1 13-18 DPECLE 4 7 1 1

18(53) 2 18-23(53-58) EQLLRR 1 1 1 1

19(54) 2 19-24(54-59) QLLRRL 2 2 3 1

20(55) 2 20-25(55-60) LLRRLG 2 2 2 1

21(56) 2 21-26(56-61) LRRLGG 1 1 1 1

22(57) 2 22-27(57-62) RRLGGS 1 1 1 1

23(58) 2 23-28(58-63) RLGGSV 1 1 1

43(~8) 3 43-48 PEDPGD 2 1

44(~9) 3 44-49 EDPGDP 9 1 1

45(=10) 3 45-50 DPGDPE 9 2 1

46(=11) 3 46-51 PGDPEC 1 1

47(=12) 3 47-52 GDPECL 1 1 1

48(=13) 3 48-53 DPECLE 4 7 1 1

"Степень превышения линии отсечения: "1" (М+5о)< A40s< 2(М+5о); "2" 2(М+5о)< A40s< 3(М+5о); "3" 3(М+5о)< A,os< 4(М+5о); "4" 4(М+5о)< Ада« 5(М+5о) и т.д.

Представлялось интересным отличие в специфичности антител, образующихся при первичном ответе, от антител, получаемых в результате вторичного ответа. Из имеющихся в распоряжении сывороток только одна, анти-АВВ1-1пз, была пригодна для изучения динамики специфичности иммунного ответа (рис. 1) . Из эксперимента следует, что при первичном ответе антитела образуются как к участкам молекулы АВВ1-1пз, соответствующим гексапептидам из первого и второго антигенных сайтов (выявляемых антителами, полученными после вторичного ответа), но также и к Ы-концевому участку молекулы (гексапептиды 1-5). Нужно заметить, что гексапептиды 2-4 полностью состоят из а.к.о., перекрывающих участок последовательности ИФН-а2 130-

137. В дальнейшем при «созревании» гуморального иммунного ответа клетки, продуцирующие антитела против этих эпитопов, подвергаются анергии.

Чтобы подтвердить специфичность связывания антител с пептидами, был проведен конкурентный ИФА на взаимодействие антител против ABBI и ABBI-Ins с гексапептидами в присутствии альбеферона и рекомбинантного человеческого ИФН-а2, выступающих в качестве конкурирующих агентов. Как и в случае с куриными антителами, присутствие интерферона не ингибирует связывание пептидов с антителами этих сывороток. Связывание гексапептидов и сыворотки против ABBI-Ins наилучшим образом ингибирует сам ABBI-Ins, а ABB и ABBI - промежуточным образом. Связывание гексапептидов и сыворотки против ABBI лучше других ингибирует ABB, а сам ABBI ингибирует это связывание немногим менее интенсивно. Этот факт в очередной раз указывает на сходство антигенной структуры ABB и ABBI, а также отличие ее от ABBI-Ins. Для антигенных сайтов 1 и 2 характерна наибольшая вариабельность в степени ингибирования различными агентами, тогда как связывание гексапептидов антигенного сайта 3 ингибируется на 85% присутствием любого из перечисленных белков-конкурентов при использовании сыворотки против ABBI-Ins и практически на 100% при использовании сыворотки против ABBI. Это говорит о наибольшем различии в конформации участка 6-18 (45-53) в составе различных белковых конструкций по сравнению с конформационно стабильным участком 18-28 (53-63), что обуславливает различные параметры связывания одних и тех же антител, полученных в ответ на введение белков с одинаковой первичной последовательностью в составе различных конструкций.

Сравнение антигенных карт искусственных белков, полученных при использовании антител животных двух видов. На рис. 2

показаны суммарные антигенные карты четырех исследуемых белков, полученные при использовании антител двух филогенетически различных видов.

№

ABB ABBI ABBI-Ins ABB-Ins

EVEVTGGTVHVEVS P| EVEVT|GGTVHVEV

|evevt|ggtvhvev

SPEDP SPEDP

EVEVTGGTVHVEVS

№

ABB ABBI ABBI-Ins ABB-Ins

87

EVEVTGGTVHVEVSPEDR V3VEVT

GGTVHVEV

iVEVT

GGTVHVEV

SPEDR

S P GERGFFXClf

iVEVTGGTVHVEVSPßERGFFyCN

Рис. 2. Антигенные карты четырех исследуемых белков с частично перекрываемыми последовательностями. Антигенные участки, выявляемые антителами кур, выделены рамкой, мышиными антителами - темно-серым цветом, совпадающие участки - светлосерым цветом. Номера аминокислот указаны для последовательности АВВ1-1пз.

- линейные антигенные детерминанты при картировании куриными антителами не обнаружены 1 - куриными антителами не картирован

Общими антигенными сайтами, выявляемыми антителами обоих видов являются сайты 6-15 и 43-51, выделенные светло-серым цветом. Не исключено и то, что при картировании куриными антителами антигенным является также сайт 19-28 (54-63), выявляемый также и мышиными антителами. Гексапептиды, принадлежащие этому фрагменту белков ABBI и ABBI-Ins, были исключены из списка антигенных из-за перекрестной реактивности с собственным белков кур - ферментом яичников 17-ß-гидроксистероид-дегидрогеназой. Последовательность 4-28, обозначенная на рис. 2 как непрерывная антигенная область из-за перекрестного связывания антител с гексапептидами, содержащими часть В-эпитопа, состоит из 4 эпитопов. Первый находится в пределах аминокислотной последовательности гексапептидов 5-6 (I, KYSPD). Второй представлен гексапептидами 8-10 (II, DPGDP), третий гексапептидом 13(48) (III, PECLE), и выявляемый только мышиными антителами ко всем четырем конструкциям. Четвертый непрерывный В-эпитоп кодируется гексапептидами 19-54 (20-55) (IV, LLRRL). Общий

антигеннный сайт 43-53 состоит из двух эпитопов являющихся идентичными эпитопам II (45-49, DPGDP) и III (49-53, PECLE).

Куриными антителами выявляется еще один В-эпитоп 34-41 (69-76), GTVHVE. Причем он выявляется только в молекулах ABBI и TRX-ABBI-Ins, в присутствии иммунодоминантного эпитопа KYSPD.

Аминокислотные остатки, входящие в карты обоих видов животных, можно объединить в условное «антигенное ядро» (Kolesanova E.F. et al., 1996). Эти участки являются наиболее иммуногенными, но без учета конформационных эпитопов, которые не выявляются посредством примененного подхода.

Межвидовые различия в антигенных картах вполне ожидаемы, поскольку показано, что гуморальный иммунный ответ генетически детерминирован (Ozaki S., Berzofsky J.А., 1987). Более того, межвидовые различия у животных филогенетически достаточно далеких видов минимальны и составляют по одному непрерывному В-эпитопу для каждого вида.

Соотношение антигенной карты и пространственной структуры молекулы. Результатом действия каких факторов является антигенная карта, полученная с помощью пиновой технологии? Одни авторы утверждают, что линейные пептиды способны имитировать лишь эпитопы денатурированного белка (Laver W.G. et al., 1990). Эта точка зрения приводит нас к тому, что карта непрерывных эпитопов никак не связана с пространственной структурой молекулы антигена, и связана лишь с функционированием иммунной системы хозяина. Полярное мнение указывает на то, что антигенные детерминанты, включая линейные, находятся на поверхности белковой глобулы (Stern S., 1991; Subramanian S., Adiga P.R., 1998).

Существуют экспериментальные данные, свидетельствующие, что в природе имеет место промежуточная ситуация между полярными способами интерпретации результатов антигенного картирования методом пептидного сканирования (Мошковскиий С.А., дис. на соиск. уч. ст. к.б.н., 2001). При введении в организм животного чужеродного белка некоторая часть антител

образуется против его участков, утративших нативный фолд. Однако наибольшей является вероятность появления антител против экспонированных на поверхности участков молекулы антигена. Поэтому при картировании белков с неизвестной пространственной структурой те гексапептиды, которые часто выявляются с использованием антител разных индивидов, можно с большой вероятностью считать соответствующими экспонированным участкам макромолекулы.

Поскольку пространственная структура исследуемых искусственных белков детально неизвестна, их антигенное картирование позволяет косвенно подтвердить или подвергнуть сомнению данные о существующей модели пространственной структуры этих белков, а также указать на сходство в третичной структуре различных конструкций по совпадению В-эпитопов в их последовательностях.

Несмотря на то, что в состав а-спиралей входит около 28% последовательности альбебетина и немногим менее в других конструкциях, участки антигенного ядра почти полностью лежат в начальных участках этого типа вторичной структуры, а также соответствуют петлям между а-спиралями и р-слоями (рис. 3).

Иммунодоминантность присуща участкам неупорядоченной структуры на Ы-конце молекул всех конструкций (за исключением молекулы альбебетина, картированной куриными антителами). Тот факт, что не все поверхностные петли вошли в состав антигенных детерминант (рис. 3), объясняется различной иммуногенностью этих участков, т.е. особенностями функционирования иммунной системы животных, получавшего антиген.

сайта, обладающие различным иммуногенным потенциалом (таблицы 1, 2). Первый антигенный сайт состоит из двух (при иммунизации кур) или трех (при иммунизации мышей) близко расположенных или частично перекрывающихся непрерывных В-эпитопов: первого в пределах пентапептида КУЭРБ, второго, конформационно зависмого, БРСОР и третьего РЕСЬЕ (индивидуального для млекопитающих). При иммунизации мышей белками, не имеющими в своем составе фрагмента интерферона, антителами выявляются два эпитопа, идентичных по аминокислотной последовательности второму и третьему В-эпитопам конструкций, несущих фрагмент ИФН-а2. Второй антигенный участок включает в себя общий для всех конструкций минорный В-эпитоп ЬЫШЬ. При иммунизации кур белками с фрагментом ИФН-а2 обнаружен индивидуальный видовой непрерывный В-эпитол, находящийся в пределах

последовательности ССТУНУЕ.

Иммунизация животных обоих видов конструкциями, содержащими фрагмент интерферона, вызывает образование антител к перекрывающим этот фрагмент пептидам, но антитела не взаимодействуют с рекомбинантным интерфероном. Отсутствие такого взаимодействия можно объяснить различной топологией общего октапептидного фрагмента в молекулах интерферона и альбебетина. С другой стороны, эти данные позволяют нам предположить, что антитела, образовавшиеся в ответ на введение в организм животного искусственного белка с фрагментом интерферона, не будут взаимодействовать в организме с молекулой цитокина и не будут предотвращать его биологическое воздействие. Этот факт показывает, что альбеферон можно изучать далее в качестве возможного терапевтического агента с интерфероноподобной активностью.

Гексапептиды, соответствующие фрагменту инсулина, не проявляют антигенной активности при иммунизации животных обоих видов. Присутствие в составе белковой конструкции только фрагмента инсулина не влияет на иммунный ответ к остальной части белковой конструкции. Это свойство также можно расценить как положительный факт, подтверждающий возможность дальнейшего

изучения инсулин-содержащих конструкций для терапевтического использования.

У млекопитающих добавление октапептидного фрагмента интерферона-а2 в молекулу альбебетина и альбебетина с фрагментом инсулина увеличивает иммуногенность получаемого в результате белка. В частности, в случае иммунизации мышей белком с двумя фрагментами в дозе 100 мкг наблюдается увеличение титра сыворотки после повторной иммунизации по сравнению с альбебетином в 10 раз, а по сравнению с альбефероном в 5 раз. При иммунизации животных альбефероном в той же дозе титр возрастает в 2 раза по сравнению с альбебетином. При этом увеличение авидности суммарной фракции сывороточных антител по отношению к конструкциям, несущим интерфероновый фрагмент, происходит не только по причине взаимодействия антител с этим фрагментом, но и за счет лучшего распознавания иммунной системой всей искусственной белковой конструкции. В результате происходит образование большего количества антител, возможно, с большей аффинностью.

У млекопитающих присутствие в молекуле альбебетина обоих фрагментов увеличивает иммуногенность итоговой конструкции, что особенно ярко проявляется при ИФА сывороток, полученных после первой иммунизации (дозы 50 и 100 мкг на животное) . Возможно, удлинение белка всего на несколько аминокислотных остатков, приводит к формированию дополнительного хелперного Т-эпитопа, заметно усиливающего иммунный ответ.

Таким образом, при антигенном картировании линейных В-. эпитопов искусственных белков с частично перекрывающимися последовательностями показана минимальная зависимость антигенных карт от видовых особенностей иммунной системы. Выявлены три общих линейных В-эпитопа и по одному индивидуальному для каждого вида животных. В то же время сила иммунного ответа на эти белки у кур ниже, чем у млекопитающих, в 64-125 раз (для ABB и ABBI-Ins, соответственно).

Рис. 3. Пространственное расположение непрерывных В-эпитопов, выявляемых мышиными антителами в молекулах ABBI (а) , ABBI-Ins (б), ABB (в) и ABB-Ins (г). Цветовая кодировка отражает значения оптической плотности, наблюдаемые при связывании антител с гексапептидами.

С учетом минимальной межвидовой вариабельности гуморального иммунного ответа на исследуемые белки наши данные косвенно указывают на сходство пространственной структуры различных конструкций. С другой стороны, полученные данные свидетельствуют о том, что у конструкций существуют отличия в антигенной структуре и конформации участков, соответствующих идентичным В-эпитопам. Присоединение фрагмента инсулина к альбебетину очень мало влияет на иммуногенность и конформационную перестройку получающейся конструкции. Антигенные свойства альбебетина и альбебетина с фрагментом

инсулина весьма схожи. При присоединении к альбебетину фрагментов интерферона или интерферона с инсулином изменяются третичная структура и иммуногенность молекул по сравнению с альбебетином.

Экспериментальные данные показывают, что химерные конструкции можно изготовить на основе последовательности искусственного белка альбебетина. На рис. 3 видно, что фрагменты ИФН-<х2 и инсулина, присоединенные к Ы- и С-концам альбебетина, хорошо доступны для молекул растворителя, рецепторов, антител и их расположение относительно всей молекулы не имеет существенных различий. Это означает, что различия в иммунногенности фрагментов ИФН-а2 и инсулина заключаются в их первичной последовательности и в последовательности соседствующих с ними участков альбебетина, т.е. в присутствии распознаваемого хелперного Т-эпитопа вблизи предполагаемых В-эпитопов. Это факт нужно принимать во внимание при создании новых активных генноинженерных конструкций. Так как предсказание хелперных эпитопов все еще имеют недостаточную точность [Каттепеэее Н.-в. et а1], экспериментальные исследования остаются единственным способом выявления иммуногенности искусственных химерных белков на основе альбебетина для последующей разработки новых конструкций с минимальной иммуногенностью.

Заключение по результатам эпитопного картирования. Наши данные показывают, что альбебетин обладает иммуногенностью, сравнимой с таковой для природных глобулярных белков подобной массы. При иммунизации кур сам по себе альбебетин не индуцирует образования антител к непрерывным участкам своей аминокислотной последовательности, но при этом образуются антитела к его конформационным детерминантам. Таким образом, биологически активные фрагменты, присоединенные к искусственному белку-носителю, влияют на иммунологические свойства итоговой конструкции. В конструкциях, содержащих фрагмент интерферона, найдены три непрерывных антигенных

выводы

1. Впервые установлено, что присоединение к молекуле альбебетина фрагмента ИФН-а2 увеличивает иммуногенность итоговых химерных конструкций, тогда как присоединение фрагмента инсулина не влияет на их иммуногенность.

2. Впервые показана минимальная зависимость антигенных карт четырех искусственных белков (альбебетин, альбеферон, альбебетин-инсулин, альбеферон-инсулин) от видовых особенностей иммунной системы.

3. Выявлены три общих непрерывных В-эпитопа и по одному, индивидуальному для каждого вида животных. Иммунодоминантным В-эпитопом является С-конец фрагмента ИФН-а2 и прилегающий к нему участок альбебетина.

4. Антигенные участки всех исследуемых белков расположены на границах элементов вторичной структуры и на предполагаемой поверхности молекул.

5. Антигенные карты всех четырех исследуемых белков совпадают практически полностью, что косвенно свидетельствует о значительном сходстве пространственной структуры этих белков.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бочарова О.В., Мошковский С.А., Черткова Р.В., Колесанова Е.Ф., Долгих Д.А. Антигенное картирование искусственных белков методом пептидного сканирования // Материалы школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии". Пущино,

2000, С. 167-168.

2. Bocharova O.V., Moshkovskii S.A., Chertkova R.V., Abdullaev Z.Kh., Kolesanova E.F., Dolgikh D.A. Epitope mapping of de novo proteins with fragments from human interferon-a2 and insulin // 7th International Congress on Amino Acids and Proteins. Vienna, Austria / Amino Acids, Springer-Verlag,

2001, P. 10.

3. Бочарова О. В., Мошковский С. А., Черткова Р. В., Колесанова Е. Ф., Долгих Д. А., Кирпичников М. П. Иммунный ответ при введении искусственных белков, содержащих биологически активные фрагменты IFN-a2 и инсулина человека // Молекулярная биология, 2002, Т. 36(1), С. 84-90.

4. Бочарова О. В., Мошковский С. А., Черткова Р. В., Абдуллаев 3. X., Колесанова Е. Ф., Долгих Д. А., Кирпичников М. П. Введение биологически активных фрагментов IFN-a2 и инсулина в состав искусственного белка альбебетина влияет на иммуногенность итоговой конструкции. // Вопросы биомедицинской химии, 2002, Т. 48(1), С. 8-14.

Актуальности» проблемы. Распознавание белковых молекул лежит в основе практически всех биологических процессов. Имитирование их сайтов связывания делает возможным создание новых молекул для использования в биотехнологии, терапии и диагностике. В этом случае белковые конструкции de novo (искусственные белки, сконструированные под заранее заданную третичную структуру и уникальную топологию, не встречающуюся в природных белках) могут являться неким каркасом, в который можно ввести сайт распознавания природного белка, тем самым открывая подход к созданию новых миметиков и антагонистов природных молекул.

Пептидные препараты, исследуемые in vitro, порой невозможно успешно применять в клинической практике, так как пептиды обычно быстро инактивируются в организме благодаря нескольким механизмам, включая гломерулярную фильтрацию в почках, рецепторно-опосредованный эндоцитоз, протеолиз сывороточными протеазами [2, 3]. Главным механизмом из перечисленных является последний. Учитывая также, что белковые фармакологические препараты разрушаются при введении per os, и поэтому вводятся внутримышечно, подкожно или внутривенно, поддержание терапевтически активной концентрации в кровотоке является важным фактором при клиническом использовании этих препаратов.

Одним из путей преодоления этого препятствия является увеличение молекулярного веса путем ковалентного свазывания с биологически инертной матрицей [4] . Представляется вполне вероятным, что присоединение активного пептида к белковой молекуле жителя приведет к возникновению иммунного ответа как против носителя, так и против самого пептида. В этом случае новые конструкции, предназначенные для длительного курса лечения, будут инактивироваться и элиминироваться иммунной системой.

Любой новый белковый препарат после экспериментов in vitro, подтверждающих требуемую биологическую активность в отсутствии нежелательных побочных активностей и токсичности, должен рассматриваться в качестве потенциального антигена. Поэтому белковый препарат, который планируется применять парэнтерально в течение длительного курса лечения, должен обладать низкой иммуногенностью, т.к. возникновение иммунного ответа приведет к возникновению тяжелых побочных эффектов у пациента и будет препятствовать проявлению активности препарата. Он не должен иметь перекрестной реакции с собственными белками организма, чтобы не вызывать у пациента аутоиммунные реакции.

Гипотезы, касающиеся иммуногенности искусственных белков могут быть проверены только экспериментально, так как теоретический анализ возможной антигенности, основанный на поиске Т- и В-эпитопов, встречающихся в последовательностях природных белков, все еще недостадочно точен и в данном случае малоэффективен, поскольку последовательности искусственных белков отличаются от природных по определению.

Цель исследования: Целью настоящей работы является изучение иммуногенности искусственного белка альбебетина и его трех биологически активных вариантов, а также изучение специфичности и межвидовой вариабельности гуморального иммунного ответа на эти белки.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать мышиные сыворотки и препараты иммуноглобулинов из желтка куриных яиц против альбебетина и его трех биологически активных вариантов, имеющих в своем составе пептидные фрагменты интерферона-а2 и инсулина человека.

2. С применением пиновой технологии синтезировать гексапептиды, перекрывающие последовательность белка с фрагментами интерферона-а2 и инсулина.

3. Определить линейные антигенные детерминанты белковых конструкций методом сорбционного ИФА гексапептидов последовательности белка с фрагментами интерферона-а2 и инсулина, используя полученные антисыворотки и препараты иммуноглобулинов.

4. Сравнить внутри- и межвидовые антигенные карты, определить иммунодоминантные участки.

5. Определить, как влияет на иммуногенность исследуемых белков присоединение к альбебетину биологически активных фрагментов.

6. Сопоставить расположение антигенных детерминант с известными структурными элементами исследуемых белков.

Научная новизна и практическая значимость работы.

1. Впервые проведено детальное исследование иммуногенности искусственного белка альбебетина и его производных, несущих биологически активные фрагменты интерферона-а2 и инсулина человека. Получены данные об иммунодоминантных В-эпитопах четырех (альбебетин, альбеферон, альбебетин-инсулин, альбеферон-инсулин) молекул.

2. Впервые показано влияние присоединенных фрагментов интерферона-а2 и инсулина человека на иммуногенность искусственных белков.

3. Впервые проведено сопоставление данных антигенного картирования искусственных белков с их трехмерной структурой. Данные антигенного картирования косвенно свидетельствуют о значительном сходстве пространственной структуры четырех исследуемых белков.

4. Впервые показано, что специфичность иммунного ответа на исследуемые искусственные белки практически не зависит от видовых особенностей иммунной системы.

Полученные данные об иммуногенности и иммунодоминантных В-эпитопах искусственных белков целесообразно учитывать в дальнейшем при создании новых искусственных белковых конструкций.

выводы

1. Впервые установлено, что присоединение к молекуле альбебетина фрагмента ИФН-а2 увеличивает иммуногенность итоговых химерных конструкций, тогда как присоединение фрагмента инсулина не влияет на их иммуногенность.

2. Впервые показана минимальная зависимость антигенных карт четырех искусственных белков (альбебетин, альбеферон, альбебетин-инсулин, альбеферон-инсулин) от видовых особенностей иммунной системы.

3. Выявлены три общих непрерывных В-эпитопа и по одному, индивидуальному для каждого вида животных. Иммунодоминантным В-эпитопом является С-конец фрагмента ИФН-а2 и прилегающий к нему участок альбебетина.

4. Антигенные участки всех исследуемых белков расположены на границах элементов вторичной структуры и на предполагаемой поверхности молекул.

5. Антигенные карты всех четырех исследуемых белков совпадают практически полностью, что косвенно свидетельствует о значительном сходстве пространственной структуры этих белков.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую признательность и благодарность моим научным руководителям Долгих Дмитрию Александровичу и Колесановой Екатерине Федоровне за обеспечение возможности выполнения диссертационной работы и доброжелательное отношение на протяжении всего времени работы. Приношу свою глубокую благодарность заведующему лабораторией спектральных методов анализа ИБХ РАН Арсеньеву Александру Сергеевичу и сотрудникам его лаборатории за дружескую атмосферу взаимопомощи, безусловно помогающей выполнению работы.

Особую благодарность выражаю Чертковой Рите Валерьевне за помощь в освоении методов экспрессии и очистки искусственных белков; Мошковскому Сергею Александровичу (НИИ биомедицинской химии РАМН) за совместно произведенный синтез пептидов последовательности альбебетин-инсулина, помощь в освоении метода пептидного сканирования и содействие в работе с литературой; Моисееву Екатерину Викторовну за предоставление мышей линии ВАЪВ/с11С:^Мо1зе; Котельникову Ольгу Викторовну за помощь в работе с животными; Бочарову Эдуарду Валерьевичу за помощь в оформлении работы. Отдельную благодарность хочу выразить моим родителям за разделение со мной обязанностей по воспитанию ребенка в период работы над диссертацией.

Работа финансировалась Российским фондом фундаментальных исследований, грант № 00-04-48355, и частично Международным научно-техническим центром, грант № 403-98.