Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Картирование функционально значимых участков белка оболочки вируса иммунодефицита человка с помощью синтетических пептидов

•18.-1 9'31

ниннстерство здравоохранения российской федерации институт иммунологии

на правах рукописи

ищряковй лианй вадимовна

картирование функционально знпчиш участков белка оболочки вируса иммунодефицита человека с помо|ь1 синтетических пептидов

14.00.38 - Аллергологи« н иимцнология

автореферат диссертации на соискание цченой степени кандидата биологических наук

I.' < 4

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в институте иммунологии министерства здравоохранения Российской Федерации.

научный руководитель:

Научный консультант.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук.

профессор A.A. нихаююва; доктор недипинскга наук.

профессор А.Ф. ваковский

Ведущая организация: институт биофизики ишздрава РФ

Запита состоится , 1993 г. в " " часов на заседании

спешшизированюго совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава Российской Федерации по адресу: 115478. носква, Кашрское шоссе г\/г.

С диссертапиеи можно ознакомится в библиотеке Института иннуноногии

Минздрава РФ.

Автореферат разослан " "

чяен-корр. раин, профессор Хаитов p.m. кандидат химических глук Анпреев с.н.

Ученый секретарь специализированного совета шжтор иеаишвдских нэук

л.с.

сеславина

рСГ •** I i,'.- ..'

•ocv.a-a .оешш®-;.-

------1

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Co времени открытия вирусной причины заболевания спид прошло десять лет. и возрастание обьена информации по многочисленным аспектам этой проблемы приобрело лавинообразный характер, очевидно, что периодическая систематизация наших знании по отдельным направлениям проблемы СПИД крайне актуальна, одно из них, без которого немыслим прогресс а разработке элективных защитных препаратов, представляется наиболее важным и состоит в выяснении молекулярных механизмов патогенеза Htv-инФекиии. в частности, проникновения вируса в клетки-мишени хозяина.

Поскольку молекула CD4 является первичным рецептором идя hiv, локализация непосредственного участка связывания с белком «pizo имеет аажнеииее значение. Известно, что из четырех внеклеточных доменов cd4 главную роль в связывании с вирусом играет анинокон-иевои домен - D1 < последовательность 1-98). Укороченные варианты CD4 и его рекомбинанты, содержащие только Dt-домен.были способны ингибировать Hiv инфекцию в культуре клеток tArthos et ai 1989: Bates et ai 1989). Летальное картирование угого домена с помошыо сайт-направленного мутагенеза и анти-соч-моноклональных антител tArthos et al 1989: Bates et at 1989: sattentau et ai 1989: wiiks et ai 1990) позволило констатировать наличие двух принципиально важных участков, первый участок в районе аминокис-лотноя последовательности 38-70 (CDRг-гомология) распознается блокирующими ноноклональными антителами,причем он, по-видимому,и является первичным реиепторным сайтом, второй, в районе 75-100 (CDR3-гомология). как было показано с поношь» иутантных молекул cd* человека и обезьяны,может играть решашу» роль в слиянии клеток в присутствии вируса (образование синиитиев) [earnerini et al 1990). синтетические пептиды, воспроизводящие указанные фрагменты. могут оказаться перспективным для селективного блокирования Hiv инфекции.

Поиск эффективных терапевтических агентов против СПИДа, начавшийся в 1983-34 гг.. привел к установлению того Факта, что соединения, содержащие отрицательно заряженные ионогенные группы. как правило, в той или иной степени блокируют hiv инФекиию в культуре клеток, среди них наиболее выраженным эффектом обладает сульФатированные полисахариды - декстрансульФаты (DS) с мол. массой более 5 kt>a,. гепарин, пентозансулы-ат, каррагенаны. суль-Фатированные хитозаны, а также синтетические полимеры - поливинил- и полиэнетол-сульфаты, сополимер акриловои кислоты и винил-сульФата tlto et al 1987: Ueno and Xuno 198?: Tochikura et al 1989: De ciercq 1990; Baba et al 1990: schois et al 1930: sot 1

et al 19911. в отличие от азидотинндина и его аналогов ряд ps способны блокировать не только репликацию вируса, но и подавлять слияние инфицированных и неинФшшРованных клеток fHitsuya et al 1988]. Весь нассив данных, известных сегодня, свидетельствует о тон, что такие полианионы вмешиваются в процессы адсорбции и слияния H1V с клеткой, но не проникают в ее питоплазиу.

С другой стороны хорошо известно! что вирус в инфицированном организме индуцирует вирус-неитралиэушие антитела (НА). которые на какое-то вреня сдерживают развитие инфекции и патологических процессов. Главный участок, на который наделены эти антитела расположен в вариабельном V3 доиене белка вР120 оболочки вируса. Как правило, у всех ШУ-инФипиРованных лиц в крови появляются на (по результатам тестирования in vitro) с той или инои динамихои их нарастания и персистениии. хотя присутствие на не приводит к 1 полной элиминации вируса из организма и не препятствует развитию спид . однако их персистенпия, по-видимому, пролонгирует бессимптомный период и увеличивает выживаемость инфицированных лиц [Weiss et ai 1985: Robert-Guroff et al 1985; тгетмау et al 1990). Анализ на -активности сывороток в вирус-клеточных культурах выявляет большу» ее зависимость от используемого штамна HIV. причем титр на меняется в зависимости от пациента, сроков инфицирования и клиническои стадии; со временем наблюдается расширение эпитопнои специфичности на из-за расширения вирусной популяции (Matthews et al 1986; Weiss et al 1986; Alesl et al 1989; Sawyer et al 1990). многие данные говорят о том. что развитие патологического процесса находится в тесной связи с эволюаиеи вируса, зависимой от особенностей организма хозяина и даже отдельного органа tSaas et al 1988; coffin 1986; Leider et al 1988; Epstein et al 1991) .

На данный номент стройная картина по механизмам анти-вируснои активности ряда полианионов, фрагментов CD4 и антител к V3 доне-ну gpizo отсутствует.

настоящая работа является частью исследовании по картированию •молекул см и 8 р 160 с помошью синтетических пептидов для локализации сайтов.принимающих участие в вирус-клеточнон взаимояеис-твии. ны приводим данные 1) . по блокированию H1V инфекции in vitro в присутствии фрагментов из dl домена молекулы cd4; г) по анализу тонкой- структур» антигенных детерминант и Функциональной нагрузки определенных анганоюгслотных остатков в составе основного вируснеитрализушего зпитопа и С-конпевои области1 №i!?ovr 3>>; по мониторингу эпитопного спектра антител из сывороток hiv-инфи-

-s-

пированных пациентов с Различит характером протекания заболевания.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель работы - картирование основных функционально значимых фрагнентов «рч1 и ер 120 с поношью синтетических пептидов: исследование механизмов вирус-клеточных взаимодеиствии путем локализации яр1го-связываших участков на соч-нолекуле и. соответственно. фрагментов яр1го. входящих в антиреиепторныя блок, для достижения поставленной пели решались следующие задачи:

1. Анализ тонкой структуры антигенных детернинант «рЧ1 и 8P120 с понотъю частично перекрывающихся синтетических пептидов и химической модификации лизин-содержапих фрагментов: оценка диагностической значимости пептидов.

2. Анализ эпитопного спектра антител в сыворотках пациентов с различным характером протекания заболевания, мониторинг сывороток ШУ-инФипированных лии.

3. комплексное исследование основного вирус-неитрализуютего эпитопа (PHD) н соч-саязываютего участна (CD4-8R): определение антигенно значимых аминокислот, опенка диагностиче'ского индекса пептидов из двух итаннов HIV - BRU и НИ; анализ их антигенного перекреста: сопоставление структурных мотивов. сравнительных анализ,свойств антипептидных сывороток кивотных и сывороток H1V-инФииированных лип.

4. оиенка блокирушеи активности фрагментов вРЧ1/а»1го в ви-рус-клеточноя системе в тесте синиитиеобразования.

5. оиенка блокирующей ' активности фрагнентов первого домена молекулы CD4 в вирус-нпеточноп системе.

6. Разработка нетоаа для анализа прямого пептид-пептидного и пептид-полианионного связывания, основанного на электростатическом взаимодеиствии.

7. Исследование механизмов антивирусной активности фрагмента CD1» и ряда сульФатированных полисахаридов, таких как сульФатиро-ванные производные декстраъа и хитозана. в разработанном пептидном варианте ELISA и тесте синчитиеобразования.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучена реактивность пептидных фрагментов из различных регионов белка оболочки с HIV-положительными сыворотками. выявлены пептидные Фрагменты, обладающие максимальный диагностическим индексом. ,

На наборе пептидных фрагментов, перекрывающих участки белка оболочки HIV с различной Функциональной нагрузкой, проведен ко-

ниторшг сывороток HIV-инФипиРованных пациентов, отмечено различие эпитошого спектра антител для пациентов с длительным бессимптомным периодом и папиентов с быстрой прогрессией заболевания,

используя набор частично перекрывавшихся пептидных Фрагментов и метод химической модификации остатков лизина е пептидах проведено эпитопное картирование:

а) основного иммунодонинантного участка «рЧ1 <584-6E4);

б) основного еирус-неггрализушего домена eptго (PND. 301-323);

в) гипотетического СМ-связываюпшго участка (CD4-BR. 423-450): г> с-конпевои области «р.120 (495-518).

Для основного иммунодонинантного эпитопа 8Р41 1584-624) установлена определяющая роль лизина-606 в Формировании антигеннои детерминанты. 1

Детальное исследование основного вирус-нептрализутего домена (PND) 8Р1Е0 (301-323) показало, что центральная относительно консервативная часть PHD (QPGRAF) не является основный эпито-пон для человеческих HIV-положительных сывороток. Эпитоп для указанных антител локализуется в н-кониевои части РШ> и содержит основные аминокислоты. Данный эпитоп не перекрывается с эпитопои для антител к PHD из сывороток лабораторных животных, полученных путем иммунизации искусственными антигенами.

Установлено, что. в случае CD4-BR. антигенная детерминанта локализуется о его Н-кониевои части и не включает остаток лизина -426. Показано сходство структурных мотивов PND и CD4-BR.

Показано, что С-концевая область gpl20 содержит, по крайней мере, две детерминанты.

Показано, что пептидный фрагмент из с-конаа первого домена молекулы CD4 обладает htv-ингибирушеи активность» в тесте син-иитиеобразов-ания. неханизм действия данного пептида сопоставлен с механизмом антивирусной активности ряда сульфатированных полисахаридов,

Установлено, что характеры антивирусной активности сульФа-■тированных полисахаридов и пептида из первого домена см сходны к обусловлены наличием специфического (большей частью электростатического) взаимодеиствия с PHD или/и с с-конвевои областью врио,

Разработан пептидныи вариант ELISA для предварительного скрининга HIV-блокируших препаратов ионного характера. ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

нетоды и подходы, использованные при изучении антигенных де-

• -

териинант белков HIV. окажутся полезными для исследования антигенной структуры белков любого другого вируса.

Отобранные пептидные фрагмента с максимальным диагностическим индексом могут быть использованы для конструирования высоко чувствительной и специфичной тест-системы для выявления антител к HIV.

Набор пептидных Фрагментов из различных регионов белков «р'И. ер 120, ргч может быть использован для разработки верификационного теста по принципу elisa.

Сравнение эпитопного спектра антител Hiv-инфииированних пациентов с различным характером протекания заболевания может иметь прогностическую значимость,

Новые научные Факты., представленные в диссертации, дополнят-современные представления о неханиэмах .в'заинолрпствия вируса с клеткои-мишенью.

Разработанный пептидныи вариант ELISA возможно использовать для предварительного скрининга Hiv-блоиируюших препаратов полна нионного характера.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ И АПР0КА1ШЯ 1'AliOTU

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, основные результаты представлены на симпозиуме по химии пептидов (('ига. 1990). I съезде иммунологов России (Новосибирск. 1992). vin неждународиои конференции по спилу (Амстердам, 1992), международной школе по иимунологии (Ташкент, 1992!. ОБЬЕН И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из следующих разделов и глав: введение, обзор ли-гегатуры и глава), собственные исследования <8 глав), выводы, список литературы. Список литературы включает источников, из которых 8 отечественных и зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

сыворотки

Сывороток исследовали на наличие анти-Hiv антител с помошьм конерческйх тест-систем VIRONOSTIKA (Oreanon Teknikai и в имму-ноблоте (BIO-RAD). Использовали панель сывороток от гч пачиентоп Института'иммунологии мз рф. СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ.

Пептиды были синтезированы и любезно предоставлены сотрудниками лаборатории пептидов Института иммунологии ИЗ гАндреевым с.н., азьмуко a.a.. взфинои н:г...сидоровой н. в. МОДИФИКАЦИЯ ПЕПТИДОВ

К раствору гоо мкг пептида/ гоо мкл кзр'юнлт-гжк-лр^жгпюго буффера, РН 0-9, лоллпляли н> мкл уксусного знгилг-wn iaa) и мкг

го перенешнвали.Через 5 мин. анализировали полноту прохождения реакции с помощью Флуоресканнна (Пика) путем нанесения "I нкл реакционного раствора параллельно с исходнын (без АА) на пластинку с силикагелем (Merck) с последующим нанесением капли 0.05* Флурескамина в диоксане, содержащем 1* пиридина и наблюдением Флуоресценции при возб.хобо нм.Как правило,при однократном добавлении АА в среду со свободным пептидом наблюдалось полное блокирование Флуоресценции,что свидетельствовало об отсутствии свободных аминогрупп. При наблюдении остаточного свечения реакцию повторяли, контролируя pH (чн НаОК). ELISA

Пептиды растворяли э 60 мН карбонат-бикарбонатнон буфере IPH 9.6) и наносили на планшеты GRE1NER в концентрации го нкг/мл. После инкубации в течение 1.5 час при 37 с планшеты Отмывали от нес вязавшихся компонентов раствором ФСБ/твин-20,Тестируемые сыворотки разводили 1:50 в фсе/о. 5* БСА /0.05* твин-го: ннкусиро-вали с адсорбированным на твердой Фазе пептидом зо мин при 31°С. после инкубации отмывали 4 раза раствором ФСБ/теин-го. Раствор коньюгата анти-IíG человека с пероксидазои (Sigma) в рабочем разведении инкубировали зо мин при 37е с. отмывали аналогично, для выявления комплексов использовали проявляющую смесь: 1 мг ОМ /ю мл он н ш-Б/ео мкл з* нгог.Реакцию останавливали гн нгзоч. Cut off оценивали как среднее значение величины оптическои плотности для го сывороток доноров + 3 3d. ELISA (конкурентный вариант)

Для проведения конкурентного варианта ELISA 8 стеклянных пробирках готовили последовательные разведения исследуемых пептидов в диапазоне от 250 нкг/мл до 60 нг/нл в ФСБ/о.5* БСА/0.05* твин-го, в пробирки добавляли пулированную позитивную сыворотку человека (п = Ю) в предварительно подобранном разведении; в контрольные пробирки к сыворотке антиген не добавляли, инкубировали чь мин при комнатной температуре, затем переносили по 100 икл из каждой пробирки в планшеты с предварительно на несенными пептидами. Инкубировали зо мин при 37'с,Далее реакцию проводили по представленной выше схеме непрямого варианта ELISA. Elisa (конкурентный вариант с лекстран сульфатом.(ds).)

с целью 0И&НКИ связывания DS soo.ooo с пептидными фрагментами вр120 и 8р41 (табл.6), адсорбированными на твердой Фазе, использовался следующий вариант ELISA. DS разводили а ФСБ/0-. 5* БСА/0,05* твин-го а диапазоне концентрации о.06-250 мкг/мл и переносили в планшеты с предварительно адсорбированным пептидом. Через 10 мин HIV-положительная сыворотка, имеющая на. данном пептиде сигнал порядка 1.0 (Разведение 1: 50 или 1:100), добавлялась в лунки планшет, указанная смесь инкубировалась зо мин при т=37. Дальнейшая постановка реакции осуществлялась по методике,' описанной выше. Аналогичная сяема использовалась для опенки взаимодействия пептида из vi CD4 с тем же набором пептидных фрагментов из табл. 6..

ELISA (снятие йнгибируюшего действия DS пептидами в растворе)

Для анализа связывания DS с пептидами в растворе использовали вариант F.LISA согласно следующей Формуле: UlA * IDS10Q'»' ■? Tip)) ♦ с, • • i"-'-- W-i00>- - минмнальная концентрации« CS. данная 100" инги^иро-

вание связывания сывороточных антител tc> с адсорбированным пей тидон (Па). Пр - пептид в растворе.

DS в концентрации г-4. миг/мл = DS100* инкубировали с пептида -ни в диапазоне концентрации 0.0S-250 мкг/мл ю.ог-юо мкн> а присутствии' сывороточных антител в течении зо нин при комнатной температуре. Затем снесь переносили в планшеты с предваритетно адсорбированными пептидами 5 или 8 (табл.З). Таким образом, был» использована гетерологичная систена. исключающая возможность взаимодействия пептида в растворе со спектром антител, направленных к адсор&ированнону на пластике пептиду. Параллельно оценивали перекрестную Реактивность пептидов в растворе и на твердой Фазе в отсутствии ds. 1 ТЕСТ СИШШТИКОБРЛЗОНАНИЯ ,

Использовали неинФиицрованную клеточную линию 119 и хронически инфицированную Н1V лини») H9/RF в соотношении 1: l или г: i при конечной концентрации клеток 5x10»5/мл в присутствии или отсутствии тестируемых образцов. Исследования проводили в 96-луночинх планшетах FLOW в объеме Юо нкл на лунку. Подсчет синии-гнеи про водили через 16-18 часов визуально во вон обьено лунки. Учитывали сшшитий, Pá3H0P которых в г.5 раз и более превышал размер клетки линии Н9 в норме. Контролем максимального синиитиеобрачо-вания считали количество синаитиев на лунку после сокультивдиии клеток и9 и H9/RF без добавления исследуемых препаратов. В качестве оценочного параметра для различных концентрации пептидов использовали относительный * ингибирования синкитиеобразования.

Для централизации ингибируюшеи активности SP, раствори D3 или ChS в двух концентрациях 0.25 мкг/мл и 2,5 мкг/мл (75* и юо* ингибирование синиитиеобразования) инкубировали ю мин при комнатной тенпературе с растворами пептидов в диапазоне концентрации 31-250 нкг/нл (12-100 нкн). Затем смесь переносили в планшеты, содержащие H3:HVRF. Через 16 часов проводили подсчет синиитиев, Параллельно тестировали сани пептиды в тон же диапазоне концентрации. Работа проводилась на базе Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АНН РФ под руководством карамова э.В. и Корнилаевои г.В. иннунизлиия

кроликов (Shinshi J i а> иммунизировали коньюгатом KUI-пептид us -Чвб (200 мкг по пептиду) и свободным пептидом HN-21 <1(>о мкг пептида) подкожно в четыре точки в полном адъюванто фреинла. Четыре последующие иммунизации проводили с интервалом 3 пололи (1.00 мкг по пептиду) а сочетании с неполным альюопнгом Фгепнла. Сыворотки оценивали.методом ELISA с использованием свободного пептида и коньюгатов. Автор благодарит Петрухину л.о. (Институт иммунологии НЗ РФ) за иммунизацию кроликов и получение антиснво-роток.

-iO-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

АНАЛИЗ ТОНКОЙ СТРУКТУРЫ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ТРАНСНЕИБРАННОГО БЕЛКА ОБОЛОЧКИ HIV С ПОНОШЪЮ ХИМИЧЕСКОЙ КОДИФИКАЦИИ СИНТЕТИЧЕС-

■КИХ ПЕПТИДОВ

581 603 .

II IV-Е AI ЕКYLQDÜARLNSVGCAFRQVC

'584 + ♦ +624

HIV-1 R1LAVEEYLKD0QLLG1WGCSGKL1CTTAVPWHASWSHKSL

__(G) A3-551

_:_ SP11I-19

ШАЬ—> _" ' . _ СН-191

_■ СН-185

.....................(Dopel et al 1989)

иль - - > --------------:-------—— (Dopei et al 1989)

------—— (Dopel et al 1969)

Рис, 1 Гомологичные последовательности синтетических петипов изинмуно-ломинантаого района прансменбраиных белков Н1У-1 и Н1У-2. пАЪ~> моноюгональное антитело, реагирует с петидон. указанным стрелкой; 4 остатки лизина

с пелью эпитопного анализа главного иммунодонинантного района оболочки Н1У.Расположенного в Н-конаевои части ТР.ансменбРанного белка вР41 (Н1У-1 вии-изолят) и «р36 (ШУ-г Щьиэолят), синтезированы твердофазным методом набор перекрывающихся пептидных Фрагментов (рис.1). Анализ реактивности синтетических пептидов с панель» ш'/-позитивных сывороток в МА показывает высбкии процент их распознования всеш пептидани из этого района; однако. , реактивность (титр) ряда сывороток к указанный пептидам з>анетно

25/25

23/25

25/25

22/25

гг/гъ

as-551

cn-190

CN-191

CN-185

SI'I!I-19

Рис.2 СРаегоггельиш анализ роактивности пептидов с анти-Н1У-позитнйиши сыворотками (ri-25>

различаотся. Так. A3-55I и CN-191 реагируют с ?5 из 75 <75/75) серопоэитивных сывороток. SPU1-19 - 62rt">» ® то же еи?и-я„ ии?-кореактивине сыворотки в отношении пептида SPH1-19 являлись вы-сокореактивними с СИ->91. AS-551. VM-368, фрагмент sp36 H1V-2. распознает 7/7 H1V-2+ сывороток. Сыворотки доноров №--20) не давали реакции с данными пептидами, картина распределения реактивности сывороток серопоэитивных и сероотрипательных. доноров приведена на рис.н. Видно, что наиболее высоким диагностическим индексом характеризуются пептиды AS-551 и СН-191. Оба пептида содержат остатки иистеина в положениях 603 и 609. способные к образованию дисульФидноя связи (оксидная Форма). Сравнение имму-нореа^тивности двух препаратов гг-членного фрагмента 603-62». где в первом (CN-190) - оба пистеина блокированы аиетамидоме-тилыюи (лет) группой, а во втором - СН-191 - эти остатки деблокированы и окислены (оксид). показывает, что оксидная Форма обладает заметно большим аффинитетом к анти-HlV антителам.

Для относительной количественной опенки связывания Hiv-анти-тел с пептидами проводили реакции конкурентного ингибирования путем предшшубадии антител пула позитивных сывороток (п=10) с пептидами в диапазоне концентрации от 0,06 нкг/мл (0.02 иМ) до 250 ннг/нл ООО ин> . . .

суммируя результаты данной серии экспериментов, можно сделать вывод о наличие пополнительных, более значимых антител-связываю-ших сайтов в области .600-610 8р"И . В этом участке расположен остаток лизина, который, судя по ранней работе, играет важную роль в Формировании антигенной детерминанты. Для опенки роли эпсилон-аминогруппы лизина в Формировании эпитопа, взаимодействующего с активным центром антител, мы провели химическую модификацию пептидов СИ-191, AS-551. SPIII-19 и VM-368 ffllv-2) путем блокирования положительного заряда эпсилон-аминогруппы лизина ааетнлиро-ванием уксусный анигидридом при pH 8-9, известно, что в данных условиях модификации должна подвергаться, в основном, эпсилон -аминогруппа лизина и N-конаевая альФа-аминогруппа. в результате такой обработки процент распознавания серопоэитивных сывороток на указанных пептидах снизился на 10-15« (рис.З). причем, тенденция к снижению величины оптической плотности в ИФА аналогична дня SP1H-19 и VM-368, и наиболее выражение для AS-551 и сн-191..

Из косвенных данных следует, что химическая модификация эпси-лси- аминог'рупгш лизмна-боб оказывает значительно больший эффект на аНипность взаимодействия пептидного Фрагмента с Hiv-антите-JMM)! я.» rpanifrnw с модификацией лизина-593. Следовательно, эли-

ОНИ

(6-551

¡ г з 4 5 6 7 |3 9 10

/

Рис з. Реактивность ШУ-позитивных сывороток с пептидами и их ацетильными производными. Черные колонки- исходный, заштрихованные колонки- модифицированный

топ. содержащий лизин-606 (AS-551. СИ-191), по-видимому, является самым главным в отношении шстинФекпионноя индукции антител.

совершенно очевидно, что коныогирование лизин-содержапшх пеп- . тидов с высокомолекулярными носителями, основанное на реакции конденсации аминогрупп пептида, должно приводить к существенному снижению антигенности пептида в составе коньюгата. если лизин входит в активный центр эпитопа. С целью избежать нежелательной модификации пептида при его коньюгировании с носителем мы попытались провести селективно конденсацию пептида AS-551 по его альФа-аминогруппе с сукдинилированным желатином.используя низкий рн (6.5-7.0). В этих условиях эпсилон-аниногруппа пептида должна е существенной степени быть протонированнои, в отличие от его альФа-аминогруппы. Реакшто аиилирования свободного пептида про- ' водили N-оксисуктшимидным эфиром сукаинил-желатина' Иммунореак-.нвность полученного препарата сравнивали в ИФА с исходным пептидом на панели из 30 положительных сывороток, как оказалось, выполненная в данных условиях коньюгапия не изменяет иннунореак-тивности конъюгата по сравнению со свободный пептидом.

ПЕПТИДЫ ИЗ ГЛАВНОГО ВИРУС-НЕИТРАЛИЗУЮШЕГО И СОЧ-СВЯЗЫВАЮШЕГО Д0-НЕНА: СХОДНЫЕ ИННУКОРЕАКТИВНЫЕ СВОЙСТВА И СТРУКТУРНЫЙ МОТИВ

Таблица 2

Шифр Белок Итанн Локализация Аминокислстши анализ

нз-ззз «P120 BRU 301-319 CTRPNNNmsiRIQBGPG

Ю-480 ÍP1ZO BRU 307-329 (ACta-C)HrKXSlHlQEOPORAFVTIGKIG.(C-Acm)

№-'185 8Р120 BRU 307-329 (OHTRKSIRIÜRGPGRAmiGKIC (С)«

ЯН-2 4 8P120 МН 301-323 (С)YNKBKRIHIGPGRAFYTTKNIIG

МН-21 8Р120 МН зоз-згз XRKRIH1GPGRAFYTTKNIIG

да-14 SP120 Ш 310-323 GPGRAFYTTKHIIG

w-чог 8Р120 БШ 434-450 EVGfOWAPPISGQIRC (Acm)

MV-404 «р1 го BHU 431-450 MVOEVGKAMYAPPISGQIRC lAcm)

MV-41I «р1 го BRU 423-450 (Acra) CRIKOFlNrWEVGKAMYAPPISGQlRC (Acm)

mv-'lllc «Р1 го BRU 423-450 CR1KQF1NMWQEVGKAMYAPP1SGO1RC«

AS-551 SP4I BRU 534-612 RILAVERYLKDQQLLG1WGCSGKL1CTTA*

КС-191 вр'н BRU '602-621 GCSGKL1 CTTAVPWHASWSNKSl,

ИЗ-551 ?Р41 BRU 842-861 CRAIRHIPRRIRQGLERIIX

• сселенная 4огиз пептида по остаткам шктеина (Cys-S-S-Cys)

- /à-

Настояшая Работа явля9тся частью исследовании по картированию функциональных сайтов сёлка оболочки hiv в плаке выявления вирус -централизующих эпитопов. изучения вирус-клеточных взаимодействии, и поиска серологических наркеров для мониторинга hiv-инфи-чированных лии. В настоящей работе на приводим данные по реактивности сывороток H1V-позитивных лип с синтетическими пептидами, иммнтируюпими секвенциальные эпитопы phd (двух отдаленных штанное - BRU и МН) и CD4-BR. Для сравнения использованы кннунодоминантные фрагненты »P120 и gpll. Была сделана попытка рассмотреть PHD и CD4-BR с различных точек зрения: вычленить ан-тигенно значимые аминокислоты, оценить диагностический индекс пептидов из двух штаммов hiv и провести анализ их антигенного перекреста и структурного сходства, используя антипептидные сыворотки и нетод химическоя модификации.

. Фрагменты PHD получены для двух итаммов nv - BRU и MN, которые в структурном отношении перекрывают значительный ареал известных вирусных изолятов, тем более, что CD4-BR представляет собой консервативную область «pi20. иммунореактивность полученных пептидов предварительно оценивали на панели rflV* сывороток (рис.Ч) .

С целью эпитопного аналиса H1V* сывороток, а также тестирования функциональных свойств фрагментов CD4-BR (иннунизация.изучение блокирующих свойств в вирус-клеточной системе), были синтезированы три перекрывающихся пептидных фрагмента 434-450, 431450 и 423-450, '"'причен последний был получен также и в циклической Форме. Все они имели в с-терминальнои части спеисер в виде двух остатков глицина, выбор таких Фрагментов был обусловлен тем Фактом, что нутапия по остатку ТРипТ0Фана-¥32 являлась критичнои .для HIV в отношении его связывания с рецептором (Cordonnier et al 1989). Как оказалось, * распознования положительных сывороток нарастал по мер© удлинения пептида с 36* до 96*. причем иикли-ческии аналог 423-450 показывал наибольшие сигналы в ELISA. Правда, большинство сывороток имело низкий титр: 6/30 (титр - 1: 50). 8/30 (1:100). 8/30 (1:200).

• Дальнейшие наши исследования выявили интересную закономерность - иннунныи ответ на фрагменты pud (307-329) и cd4-br <423450). по-видимону. както взаимосвязан, Так. профиль реактивности (оптическая плотность й elisa) сывороток с пептидом 307-329 почти синхронно воспроизводится с пептидом 423-150 (рис.5) , хотя и с разными титрами,, при этом корреляция совершенно отсутствует для других имнунореактианых пептидов. <584-612. 604-624) и вирус-

г.5( 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

Ш

13/25 16/25

• !

* 8*

8* {

„т 41

р1

23/25 ?

6/25

25/25

1

«п»

и ь

~ •тшш

I

р?

Р2 Р4 Рб

Р Е Р Т I О Е

РИСИ йннунореактивность синт&тиЧеских пептидов с сыворотками ШУ-поэитивных лип в твердофазной имнуноФерментом анализе; .ордината - оптическая плотность при <92 ни. Абсписса - пептиды Р1 (Нз-ззз). рг (нэ-чт рч шн-гч).

шц-ш р7 <ис-19»

г

I I Г I I I И I I I I I II Г 1 II Ч » 1 » I » * » > I I 'I I I'» I М I 1 I I ' I М 14 Г I т

РйС- 5. Профиль 1м1уюреак1мвнхли для -м шу-гкдаотгельных сывороток

с геггтипзми «з-чвб (-) им^-чн {- - -) в твердоФазнэн ижуноФепютда

анализе. По оси ординат - оптическая плотность при чэг пэ оси абиисс-порядковш номер сыворотки.

ного лизата в тест-системе Ог«апо1)-У1гопо$ика. Расчитанныи коэффициент корреляции оказался равен 0.82 ♦./- 0.18.

Итак, данные независино проведенных экспериментов показали наличие четко выраженного антигенного перекреста на пептидных фрагментах из РШ> и СВЧ-В1? как для Н1У-1/2-положительных сывороток, так и в модельной системе для антнпептидных сыеороток кролика (таблида г).

Таблица г. перекрестная жмунорективяость антител к синтетически« фрагментам из РНВ и СМ-ВК (величина обратная татру)

Антисыворотка к пептид/

PHDIBRW 307-329

Пептид на твердой «азе (планшета)

100 12.800 ' 1.600 1.600

100

200 1.600

PHDMH) 301-323

<100

•400

6.400 6.400 400

100

CD4-BR 423-450 -

<100

600

6.400 6.400 6.400 51.200 51.200 51.200

• \ • . . .

Необходимо отметить, что зоны PHD и CP4-BR для H1V-1 заметно различаются по оервичнои структур«, причем первая - гипервариа-бельна.а вторая - консервативна. Тем не менее, анализ гонологии этих фрагментов выявил их обтие структурнью элементы (рис.6). Шесть позиции, е которых определенные аминокислоты с вероятностью 90-95* встречаются в PNt> (LaRosa et ai 1990). точно воспроизводятся в последовательности CD4-BR. Имеется также гомология, с вахнои для PHD центральной областью.

таким образон. структурные мотивы главного вирустнеитрализую-г.его элитапа и гипотетического скч-связываюшего участка, очень похожи и это может играть какую-то функциональную роль.

О

СШНОВНЮ CTRPHHN..T laitosa et at 1990

пз

0С7-329. ЕШ

ШНЙ

«£ИЕй EEU

О H . . Т

С Й I

к s

KS

Q F

H

. . QPC

QRCPC

.TTGEI I G DIRQAHC

TIGKI.G О

к к к . «

VQEVG

АН

АРР I SGQ 1 RC

H

РИС. б. выровненные гомологичные последовательности областей PND (пептид MS-48B, вни-штаин). CD4-BR (пептид HV-411. BRU штанн) и консенсусная последовательность для PHD [LaRosa ét al 1990).

анмкз эпитопнои специфичности лнтител ИЗ сывороток hiv-иифициро-ванных гаи с использованием функционально значимых фрагментов белков h1v ..

клиническая картина протекания заболевания значительно ваРь-.. ир/ет у различных индивид/улов. Наряду с быстрым развитием у одной группы пациентов генерализованной лииФаденопатии е сочетании с симптомами. классиФидируеными как спид-ассоииированныи комплекс, существует группа инфицированных лип с длительным, практически бессимптомным периодом.Факторы, которые определяют течение Hiv-инфекаии'. неизвестны, как и не существует пока методов, которые бы прогнозировали развитие заболевания.

из многочисленных исследовании по изучению иммунобиологических свойств отдельных фрагментов оболочки HIV следует обшии вы- ( вод. что именно тонкие вариации ее структуры во многой определяют картину патогенеза Hlv-инФекпии (Андреев и Нетерякова 19923 . Изменения ь ее аминокислотной последовательности, вследствие иу-

%

таами и отбора вирусных вариантов под прессой иммунной,системы, должны влиять не только биологические свойства вируса, но и эпи-топную специфичность антител в ответ на изменения.его антигенных детерминант.

Наиболее удобный способом анализа эпитопнои специфичности сывороточных антител, на наш взгляд, является использование ELISA на основе синтетических пептидов. Таной метод легко стандартизируется и. в случае'правильного выбора антигенов, по информативности не уступает методу western Blot, следует отметить, что работ по мониторингу этштопного спектра антител индивидуального больного до настоящего времен« не проводилось.

Используемые в работе пептидные фрагменты перекрывают участки белка оболочки H1V с различной функциональной нагрузкой (таблица 1): .

1> ww/нопоминактные элитокы:

2) Фрагмент, который индуцирует образование вирус-нейтрализующих антител (PND);

' 3) икмуносупрессорнын участок 8Р41; ») области, гомологичные фрагментам HLA класса П; 5) домен слияния вирусной и клеточной мембран, локализованный 8 н-кониевои части IP41; : ,

о вознохныи анткревепторныл участок (CDH-BR), ответственный за первичное связывание вируса с СМ в сложной многоступенчатом процессе адсорбции. . .

б работе использовали панель сывороток от 29 hiv-i-ннфипиро-

ФШСИШЛПЫЮ OíiVKlE 0БЛЛ7Ш ГОЖЛ ОБОЛОЧКИ HIV ШШ игганн)

CIUETIUCME ШИН

' НСИИЛ^

Авзопштш kutkiinitóocti Em«. ink* bit* tt

л. iri-jw IM! отптштташ

-I. ИМИ ИМИ CtlSlVMSUfffllTflCIJUC

j. м$ иипсгготттикгмисю

mt ими сшгшсктятш

5. hc-î3t ri-m тсигтшиимш

( sc-jj) jsi-in тгплшшиск

j. ими ИМИ tciiTHsiiKiGPCttnmim «

I. K-IM JW-3ÎÎ Ю-»а1П1НШИ5КиПТШ1С-»П>

». И-ll ИНН 1СИ«Ш11ВКтАШТШ151

i». lü-n 510-ш treurmiiiis

• It.ÄMIl Ш-150 ШЮПШГШМтМИС "

-ti. BMÍ» tJM»КЯПС1ЛШРР1!С31К(СС)

1). K U (ÍM11 ШПМШШК

h. ими 115-5H iimnwuimwmt •

15. И-Ш Ml-Slf тмтшктнн

It, ÍS-JK 5П-538 Ш1ШГиШШТШ1 <

t». ИМ» 51I-5H нвшншпти

ti. M-5SI 5)i tü иипшдаиойшпстти

». ИМИ MI-IOJ ШТММДШШПИС < 8IT-Î

21. К-II! ММН СС5ИИСШМШШ1 >

И.М-Я1 in-»} imni im ■

гг. N3-551 ими сшшишшш ■

от 10

от 'Л

пи n

» 1П и

i tro ¡I

о tro 5J

от Tt

ira К

OKI Ii

OKI 10

0 liil к

0119 10

от 15

от к.

im

m и-

ra

ш »-

И» 12

ш too

m п-

in (1.

(famtm vmt «noi BIT

■n. id-m Ш1гсшшегшЕшшйгсшп1 • »H

¡4. W-WO И-» СТЮСПИПМСГ ut

ra

и и

шши

вашшх лиц, находящихся на обследовании в институте иннунологии Минздрава РФ (таблипа S). Все сыворотки предварительно были исследованы методом Western Blot и содержали антитела как к gpl20. так и 8р<и.

Максимальный процентом распознавания положительных сывороток обладали два частично перекрывающихся пептида AS-551 (584-612) и НС-191 (602-624) : по нашим данным, они реагировали на расширенной панели сывороток с 71/72 (98.6 *) и 7г/ 72 (100 *>. соответственно, и с 25/25 на панели сывороток Института Иммунологии. Проценты распознавания положительных сывороток для каждого пептида приведены в таблице 4. Видно, что достаточно высоким процентом распознавания характеризуются также пептиды из основного вирус-нейтрализующего эпитопа IPHD) (303-323) и С-кон-ца 8P120 (495-516). По нашему мнению, принципиальным в данной работе является не пропент распознавания сывороток тем или икым 1 конкретный эпитопом. а титр сыворотки (или величина оптическои плотности в ELISA). Анализируя полученные данные по мониторингу сывороток каждого пациента на наборе из 24 пептидов, мы пришли к выводу, что наиболее информативными для наших целей являются пептиды AS-551 (584-612), НС-191 (603-624). HS-5511 (842-661) из eptl.mn-24 (303-323). KV-477 (495-516) из «p120, MV-475 (330-363) из р24, Данный набор пептидов был использован для Солее детального -нализа эпитопного спектра антител каждого пациента в динамике. Следует отлетать, что каждая сыворотка имеет свои индивидуальный .спектр антител, реагирующих с тени или иными пептидными «рагнентами. По-видимому, для статистически достоверных выводов, какой именно эпитопныи спектр антител характерен для пациентов с длительным бессимптомным периодон. вирусоноси-тельстэа. анализ. сывороток 29 больных является недостаточным, однако, некоторые обше закономерности все же ножно отметить:

1) для каждого Конкретного, пациента эпитопныи спектр антител строго специфичен и относительно стабилен:,. ' ;;

г) не удалось зафиксировать изменения спектра антител при прогрессии заболевания;

. 3). в случае РНВ пептидов высокий уровень антител был обнаружен как в сыворотках бессимптомных вирусоносителея. так и в сыворотках паииентоа с 3-S стадияик заболевания (рис.7):

4> для пациентов с длительным благоприятным течением заболевания характерно наличие антител ко всей рассматриваемым фрагментам в достаточно высокой титре, в тоже вреня. пациенты с быстрой прогрессиея заболевания в течение 3-5 с нонента инфицирования

Таблица

ПЛ11ИЕНТ СРОК С НОНЕНТЛ СТАДИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ » ИНФИЦИРОВАНИЯ (количество лет)

1. 3 И

г. 4 I

3. 3 1-П

4. •> 1

5. 4 I

6. 3 I

7. 3 IV

8. 3 1

9. 11 7

10. 5 III

11. 5 III

12. 6 111

13. 3 1-11

14. 4 1-М

15. 7 IV

16. 11 7

17. 10 III

16, ? 1-П

19. 3 I

го. 9 III-IV

21. 10 1

гг. 4 IV

гз. 1 1-П

24. 1.. П-П1

25. 6 111

26. 4 П1-1У

27. 2 1

28, 4 11-111

гэ: 4 П-1П

« Стадия заболевания установлена на основании данных последнего обследования каждого пациента

С.щ ИМ «М 1II и! МЧИ М1ПТ1 ГТИ Ч1И

? 10 3) 12 В I? а Я

РИС Л Реактивность пептидного фрагмента №-21 из РШ) с сывороткани пациентов с различили стадиями заболевания. А: 1-И стадии; Е III-IV

Ю-475

I

'яУ-477

тгн

П5-551

№-19".

1К-475 «'/•47

№-551 К-55)

км?!

РИС. 9 эпитопныи спектр антител для пациентов с различным характером протекания заболевания: А - папиент 17 с длительным периодом бессимптомного вирусоносительства; В: и С: пациенты г 6 и 24, соответственно, с быстрой прогрессией заболевания.

имеют антитела только к пептидан НС-191 (603-624). AS-551 (564-612) из SP41 и с неньаеи вероятностью к PHD-пептиду ИН-24 (301-323) (РИС. 8):

5) наиболее изменчивым параметром с течениен ерененн является сигнал на пептиде KS-551' (842-861). который для большинства пациентов нарастает с течениен времени.

Биологическии Фенотип изолята HIV играет не менее значимую роль в характере протекания заболевания, чен человеческий Фактор. Поэтому в идеале, необходимо проводить комплексную работу, охватывающую эволюционную изменчивость вируса in vivo в сочетании с оценкой иннунологических параметров в динамике, в данной случае - эпитопного спектра антител. Учитывая тот Факт, что количество положительно заряженных аминокислотных остатков в

• i

N-кониевои части PND. возможно, обуславливает тропность вируса к различным типам клеток и является своебразным маркером быстро (медленно) реплицирующегося изолята вируса, было бы, на наш взгляд,целесообразно сопоставить аминокислотную последовательность PND преобладающего изолята вируса конкретного пациента. используя методику PCR. с клиническои картинок протекания заболевания данного пациента. Не исключено, что подобный подход даст возможность предсказывать характер развития заболевания.

СИНТЕТИЧЕСКИЕ ФРАГМЕНТЫ CD4-PEUEI1T0PA'.

блокирование hiv-инфекции im vitro и иннунореактиеностъ

С СЫВОРОТКАНИ HIV-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ

Настоящая работа является частью исследовании по картированию молекул CD4 и 8Р160 с помошью синтетических пептидов для локализации сайтов.принимающих участие в вирус-клеточном взаимодеис-твии. мы приводим данные по блокированию HIV инфекции in vitro в присутствии фрагментов из D1 донена молекулы CD4 и их иммуноре-активность с сыворотками HIv-инФицированных лиц.

ны синтезировали пептиды, которые в большей части перекрывают функционально важные cdr2 и cdr3 районы Dl донена (рис. 9 >. az-1 и az-4 - А2-8 пептиды входят в CDR2-panoH, в то время как az-2/a2-3 - в cdr3-panoH CD4. иеркаптогруппа остатка цистеина-84 в А2-2 была блокирована ааетамидометильнои (Аст) группой для предотвращения его спонтанной дииеризапииза счет окисления кислородом воздуха. Была проведена опенка их способности блокировать HIV инФекпию в-культуре T-пмФоиитов. Установлено, что пептид AZ-2 (75-99) проявлял дозо-зависиныи характер ингибирования: 100* подавление образования синиитиев при концентрации l.o х ю\ -5 и 50'- - при о.в х 106 н (рис. 10).

рис.9. сшпегичвсюш пегшш d1 ДОЬЕНА нолехулы см

бета-' C'C'D Е F G

изгиба _ _ _ _ _ _

♦ ♦ - ♦ ♦ - «_ — « —

HSNQIК ! LCaWGSFt,TKGrSKIM)RADSRRSLWtOGNFPLI IKNLKI EDS ЭТУ 1CEVEDQKEEVQ! .UVF CL 30 40 50 60 70 80 90 100

_ A2-1 _ AZ-3

tAcm)C_ C_

AZ-8

_C (АС®) -Ш2 A2-1 _C(Acm)-W2 A2-5 _С(асп)-Ж2 A2-6 _C (oxtded) A2-7

.,»... А2-2

>

В»»ВЭ»ш»»А<» [Lifson el al 1991)

»«»«»» пегпипы с блокиргапеи активностао в вирус-клеточнои системе H - аминокислота (Oys) -с аоетонипсметальнои (Асп) мсдиоикашеи В - аминокислота с бензилшоя ногайикашеи А - амиюкюота с ааетильноя мошйикалиеи

СС], м

РИС АО. Блокирование ШУ-инФекпии пептидом Аг-2 е тесте синаитие-образования. по оси .ординат: * подавления синиитиев; по оси абсиисс: концентрация пептида.

Ни один ИЗ наших синтетических фрагментов из CDR2 Района практически не подавлял смшитиеобразование. Интересно, что син-тезированныи нами ранее описаннын "активный" пептид CPF (Finber« «t al 1990) не показал какои-либо активности а этой тесте, возможно. ни один из пептидов не воспроизводит нужную архитектуру «рио-связываютего сайта CDS. Возможно, для этого требуется удлинение пептида А2 -7 с р-нонаа до 61-62 аминокислоты, чтобы полностью воспроизвести экспонированную петлю из СОйг-раиона. состоящую из С'.С" и D бета-слоев.

Поскольку имелись сообщения о наличии в ряде сывороток при H1V инфекции антител к CD4 tSekliawa et al 1991; Kowalski et al . 1989) мы провели оценку реактивности пептидов AZ-1. А2-2, AZ-3 с панелью сыворотками HIV-позитивных лип. При этом 3 из 13 Hiv-no-ложительных сывороток реагировали с пептидом AZ-1 с крайне низ-кин титром Г. 50, в свою очередь, пептид А2-2 показал неожиданно высокий * распознавания сывороток; 13/19 (68*) и 17/18 (95* > в зависимости от панели сывороток. На рис.И отражен характер реактивности пептида со свободной (А2-3) и заблокированной (AZ-2) sh-группой пистеина. Для интерпретации отмеченных нами данных по реактивности пептида из см был проведен анализ гомологии указанного фрагмента и белка оболочки HIV. Оказалось, что максимальной гомологиеи с исследуемын пептидом обладает фрагмент 8р120 в районе аминокислотных остатков 258-272 (пептид ms-337):

MS-337 (8Р120) CTHGIRPWSTOLLLHGSLA » прямая гомология

: : ::«««:« : эквифункдиональная AZ-3 (CD4) KIEDSDTY1CEVEDQKEEVQLLVFG замена

Как уже здесь упоминалось область 250-270 ,по-видимону. вовлекается в пропесс взаимодействия вируса с клеткой tHo et äi 1988; wiliey et al 1989). О учетом отмеченной гомологии фрагментов MS-ЗЗ? и А2-2. провели сопоставление * распознавания положительных сывороток данными пептидами.. Пептид MS-337 «р120 распознавал 3/18. (5/19) положительных сывороток с . титром 1:50. Корреляции с пептидом AZ-2 отмечено не было. Таким образом, обнаружение антител в сыворотках HIV-ннФииированных лиц. реагирующих с фрагментом из CD4. по-видинону. не связано с перекрестной реактивностью с фрагментами из белка оболочки вируса, кроме того. несмотря на такую гомологию, пептид MS-337 по нашим данным не вызывал блокирования синпитиеобразования, в отличие от пептида А2-2.

ИЕХЛНИЗИ АНТИ-HIV АКТИВНОСТИ' РЯДА СУДМЛТИРОВЛННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ К ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ ИЗ ПЕРВОГО ДОНЕНА МОЛЕКУЛЫ CD».

В настоящей работе ни попытались сопоставить механизм антивирусной активности синтетического пептида 75-99 из CD4 Андреев и др 199п с механизмом действия SP и оаенить специфичность взаимодействия (электростатического) нежду полианионами с анти-Hlv активностью и положительно заряженныни областяни белка оболочки вируса. Для этой пели был разработан специальный вариант ELISA, основанный на использовании пептидов из всех областей белка оболочки H1V с высокой плотностью положительного заряда, полианионов. блокирующих HIV инфекцию. и антител из сывороток HIV-позитивных лиц и кроличьих анти-пептидных сывороток, Параллельно поведение тех же самых полианионов оценивалось в вирус-клеточной системе в тесте синпитиеобразования. С целью оценки роли лизина

i

в предполагаемом взаимодействии была проведена химическая модификация лизин-содержащих пептидов по эпсилон-аминогруппе лизина tAndreev et al 1991).

*ч

Используеные е работе пептидные фрагменты приведены в табл.6, ' Для уменьшения плотности положительного заряда в составе пептидных фрагментов 1-3. 5, 7, 8i 10, .13 использовали нетод химической модификации путем аиетилирования уксусный ангидридон. приводяшии к блокированию заряда эпсилон-аминогруппы лизина (Lys) и н-кониевои альФа-аминогруппы пептида. При этом не затрагивается заряд бокового радикала аргинина lAri). Таким образом, можно лиФФерендиально оаенить значимость Lyj в процессе взаимо-деиствия с отрицательно заряженными полиионами.

На первой стадии анализа оценивали реактивность HIV-положительных сывороток на исходном и модифицированном пептидах в ELISA. Положительные сыворотки практически не распознавали модифицированные аналоги phd-пептидов г, 3, 5: только 3/е6 сывороток давали слабый сигнал в ELISA (рис.12). суммируя результаты можно сделать вывод, что антигенная детернинанта в составе PHt> для антител из сывороток инфицированных лип располагается в н-кониевои части и включает Lys.

Реактивность кроличьеи анти-пептид ч сыворотки была практически идентичной на и сходной и модифицированном пептиде "4; реактивность кроличьеи анти-пептид 5 сыворотки изменилась не существенно, Таким образом, модификация пептидов 4 и 5 для кроличьих антител не повлияля столь драматически на распознавание, как в случае с человеческими антителами, что свидетельствует о раэлинои локализации детерминант для природных антител и антител, получаемых исскуственным путем.

ТАЕШЛ 6. ШШТГЕЛШ) ЗЛРПШНЫЕ ПЕГПТО1 ГО БЕЖА ОБОЛОЧКИ Н1У И КОНТРОЛЬНЫЕ ПЕЮТДЫ

пептид аминокислотная последовательность селок

шифр распределение зарядов пггамн вируса

1. МУ-471 107-131

2. Ю-333 301-319

к

3. МЗ-486 307-329

4. М5-4В0 307-329

5. Ш-24 301-323

6. МЯ-Н 310-323

7. №М11 423-150

8. М7-477 495-516

9. аз-551 584-612.

10.N0-191 602-624

01тшюькрсгатршзш;

♦ + 4 + . +

СТЯРШГгеШ1?ЮКСРО

♦ 4 4 4 4 4

(ошюшойсронАтикюгс)

4+44 + ♦

(с-Ашт.кзшорарсш^пскш К-АСГО)

4 + 44 4 *

<С>УгаЖШН1СР0ЙА1ТГТШ ю

♦ 4

сизкаглтшю

+ + 4 ♦

сй 1ког1мюшзкамуаррiзсо1 кс

♦ - 4 44-4 4-44

ШРи^АРТКАКШУйКЕКК

♦ -4 *

■ КI иУЕЙ'/ЬККЮИС IШЗЗСШСТТЛ

4 ♦

ССЗСШСГГАУРИНАгУЗШЬ

и.аэ-501 828-835 естиш <« 12.мз-551 642-861

+ 4 4+4 -4-

13.ш-475 ззо-зез '1ч.аз-540 150-164

ашшхрншасцть

♦ + 4 ♦ •

СКТЛ-КАЮ РААПЕП-ЛТАСОСЖЙ РШКАНУ!

4 + 4 ♦ +4-4 +

¡шснэРЕтрэрк (С)

8Р120 вки в Р120 ВЯЦ «Р120 ВШ «Р120 ВШ

8 ¡>120 ш

8Р120 МЯ «Р120 ВИЦ ЙР120 ВИЦ 8Р41 ВШ 8Р41 ВИи «Р41 ВШ ВР41 Вйи Р24 ВШ НВУ НВсАб

* окисленная «орма

рис 12, реактивность Hiv-положительных сывороток на исходных пептидных фрагментах (заштрихованные столбики) и их модифицированных аналогах (черные столбики): А - пептид 5. образец # ю -кроличьи антитела к пептиду 5: в - пептид 8; с - пептид ю, Горизонтальной линиеи отмечена величина cut off. Абсцисса: номер образца сыроротки.

Предполагая наличие электростатического озаимодепствид между позитивно заряженными.областями белка оболочки и отрицательно заряженными сульфогруппэми DS. лежащего в основе антивирусной активности ряда SP. мы попытались показать данное непосредственное связывание в пептидном варианте ELISA, пептиды из-всех участков sp120 и «ри с высокой плотностью положительного заряда. а также контрольные пептиды (табл.6) использовали в качестве антигенов в ELISA. DS 500.000 в концентрации 0.5-2 мкг/мл полностью блокирует связывание антител с адсорбированными пептидами 2-5. 8 для 7/7 положительнвх сывороток (рис.13). Для того, чтобы исключить возможное влияние сывороточных белков на данный эф- , Фект. была проведена аффинная очистка человеческих антител на колонках с пептидами 5 и а. АФФинно очищенные антитела работали аналогично цельной сыворотке (данные не показаны). Таким образом. из результатов следует, что DS связывается с г чсорбирован-ными на пластике пептидами из pnd и с-конаевои ..области вр120. Более того. DS не блокировал связывания антител с модифицированным пептидом 8 из С-конаа ей 20. следовательно, остаток Lys важен для взаинолепстаия с DS. в модельной системе при использовании кроличьих анти-пептшшых антител не было обнаружено достоверного ингибирования D3 взаимодействия антитело-пептид.

Для того, чтобы оценить, происходит ли связывание ds с пепти-аани в яидкоп Фазе также эффективно, как и с адсорбированными пептидами, был использован вариант ELISA, основанный на инкубации в растворе ингибируюиеи концентрации BS с различными кон- . пентрапияни пептидов с ¿елью неитрализапии блокирующего, действия DS. описанного выше (рис. 14).

•В следующей серии экспериментов оценивали снятие ингкеируюте-го действия DS пептидами в растворе в тесте синпитиеобразования. Для данного эксперимента использовали ds soo.ooo . и ChS 1 (табл.7) в двух концентрациях, вызывающих, примерно. 75* и 100*-ое ингибирование синпитиеобразования. пептиды 4, 5 из phd двух штаммов вируса. МН и BHU, в концентрации 250 мкг/мл (90 мкм) полностью нейтрализовали блокирующее действие как DS, так и Ch3: число синпитиев равнялось контрольному уровню без добавления каких-либо блокирующих агентов (рис.15). Была выявлена четкая зависимость доза-эФФект. Важно, что ни модиФияярованныи пептид 5, ни 14- членный пептид б не влияли на ингибирушии потенциал DS. пептид В вызывал лишь 30-38* увеличение числа синпитиев, пептид 12 при концентрации г50 мкг/мл (loo мкн) был токсичным лля клеток. однако, в меньших концентрациях достаточно эффективно непт-

ржг

>

рт:г

к

г :>.

Ре+Р=

РИС. 13. Кривые ингибирования 05 Ос) и пептидом А21 <$> связывания антител с адсорбированным пептидом 8; аналогичные кривые, в случае адсорбированного пептида 5: Ю (А). А22 <♦). Абсписса: концентрации М или пептида лгг а растворе (мкг/мл). ордината: величина оптическол плотности при 492 им.'

. 0.125 0.5 2 8 31 125

РИС.f4• снятие ингибирукдеи активности DS в ELISA пептидами и полилизином в растворе. А: пептид а адсорбирован на пластике; С: пептид 5 адсорбирован на пластике, сплошная тс якая линия соответствует кривои ингибироаания яекстран суль»атон связнванйя антител с апсорбированным на пластике пептидом. В: ингибирование связывания антител с адсорбированным пептидон В пептидами и полилизином е растворе (перекрестная реактивность); D: аналогично для адсорбированного пептида 5.

рализовал действие DS. Пептид 11 сам по себе подавлял образование синиитиев. Поэтому его использование в данном тесте не представлялось возможным, пептиды 7, 9. не оказывали никакого влияния на ингибирушее действие DS.

Ны проанализировали блокирующие активности ряда SP (табл.в) в ELISA и сопоставили полученные Результаты с их ингибирушим потенциалом в тесте синиитиеобразонания . Рассматривая в качестве оценочного параметра концентрации 50*-го ингибирования'. мы имели возможность сравнить поведение тестируемых попнанионов в. двух качественно различных системах. Была обнаружена достоверная корреляция результатов: препараты- которые показали себя более актненыни в тесте синантиеобразоваиия были также более активны в пепгшшон варианте ELISA.

ТАБЛИЦА 7. ИЙГИБЙРУЮШАЯ АКТИВНОСТЬ'РАЗЛИЧНЫХ ПОЛИАНИОНОВ Ь ТЕСТЕ ' СИНЦИТИЕОБРАЭОБАНИЯ

СОЕДИНЕНИЕ : ' " Mw (Da)» КОНЦЕНТРАЦИЯ 50*-го ПОДАВЛЕНИЯ СИШ1ИТИЕВ, йкг/МЛ

PS ' 8,000 3.9 • 0.5

PS .■'••;,, „" 500,000. 0.72 « 0.12

ChS 1 21.000 * 0.1 » О.ОЗ

ens г' ' 21. 000 0.08 » 0.02'

¿hS 3 . i . 7 21.000 0.64 « О.ОЭ

ChS 4 . 5.000 . > 100

данные представляют собой среднее арифметическое для трех независимых экспериментов. • . ■ . « ;Для с/ЛЬФатированных хитозаноа приведен молекулярный вес производных до сульФатирования; образцы 1.-4 характеризуются различной степенью сульФатирования. Образцы i-з были.любезно предос-таблейы д-ром а.и. Гамзазаде (Институт пишевых веществ ран), •образец 4 - д-ром В.П. Варламовым (Центр "Еиоинженерия* ран).

■Как ны показали ранее, синтетический пептид AZ2 из первого домена молекулы CD4 блокирует Hiv-идупированное синиитиеобразования. (АНдревй и др 1991). В настоящей работе было показано, что данный пептид :а22 а концентраций 250 мкг/мл . (вб мкш. полностью блокирует связывание сывороточных антител с адсорбированными на пластике пептидами 2-5 из pmd и пептидом в из с-конпевои области «р120 (рис.13).Таким образом, блокирующие концентрации для

пептида AZZ значительно превышают аналогичный паганетр для DS. но.что интересно отметить, характер кривых ингибироваиия (угол наклона Линеянои части кривои) одинаков лля AZH и 03.

Анализируя полученные результаты можно, по-видимому. сделать вывод, что механизм подавления синиитиеобразования сульФзтиро-•ванныни полисахаридами обусловлен наличием электростатического взаинодепствия с основный неитрализушим доменом 8Р120 301-323 (PHD) и/или с с-кондевои облйсть» gplïo (195-516), наши данные частично согласуются с опубликованными ранее результатами, где с понотью моноклональных антител к определенный фрагментам «Р120 было показано, что DS связывается только с PHD (Callahan et al 19911. ны полагаем, что использование поликлональнои человеческой сыворотки, а не моноклональных антител дает нашей систене определенные преимущества. которые будут отмечены ниже. Как PND. так и с-нокеп'8Р120 сохраняют высокую плотность положительного заряда у различных штаммов HlV-i. в тоже время, из представленных результатов следует, что не только плотность заряда инеет функциональное значение для. связывания* а также специфическое сочетание аминокислотных остатков, включаютее. по крайней нере, две соседствуюаие положительно заряженные аминокислоты: Lys-Lys, Lys-Are. Are-Lys. Ars-Ari. таким образом, теоретически, рассматриваемые полианионы ногут связываться с различными белкани. имеющими указанные аминокислотные комбинации. Доказательством данного предположения могут служить наши данные, полученные для С-кониевого фрагнента «Р41 842-861, а также результаты использо-. вания неродственных HÏv соединении, таких как/ полилизин или фрагмент белка вируса гепетата в. в действительности же. необходимо учитывать. Судет ли экспонирована данная область на поверхности Hiy-инФшшр'ованноя клетки.

в данной работе нам удалось показать пептид-пептидное взаимо-деиствие. отражающее, на наш взгляд, одну из важных стадии в сложной, возножно. многоступенчатом процессе адсорбпии вируса на клеточной мембране, рентгеноструктурныи анализ первого домена CD4 молекулы выявил только один отрицательно заряженный участок на рассматриваемой поверхности бел~ка. ассоциированный с аминокислотными остатками Glu-85. Glu-87. Asp-88. Все данные аминокислоты как раз входят в состав пептида AZï. Более того, остатки 88 и 89 расположены на вершине бетта-изгиба tRyu et al' 1990j. электростатическое взаинодеиствие между положительно заряженной N-кониевои частью PHD и отрицательно заряженным фрагментом 75-99 из первого домена CD4. по-видимому, инеет место независимо от

первичного связывания «P120-CD4. Основываясь на данном предположении, можно объяснить молекулярный механизн неитралиэушеи активности антител, картируемых к РНй, ингибирушии потенциал пептидов из VI CD», а также механизм : действия HlV-блокируютих сульфатированных полисахаридов.Исходя из полученных результатов, нельзя исключить Функциональную значимость С-конаевого фрагнента «pi 20 в процессе шшитиеобразования.

ВЫВОДИ

1. изучена реактивность пептидных фрагментов из различных регионов белка оболочки с HlV-положителышни сывороткани. Выявлены пептидные Фрагменты, обладающие максимальным диагностическим индексом,

2. на наборе пептидных Фрагментов, перекрывавших участки белка оболочки HIV с различной Функциональной нагрузкой, проведен мониторинг сывороток Hiv-ннФипированных пациентов, отмечено разли- . чие эпитрпного спектра антител для пациентов с длительным.бессимптомным периодом и пациентов с быстрой прогрессией

• заболевания. . .

3. Используя набор частично перекрывающихся пептидных фрагментов и метод химической модификации остатков лизина в пептидах проведено эпитопное картирование;

а) основного иммунодоминантного участка «pu (584-624) ;

б) основного вирус-неитрализуюаего домена îpi20 <pnd. 301-323) ;

в) гипотетического см-связывающего участка (CD4-BR. »23-450)1

г) ç-кониевои облает" «иго Ш5-5Ш.

4. Для основного иммунодоминантного эпитопа «»41 (504-624) установлена определяющая роль лизина-606 в Формировании антигеннои детерминанты. •

5. детальное исследование основного вирус-неитралиэуютего до-нена (PND) «P120 <301-323) показало, что центральная относительно консервативная часть РШ) «JPGfun не является основным эпито-пом для человеческих HIV-положительных сывороток. Эпитоп для указанных антител локализуется в Н-кошевои части PND и содержит основные аминокислоты. Данный эпитоп не перекрывается с эпитопон для антител к PHD из сывороток лабораторных животных, полученных путем иммунизации искусственными антигенани.

6. Установлено, что. в случае CD4-BR. антигенная детерминанта ' локализуется в его н^-кониевоя части и не включает остаток лизина т426. показано сходство структурных мотивов РНр и cd4-br.

7. Показано, что с-конвевая область «pi 20 содержит, по крайней мере;, две детернинанты.

е. Показано,' что пептидный фрагмент из c-кониа первого домена молекулы СD4 обладает НП-ингисиру»шеи активностью в тесте син-аитиеобразоёания, механизм действия данного пептида сопоставлен с механизмом антивирусной активности ряда суль&атированных полисахаридов. 4 * • ' ' ' .

9. Установлено, что характеры антивирусной активности сульфэ-тироеанных полисахаридов и пептида из первого домена CD4 сходны и обусловлены наличием специфического (большей частью электростатического) взаимодействия с PHD или/и с С-конаевой областью

ept го.

10. разработан пептидный вариант ELISA для предварительного скрининга нIV-блокируют« препаратов ионного характера.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО НАТЕРИАЛАН ДИССЕРТАЦИИ

1. Лиознер А.п.. Иыганков А.Ю.. неиерякова Д.В.. АУтеншлюс А.и.. Каурое о.А.. Прусаков А.Н.. АФонин в.г.. Скляров л.ю.. Николаев А.ю. 1990. Распознавание синтетических пептидов HIV. иммобилизованных на нитропеллюлозном носителе, антивирусными антителами. Иммунология. N 3: Ю-и

2. Неиерякова Д.В., Андреев с.н.. трубченинова Л.П.. Хаитов Р. н. 1990. Анализ тонкой структуры антигенных детерминант белка оболочки gpll HIV с помощью синтетических пептидов. Всесоюзный • симпозиум по хинии пептидов. Рига. Тезисы докладов, с. чо

3. Андрееве.«.. Мещерякова Д.В., азьмуко а.а.. Корнилаева Г.в., Карамов Э.В,. Сидорова И.В.. Хаитов Р.н. 1991. Синтетические фрагменты CD4-penenTOPa: блокирование ВИЧ-инФекиии in vitro . и иммунореактивность с сыворотками ВИЧ-инФшшро ванных лиц. Иммунология. No 5: 15-19

4. Andreev S.M.. Mescheryakova D.Y.. Vafina M.G., Azmuko A.A.. Sidorova H.V.. Khaltov R.M.. 1991. Analysis of fine structure of antigenic .determinants from HIV transnerabrane protein by chemical modification of the synthetic peptides. Biomedical science, 2: 271-278

5. Khattov R.H.. Mesticheryakova D.V.. Andreev 3.H., Sidorova 11,V.. Vafina H.G. 1991. Imraunoreactivity of selected peptides from HIV-l «Р120 principle neutralizing domain (PND) and CD4-b ind ins region (CDH-BR) . VII Intern. Conf.on AIDS. Florence. Italy. Abstracts, l: 127

Б. Andreev 3.H..' Heshcheryakova D.V., Ajnuko A.A.. Khaitov R.M. 1991. Fine analysis of the immunodominant region from HIV transaembrane protein by chemcai modification of the synthetic peptides. Vll intern. Conf.on AIDS. Florence. Italy, Abstracts, l: 127

7. Андреев С,Нч. Нетерякоэа Д.В. 1992. функциональная структура белка оболочки вич и вирус-клеточные взаимодеиствия". спид (фундаментальные биомедиаинские исследования). Часть 2. иммунологические аспекты СПИДа: Итоги науки и технини. ВИНИТИ, сер. Иммунология. 30: 44-80

8. Мещерякова Д.В.. Андреев С.н,. Сидорова Н.В.. ВаФина н.г.. Азьмуко А.а.. Петрухина А.о.. Хаитов р.н. 1992. Пептиды из глав-.ного вирус-неятрализушего и СМ-связнеаюшего доиена: сходные инмунореактивные свойства и структурный мотив". Вестник АНИ РФ. Ко 11-12

9. Андреев С.н., нетёрякова Д.В,. азьмуко а.А.. Сидорова н.в.. Корнилаева Г.В.. карамов э.в. 1992. синтетические фрагменты CD4-редептора блокируют вич-инфекаию. 1 съезд иммунологов России. Новосибирск, тезисы докладов, с. 15'

10. неиерякова Д.В.. Сидорова Н.В.. ВаФина н.Г.. Петрухина А,о.,,Тарасова С.о.. Хаитов Р.Н.. Андреев с.н. 1992. Схояйые ин-мунореактивные. свойства и структурные мотивы Фрагментов главного вйрус-неитрализутего (РНШ и сон-связывающего (ссч-вю доменоь белка оболочки ВИЧ. 1 сьезд иммунологов России. Новосибирск. Тезисы докладов, с. 301

и. Щербакова Т.Н., Игнатьева Г.А., сидорович И.г., Сидорова н. В.. нешерякова Л.в.. Андреев с.н. 1992. Создание гибридом. сек-ретируютих моноклональные антитела к белкан оболочки вируса иммунодефицита человека. 1 Съезд иммунологов России. Новосибирск. Тезисы докладов, с. 567

12. Meshcheryakova D.. Andreev s., Sidorova M., vafina M.. Tarasova S., Knaitov R. 1992. Analysis of antigenic sites and linear structiirai features of HIV principal neutralizing domain (PND) and potential CD4-bmding region (CD4-BR). I Intern.Meeting Peptide models * Immunological Recognition. La Grande Hotte, France. Abstracts, P.108

13. Andreev S.. Meshcheryakova D.. Ai'muko A., Petrukhina A.. Karamov E.. Korniiaeva G.. Pichugm A.. Ataullakhanov R., Khaitov R. 1992. CD4-derived peptides in studies of HIV-cel! interactions. 1 Intern.Meeting Peptide models & immunological Recognition. La Grande Hotte. France. Abstracts, p.99

H. Андреев С.н.. неаерякова Д.В. 1992. функциональная структу- t pa белка оболочки hiv и вирус-клеточные взаимодеиствия. СПИД (Фундаментальные биомедииинские исследования).Часть 2. Иммунологические аспекты СПИДа. Итоги науки и техн. ВИНИТИ. Сер. Иммунология. 30: 44-80

15. нешерякова д.в,. Андреев С.И.. Тарасова с.0.. Сидорова н.В..ВаФина Н.Г,6 корнилаева Г.В.. Карамов Э.В.. Хаитов Р.н. 1992. неханизн анти-Hlv активности ряда сульФатированных полисахаридов и пептидных фрагментов из первого домена молекулы CD4. Иммунология, принята в печать.

16. Tarasova S.. Mesftcheryakova D., Andreev S.. Khaitov R 1 992 . CD4-derlved peptide and dextran sulfate block antibody binding to peptides from principal neutralizing domain (PND) and carboxy -terminal region of gpl20. Vltl international Conference on. AIDS. Amsterdam. The Netherlands. Abstracts, V.2, P.A7

17. Meshcheryakova D.. Andreev s., Tarasova S., Sidorova M.. Vafina M.. Korniiaeva G., Karamov E,. Khaitov R.. 1992. CD4-denved peptide and sulfated polysaccharides have similar mechanisms of antt-HIV activity based on the electrostatic interactions vith positively charged gPi20 fragments. Mol. Immunol, (in Press)