Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Эффекты действия природных антимикробных пептидов и их синтетических аналогов с различными изменениями структуры молекулы

На правах рукописи

Артамонов Александр Юрьевич

ЭФФЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ СТРУКТУРЫ

МОЛЕКУЛЫ

14.03.03 - патологическая физиология

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 [;!ДР 2012

Санкт-Петербург 2012

005014779

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологам Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук Научные руководители:

доктор биологических наук Рыбакина Елена Георгиевна

кандидат медицинских наук, доцент Орлов Дмитрий Сергеевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор,

начальник научно-исследовательской лаборатории

клеточных и генных технологий Федерального

государственного военного образовательного

учреждения Высшего профессионального образования

«Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова»

Министерства обороны Российской Федерации Александров Виктор Николаевич

Доктор биологических наук, заведующий лабораторией № 15 сравнительной биохимии ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова»

Российской академии наук Морозов Владимир Игоревич

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования Северо-Западный Государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова Минздравсоцразвития России

Защита состоится « марта 2012 г. в // часов на заседании диссертационного совета Д001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан _ февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Дыбан П.А.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Молекулярно-клеточные механизмы защитных функций в настоящее время являются предметом изучения большинства экспериментальных работ, создающих основу для формирования общих представлений о типовых защитных и компенсаторно-приспособительных реакциях организма (Корнева Е.А. и соавт., 2000).

Особое внимание уделяется семейству эффекторных и сигнальных биологически активных веществ - антимикробным пептидам, обеспечивающим реализацию защитных и приспособительных реакций при инфицировании, стрессорном воздействии (BCorneva Е.А. et al., 1997; Aberg К.М. et al., 2007), паразитарной инвазии (McGwire B.S. et al., 2010), опухолевом росте (Jin G. et al., 2010). Антимикробные пептиды (АМП) - группа биологически активных веществ, преимущественно продуцируемых нейтрофильными гранулоцитами и макрофагами, а также эпителиальными клетками барьерных органов. Эффекты их действия на клетки и ткани разнообразны и зависят от концентрации пептидов. Наиболее изученной является их непосредственная антимикробная биологическая активность, отражающая наиболее значимую роль этих пептидов в защитных функциях организма (Korneva Е.А., Kokryakov V.N., 2003).

Одним из основных направлений исследования антимикробных пептидов в последнее десятилетие стало изучение молекулярных и клеточных механизмов их биологической активности, обеспечивающих участие АМП в реализации защитных функций организма (Кокряков В. Н., 2006). Антимикробные пептиды обладают уникальными свойствами: они селективно действуют на бактерии, поскольку их катионные молекулы имеют высокое сродство к мембранам бактерий, обогащенным отрицательно заряженными компонентами -липополисахаридом и др. Выработка у бактерий резистентности к АМП затруднена в связи с особенностями механизма их бактерицидного действия - быстрого, в течение минут, повышения проницаемости мембран микроорганизмов, утратой их барьерной функции, приводящей к осмотическому разрушению клеток (Orlov D.S. et al., 2002). АМП не задерживаются и не накапливаются в организме, их связывают и инактивируют белки плазмы, разрушают протеазы. Антимикробные пептиды не угнетают функции иммунной системы, а обладают различными иммуномодулирующими эффектами, например, свойством стимулировать активность естественных киллерных (ЕК) клеток, что может быть полезным при создании лекарственных препаратов (Cheniysh S. et al., 2012). Эти особенности выгодно отличают природные петидные соединения от классически применяемых антибиотиков (Gordon Y. J., Romanowski Е. G., 2005).

Однако клиническое применение АМП ограничивается сходным диапазоном эффективных концентраций пептидов как антимикробных средств и концентраций, при которых проявляется их токсическое действие на клетки человека. Положительные примеры удачных попыток практического использования природных АМП в традиционных лекарственных формах имеются, но только в качестве препаратов местного действия, используемых в виде аэрозоля, мази или таблеток для рассасывания. In vivo АМП действуют в составе сложного ансамбля молекул, чаще в ограниченном объеме - фагосоме, слое слизи барьерных органов.

Применение АМП возможно после изменения биологических свойств природных пептидов, и способом такого изменения может быть их структурная модификация, создание синтетических соединений с новыми эффектами действия. Однако так как структура АМП обуславливает их биологическую активность, молекулярно-клеточные механизмы действия синтетических аналогов природных пептидов требуют специального изучения.

Настоящая работа посвящена изучению возможностей получения антибиотических веществ на основе природных антимикробных пептидов со свойствами, оптимальными для поддержания защитных функций, наиболее перспективных для получения препаратов нового поколения.

Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение антибиотической и иммуномодулирующей активности природных антимикробных пептидов и их синтетических структурных модификаций.

В задачи исследования входило:

1. Изучение антибиотической и гемолитической активности протегрина-1 и его синтетических аналогов с измененным, по сравнению с природной молекулой, расположением дисульфидных связей.

2. Исследование антимикробной, цитотоксической и гемолитической активности природного пептида индолицидина и его синтетических структурных аналогов.

3. Сравнительное изучение эффектов действия природного индолицидина и его синтетических структурных модификаций на цитотоксическую и пролиферативную активность спленоцитов крысы.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных экспериментов получены новые данные, характеризующие антибиотические свойства природных антимикробных пептидов в сравнении с их синтетическими аналогами с измененным расположением дисульфидных связей. Приоритетный характер носят результаты исследования антимшфобной, цитотоксической и гемолитической активности природного пептида индолицидина и его синтетических структурных модификаций. Впервые изучены изменения пролиферативной и цитотоксической активности спленоцитов

крысы под действием индолицидина в сравнении с эффектами действия его синтетических аналогов различной структуры. В работе впервые использованы хромогенные и флюоресцентные маркеры для оценки антимикробной активности и возможного механизма антибиотического действия пептидов.

Проведенное экспериментальное исследование способствует формированию новых представлений о молекулярно-клеточных механизмах реализации защитных функций с участием катионных пептидов, обладающих антибиотическими и иммуномодулирующими свойствами. Практическая значимость исследования определяется проблемами и вопросами, стоящими перед современной медициной. По данным ВОЗ рост резистентности микроорганизмов к существующим антибиотикам делает необходимым разработку противомикробных препаратов нового поколения в ближайшие годы. Выявление модификаций пептидов с оптимальными антимикробными и иммуномодулирующими свойствами, а также теоретическая разработка способов их получения, открывают возможность создания на их основе противомикробных, противовирусных, фунгицидных лекарственных препаратов (Чатгерджи П., Флек Ф., 2011). Полученные в работе данные также открывают перспективу для разработки путей коррекции нарушенных защитных функций с помощью антимикробных пептидов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Синтетические структурные аналоги протегрина-1 с измененным расположением дисульфидных связей обладают сниженной антимикробной и гемолитической активностью по сравнению с активностью природного пептида.

2. Триптофан-богатые пептиды обладают высокой антимикробной активностью, которая усиливается при увеличении заряда молекулы. Пептиды ЗВЗ, GSP-1, пуроиндилин А, Ind23, Ind34, Ind35, Ind36, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21 и Ind22 проявляют низкую гемолитическую активность.

3. Пептиды - аналоги индолицидина - с низкой токсичностью в отношении клеток К562 проявляют иммуномодулирующую активность: изменяют цитотоксическую активность ЕК-клеток и пролиферативную активность спленоцитов крыс.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования вошли в содержание курса лекций, читаемых на Кафедре патологии медицинского факультета и Кафедры биохимии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета. Методические подходы, разработанные в ходе исследования, применяются при изучении биологической активности пептидов в Отделе общей патологии и патофизиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, Кафедры биохимии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета, в Государственном НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Конференции молодых ученых, посвященной 115-летгао образования ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2006), Научно-практической конференции с международным участием «Ученые будущего» (Одесса, 2006), Международных симпозиумах «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и при патологии» (Санкт-Петербург, 2007, 2009, 2011), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 7 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах и включает 39 рисунков, 11 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Библиографический указатель содержит 229 источников, в том числе 15 работ на русском и 214 - на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общие условия работы. Общим условием работы было принятие необходимых мер, предотвращающих возможность бактериального загрязнения препаратов и растворов.

Экспериментальные животные, условия культивирования микроорганизмов, клеток крови человека и клеточных линий. В работе использованы микроорганизмы Escherichia coli, штамм ML-35p; Listeria monocytogenes, штамм EGD; Staphylococcus aureus, штаммы ATCC 33591 и 710a; Candida albicans, штамм 820, которые были предоставлены проф. Р. Лерером (Калифорнийский университет, Лос-Анжелес, США). Культуры бактерий хранили в среде на основе триптического гидролизата сои (TSB), грибков - на среде Сабуро. Микроорганизмы культивировали в жидких средах аналогичного состава в течение 18 ч. Эритроциты человека получали от здоровых доноров 20-30 лет. Клетки миелоидной эритролейкемии человека К562 предоставлены Институтом цитологии РАН (Санкт-Петербург). Спленоциты получали от крыс-самцов Wistar массой 180-200 г (Питомник «Рапполово», Санкт-Петербург). Крыс содержали в условиях вивария при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище, на стандартной диете в соответствии с нормами содержания лабораторных животных.

Исследуемые пептиды являются представителями распространенного в природе семейства кателицидинов, обладающих высокой антимикробной активностью. В работе использованы представители двух подгрупп кателицидинов: пептиды с дисульфидными связями, обеспечивающими вторичную структуру бета-шпильки, и пептиды, обогащенные остатками триптофана. К первой подгруппе пептидов относятся природный протегрин-1 (PG-1), впервые полученный в Отделе общей патологии и патофизиологии ФГБУ «НИИЭМ»

СЗО РАМН (Kokryakov V.N. et al., 1993) и его синтетические структурные аналоги с различным расположением дисульфидных связей Р45, Р88, Р85 и Р90, синтезированные проф. O.A. Миргородской (НИИ аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург). Представители второй подгруппы - природные и синтетические пептиды, характеризующиеся высоким содержанием триптофана (W): индолицидин (Ind), ЗВЗ, GSP-1а, пуриндолин A (PuroA), тритриптицин, а также пептиды с остатками омега-аминокислот (Ind23, Ind34, Ind35, lnd36), различным зарядом молекулы и расположением гидрофобных и гидрофильных участков (Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21, lnd22).

Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) пептидов проводили с использованием ресазурина - хромогенного маркера метаболической активности размножающихся клеток, и методом радиальной диффузии в геле. При применении ресазурина пробы инкубировали при 37°С в течение 2 ч, одновременно на спектрофотометре проводили измерение их оптической плотности при длинах волн 570 и 600 нм. При определении МИК методом радиальной диффузии в геле, микроорганизмы инкубировали с пептидами, внесенными в лунки геля, в течение 24 ч. Для оценки антибиотического действия пептидов измеряли диаметр зоны лизиса вокруг мест внесения пептидов в гель. МИК пептидов вычисляли методом линейной регрессии.

Влияние пептидов на проницаемость внешней и внутренней мембран Е. coli оценивали с помощью хромогенных и флуоресцентных маркеров проницаемости -субстратов для фермента лактамазы в периплазматическом пространстве и гапактозидазы в цитоплазматическом пространстве микроорганизма. В качестве маркеров увеличения проницаемости внешней мембраны применяли Nitrocefin (Calbiochem-Novabiochem, USA) или ССР2-свободную кислоту (Aurora Bioscience, USA), внутренней - ONPG (Sigma) или DiFMUG (Invitrogen, USA).

Фотометрический метод оценки гемолитической активности антимикробных пептидов в отношении эритроцитов человека основан на измерении оптической плотности проб, содержащих гемоглобин, вышедший из лизированных эритроцитов, при длине волны 540 нм. В пробы крови добавляли гепарин или ЭДТА, осадок эитроцитов ресуспендировали в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (pH 7,4, с содержанием 0,137 моль/л NaCl и 0,0027 моль/л KCl) и инкубировали с пептидами при 37°С в течение 30 мин.

Оценку цитотоксического действия пептидов проводили с использованием МТТ -хромогенного маркера метаболизма ферментов дыхательной цепи митохондрий. В клетках с активным метаболизмом МТТ переходит в восстановленную форму с максимумом поглощения при 540 нм. Пробы, содержащие клетки К562 в среде RPMI-1640 и исследуемые пептиды, инкубировали в течение 24 ч при 37°С в атмосфере 5% СО?, и 100% влажности. За 3 часа до окончания инкубации в лунки планшетов добавляли МТТ. По окончании инкубации

к пробам добавляли изопропанол и 0,04 M HCl, оптическую плотность проб измеряли при 540 им. Концентрацию IC50, при которой происходит ингибирование 50% клеток, вычисляли с помощью метода нелинейного регрессионного анализа.

Выделение спленоцитов из селезенки крыс. Животных декапитировали, извлекали селезенку и гомогенизировали ее. Суспензию спленоцитов в среде RPMI-1640 фильтровали, обрабатывали раствором 0,83% NH4CI для лизирования эритроцитов, центрифугировали и ресуспендировали в такой же среде.

Эффекты действия пептидов на цитотоксическую активность силеноиитов крыс.

В качестве мишеней для ЕК-клеток селезенки использовали клетки К562, меченные 3Н-

уридином. Пробы, содержащие пептиды, спленоциты и клетки К562, инкубировали при

соотношениях эффектор:мишень 25:1, 12:1 и 6:1, в течение 20 ч при 37°С в атмосфере 5%

СОг и 100% влажности. После окончания инкубации содержимое ячеек переносили на

бумажные фильтры и промывали раствором 0,15 M NaCl и 30% этанолом при помощи 12-

канального харвестера (Skatron, USA). Высушенные фильтры заливали 10 мл толуолового

сцинтилляционного коктейля. Радиоактивность проб измеряли на жидкостном

сцинтилляционном счетчике LS6000 (Beckman Coulter, USA). Реакцию учитывали

количественно по уровню меченого уридина в нелизированных опухолевых клетках-

мишенях в течение 1 мин (импульсы в мин, counts per minute, c.p.m.). Цитотоксическую

активность ЕК-клеток селезенки в % рассчитывали по формуле:

тт = п - среднее число импульсов (c.p.m.) в тест-ячейке ) vinn

Цитотоксичность " --,-^Г- А iuu

среднее число импульсов (c.p.m.) в контроле

Определение интенсивности пролиферации спленоцитов крыс, стимулированных митогеном и препаратом ИЛ-lß. Первая группа инкубируемых проб, кроме исследуемых пептидов, содержала суспензию спленоцитов (5,0 х 106 клеток/мл); в пробы второй и третьей групп вносили также раствор Конканавалина А (Кон A, Sigma) в дозе 0,75 мкг/мл; а в пробы третьей группы - дополнительно 50 мкл рекомбинантного препарата ИЛ-lß (рИЛ-lß, PeproTech ЕС, UK) со специфической активностью 1,0 х 109 ед/мг белка, в дозе 250 нг/мл. Пробы культивировали при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности. Через 56 ч после начала инкубации в лунки вносили 3Н-тимидин (ГИПХ, Санкт-Петербург) в дозе 5 мкКИ/мл. Через 16 ч после внесения тимидина клетки переносили на фильтры с помощью харвестера (Skatron, USA). Количественную оценку включения 3Н-тимидина в ДНК делящихся клеток в течение 1 мин (c.p.m.) проводили на счетчике LS6000 с использованием толуоловой сцинтилляционной смеси.

Анализ и статистическая обработка данных проводили с помощью программных пакетов Sigma Plot 8.0, 9.0 (Systat Software, Inc.), Statistica 6.0 (StatSoft). Результаты

исследования обработаны статистически с применением критерия t Стьюдента. Различия считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Эффекты действия протегрина-1 и его синтетических структурных аналогов с измененным расположением дисульфидных связей. Одной из важных особенностей структуры PG-1 (RGGRLCYCRRRFCVCVGR; S-S-связи: С6-С15, С8-С13) является наличие двух дисульфидных связей, обусловливающих его конформацию бета-шпильки. Аналоги PG-1, отличающиеся от нативного пептида как заменами отдельных аминокислотных остатков, так и расположением дисульфидных связей, предоставлены проф. О. А. Миргородской.

При определении минимальной ингибирующей концентрации (МИК) природного пептида PG-1 в отношении Е. coli, L. monocytogenes, С. albicans, установлено, что она составляет 0,6; 0,7 и 0,7 мкМ соответственно, и, таким образом, лежит в диапазоне величин, определенных в работах отечественных и зарубежных авторов (Кокряков В.Н., 2006; Таш J.P. et al., 2000). Антимикробная активность всех изученных синтетических модификаций PG-1 сопоставима, но является сниженной в сравнении с этим показателем у природного пептида. Так, пептиды Р45, Р88, Р88 и Р88 в сравнении с PG-1 менее активны в 5, 21, 15 и 7 раз, соответственно, в отношении грам-отрицательной Е. coli; в 4, 7, 7 и 6 раз в отношении грам-положительной L. т onocytogenes; в 9, 41, 30 и 30 раз в отношении С. albicans (Рис. 1).

Е. coli. штамм ML-35p

100

о

1 10 100 Концентрация пептида, жМ

L. monocytogenes, штамм EGD

100 80 60 40 20 О

1 10 100 Концентрация пептида, мкМ

100 80 60 40 20 О

1 10 100 Концентрация пептида, мкМ

С. albicans, штамм 820

Рис. 1. Определение МИК протегрина (PG-1) и его структурных аналогов Р45, P88, Р85, Р90 в отношении микроорганизмов Е. coli, L. monocytogenes, С. albicans, при использовании метода радиальной диффузии в геле. По оси абсцисс - концентрация пептидов, выраженная в мкМ, по оси ординат - условные единицы активности пептидов.

Изучение антимикробной активности пептидов включает в себя не только оценку МИК, но также исследование их действия на проницаемость мембран. Установлено, что природный PG-1 вызывает увеличение проницаемости внешней и внутренней мембран Е. coli, что совпадает с данными литературы (Кокряков В.Н., 2006; Orlov D.S. et al., 2002). Синтетический пептид Р45 также увеличивает проницаемость обеих мембран Е. coli. Пептиды Р88 Р88, Р88, напротив, не индуцируют увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны Е. coli, но по-разному действуют на ее внешнюю мембрану: пептид Р88 увеличивает, а пептиды Р88 и Р88 не изменяют ее проницаемость.

Результаты изучения гемолитической активности PG-1 в отношении эритроцитов человека (Рис. 2) совпадают с данными литературы. Так, показано, что при концентрации 80 мкМ он вызывает лизис 50- 60% клеток (Tarn J.P. et al., 2000). Синтетический пептид Р45 также индуцирует 50%-й лизис эритроцитов, в отличие от Р88, Р88 и Р88, которые в концентрациях 0-80 мкМ вызывают лизис 0-10% клеток. Полученные результаты согласуются с данными литературы, показывающими, что изменение структуры природного протегрина - уменьшение или увеличение числа дисульфидных связей - циклизация структуры мономера приводит к нарушению конформации бета-шпильки и изменению характера влияния пептидов на гемолиз эритроцитов человека (Tarn J.P. et al., 2000).

Концентрация, мкМ

Эффекты действия природных пептидов с высоким содержанием триптофана.

Изучение антимикробной активности природных триптофан-богатых аналогов пептида индолицидина также включало в себя определение МИК исследуемых пептидов. Показано, что ЗВЗ, GSP-la, пуроиндолин А и тритриптицин, так же как и Ind, МИК которого в отношении Е. coli, L. monocytogenes, S. aureus и С. albicans составляет 1,19; 1,19, 1,19 и 2,4 мкг/мл, соответственно, являются высокоактивными антимикробными веществами (Табл. 1). Полученные результаты коррелируют с данными других авторов (Rahman S. et al., 1994; Tanchak M.A. et al., 1998; Yang S.T. et al., 2002; Caparelli R. et al., 2005; Chan D.I. et al., 2006).

Пептиды тритриптицин, пуроиндолин A, GSP-la, ЗВЗ и Ind вызывают увеличение проницаемости внешней мембраны Е. coli (Рис. ЗА). Взаимодействие этих пептидов с

синтетическими и биологическими мембранами изучено рядом авторов, данные которых согласуются с полученными результатами (Yang S. et al., 2002). Помимо высокой антимикробной активности, продемонстрировано избирательное действие пептидов GSP-la и ЗВЗ на проницаемость внутренней мембраны Е. coli (Рис. ЗБ), а также отсутствие их гемолитического эффекта, в отличие от тритриптицина, пуроиндолина А и Ind, которые вызывают увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны кишечной палочки Е. coli, а также, в используемой концентрации, и лизис 10 - 45 % эритроцитов.

Таблица 1

Минимальная ингибирующая концентрация природных пептидов с высоким содержанием триптофана: Ind, ЗВЗ, GSP-la, пуроиндолина А, тритриптицина, в отношении Е. coli, штамм ML-35p, L. monocytogenes, штамм EGD, S. aureus, С. albicans, штамм 820. РД - радиальная диффузия в геле

О 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60

Длительность инкубации, мин

Рис. 3. Динамика изменения проницаемости внешней (А) и внутренней (Б) мембран Е. coli, штамм ML-35p при действии пептидов PG-1, Ind, ЗВЗ, GSP-la, пуриндолина А, тритриптицина в концентрации 20 мкМ. По оси абсцисс - длительность инкубации пептидов, мин. По оси ординат -оптическая плотность (OD) проб, измеренная при длинах волн 490 или 420 нм. Число наблюдений по каждой точке равно 5.

Полученные результаты позволяют сделать предположение о влиянии заряда молекул пептидов на их гемолитическую активность. Так, пептид тротриптицин, обладающий наибольшим зарядом, является и наиболее активным в отношении эритроцитов человека в сравнении с исследованной группой пептидов, обладающих меньшим значением заряда молекулы. Согласно предположению авторов других работ (Yang S. et al., 2002), избирательное антибиотическое действие пептидов GSP-la и ЗВЗ обусловлено особенностью их взаимодействия с биологическими мембранами, в составе которых преобладает фосфотидилхолин. Выявлено, что степень насыщения молекул триптофаном, как и различный заряд молекулы пептида, нелинейно влияют на изученные эффекты их действия.

Эффекты действия структурных аналогов индолицидина со встроенными омега-аминокислотами. Пептиды Ind23, Ind34, Ind35, Ind36 являются аналогами природного пептида Ind, отичающимися от него наличием омега-аминокислот в структуре. МИК Ind составляет 1,25; 1,25 и 2,5 мкМ в отношении Е. coli, L. monocytogenes и S. aureus (Рис. 4), соответственно, что согласуется с данными литературы (Selsted М.Е. et al., 1992; Falla Т. J., Hancock R.E.W., 1997). Все изученные синтетические пептиды, являются высокоактивными в отношении 5. aureus, их МИК ниже по сравнению с этим показателем у природного Ind. С другой стороны, при их инкубировании с микроорганизмом L. monocytogenes выявлены различные степени их антимикробной активности относительно Ind: пептиды Ind23, Ind34 в 2 и 4 раза более активны, а активность Ind35 совпадает с активностью Ind. МИК пептида Ind36 в 2 раза выше этого показателя у Ind. В отношении Е. coli пептиды lnd35 и Ind36 являются в 4 раза менее активными по сравнению с природным Ind, а пептиды Ind23 и Ind34 имеют МИК, эквивалентную МИК пептида Ind. Выявлено, что наиболее активным пептидом является Ind34, у которого пролин в положениях 3, 7 и 10 замещен на аминобутировую кислоту. Данные по антимикробной активности изученных синтетических пептидов получены впервые, однако известно, что встраивание омега-аминокислот в модификации пептидов приводит к изменению вторичной структуры молекулы, а именно, разобщению гидрофильных и гидрофобных участков (Falla Т. J., Hancock R.E.W., 1997), увеличению количества водородных связей (Vasudev P.G. et al., 2011). Эти изменения структуры приводят к усилению антимикробной активности пептидов в отношении ряда микроорганизмов, чему соответствуют результаты проведенного исследования.

Проведено также изучение активности синтетических пептидов Ind23, Ind34, Ind35 и Ind36, а также природного Ind, в отношении изменения проницаемости внешней (Рис. 5А) и внутренней (Рис. 5Б) мембран Е. coli. Выявлено, что все изученные пептиды с заменой аминокислоты пролина на омега-аминокислоты вызывают увеличение проницаемости как внешней, так и цитоплазматической мембран Е. coli. Полученные результаты

подтверждаются данными литературы о мембранолитическом механизме действия природного Ind (Falla T.J. et al., 1996). Для изученных в работе синтетических пепидов, в структуре которых содержатся омега-аминокислоты, такие данные получены впервые.

Рис. 4. Определение минимальной ингибируюшей концентрации (МИК) пептидов на примере индолицидина (Ind) в отношении S. aureus. По оси абсцисс - концентрация пептида 0-5 мкМ, по оси ординат - оптическая плотность (ОГП инкубируемой пробы, измеренная при длине волны 570 нм.

* - р <0,05 - по сравнению с ОП проб без добавления пептида

о 0,3 0,6 1,3 2.6 5

Концентрация пептида, мкМ

Без пептида

Ind

Ш23

0 10 Длительность инкубации, мин

Рис. 5. Динамика изменения проницаемости внешней (А) и внутренней (Б) мембран Е. coli при действии индолицидина (Ind) и его структурных аналогов со встроенными омега-аминокислотами -Ind23, Ind34, Ind35, lnd36 - в концентрации 20 мкМ. По оси абсцисс - длительность инкубации пептидов с бактерией, мин. По оси ординат - оптическая плотность (OD) проб, измеренная при длинах волн 490 или 420 нм. Число наблюдений по каждой точке равно 5.

При изучении гемолитической активности синтетических пептидов Ind23, Ind34, !nd35 и Ind36, а также природного Ind. показано, что все они вызывают гемолиз эритроцитов человека. Так, при действии пептидов Ind23, lnd34, Ind35 и Ind36, а также природного Ind в концентрации 100 мкМ лизису подвергалось 10-30% клеток. Сходные значения гемолитической активности природного пептида получены другими авторами (Halevy R. et al., 2003). Данные о гемолитической активности синтетических пептидов с наличием в структуре омега-аминокислот получены впервые. Однако известны другие способы модификации индолицидина, приводящие к уменьшению его гемолитической активности, например, замена пролина на аланин или триптофана на фенилаланин (Yang S. et al., 2002).

Проведена оценка цитотоксичности пептидов Іші, ІпсШ, М34, Іп(135, Ы36 в отношении клеток эритроидной миеломы человека. Результаты инкубации исследуемых пептидов с клетками линии К562 в течение 24 ч продемонстрировали высокий уровень их цитотоксичности в отношении опухолевых клеток. Цитотоксическая активность пептидов Іпс123, 1пс134, 1пё35 и ІпсІЗб, как и природного токсичного Іпсі, является высокой. Концентрация пептидов, при которой происходит ингибирование роста половины общего количества клеток (ІС50) составляет 3,7; 2,6; 5,6 и 5,8 мкМ, соответственно, по сравнению с 3,1 мкМ для Іпй (Рис. 6). Данные о цитотоксической активности пептидов 1пё23, Іпсі34,1п<Ш и ІпсІЗб получены впервые, однако из литературных источников известно, что встраивание в молекулы пептидов омега-аминокислот приводит к усилению спектра их антибиотической активности (Вапецее А. еі аі., 1996; Мар Б.К. еі аі., 2002), обусловленному, вероятно, изменением конформации пептидов.

Рис. 6. Цитотоксическая активность пептида 1пс]34 в отношении клеток К562.

По оси абсцисс - концентрация пептида 6,25 -100 мкМ, по оси ординат — разность оптических плотностей (ОЭ) инкубируемых проб, измеренная при длинах волн 540 и 690 нм.

1 ю 100

Концентрация пептида, мкМ

Эффекты действия структурных аналогов индолицидина с различным зарядом и амфипатичностыо. Пептиды Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21, Ind22 - структурные аналоги природного пептида Ind - обладают различным зарядом и амфипатичностью, что отражается на изменении их антибиотической активности, а также на эффектах их действия на цитотоксическую и пролиферативную активность спленоцитов крыс.

Минимальная ингибирующая концентрация природного пептида индолицидина составляет 1,25; 1,25 мкМ и 2,5 мкМ в отношении Е. coli, L. monocytogenes, S. aureus, соответственно (Табл. 2), что лежит в диапазоне величин, определенных в различных работах (Selsted М.Е. et al„ 1992; Falla Т. J., Hancock R.E.W., 1997). Антимикробная активность синтетических пептидов lnd7, Ind8, Ind20 и Ind21 в отношении Е. coli, оцененная по их МИК, сопоставима с активностью природного Ind, в отличие от менее активных пептидов Ind2 и Ind22 (Табл. 2). Пептиды Ind2, Ind7, Ind8, Ind20 и Ind21, в сравнении с Ind, менее активны в отношении ингибирования роста L. monocytogenes, в то время как МИК пептида Ind22 в 2 раза ниже этого показателя у Ind. Минимальная ингибирующая концентрация как природного Ind, так и синтетических пептидов Ind2 и Ind22, в отношении

S. aureus составляет 2,5 мкМ. Пептиды Ind7, lnd8, Ind20 и Ind2l проявляют менее выраженную активность в отношении этого микроорганизма. Данные об антимикробной активности синтетических пептидов Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21 и Ind22 получены впервые. Однако в работах других авторов показано усиление антимикробной активности пептидов с аналогичными модификациями, обладающих увеличенным зарядом и пространственным разобщением гидрофильных и гидрофобных участков (Falla Т. J., Hancock R.E.W., 1997).

Таблица 2.

Минимальная ингибирующая концентрация Ind и его структурных аналогов Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21 и Ind22. Поиск МИК проведен в диапазоне концентрации от 0 до 5 мкМ в отношении Е. coli, штамм ML-35p, L. monocytogenes, штамм EGD, и S. aureus, штамм 710а.

Пептид // Микроорганизм E. coli, штамм ML-35p L. monocytogenes, штамм EGD S. aureus, штамм 710а

МИК, мкМ МИК, мкМ МИК, мкМ

Ind 1,25 1,25 2,50

Ind2 >5,00 2,50 2,50

Ind7 0,31 >5,00 >5,00

Ind8 0,63 5,00 5,00

Ind20 1,25 5,00 >5,00

Ind21 0,63 2,50 >5,00

lnd22 2,50 0,63 2,50

Установлено, что индолицидин увеличивает проницаемость внешней и внутренней мембран Е. coli (Рис. 7). Полученные в работе данные о взаимодействии Ind с биологическими мембранами Е. coli совпадают с литературными (Wu М. et al., 1999). Так, природный пептид Ind, как и его синтетические аналоги Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21 и Ind22, увеличивают проницаемость внешней мембраны Е. coli (Рис. 7).

О 10 20 30 40 SO о 10 20 30 40 50

Длительность инкубации, мин

Рис. 7. Динамика изменения проницаемости внешней (А) и внутренней (Б) мембран Е. coli, штамм ML-35p, при действии индолицидина (Ind) и его структурных аналогов с различной амфипатичностью: Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21 и Ind22 в концентрации 20 мкМ.

По оси абсцисс - длительность инкубации пептидов с бактерией, мин. По оси ординат -оптическая плотность (OD) проб, измеренная при длинах волн 490 или 420 нм. Число наблюдений по каждой точке равно 5.

Синтетические модификации индолицидина - пептиды Ind7, Ind8 и Ind21 - не увеличивают проницаемость внутренней мембраны Е. coli, в отличие от пептидов Ind2, In20 и Ind22. Полученные данные отчасти совпадают с литературными, так как. в работах других авторов показано, что при увеличении заряда молекулы пептида и наличия пространственного разобщения гидрофобных и гидрофильных участков структуры пептида наблюдается усиление эффекта их влияния на увеличение проницаемости мембран Е. coli (Falla Т. J., Hancock R.E.W., 1997). С другой стороны, исследованные в работе пептиды Ind7, Ind8 и Ind21, обладающие перечисленными свойствами, не вызывают увеличения проницаемости внутренней мембраны микроорганизма, что расходится с результатами аналогичных исследований других авторов (Falla Т. J., Hancock R.E.W., 1997).

Результаты исследования гемолитической активности пептидов Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21 и Ind22 в отношении эритроцитов человека показали, что все исследованные пептиды обладают сниженной гемолитической активностью в сравнении с этим показателем у Ind. Так, при действии пептидов Ind7, Ind8, Ind20, Ind21 и Ind22 в концентрации 100 мкМ лизису подвергается 1,55; 3,32; 3,32; 0,84; 0,08 и 16,65 % клеток, соответственно. Данные о гемолитической активности синтетических пептидов с подобными модификациями согласуются с литературными, в которых также отмечен эффект уменьшения лизиса эритроцитов при воздействии на эти клетки модифицированными пептидами (Falla Т. J., Hancock R.E.W., 1997).

Результаты изучения цитотоксической активности пептидов Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21, Ind22 и Ind (Табл. 3) показали, что синтетические пептиды Ind2 и Ind8, как и природный пептид Ind, являются высокотоксичными. Их концентрация (IC50), при которой происходит ингибирование роста половины общего количества клеток К562,составляет 3,9; 8,7 и 3,1 мкМ, соответственно. Другие исследованные в работе пептиды - Ind7, Ind20, Ind21 и Ind22, проявляют невыраженный цитотоксический эффект. Данные о цитотоксической активности пептидов Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21 и Ind22 получены впервые, не имеют аналогов в литературе. В научной литературе дана неоднозначная оценка цитотоксичности природного пептида Ind (Bowdish D.M.E et al., 2005; Hsu Ch. et al., 2005).

Эффекты действия пептидов Ind, Ind7, Ind20, Ind21 и Ind22 на интенсивность пролиферации спленоцитов крыс Wistar. Дальнейшим этапом исследования стало изучение иммуномодулирующей активности антимикробных пептидов. С этой целью проведена оценка их влияния на пролиферативную активность спленоцитов, индуцированную действием митогена Кон А в субоптимальной дозе и препарата рекомбинантного ИЛ-lß, обладающего комитогенным эффектом.

Таблица 3.

Цитотоксичность синтетических пептидов Ind2, Ind7, Ind8, Ind20, Ind2I, Ind22 -структурных аналогов природного антимикробного пептида индолицидина (Ind) - в отношении опухолевых клеток линии К562, выраженная в ICjo-

Исследуемый Пептид IC50, мкМ

Ind 3,1

Ind2 3,9

Ш7 35,9

Ind8 8,7

Ind20 14,8

Ind21 24,6

Ind22 16,1

Пептиды, выбранные для изучения их влияния на интенсивность пролиферации спленоцитов крыс (Ind7, Ind20, Ind21n Ind22), в использованной концентрации являются нетоксичными в отношении клеток К562 (Табл. 3). В результате проведенного исследования показано, что как природный пептид Ind, так и его структурные аналоги Ind20 и Ind21 в концентрации 0,6; 2,5; 1,3 мкМ, соответственно, при внесении в инкубационную среду не вызывают ни усиления, ни подавления пролиферативной активности нестимулированных спленоцитов (Рис. 8), в то время как Ind7 и Ind22 в концентрациях 0,6 и 5 мкМ, соответственно, оказывают выраженное митогенное действие на клетки, индуцируя пролиферативную активность спленоцитов без их дополнительной стимуляции (Рис. 8). Однако при стимуляции клеток Кон А в субоггтимальной дозе и сочетанном действии Кон А и цитокина HJl-ip, пептиды Ind, Ind7, Ind20, Ind21 и Ind22 в использованных концентрациях ингибируют пролиферацию спленоцитов (Рис. 8).

Таким образом, при сопоставлении физико-химических характеристик молекул пептидов и их влияния на пролиферативную активность спленоцитов установлено, что увеличение заряда аналогов Ind по сравнению с зарядом нативного пептида, а также пространственное разобщение гидрофобных и гидрофильных участков молекул приводит к усилению их ингибирующего действия на пролиферативную активность спленоцитов, стимулированную либо Кон A (Ind 7, Ind 20, Ind 21 и Ind 22), либо Кон А в сочетании с ИЛ-ip (Ind 20), что свидетельствует о подавляющем действии Ind 20 на комитогенную активность ИЛ-ip в отношении пролиферации спленоцитов.

Результаты исследования позволяют заключить, что в то время как Ind7 и Ind22 оказывают прямое митогенное действие на пролиферацию клеток, природный Ind и его

структурные аналоги Ind 7, Ind 20, Ind 21 и Itid 22 оказывают подавляющее действие на пролиферативную активность спленоцитов, вызванную Кон А и ИЛ-lß. Возможно, что эффект диссоциации биологических свойств пептидов, приобретенной в результате модификации их структуры, и появление у них активности, направленной на подавление интенсивности пролиферации спленоцитов, индуцированной действием Кон А и ИЛ-lß, в какой-то мере обусловлен измененным состоянием структур клеток в период их деления (Friedrich С. et al, 1999). Данные о влиянии изученных в работе пептидов на пролиферативную активность спленоцитов, индуцированную действием митогена Кон А в субоптимальной дозе и препарата рекомбинантного ИЛ-lß, обладающего комитогенным эффектом, получены впервые. Однако сходные исследования проводились в отношении других пептидов, также относящихся к группе кателицицидинов - LL37 и дефенсинов. Так, показано, что пептид LL37 вызывает увеличение пролиферации клеток эндотелия (Koczulla R. et al., 2003), а дефенсины являются мощными митогенами для эпителиальных клеток, клеток линии карциномы и фибробластов (Murphy C.J. et al., 1993; Nishimura M. et al., 2004).

Оценка влияния структурных аналогов индолицидина с различной амфипатичностью на цитотоксическую активность спленоцитов крысы продемонстрировала, что пептиды Ind7 в концентрации 0,6 мкМ и Ind22 в концентрации 5 мкМ подавляют специфическую активность спленоцитов в отношении опухолевых клеток К562, a Ind20 и Ind21 в концентрациях 2,5 мкМ и 1,3 мкМ, соответственно, не изменяют ее (Рис. 9).

Таким образом, хотя пептид Ind7 практически не оказывает непосредственного цитотоксического действия на опухолевые клетки К562, a Ind22 обладает слабо выраженной цитотоксичностью, тем не менее, в использованных концентрациях оба пептида подавляют специфическую активность спленоцитов в отношении клеток К562. Особенностью структур пептидов Ind7 и Ind22 является замена анминокислоты триптофан в шестом положении на лизин, что возможно, обуславливает появление в спектре их биологической активности подавляющего действия на цитотоксическую активность спленоцитов. Данные о влиянии пептидов Ind7, Ind20, Ind21 и Ind22 на цитотоксическую активность спленоцитов крысы получены впервые. Тем не менее, аналогичные исследования проведены другими авторами, показавшими, что ЕК-индуцированный цитолиз трансформированных клеток линии KN62 уменьшается в присутствии пептидов HNP1-3 и является дозозависимым (Chalifour А. et al., 2004; Zhang К. et al., 2004). В других исследованиях установлено, что мононуклеарные клетки периферической крови, обработанные зимозаном, выделяют сериновые протеазы и HNP, усиливающие цитотоксичность ЕК-клеток (Lala А et al., 1992).

Рис. 8. Пролиферативная активность спленоцитов крыс Wistar после добавления в инкубационую среду Кон А, ИЛ-10 и исследуемых пептидов: индолицидина (Ind) и его структурных аналогов с различной амфипатичностью: Ind7, Ind20, Ind21 и Ind22. В круглых скобках указаны конечные концентрации пептидов в лунках. * - р <0,05, ** - р <0,01 - по сравнению с пролиферативной активностью спленоцитов без добавления пептидов, # - р < 0,05, # # - р < 0,01- по сравнению с пролиферативной активностью спленоцитов, индуцированной пептидом Ind.

пептида (0.6 мкМ) (2.5 ш■№) (1.3 шМ) (5,0 мкМ)

Рис. 9. Цитотоксическая активность спленоцитов крыс \Vistar после добавления в инкубационную среду структурных аналогов Ы с различной амфипатичностью: Ы7, М20, Ы21 и М22. В круглых скобках указаны конечные концентрации пептидов в пробах.

* - р <0,05, ** - р <0,01 - по сравнению с цитотоксической активностью спленоцитов без добавления пептидов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из основных направлений современных патофизиологии, биохимии и иммунологии является изучение клеточно-молекулярных механизмов реализации защитных функций и роли пептидов - эффекторов и регуляторов систем врожденного и адаптивного иммунитета - в этих процессах. Основными эффекторными молекулами системы врожденного иммунитета являются катионные пептиды лейкоцитарного и эпителиального происхождения, обладающие прямым антимикробным, фунгицидным и противоопухолевым действием. В более низких концентрациях антимикробные пептиды проявляют иммуномодулирующую активность.

В работе впервые получены данные, раскрывающие особенности антибиотических и иммуномодулирукмцих эффектов природных антимикробных пептидов семейства кателицидинов в сопоставлении с эффектами действия их синтетических структурных аналогов. Сравнительный анализ антимикробной, цитотоксической и гемолитической активности природного пептида протегрина-1 и его синтетических модификаций позволил установить, что молекулы протегрина-1 с измененным расположением дисульфидных связей обладают сниженной антимикробной и гемолитической активностью. Антимикробная активность триптофан-богатых пептидов усиливается при увеличении величины заряда молекулы. Изменение распределения гидрофильных и гидрофобных участков в молекуле индолицидина приводит к диссоциации антимикробных и цитотоксических свойств пептида, снижению его повреждающего действия на клетки человека. Пептиды - аналоги индолицидина - с низкой токсичностью в отношении клеток миелолейкоза человека К562 оказывают иммуномодулирующие эффекты: изменяют цитотоксическую активность ЕК-клеток селезенки и пролиферативную активность спленоцитов крыс. Впервые изучены изменения цитотоксической и пролиферативной активности спленоцитов крысы под действием индолицидина в сравнении с эффектами его синтетических аналогов различной структуры и показано, что пептиды 1пс17 и 1пс122 подавляют специфическую активность спленоцитов в отношении клеток К562 и оказывают прямое митогенное действие на пролиферацию нестимулированных спленоцитов. Проведенное экспериментальное исследование позволяет оценить значение определенных структурных модификаций молекул антимикробных пептидов для проявления их биологической активности. Получение модификаций пептидов с оптимальными антимикробными и иммуномодулирующими свойствами позволяет рассматривать их как перспективные антибиотические молекулы и корректоры защитных функций и открывает возможности разработки на их основе новых синтетических лекарственных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Синтетические аналоги природного протегрина-1 с измененным пространственным расположением дисульфидных связей обладают сниженной антимикробной активностью. Гемолитическая активность пептидов Р88, Р88 и Р88 в отношении эритроцитов человека подавлена.

2. Триптофан-богатый пептид тритриптицин, имеющий больший, по сравнению с природным индолицидином, суммарный заряд молекулы, обладает повышенной антибиотической активностью.

3. Триптофан-богатые антибиотические пептиды индолицидин и тритриптицин обладают высокой гемолитической активностью, а пептиды ЗВЗ, ОЗР-1 и пуроиндолин не вызывают лизиса эритроцитов человека.

4. Синтетические модификации природного индолицидина, в структуре которых пролин замещен на омега-аминокислоты, обладают усиленной антимикробной активностью при сохранении высокой цитотоксической активности, характерной для молекул индолицидина.

5. Синтетические аналоги природного индолицидина, характеризующиеся более полным пространственным разделением гидрофильных и гидрофобных участков молекулы и увеличением суммарного заряда молекулы, проявляют более высокую антимикробную и низкую цитотоксическую активность по сравнению с эффектами действия природного пептида.

6. Структурно-модифицированные аналоги индолицидина, не обладающие цитотоксичностью в отношении клеток эритроидной миеломы человека К-562, не изменяют цитотоксическую активность спленоцитов крысы (М 21) или вызывают ее снижение (М 7 и М22).

7. Исследованные синтетические аналоги индолицидина с различной степенью пространственного разделения гидрофобных и гидрофильных участков молекулы угнетают пролиферативную активность спленоцитов крысы, индуцированную действием Кон А и ИЛ-1(5. Пептиды М7 и 1п<122, в молекулах которых триптофан в 6-м положении заменен на лизин, оказывают прямое митогенное действие на клетки селезенки крыс.

8. Модификация структуры природного индолицидина приводит к появлению новых вариантов иммуномодулирующей активности пептида, а характер структурных модификаций указывает на возможные пути направленного синтеза молекул с измененными биологическими свойствами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Артамонов А. Ю., Шамова О. В., Кокряков В. Н., Миргородская О. А., Орлов Д. С. Мембраноселективные структурные варианты протегрина-1 // ВЕСТНИК СПбГУ. 2008. Сер. 3. Вып. 3. С. 79—86.

2. Артамонов А. Ю., Шамова О. В., Кокряков В. Н., Орлов Д. С. Фото- и флюорометрические методы оценки проницаемости мембран Е. coli, ML-35p // ВЕСТНИК СПбГУ. 2008. Сер. 3. Вып. 2. С. 139—142.

3. Артамонов А. Ю., Шанин С.Н., Орлов Д. С., Шамова О. В., Колодкин Н.И., Рыбакина Е.Г. Иммуномодулирующая активность антимикробных пептидов индолицидина и его структурных аналогов // Медицинская иммунология. 2009. Т. 11, №1. С. 101—104.

Тезисы докладов:

4. Артамонов А.Ю. Исследование антимикробного действия протегрина и синтетических протегриноподобных пептидов // Тезисы докладов. Научно-практическая конференция с международным участием «Ученые будущего». Одесса, 2006. С. 40.

5. Orlov D.S., Shamova O.V., Mirgorodskaya О.А., Artamonov A.Yu. Study of protegrin-1 and its synthetic variants // Abstracts. International symposium «Interaction of the nervous and immune systems in health and disease». SPb., 2007. P. 63.

6. Orlov D.S., Shamova O.V., Artamonov A.Yu, Kalesnik A.M., Smirnova M.P., Kolodkin N.I. Antimicrobial activity of triptophan-rich peptides // Abstracts. International symposium «Interaction of the nervous and immune systems in health and disease». SPb., 2007. P. 63.

7. Орлов Д.С., Бабкин A.B., Артамонов А.Ю., Калесник A.M., Шамова О.В. Антимикробная активность пептидов врожденного иммунитета в отношении антибиотикорезистентных микроорганизмов // Российский иммунологический журнал. СПб., 2008. Т 2, №2-3. С. 150.

8. Артамонов А.Ю., Шамова О.В., Миргородская О.А., Орлов Д.С. Анализ антимикробных и цитотоксических свойств протегрина-1 и его структурных синтетических вариантов // Российский иммунологический журнал. Т. 2, №2-3. СПб., 2008. С. 147.

9. Artamonov A.Yu., Orlov D.S., Shanin S.N., Shamova O.V., Kolodkin N.I., Rybakina E.G. Immunomodeulatory activity of antimicrobial peptide indolicidin and its structural analogues // Abstracts. II International symposium «Interaction of the nervous and immune systems in health and disease». SPb., 2009. P. 8.

10. Artamonov A.Yu., Orlov D.S., Shamova O.V., Shanin S.N., Kolodkin N.I., Smirnova M.P., Rybakina E.G. Cytotoxic activity of native peptide indolicidin and its synthetic analogues // Abstracts. Ill International symposium «Interaction of the nervous and immune systems in health and disease». SPb., 2011. P. 148.

Подписано в печать 17.02.12 Формат 60х84'/іб Цифровая Печ. л. 1.25 Уч.-изд.л. 1.25 Тираж 100 Заказ 17/02 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)