Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Физико-химические свойства нового пространственно-затрудненного фенола и разработка параметров стандартизации его таблетированной формы

На правах рукописи

т

Назмутдинова Елена Евгеньевна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВОГО ПРОСТРАНСТВЕННО-ЗАТРУДНЕННОГО ФЕНОЛА И РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ ЕГО ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ФОРМЫ

14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук 1 3 ОКТ 2011

4857094

Самара-2011

4857094

Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Краснов Ефим Авраамович Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Лозовая Галина Федоровна

доктор химических наук, профессор Онучак Людмила Артемовна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «8» ноября 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171)

Автореферат разослан «_»_ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук,

доцент

И.К. Петрухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Нарушения мозгового кровообращения представляют собой важную медицинскую и социально-экономическую проблему. Они занимают второе место среди причин смертности населения и первое место среди причин первичной инвалидности.

Одним из основных и универсальных механизмов повреждения клеток ткани мозга в условиях нарушения мозгового кровообращения является оксидантный стресс. Ввиду этого патогенетически обоснованным является применение в терапии нарушений мозгового кровообращения нейропротекторных средств (антиоксидантов и антигипоксантов), способных удалять избыток свободных радикалов и обеспечивать метаболическую защиту головного мозга.

В последнее время резко возрос интерес к производным пространственно-затрудненных фенолов (ПЗФ) в связи с открытием многочисленных аспектов их практического использования. Одним из перспективных низкотоксичных соединений данной группы является новый полусинтетический антиоксидант медиборол (4-метил-2,б-диизоборнилфенол). Медиборол обладает выраженным влиянием на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз, нейропротекторной и ретинопротекторной активностью и является основой для создания лекарственного средства профилактического и лечебного действия при свободнорадикальных патологиях в неврологии и офтальмологии.

Для внедрения медиборола в медицинскую практику необходимым этапом и актуальной задачей является изучение его физико-химических свойств, разработка параметров качества субстанции и таблетированной лекарственной формы медиборола, которые гарантировали бы их эффективность и безопасность, и составление проектов фармакопейных статей предприятия (ФСП). В связи с возросшими требованиями к качеству, как фармацевтических субстанций, так и екарственных препаратов актуальным является проведение валидации методик нализа.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение . изико-химических свойств, разработка методик анализа и стандартизация едиборола и его таблетированной лекарственной формы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать физические, химические и физико-химические свойства убстанции медиборола, используемой для производства твердой дозированной екарственной формы - таблеток.

2. Изучить спектральные характеристики субстанции медиборола методами УФ-, К-спектроскопии, масс-спектромегрии, флуориметрии и оценить возможность их спользования для стандартизации субстанции медиборола.

3. Провести исследование хроматографического поведения медиборола, 1сходных и побочных продуктов синтеза методами тонкослойной, газо-жидкостной

высокоэффективной жидкостной хроматографии с целью их использования для ценки чистоты субстанции медиборола.

4. Разработать методики количественного определения субстанции медиборола.

5. Установить фармакопейные показатели качества твердой дозированной лекарственной формы медиборола, разработать методики определения количественного содержания медиборола в таблетках.

6. Изучить стабильность и установить сроки годности субстанции и лекарственной формы медиборола.

Научная новизна. Впервые изучены физико-химические свойства нового оригинального нейропротектора медиборола. Изучены его спектральные характеристики с использованием методов УФ-, ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии, флуориметрии. Изучена хроматографическая подвижность медиборола и возможных примесей методами ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ, и установлены оптимальные условия, позволяющие достичь максимального разделения медиборола и примесей за минимальное время анализа, Разработаны методики количественного определения субстанции медиборола с использованием методов УФ-спектрофотометрии, ВЭЖХ и инверсионной вольтамперометрии. Впервые определены показатели качества, и разработаны методики фармацевтического анализа твердой дозированной лекарственной формы медиборола. Изучена стабильность субстанции медиборола и его таблетированной лекарственной формы при хранении методом «ускоренного старения» и в обычных условиях, установлены их сроки годности.

Практическая значимость. Впервые разработаны:

- методики анализа субстанции медиборола, установлены показатели и нормы качества. Подготовлен проект ФСП на субстанцию медиборола;

- методики и нормы качества таблетированной лекарственной формы медиборола. Подготовлен проект ФСП на таблетки медиборола.

- способ количественного определения медиборола (оформлен заявкой на патент РФ, положительное решение от 30.05.2011 г. по приоритетной справке № 2010131815 от 28.07.2010 г.)

Полученные результаты используются на кафедрах фармацевтической химии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России и ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России в качестве лекционного материала и методических рекомендаций для практического занятия на тему «Препараты группы экранированных фенолов». Методики идентификации, оценки чистоты и количественного определения экранированных фенолов методами ВЭЖХ и ГЖХ-МС используются в лаборатории хроматографических методов анализа ЦКП ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет».

Основные положения, выносимые на защиту:

• результаты исследования физико-химических свойств, спектральных характеристик и хроматографической подвижности медиборола;

• результаты разработки ВЭЖХ-методики определения посторонних примесей в субстанции медиборола и ее валидированная оценка;

• методики количественного определения медиборола в субстанции и таблетированной лекарственной форме;

• методики анализа твердой дозированной лекарственной формы медиборола.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского университета и комплексной целевой программой СО АМН Российской федерации «Здоровье человека в Сибири» (№ государственной регистрации 01200602064).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на X международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009); VII Всероссийской конференции «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009» (Уфа, 2009); VIII Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа, 2010); симпозиуме «Теория и практика электроаналитической химии» (Томск, 2010); Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010); на научных семинарах кафедры фармацевтической химии СибГМУ (Томск, 2009-2011); на проблемной комиссии СибГМУ «Разработка и создание новых лекарственных средств» (Томск, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованные ВАК РФ, получено положительное решение на выдачу патента РФ на изобретение.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на кафедре фармацевтической химии СибГМУ (г. Томск), а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: Центр коллективного пользования Сибирского федерального университета (г. Красноярск), НИИ органической химии СО РАН (г. Новосибирск), кафедра физической и аналитической химии и кафедра органической химии и технологии органического синтеза Национального исследовательского Томского политехнического университета, Институт химии нефти СО РАН (г. Томск). Выражаем искреннюю благодарность сотрудникам указанных подразделений и научных учреждений.

Личный вклад автора. Основные экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором или при его непосредственном участии. Автором выполнены исследования по установлению физических и физико-химических свойств медиборола, подобраны оптимальные условия для изучения субстанции и таблетированной лекарственной формы медиборола методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), инверсионной вольтамперометрии (ИВА), УФ-спектрофотометрии, разработаны методики количественного определения и оценки чистоты, изучены стабильность и установлены сроки годности субстанции и таблеток медиборола.

Автор проводил обработку, обобщение всех полученных результатов и формулировал основные выводы.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, шести глав экспериментальных исследований, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Материал работы изложен на 115 страницах, включает 21 таблицу, 30 рисунков и 1 схему. Библиографический указатель включает 139 наименований, из которых 38 зарубежных источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объекты и методы исследования

Объектами исследований явились серийные образцы субстанции 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (медиборола) (рис. 1, 2), исходные продукты синтеза (камфен, л-крезол), побочный продукт синтеза - 4-метил-2-изоборнилфенол, полученные в Институте химии Коми НЦ УрО РАН, а также таблетированная лекарственная форма «Медиборол 125 мг», разработанная на кафедре фармацевтической технологии СибГМУ.

С27Н4оО, М.м. 380,61

Рис. 1. Структурная формула медиборола

1 3 4

Рис. 2. Схема синтеза медиборола

Обозначения: 1 - «-крезол; 2 - камфен; 3 - 4-метил-2,6-диизоборнилфенол; 4-4-метил-2-изоборнилфенол.

Определение внешнего вида, растворимости, прозрачности и цветности раствора, неорганических примесей, потери в массе при высушивании, температуры плавления образцов субстанции медиборола и фармакопейных показателей таблеток медиборола проводили по методикам ГФ XI издания, вып. 1 и 2, ГФ XII издания и в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 (табл. 12,13).

УФ-спектры медиборола снимали на спектрофотометре СФ-2000-02 (Россия), ИК-спектры получали на приборе IR-80 (Германия), NICOLET 5700 (США). Масс-спектры высокого разрешения при прямом вводе пробы снимали на приборе «Finnigan МАТ 8200» (США).

Хроматографирование в тонком слое выполняли в восходящем токе системы гексан-этилацетат 95:5 в герметически закрытых стеклянных камерах, предварительно насыщенных заданной системой, используя хроматографические пластины «Sorbfíl» (Россия). Нанесение исследованных образцов на хроматографические пластины осуществляли при помощи капилляров и калибровочных микропипеток. В качестве детектора использовали насыщенный водный раствор перманганата калия.

Исследования методом высокоэффективный жидкостной хроматографии проводили на приборе Agilent Technologies 1200 (США), снабженным диодно-матричным детектором (длина волны детекции - 282 нм). Колонка Zorbax Eclipse

б

XDB C-18, 5 мкм, размер 4,6x150 мм (для исследования примесных соединений) и 4,6x50 мм (для количественного определения медиборола в субстанции и таблетированной лекарственной форме). Подвижная фаза: вода-ацетонитрил (вода бидистиллированная отфильтрованная на системе очистки воды, ацетонитрил квалификации «осч» для градиентной ВЭЖХ фирмы Рапсгеас, Испания). Объем вводимой пробы - 20 мкл. Обработку полученных данных производили с использованием программного обеспечения Agilent ChemStation.

Вольтамперометрическое определение медиборола проводили на компьютеризированном вольтамперометрическом анализаторе «ТА-2» (ООО «Томьаналит», Россия).

2. Физико-химические характеристики субстанции медиборола

По внешнему виду медиборол (диборнол) представляет собой бесцветные кристаллы или белый, белый с желтоватым оттенком микрокристаллический порошок со специфическим запахом, обладающий липофильными свойствами: практически нерастворим в воде и растворим в неполярных органических растворителях.

В ИК-спектре медиборола в области от 4000 до 400 см"1 в дисках с калия бромидом (2 мг/400 мг КВг) обнаружены следующие полосы поглощения, vmax, см"1: 3580, 3529, 3449 (ОН-); 3000-2870 (СН3-,СНГ), 1605, 1459 (ароматическое кольцо) (рис. 3).

УФ-спектр 0,01% этанольного раствора медиборола имеет характерные для ПЗФ две полосы поглощения: в области 210-230 нм (е=9520) и 270-290 нм (е=393) (рис. 4). Аналитическую ценность имеет максимум поглощения при длине волны 282±2 нм. При этом удельный показатель поглощения медиборола составил

Согласно данным масс-спектра (МС) высоко разрешения (рис. 5), молекулярная масса медиборола (М+) равна 380 а.е.м, а брутго-формула - С27Н40О,, что согласуется с теоретическими расчетами. МС медиборола содержит ионы с m/z (отн. инт., %) 380 (21) М+, 270 (48), 255 (41), 160 (100), 147 (37), 123 (18), 95 (22), по

72,2±0,9.

л

Â. им

Рис. 3. ИК-спектр медиборола в таблетке с калия бромидом

Рис. 4. УФ-спекгр 0,01% этанольного раствора медиборола

наличию которых можно заключить, что фрагментация молекулы медиборола проходит в первую очередь с расщеплением изоборнильных радикалов, о чем свидетельствуют фрагменты с m/z 270 (М+ - С8Н14), 160 ((М+ - С8Н,4) - С8Н,4).

Рис. 5. Масс-спектр высокого разрешения медиборола

3. Определение примесных соединений в субстанции медиборола

3.1 Тонкослойная хроматография

При хроматографировании в тонком слое использовали хлороформные растворы медиборола, лдра-крезола и 4-метил-2-изоборнилфенола различной концентрации 0,00125-1,0% для нормирования содержания примесей. Наилучшее разделение исследуемых соединений наблюдали в системе растворителей гексан-этилацетат 95:5.

Определение примесей в субстанции медиборола проводили по следующей методике. 0,2 г медиборола растворяли в 10 мл хлороформа (раствор А). К 0,01 мл раствора А прибавляли до 1 мл хлороформа и перемешивали (раствор Б). 0,004 мл раствора А (80 мкг) и 0,001 мл раствора Б (0,2 мкг) наносили на пластинки ЭогЬШ размером 3 Я0 см, высушивали на воздухе в течение 3 мин и помещали в хроматографическую камеру с системой растворителей гексан-этилацетат (95:5), которая является оптимальной подвижной фазой. После прохождения фронтом растворителя около 8 см пластинки вынимали из камеры, высушивали на воздухе в течение 5 мин, затем пропускали через насыщенный водный раствор перманганата калия. На хроматограммах проявлялись бурые пятна медиборола с = 0,80±0,02. В случае наличия примеси «-крезола или моноалкильного производного наблюдаются дополнительные пятна с ^ = 0,11 ±0,01 и 0.26±0,02 соответственно, каждое из

которых по величине и интенсивности окраски не должно превышать пятно медиборола раствора Б (0,25%). Чувствительность данной методики для медиборола составляет 0,2 мкг, для «-крезола и моноалкильного производного 0,0125 мкг и 0,025 мкг соответственно.

3.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография

В качестве посторонних примесей в субстанции медиборола могут быть как исходные вещества - я-крезол (примесь I), так и промежуточный продукт синтеза -4-метил-2-изоборнилфенол (примесь II). Наиболее приемлемое разделение исследуемых веществ достигалось при следующих условиях: ПФ вода:ацетонитрил в соотношении 60:40 в режиме градиентного элюирования до соотношения 5:95 в течение 4 мин, скорость потока 1,2 мл/мин, затем вода:ацетонитрил в соотношении 5:95 в режиме изократического элюирования, скорость потока 1,5 мл/мин.

Для проверки пригодности хроматографической системы использовали раствор примеси I (0,005 мг/мл) и примеси II (0,005 мг/мл) в ацетонитриле. Расчет параметров хроматографической системы проводили для пиков «-крезола и 4-метил-2-изоборнилфенола на пяти хроматограммах, полученных в условиях анализа. Степень разделения системного пика, пиков примесей I и II, а также пика медиборола на хроматограмме больше 2. Коэффициент асимметрии пика примеси I составил 0,9, а примеси II - 1,5. Относительное стандартное отклонение площади пиков для примесей I и II равно 1%.

Рис. 6. Хроматограмма модельной смеси медиборола (1 мг/мл) и примесей I, II (0,005мг/мл) в ацетонитриле

Обозначения: 1- системный пик; 2 - примесь I (2,40 ± 0,02 мин); 3 - примесь II (5,45 ± 0,02 мин); 4 - медиборол (11,40 ± 0,03 мин).

а б

Рис. 7. Зависимость площади пика от содержания л-крезола (а) и 4-метил-2-изоборнилфенола (б) в модельных смесях

Разработанная ВЭЖХ-методика определения посторонних примесей в субстанции медиборола является специфичной (рис. 6), характеризуется корректной точностью (табл. 1) и воспроизводимостью результатов (табл. 2), линейной зависимостью в аналитической области от 0,01 до 1,0% от основного вещества, принятого за 100 % (рис. 7). Предел обнаружения для примеси I и II составил 0,1 мкг/мл (0,01%) при соотношении аналитического сигнала к фоновому шуму (3:1). Предел количественного определения для примеси I и II составил 0,5 мкг/мл (0,05%) при соотношении аналитического сигнала к фоновому шуму не менее 10:1.

Таблица 1

Оценка правильности ВЭЖХ-методики для анализа примеси I, II

Содержание примеси Отклонение Среднее отклонение,

в растворе мкг/мл (погрешность %

Теоретическое Найдено определения), %

I II I II I II

0,50 0,48 0,59 4,0 18,0

0,46 0,43 8,0 14,0 6,7 17,3

0,46 0,40 8,0 20,0

1,00 1,07 1,02 7,0 2,0

0,98 1,09 2,0 9,0 4,7 8,3

1,05 1,14 5,0 14,0

2,00 2,13 2,10 6,5 5,0

2,12 2,12 6,0 6,0 6,2 5,7

2,12 2,12 6,0 6,0

5,00 5,38 5,13 7,6 2,6

4,50 4,96 10,0 0,8 7,8 2,5

4,71 5,20 5,8 4,0

Таблица 2

Оценка воспроизводимости ВЭЖХ-методики определения примесей в субстанции медиборола модельного раствора с содержанием примесей I и И на уровне 0,5% (0,005 мг/мл)

№ опыта 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Площадь пика примеси I 62,8 63,1 63,2 62,0 62,2 62,2 63,0 62,9 63,6 64,4

Метрологическая характеристика Хср=62,9; S=0,723; ДХср-0,52; Хср ± ДХСР=62,9±0,52; £„=0,83%

Площадь пика примеси II 44,8 45,5 47,1 47,4 46,3 45,3 46,6 47,1 46,1 46,5

Метрологическая характеристика Хср-46,3; S=0,856; ДХсР=0,61; Хср ± ДХСВ=46,3±0,61; £„=1,33%

4. Количественное определение медиборола в порошке и таблетнрованной лекарственной форме

4.1 Спектрофотометрический метод

Количественное определение медиборола проводили по следующей методике. Около 0,05 г (точная навеска) порошка медиборола помещали в коническую колбу с нормальным шлифом вместимостью 250 мл, прибавляли 70 мл спирта этилового 95% и нагревали на водяной бане (при 70 °С) с обратным холодильником в течение 10 мин. Затем содержимое колбы количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и после охлаждения до комнатной температуры доводили до метки тем же растворителем (раствор А). 10 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили 95% этиловым спиртом до метки (раствор Б). Измеряли оптическую плотность раствора Б при длине волны 282 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый 95%.

Содержание медиборола в порошке в процентах (X) вычисляли по формуле 1:

А 100 50 100 А 500 Л- « Ю 100 = ^ ° где А - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 282 нм;

АУ

Асм - удельный показатель поглощения медиборола, равный 72,2; а - навеска

медиборола, в граммах.

Полученные результаты представлены в табл. 3, из которой видно, что методика количественного определения медиборола в порошке обладает достаточно высокой точностью (относительная ошибка среднего результата - 0,7%).

Таблица 3

Результаты количественного определения субстанции медиборола

№ п/п Навеска, г Оптическая плотность Содержание, % Метрологическая характеристика

1 0,0550 0,8024 101,03 Х = 99,76% Б = 1,08 Бх = 0,34 Р = 0,95 ДХ = 0,71 Х±ДХ = 99,76%±0,71% е - 0,7%

2 0,0532 0,7627 99,28

3 0,0502 0,7382 101,84

4 0,0499 0,7127 98,91

5 0,0536 0,7741 100,01

6 0,0520 0,7482 99,64

7 0,0504 0,7218 99,18

8 0,0497 0,7070 98,51

9 0,0527 0,7564 99,40

10 0,0520 0,7587 101,04

Количественное определение медиборола в таблетках «Медиборол 125 мг» проводили по нижеописанной методике. Около 0,4000 г (точная навеска) порошка 20 растёртых таблеток помещали в коническую колбу вместимостью 250 мл с нормальным шлифом и прибавляли 70 мл спирта этилового 95%. Колбу соединяли с

обратным холодильником и нагревали на водяной бане (температура водяной бани 70 С) в течение 10 мин. Затем охлаждали, содержимое колбы количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до метки спиртом этиловым 95%, перемешивали и фильтровали. 1 мл фильтрата переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили объём до метки спиртом этиловым 95%, перемешивали и измеряли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 282 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый 95% (табл. 4).

Содержание медиборола в таблетках в граммах (X) вычисляли по формуле 2:

А а0 100 25 А д0 25

Асм а 100 1 А\т а

где А - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 282 нм;

,1%

А1см~ удельный показатель поглощения медиборола, равный 72,2; а-навеска таблеток медиборола, в граммах; ао - средняя масса таблеток медиборола, в граммах.

Таблица 4

Результаты количественного определения медиборола в таблетках

Масса Оптическая Содержание медиборола Метрологическая

навески,г плотность в таблетке, г характеристика

0,3994 0,3480 0,1219 Х = 0,1230

0,3976 0,3474 0,1222 S = 0,002

0,3990 0,3622 0,1270 Sx = 0,00082

0,3998 0,3501 0,1225 Р = 0,95

0,4018 0,3506 0,1221 ДХ = 0,0021

0,3999 0,3488 0,1220 Х±ДХ = 0,1230±0,0021

£=1,71%

4.2 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

При разработке методики количественного определения медиборола в субстанции и таблетированной лекарственной форме методом обращено-фазной ВЭЖХ необходимо было подобрать условия, при которых пик медиборола не давал «хвостового эффекта», имел максимально симметричный вид и высокое разрешение с пиками возможных примесей при минимальном времени анализа. С этой целью была выбрана колонка Zorbax Eclipse XDB С-18, 5 мкм, размером 4,6x50 мм и следующие условия хроматографирования: скорость потока 1,0 мл/мин, время анализа - 7 мин, ПФ: А - вода, Б - ацетонитрил.

Хроматографический режим:

Время, мин ПФ А, % ПФ Б, % Режим

0-3 95—>0 5—>100 Линейный градиент

3-6 0 100 Изокрйтический

6-7 95 5 Переход к начальному составу

Для определения медиборола в субстанции около 0,025 г порошка медиборола (точная навеска) переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в 20 мл ацетонитрила на ультразвуковой бане и доводили объем раствора до метки тем же растворителем. Сущность пробоподготовки таблеток «Медиборол 125 мг» заключается в следующем: около 0,05 г порошка растертых таблеток (точная навеска) обрабатывали в мерной колбе вместимостью 25 мл ацетонитрилом (20 мл) на ультразвуковой бане в течение 10 мин, доводили объем раствора до метки ацетонитрилом и затем центрифугировали. Для анализа использовали надосадочную жидкость.

Специфичность методики подтверждали, применяя модельные смеси. Для количественного определения медиборола в субстанции использовали модельную смесь медиборола и возможных примесей n-крезола и 4-метил-2-изоборнилфенола. Время удерживания пика медиборола составило 3,9 мин, а примесей и-крезола и 4-метил-2-изоборнилфенола 1,3 и 2,9 мин соответственно, что свидетельствует о высокой специфичности методики. Для таблетированной лекарственной формы на хроматограмме модельной смеси, содержащей вспомогательные вещества без действующего вещества (плацебо), отсутствовали пики, мешающие определению медиборола.

Пригодность хроматографической системы характеризовали несколькими параметрами: величина относительного стандартного отклонения площади пика для субстанции и таблеток составила 0,9%, коэффициент ассиметрии пика находился в диапазоне 0,91-0,94, разрешение между пиком медиборола и пиком примеси 4-метил-2-изоборнилфенола составило не менее 7. Расчет параметров хроматографической системы оценивали путем последовательного пятикратного введения раствора медиборола в хроматограф и регистрации хроматограмм.

Линейность методики исследовали в диапазоне концентраций от 80 до 120% от искомой концентрации медиборола в растворе (рис. 8, а) и на модельных смесях, содержащих вспомогательные вещества и действующее вещество в диапазоне 70130% от заявленного содержания в таблетке (рис. 8, б).

Рис. 8. Зависимость площади пика от содержания медиборола в ацетонитриле (а) и в модельной смеси (б)

Оценка правильности методики количественного определения медиборола в таблетках проводилась с использованием модельных смесей на трех уровнях содержания действующего вещества-90, 100,110% (табл. 5).

Таблица 5

Оценка правильности методики для таблеток «Медиборол 125 мг»

Содержание действующего вещества от заявленного, % Введено, мг Найдено, мг Среднее, мг Отклик, %

90 113,3 112,2 113,9 114,3 113,5 100,18

100 125,2 124,4 125,3 124,8 124,8 99,68

110 136,0 134,8 134,8 134,8 134,8 99,12

Параметр прецизионность аналитической методики включает в себя повторяемость, промежуточную прецизионность и воспроизводимость. В данной работе оценивали повторяемость методики (табл. 6, 7). Относительная ошибка среднего результата для субстанции составила 1,6%, для количественного определения медиборола в таблетках 1,7%.

Таблица 6

Оценка повторяемости методики количественного определения медиборола в порошке

Площадь под пиком медиборола 5328,3 5229,2 5249,4 5411,2 1 5399,0 5400,0

Метрологическая характеристика n=6; Хср=5336,2; S=80,9; ДХср=84,8; Хср±ДХср=5336±84,8; еср=1,6%

Таблица 7

Оценка повторяемости методики для таблеток «Медиборол 125 мг»

Xj, мг 121,5 122,4 | 124,4 | 125,3 125,9 126,7

Метрологическая характеристика п=6; Хср= 124,4; S=2,04; ДХср=2,14; Хср±ДХср=124>4±2,14; еср=1,7%

Таким образом, разработанная ВЭЖХ-методика количественного определения медиборола в субстанции и в таблетках «Медиборол 125 мг» характеризуется специфичностью, пригодностью хроматографической системы, линейностью, правильностью и повторяемостью, что позволяет использовать ее для стандартизации субстанции и таблеток медиборола.

4.3 Вольтамперометрический метод

В последние годы вольтамперометрический метод, благодаря простоте, селективности, экспрессности и доступности оборудования, успешно используется для анализа органических веществ, в том числе для количественного определения лекарственных средств.

При исследовании электрохимических свойств медиборола были сняты вольтамперограммы в широком диапазоне потенциалов: Е = -2,0 - 2,0 В (для рабочего СУЭ, ПЭ и ХМПЭ) и Е = -1,2 - 0,0 В (для рабочего РПЭ). Медиборол не обнаружил электрохимической активности на РПЭ и на ХМПЭ, но проявил восстановительные свойства на СУЭ и ПЭ, дав анодный пик окисления при потенциале Е = 1,3 В (рис. 9). Лучшую воспроизводимость сигнала на вольтамперограмме наблюдали на платиновом электроде, который и был выбран в качестве рабочего (табл. 8, 9). Результаты оценки влияния природы растворителя и фонового электролита на аналитическое определения медиборола показали, что наиболее выраженный и воспроизводимый пик окисления проявляется в среде 0,1 М перхлората натрия в ДМФА (рис. 10). Для повышения чувствительности и воспроизводимости количественного определения медиборола использовали инверсионную вольтамперометрию с предварительным накоплением медиборола на платиновом электроде.

окисления медиборола окисления медиборола на ПЭ на фоне

Обозначения: 1 - фон; 2 - медиборол. №С104 от концентрации в ячейке

Таблица 8

Метрологические характеристики вольтамперометрического определения субстанции медиборола

X;, МГ/МЛ_

Метрологическая характеристика

0,89

0,90

0,92

0,94

0,97

0,99

п=6; Хср=0,94; 8=0,04; ЛХср=0,04; Хср±ДХср=0,94±0,04; еср=4,5%

Таблица 9

Метрологические характеристики вольтамперометрического определения медиборола в таблетках «Медиборол 125 мг»

Xj, мг 112,2 120,2 125,1 128,0 134,6 135,6 145,4

Метрологическая характеристика n=7; Хср=128,7; S=11,0; ДХср=10,2; Хср±ДХср=128,7±10,2; еср=7,9%

Таким образом, методика количественного определения медиборола методом инверсионной вольтамперометрии характеризуется следующими параметрами: предел обнаружения 1-10"3 моль/л, область определяемых содержаний медиборола от 1 -10" моль/л до 3,2-10"3 моль/л, относительная ошибка определения 4,5% и 7,9% для субстанции и таблеток соответственно.

Полученные данные имеют приоритетный характер и были оформлены заявкой на изобретение (положительное решение от 30.05.2011 г. по приоритетной справке №2010131815 от 28.07.2010 г.).

5. Оценка качества таблеток медиборола

Состав на одну таблетку:

Медиборол 125 мг

Лактоза 225 мг

Примогель 17 мг

Натриевая соль кроскармеллозы 17,6 мг

Поливинилпирролидон 12 мг

Магния стеарат 3;4 мг

По внешнему виду полученные таблетки белого цвета, плоскоцилиндрической формы с фаской и риской, с гладкой и однородной поверхностью без сколов.

Поскольку медиборол практически нерастворим в воде, то для теста «Растворение» в ОФС 42-0003-04 «Растворение» для таких веществ рекомендуется в качестве среды растворения использовать водные растворы с добавлением поверхностно-активных соединений или органических растворителей. В качестве среды растворения таблеток медиборола исследовали фосфатный буфер с натрия додецилсульфатом в разных концентрациях и смесь 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты с спиртом этиловым 95% в разных соотношениях.

В химический стакан, заполненный 900 мл фосфатного буфера (рН 6,86), содержащего натрия додецилсульфат, опускали таблетку, находящуюся внутри корзинки, вращающейся со скоростью 100 об/мин. Через 45 мин раствор фильтровали через стеклянный фильтр. Измеряли оптическую плотность фильтрата на спектрофотометре при длине волны 282 им в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали фосфатный буфер с натрия додецилсульфатом.

Количество медиборола в граммах, перешедшего в раствор, рассчитывали по формуле (3):

А ап 900 А а0 9

X = "* "*о _ л "о

Д'Г; а 100 = д1* я

1СЛ1 "

где X - содержание медиборола в таблетках, г; А - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 282 им; А1%,см - удельный показатель поглощения медиборола, равный 72,2; а-масса таблетки медиборола, взятая для анализа, г; а« - средняя масса таблеток медиборола, г.

Как видно из табл. 10, увеличение концентрации натрия додецилсульфата незначительно влияло на высвобождение медиборола из таблеток в фосфатный буфер и не превышало 35 %.

Таблица 10

Влияние концентрации натрия додецилсульфата на растворение медиборола

Концентрация натрия додецилсульфата, % Масса медиборола, перешедшего в раствор, г Концентрация медиборола в растворе, %

0,5-Ю"3 0,0118 ±0,0004 9,44 ± 0,32

МО'3 0,0239 ± 0,0010 19,12 ±0,80

МО'2 0,0306 ± 0,0013 24,48 ± 1,04

2-Ю'2 0,0419 ±0,0019 33,52 ± 1,52

8-Ю"2 0,0292 + 0,0014 23,36 ± 1,12

Далее нами были исследованы в качестве среды растворения смесь 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной и спирта этилового 95% в соотношениях 1:9, 2:8 и 3:7. Кроме того, для увеличения высвобождения медиборола из таблеток была подобрана величина скорости вращения корзинки (рис. L1).

too-.

Время растворения, мин

Рис. 11. Профиль высвобождения медиборола в смесь 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной и спирта этилового 95% при различных соотношениях

Обозначения: 1-1:9 (100 об/мин); 2-1:9 (200 об/мин); 3 - 1:9 (150 об/мин); 4 -3:7 (100 об/мин); 5-2:8 (100 об/мин); 6-2:8 (200 об/мин).

Наилучшие результаты были получены при использовании смеси 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной и спирта этилового 95% в соотношении 2:8 и скорости вращения корзинки 200 об/мин по следующей методике (табл. 11). В химический стакан, заполненный 500 мл смесью 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной и спирта этилового 95% (2:8), опускали таблетку, находящуюся внутри корзинки, вращающуюся со скоростью 200 об/мин. Через 15, 30, 45 мин отбирали мерной пипеткой 15 мл раствора, восполняя объем равным количеством исследуемой среды. Раствор фильтровали через бумажный фильтр. 10 мл фильтрата переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили объём раствора исследуемой средой до метки и перемешивали. Затем измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 282 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали смесь 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной и спирта этилового 95% в соотношении 2:8. Количество медиборола в граммах, перешедшего в раствор, рассчитывали по формуле 4:

А а0 500 25 А а0 12,5

А\см '

обозначения как в формуле 3.

Хт4*\ 100 10" ¿7' (4)

Таблица 11

Высвобождение медиборола в среду 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной и спирта этилового 95% (2:8)

Время взятия аликвоты, мин Масса медиборола, перешедшего в раствор, г Концентрация медиборола в растворе, %

15 0,0698 ± 0,0038 55,84 ± 3,04

30 0,0992 ± 0,0054 79,36 ± 4,32

45 0,1084 ±0,0059 86,72 ± 4,72

Таким образом, на основании проведенных исследований разработаны методики фармацевтического анализа таблетированной лекарственной формы медиборола, позволяющие осуществлять контроль ее качества.

Таблица 12

СПЕЦИФИКАЦИЯ Медиборол, субстанция

Показатель Метод Норма

Описание Органолептиче-ский От белого до белого с кремовым оттенком микрокристаллический порошок или бесцветные кристаллы со специфическим запахом.

Растворимость ГФХН Легко растворим в хлороформе, очень мало растворим в спирте 95%, практически не растворим в воде.

Подлинность ИК-спектроскопия ИК-спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом, в области от 4000 до

УФ- спектрофотометрия ВЭЖХ 400 см"1 по положению полос поглощения должен соответствовать спектру стандартного образца медиборола. УФ-спектр 0,01 % раствора субстанции в спирте 95% в области от 230 до 350 нм должен иметь максимум при 282±2 нм. Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора

(раздел «Количественное определение») должно соответствовать времени удерживания основного пика на хроматограмме раствора медиборола стандарта.

Температура плавления ГФХИ От 206 до 210°С.

Прозрачность раствора ГФХИ Прозрачный или не более эталонного раствора I (10% раствор в хлороформе)

Цветность раствора Спектрофотомет-рический Оптическая плотность 5% раствора медиборола в хлороформе при длине волны 340 нм не должна превышать 0,1

Посторонние примеси ВЭЖХ Единичной примеси - не более 0,2 %

Потеря в массе при высушивании ГФ XI Не более 0,2 %

Хлориды ГФ XI Не более 0,01%

Сульфатная зола и тяжелые металлы ГФХИ Не более 0,1% Не более 0,01%

Количественное определение ВЭЖХ Не менее 99,0%

Микробиологическая чистота ГФ XII Категория 2.2

Упаковка По 1,0; 2,0 и 5,0 кг в двойные пакеты из пленки полиэтиленовой. Для герметизации горловины пакетов запаивают сварным швом и вкладывают в мешок бумажный или в коробки из картона гофрированного

Маркировка В соответствии с ФСП

Транспортирова ние В соответствии с ГОСТ 17768-90Е

Хранение В защищенном от света месте

Срок годности 2 года

Таблица 13

СПЕЦИФИКАЦИЯ Медиборол таблетки 125 мг

Показатель Метод Норма

Описание Визуально Таблетки белого цвета, плоскоцилиндрической формы с фаской и риской.

Подлинность УФ- спектрофотометрия ВЭЖХ Ультрафиолетовый спектр поглощения 5-103% раствора препарата в спирте 95%, в области от 230 до 350 нм должен иметь максимум при 282нм±2нм. Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора (раздел «Количественное определение») должно соответствовать времени удерживания основного пика на хроматограмме раствора медиборола стандарта.

Средняя масса таблеток ГФ XI, вып.2, с.154 От 0,380 до 0,420 г.

Распадаемость ГФ XI, вып. 2, с. 154 Не более 15 мин

Растворение ГФ XI, вып.2, с.154 и ОФС 42-0003-04, спектрофотометрия в УФ-области Не менее 75% за 45 мин

Посторонние примеси тех Единичной примеси - не более 0,2 %

Количественное содержание_ ВЭЖХ От 0,1188 г до 0,1313 г (0,125±5,0%)

Микробиологическая чистота ГФ XII, с. 160 Категория ЗА

Упаковка По 10 таблеток, в контурную ячейковую упаковку. 3 упаковки в пачку картонную с инструкцией по применению

Маркировка В соответствии с ФСП

Транспортирование В соответствии с ГОСТ 17768-90Е

Хранение В защищенном от света месте |

Срок годности 2 года {

выводы

1. На основании изучения физических, химических и физико-химических свойств медиборола (4-метил-2,б-диизоборнилфенола), предложены параметры контроля качества субстанции медиборола.

2. УФ-спектр этанольного раствора медиборола имеет максимум поглощения при >.=282±2нм; в ИК-спектре медиборола наличие интенсивной полосы при 1459 см'1 и низкой интенсивности полосы поглощения бензольного кольца при 1605 см"1 характерно для экранированных фенолов с срти »-заместителями, что позволяет использовать методы УФ- и ИК-спектроскопии для стандартизации субстанции медиборола - определение подлинности и установления количественного содержания вещества.

3. Установлена валидность ВЭЖХ-методики определения посторонних примесей и-крезола и 4-метил-2-изоборнилфенола в субстанции медиборола в разработанных условиях хроматографического разделения с использованием колонки Zorbax Eclipse XDB С-18,5 мкм, размером 4,6x150 мм и УФ-детектора.

4. ВЭЖХ-методика количественного определения медиборола в субстанции и таблетках в условиях хроматографического разделения с использованием колонки Zorbax Eclipse XDB С-18, 5 мкм, размером 4,6x50 мм, подвижной фазы водагацетонитрил и УФ-детектора имеет относительную ошибку определения медиборола 1,6% для субстанции и 1,7% для таблетированной формы и удовлетворяет требованиям валидации.

5. Использование в тесте «Растворение» среды 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты с 95 % этанолом в соотношении 2:8 позволяет контролировать качество твердой лекарственной формы медиборола. Проведенные испытания показали, что таблетки «Медиборол 125 мг» удовлетворяют фармакопейным показателям качества твердой дозированной лекарственной формы.

6. Методом «ускоренного старения» и хранения в естественных условиях определены сроки годности субстанции и твердой дозированной лекарственной формы медиборола, которые составили не менее 2 лет.

7. На основании проведенных исследований составлены проекты фармакопейных статей предприятия на субстанцию и твердую дозированную лекарственную форму медиборола.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Краснов, Е. А. Разработка методик анализа нового пространственно-затрудненного фенола диборнола в качестве фармацевтической субстанции / Е. А. Краснов, Е. Е. Назмутдинова, И. С. Иванов, И. Ю. Чукичева, А. В. Кучин, М. Б. Плотников // Химико-фармацевтический журнал. - 2010. - Т. 44.- № И.-С. 53-56.

2. Назмутдинова, Е, Е. Определение посторонних примесей в субстанции диборнола методом ВЭЖХ / Е. Е. Назмутдинова, Е. А. Краснов, Е. Г. Струкова, А. А. Ефремов, М. Л. Белянин // Журнал Сибирского федерального университета. Химия. - 2010. - № 3. - С. 260-267.

3. Назмутдинова, Е. Е. Валидационные исследования ВЭЖХ-методики определения медиборола / Е. Е. Назмутдинова, Е. А. Краснов, Е. Г. Струкова, A.A. Ефремов//Фармация.-2011.-№3.-С. 6-8.

4. Назмутдинова, Е. Е. Разработка проекта фармакопейной статьи на субстанцию пространственно-затрудненного фенола / Е. Е. Назмутдинова // Тез. докл. на X конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2009. -С. 120-121.

5. Краснов, Е. А. К вопросу стандартизации нового антиоксиданта диборнола / Е. А. Краснов, Е. Е. Назмутдинова, И. Ю. Чукичева, А. В. Кучин, А. А. Ефремов, М. Б. Плотников // Тез. докл. На VII Всероссийскую конф. «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009». - Уфа, 2009. - С. 49-50.

6. Краснов, Е. А. Разработка лекарственной формы диборнола для лечения инсульта / Е. А. Краснов, Е. Е. Назмутдинова, Т. Г. Хоружая, В. А. Шелехова, И. Ю. Чукичева, А. В. Кучин // Тез. докл. на VIII Всероссийскую конф. «Химия и медицина». - Уфа, 2010. - С. 57.

7. Назмутдинова, Е. Е. Определение диборнола методом инверсионной вольтамперометрии / Е. Е. Назмутдинова, Е. А. Краснов, Е. В. Дорожко, Е. И. Короткова // Теория и практика электроаналитической химии: тезисы докладов симпозиума. - Томск, 2010. - С. 124-125.

8. Назмутдинова, Е. Е. Разработка ВЭЖХ-методики определения посторонних примесей в субстанции диборнола / Е. Е. Назмутдинова, Е. Г. Струкова, Е. А. Краснов, А. А. Ефремов // Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез: материалы Всероссийской конференции. - Краснодар, 2010. -С. 147.

9. Краснов, Е. А. Способ количественного определения диборнола / Е. А. Краснов, Е. Е. Назмутдинова, Е. В. Дорожко, Е. И. Короткова // Положительное решение от 30.05.2011 г. по приоритетной справке № 2010131815 от 28.07.2010 г.

Список сокращений

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ГФ - государственная фармакопея; ИВА - инверсионная вольтамперометрия; ИК - инфракрасный;

ПЗФ - пространственно-затрудненный фенол;

ПФ - подвижная фаза;

ПЭ - платиновый электрод;

РПЭ -ртутно-пленочный электрод;

PCO - рабочий стандартный образец;

СУЭ - стеклоуглеродный электрод;

ТСХ - тонкослойная хроматография;

УФ - ультрафиолетовый;

ФСП - фармакопейная статья предприятия;

ХМПЭ - химически-модифицированный платиновый электрод;

ХСЭ - хлоридсеребряный электрод.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность д.х.н, профессору Томского политехнического университета Е.И. Коротковой за помощь в проведении вольтамперометрического определения медиборола, д.х.н., профессору Сибирского федерального университета А.А. Ефремову за помощь в выполнении ВЭЖХ-анализа, д.х.н., профессору НИИОХ СО РАН Э.Э. Шульц за запись масс-спектров высокого разрешения.

Подписано в печать 23.06.2011 г. Усл.печ.листов 0.6. Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ № 233 Тираж 110 экземпляров