Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Нейропротекторная и антитромбогенная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола

На правах рукописи

А

ИВАНОВ ИВАН СЕРГЕЕВИЧ

НЕЙРОПРОТЕКТОРНАЯ И АНТИТРОМБОГЕБНАЯ АКТИВНОСТЬ 4-МЕТИЛ-2,6-ДИИЗОБОРНИЛФЕНОЛА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ . диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2009

003472056

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Плотников Марк Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Поветьева Татьяна Николаевна доктор биологических наук Новожеева Татьяна Петровна

Ведущее учреждении ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится "_" июня_2009 г. в "_" часов на заседании диссертационного совета Д.001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан" £ " мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нарушения мозгового кровообращения представляют собой важную медицинскую и социально-экономическую проблему. В России ежегодно инсульты переносят более, чем 450 тысяч человек. Около 50% из них умирают к концу года с момента заболевания (25% в течение первого месяца). Острые нарушения мозгового кровообращения занимают второе место среди причин смертности населения и первое место среди причин первичной инвалидности [Виленский Б.С., 2005; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001].

Недостаточно эффективное лечение острых и хронических расстройств кровообращения головного мозга ведет к ухудшению качества жизни пациентов, снижению социальной и семейной адаптации, повышению риска развития повторных острых нарушений мозгового кровообращения и, в конечном счете, к росту смертности и сокращению продолжительности жизни [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001].

Проблеме нарушений мозгового кровообращения посвящается большое количество научных публикаций, отражающих значительную динамику представлений о патогенезе расстройств мозгового кровообращения, различное отношение к тактике и стратегии профилактики, диагностики, лечения данной группы заболеваний. По-прежнему сложной и спорной остается проблема защиты клеток мозга от повреждающих воздействий при острой и хронической недостаточности мозгового кровообращения [Ginsberg M.D., 2008]. Несмотря на огромное количество работ, в настоящее время не существует ни одного средства с абсолютно доказанной эффективностью (нейропротекцией) при ишемии мозга [Ringleb P.A. et al., 2008].

Одним из основных и универсальных механизмов повреждения клеток ткани мозга в условиях нарушения мозгового кровообращения является окси-дантный стресс. Ввиду этого актуальным является применение в терапии нарушений мозгового кровообращения нейропротекторных средств, обеспечивающих метаболическую защиту головного мозга, к которым относятся антиокси-данты и антигипоксанты [Поварова О.В. и др., 2003; Суслина З.А. и др., 2007].

В Институте химии Коми НЦ УрО РАН синтезирован ряд производных о-изоборнилфенола, относящихся к группе пространственно-затрудненных фенолов, представители которой обладают высокой антиоксидантной активностью [Меньшикова Е.Б. и др., 2006].

Цель исследования: изыскание и изучение соединений, обладающих ней-ропротекторной и антитромбогенной активностью, в ряду производных о-изоборнилфенола.

Задачи исследования:

1. Провести скрининг в ряду производных о-изоборнилфенола с целью выявления соединения, обладающего высокой ангирадикальной, антигипоксиче-ской активностью и низкой токсичностью.

2. Исследовать нейропротекторную активность отобранного производного о-изоборнилфенола в условиях модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга.

3. Изучить механизмы нейропротекторной активности отобранного производного о-изоборнилфенола:

- влияние на процессы перекисного окисления липидов в ткани мозга;

- эффект на мозговой кровоток;

- влияние на реологические свойства крови.

4. Оценить антитромбогенную активность отобранного производного о-изоборнилфенола на модели внутрисосудистого тромбоза.

5. Изучить механизмы антитромбогенной активности отобранного производного о-изоборнилфенола:

- влияние на агрегацию тромбоцитов;

- влияние на антитромбоцитарную активность сосудистой стенки;

- эндотелийпротекторный эффект.

Научная новизна. Впервые в ряду новых полусинтетических производных о-изоборнилфенола выявлены соединения, обладающие антирадикальной, ан-тигипоксической активностью и низкой токсичностью.

Впервые установлено, что 4-метил-2,б-диизоборнилфенол обладает нейропротекторной активностью: повышает выживаемость после тотальной транзи-торной ишемии головного мозга и ускоряет восстановление неврологического статуса у животных.

Впервые показано, что в основе нейропротекторного действия 4-метил-2,6-диизоборнилфенола лежит его способность ингибировать процессы перекисного окисления липидов в ткани мозга, увеличивать мозговой кровоток и улучшать реологические свойства крови.

На модели артериального тромбоза у крыс впервые выявлена антитромбо-генная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, в основе которой лежит его способность снижать агрегацию тромбоцитов, повышать антитромбоцитарную активность сосудистой стенки и проявлять эндотелийпротекторный эффект.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты обосновывают целесообразность проведения клинических исследований 4-метил-2,6-диизоборнилфенола у больных с острыми и хроническими нарушениями мозгового кровообращения.

Результаты исследований 4-метил-2,6-диизоборнилфенола изложены в виде отчета по специфической активности и острой токсичности для предоставления в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения».

Публикации. По материалам проведенных исследований опубликовано 6 работ, из них 1 в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК.

Патенты. Патент № 2347561 «Средства, обладающие гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью». Патент № 2351321 «Средство, увеличивающее мозговой кровоток».

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 131 странице машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 262 источника, из них 91 на

иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 7 рисунками.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), VI Всероссийском семинаре с молодежной школой «Химия и медицина» (Уфа, 2007), VI международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 2007), IX конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008), V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008), симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 2008), IV Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (Москва, 2009).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на 55 беспородных крысах-самцах, 125 беспородных крысах-самках и 172 крысах-самцах Вистар массой 200-350 г, а также на 259 беспородных мышах обоего пола массой 18-22 г. Животных содержали на стандартном пищевом рационе вивария в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты проведены в соответствии с рекомендациями, изложенными в Приказе МЗ СССР за № 755 от 12 августа 1977 г., а также с использованием методик, не противоречащих принципам Европейской конвенции по защите животных 1986 г. Все болезненные процедуры проводили на наркотизированных животных. Эвтаназию проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» передозировкой эфирного наркоза.

В работе использованы образцы производных о-изоборнилфенола, изготовленные на опытном производстве Института химии Коми НЦ УрО РАН. Субстанции представляют собой кристаллические или мелкокристаллические порошки белого цвета.

Антирадикальные свойства производных о-изоборнилфенола оценивали спектрофотометрическим экспресс-методом in vitro [Починок Т.В. и др., 1985; Takebayashi J. et al., 2006]. В качестве стабильного свободного радикала использовали 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (ДФПГ). Оценивали полноту нейтрализации свободных радикалов (за 60 мин) и показатель ETso% значение времени (мин), за которое происходит уменьшение исходной оптической плотности на 50% [Починок Т.В. и др., 1985].

Моделирование острой гипобарической гипоксии осуществляли в герметичной камере с поглотителем С02 (30%-ный раствор КОН) при внешней температуре 20-22 °С и максимальном разрежении 170 мм рт.ст. Скорость подъема на высоту - 50 м/с [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005]. Регистрировали параметры: время жизни (с) на «смертельной площадке», которое отсчитывали от момента подъема на «площадку» до наступления летального исхода; выживаемость - по количеству животных, которое выдерживают пребывание на «смертельной

площадке» в течение 20 мин (в % от общего количества животных в группе). «Смертельная площадка» - разрежение, при котором гибнут все контрольные животные.

Модель тотальной транзиторной ишемии головного мозга (ИГМ) воспроизводили на беспородных крысах-самках по методу W.A. Pulsinelli и J.B. Brier-ley [1979]. Неврологический дефицит у животных определяли по шкале Stroke-index McGraw [McGraw С.Р., 1977] в нашей модификации. Оценку функционального состояния высшей нервной деятельности проводили на 1-е, 3-й, 5-е и 7-е сутки после создания модели тотальной транзиторной ИГМ, по следующим показателям: спонтанная двигательная активность (нормальная, повышенная или сниженная, отсутствие); расстройства походки (скованность, шаткость, замедленность движений, нарушение ориентации); рефлексы отдергивания хвоста, обеих передних и задних лап; реакция на звук; тремор; судороги; тонус мышц туловища и конечностей (нормальный, повышенный, отсутствие); признаки птоза (отсутствие, односторонний, двусторонний). Каждый показатель оценивали в баллах: 0 баллов - норма; 1 балл - умеренно выраженные изменения; 2 балла - резко выраженные изменения. Тяжесть состояния оценивалась по сумме соответствующих баллов. Кроме того, в каждой группе крыс определяли долю животных с тяжелыми неврологическими расстройствами (6 баллов и более), с нарушениями средней тяжести (3-5 баллов) и с легкими изменениями (до 2 баллов). Кроме того, на 1-е, 3-й, 5-е и 7-е сутки регистрировали выживаемость животных.

Модель неполной ИГМ у крыс воспроизводили под эфирным наркозом путем полной окклюзии левой сонной артерии и ограничения кровотока по правой сонной артерии на 50% от исходного значения [Плотников М.Б. и др., 1994].

Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли в гомогенате мозга крыс. Экстракцию липидов из гомогената проводили смесью гексан-изопропанол [Косухин А.Б., Ахметова Б.С., 1987]. Содержание диеновых (ДК) и триеновых конъюгатов (ТК) оценивали по характерным пикам поглощения при 232 нм и 275 нм соответственно и рассчитывали в единицах оптической плотности на 1 мг липидов. Измерение проводили на спектрофотометре Hitachi модель 557. Основания Шиффа (ОШ) определяли на спектрофлюориметре Hitachi модель 850 (Х.Возб=ЗбО нм и Х„сп=460 нм) [Tappel А., 1978]. Содержание ОШ рассчитывали в относительных единицах на 1 мг липидов. Содержание липидов определяли взвешиванием.

Системное артериальное давление (САД) регистрировали прямым методом с непрерывной записью на самописце. Мозговой кровоток (в мл/мин) оценивали методом электромагнитной флоуметрии по притоку крови к мозгу через общую сонную артерию с помощью прибора MFV-1100 фирмы Nihon Kohden.

В работе исследовали такие гемореологические показатели, как вязкость цельной крови, гематокрит, содержание фибриногена в плазме крови, вязкость плазмы, спонтанную агрегацию эритроцитов и их деформируемость. Вязкость цельной крови оценивали на ротационном вискозиметре АКР-2 в диапазоне скоростей сдвига от 3 до 300 с"1, плазмы - 300 с"1 [Парфенов А.С. и др., 1994]. Гематокрит определяли центрифугированием и выражали в %. Концентрацию

фибриногена в плазме оценивали методом тромбообразования Клаусса на коа-гулометре KG-4 фирмы Согшау с использованием набора реагентов «Фибриноген-тест» [Балуда В.П. и др., 1980]. Спонтанную агрегацию эритроцитов исследовали с помощью метода силлектометрии [Плотников М.Б. и др., 1995]. Критерием агрегационной активности эритроцитов служил полупериод агрегации Tía — время (с), за которое величина фотометрического сигнала снижается в два раза [Богоявленский В.Ф., 1981] Деформируемость эритроцитов оценивали методом лазерной дифрактометрии (эктацитометрии) [Evans Е., Mohandas N.,

1986]. Способность эритроцитов к деформации выражали в виде индекса, который рассчитывали как отношение (L-H)/(L+H), где L и Н - соответственно больший и меньший диаметры первого дифракционного максимума. Доступность кислорода для тканей оценивали по соотношению гематокрит/вязкость крови на высоких скоростях сдвига (50-300 с"1) [Stoltz J.F. et al., 1991].

Исследование антитромбогенной активности проводили в условиях модели внутрисосудистого тромбоза [Максименко А.В., Тищенко Е.Г., 1999].

Получение богатой и бедной тромбоцитами плазмы и подсчет числа тромбоцитов проводили стандартным методом [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001]. Амплитуду АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов оценивали в стандартизованной плазме (400±30 тыс. в 1 мм3 пробы) на приборе АТ-02 по методу, предложенному Born [Born G.V.R., 1962]. Агрегатограммы регистрировали с помощью самописца Recorder 2210.

Антитромбоцитарную активность сосудистой стенки оценивали по степени угнетения АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов [Балуда В.П. и др.,

1987].

Функциональное состояние эндотелия характеризовали коэффициентом эндотелиальной дисфункции (КЭД), который рассчитывали как отношение площади над кривой падения САД в ответ на внутривенное болюсное введение натрия нитропруссида (30 мкг/кг) к площади над кривой падения САД в ответ на введение ацетилхолина гидрохлорида (5 мкг/кг) [Тюренков И.Ю., Воронов А.В.,2008].

Оценку острой токсичности производных о-изоборнилфенола проводили на бодрствующих мышах и крысах обоего пола. Исследуемые образцы соединений вводили внутрижелудочно и внутрибрюшинно. Исследования проводили в соответствии с Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005].

Исследуемые производные о-изоборнилфенола и препараты сравнения вводили внутрижелудочно в виде суспензий в 2% крахмальной слизи. Животные контрольной группы, интактные и ложнооперированные (JIO) животные получали эквиобъемное количество 2% крахмальной слизи. При оценке влияния 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на показатели гемодинамики опытным животным субстанцию вводили подкожно в масляном растворе (миндальное масло), а контрольным животным - эквиобъемное количество миндального масла.

Забор проб цельной крови проводили из общей сонной артерии крыс. Для этого у животных под эфирным наркозом выделяли общую сонную артерию, сосуд перевязывали и проксимально вставляли тефлоновый катетер. Кровь стабилизировали 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 9:1.

В качестве наркозных средств использовали тиопентал-натрий и этаминал-натрий (60 мг/кг, внутрибрюшинно), уретан (1 г/кг, внутрибрюшинно), а также диэтиловый эфир.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 6.0». В таблицах представлены средние значения показателей и стандартные ошибки среднего значения. Нормальность распределения оценивали с помощью показателей асимметрии и эксцесса; достоверность различий (р<0,05) между сериями определяли с помощью теста Манна-Уитни, t-критерия Стьюдента и критерия х2- Для определения LD50 и ЕТ50% использовали пробит-анализ по методу Литчфилда-Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В экспериментах in vitro по оценке антирадикальной активности производных о-изоборнилфенола в сравнении с ионолом все исследуемые соединения проявили радикалсвязывающую активность. Снижение оптической плотности относительно ее исходного значения к 60 мин под действием 4-метил-2-изоборнилфенола, 2-метил-6-изоборнилфенола, о-изоборнилфенола, 4-метил-2,6-диизоборнилфенола и 2-(дибутиламино)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорида составило 59%, 82%, 8%, 89% и 51% соответственно, а для ионо-ла - 67% (рис. 1).

Показатель ETso% для 2-метил-6-изоборнилфенола, 4-метил-2,6-диизоборнилфенола был меньше, чем у ионола, в 4,5 и 6,8 раз соответственно. Нейтрализация радикалов ДФПГ под действием 4-метил-2-изоборнилфенола и 2-(дибутиламино)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорида происходила несколько медленнее: значение ETso% для этих соединений было больше значений для ионола в 1,2 и 2,1 раза соответственно. о-Изоборнилфенол проявлял настолько низкую антирадикальную активность, что вычисление для этого соединения ЕТ50% не представлялось возможным (табл. 1).

По выраженности антирадикальной активности исследуемые производные о-изоборнилфенола расположились в следующем порядке: 4-метил-2,6-диизоборнилфенол > 2-метил-6-изоборнилфенол > 4-метил-2-изоборнилфенол > 2-(дибутиламино)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорид > о-изоборнилфенол. При этом антирадикальный эффект 4-метил-2,6-диизоборнилфенола и 4-метил-2-изоборнилфенола значительно превосходил таковой у ионола.

Оценку антигипоксической активности проводили для соединений, проявивших умеренную и высокую антирадикальную активность in vitro. В качестве позитивного контроля использовали натрия оксибутират. Натрия оксибути-рат в сравнении с контролем увеличивал время жизни животных в 3,2 раза, при этом выживаемость составила 33% (рис. 2).

2-Метил-6-изоборнилфенол, 4-метил-2-изоборнилфенол и 2-(дибутилами-

100 П * * * * * * * * * * * * 1

90 -

80 -

70 -60 -50 -, V» «ч * * * * * * * * * 2

40 -30 -20 - * * * * * * * — 3 - 4 * 5

—■2— * * * * * * * в

10 -

0 Н 1 1 1 1 1 1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Рис. 1. Динамика оптической плотности раствора ДФПГ под влиянием производных о-изоборнилфенола и ионола. 1 — о-изоборнилфенол; 2-2-(дибутиламино)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорид; 3-4-метил-2-изоборнилфенол; 4 - ионол; 5 - 2-метил-6-изоборнилфенол; 6-4-метил-2,6-диизоборнилфенол. По оси ординат - оптическая плотность (%), по оси абсцисс - время (мин). *.— р<0,05 по сравнению с эффектом ионола.

Таблица 1

Значения показателя ЕТ50«/. для производных о-изоборнилфенола

Исследуемые ЕТт,мин

соединения

4-Метил-2-изоборнилфенол 32±3

2-Метил-б-изоборнилфенол 6±1*.

4-Метил-2,6-диизоборнилфенол 4±1*

о-Изоборнилфенол -

2-(Дибутиламйно)метил-4-метил-6- 57±1*

изоборнилфенола гидрохлорид

Ионол 27±1

Примечание: * -р<0,05 по сравнению с эффектом ионола.

но)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорид значимо не влияли на время жизни животных и их выживаемость в условиях острой гипобарической гипоксии, в то время как 4-метил-2,6-диизоборнилфенол увеличивал время жизни животных и их выживаемость на 35% и 13% соответственно в сравнении со значениями у контрольных животных (рис. 2).

Таким образом, среди исследуемых соединений только 4-метил-2,6-диизоборнилфенол проявляет антигипоксическую активность в условиях острой гипобарической гипоксии, уступая при этом натрию оксибутирату.

1000 800 600 400 200 0

I

Рис. 2. Время жизни (с) в условиях острой гипобарической гипоксии контрольных животных (1) и животных, получавших однократно внутрижелудочно натрия оксибутират (2), 4-метил-2-изоборнилфенол (3), 2-метил-б-изоборнилфенол (4), 4-метил-2,6-диизоборнилфенол (5) и 2-(дибутш1амино)метш1-4-метил-6-изоборнилфенола пвдрохлорид в дозах 300 мг/кг. + - р<0,05 по сравнению со значениями у контрольных животных.

В экспериментах по изучению острой токсичности соединений значения 1ЛЭ5о для 4-метил-2-изоборнилфенола при внутрибрюшинном и внутрижелу-дочном введении мышам составили: у самцов - 0,77±0,07 г/кг и 1,22±0,28 г/кг соответственно, у самок — 0,70±0,06 г/кг и 1,37±0,29 г/кг соответственно. Для 2-метил-6-изобррнилфенола значения ЬО50 при внутрибрюшинном и внутриже-лудочном введении мышам составили: у самцов - 1,31±0,16 г/кг и 6,41±1,9 г/кг соответственно, у самок — 1,14±0,14 г/кг и 6,41±1,9 г/кг соответственно. 2-(Дибутиламино)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорид вызвал гибель мышей-самцов только при внутрибрюшинном введении: значение и}50 было равно 5,71±1,43 г/кг. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол не вызывал смертности в

группах экспериментальных животных (мышей) при введении в максимально допустимом объеме для каждого из путей введения.

Для дальнейших исследований острой токсичности на другом виде животных (крысы) были отобраны наименее токсичные соединения: 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, 2-метил-6-изоборнилфенол и 2-(дибутиламино)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорид.

Значения LD30 для 2-метил-6-изоборнилфенола при внутрибрюшинном введении крысам составили: 1,51±0,34 г/кг у самцов и 1,34±0,28 г/кг у самок. При внутрижелудочном введении крысам-самкам 2-метил-6-изоборнилфенола LD50 было равно 5,76±2,04 г/кг. Для 4-метил-2,6-диизоборнилфенола и 2-(дибутиламино)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорида в группах крыс-самцов и крыс-самок ни при одном из способов введения в максимально допустимых объемах смертности достигнуть не удалось.

По токсичности исследуемые соединения можно расположить в следующий ряд: 4-метил-6-изоборнилфенол > 2-метил-6-изоборнилфенол > 2-(дибутиламино)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорид > 4-метил-2,6-диизоборнилфенол.

В результате исследований острой токсичности установлено, что 4-метил-2-изоборнилфенол относится к III классу опасности, а 2-метил-6-изоборнилфенол, 4-метил-2,6-диизоборнилфенол и 2-(дибутиламино)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорид - к IV классу опасности в соответствии с ГОСТ 12.1007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности». Проведенные исследования подтвердили низкую токсичность представителей пространственно-экранированных фенолов [Просенко А.Е. и др., 2006].

LDS0

Общая структура

т/кг А

6— 5— 4-3-2-1--

Рис. 3. Зависимость ЬО50 (внутрибрюшинное введение, мыши-самцы) от заместителя в ор/ло-положении у производных о-изоборнилфенола. # - значение для 4-метил-2,6-диизоборнилфенола не найдено и >5 г/кг.

Анализ полученных данных позволяет выдвинуть предположение о зависимости токсичности исследуемых соединений от степени экранирования фе-нольного гидроксила, которая характеризуется наличием различной природы заместителей в ор/ио-положениях фенольного кольца (рис. 3). Наименее токсичным представителем данных производных оказалось соединение 4-метил-2,б-диизоборнилфенол, у которого экранирование фенольного гидроксила осуществляется с помощью двух изоборнильных фрагментов, а наиболее токсичным - 4-метил-2-изоборнилфенол, имеющий самую низкую степень экранирования. Следует отметить, что значение 1ЛЭ50 для 2-метил-6-изоборнилфенола, 4-метил-2,б-диизоборнилфенола и 2-(дибутиламино)метил-4-метил-6-изоборнилфенола гидрохлорида значительно ниже, чем 1Л550 у их структурного аналога - ионола (2,2 г/кг у мышей, внутрижелудочно) [Зарудий Ф.С. и др., 2001].

В экспериментах по оценке антирадикальной, антигипоксической активности и острой токсичности выявлено наиболее перспективное соединение в ряду производных о-изоборнилфенола - 4-метил-2,6-диизоборнилфенол (диборнол), обладающий наиболее выраженной ангарадикальной, антигипоксической активностью и низкой токсичностью.

Нейропротекторную активность диборнола оценивали на модели тотальной транзиторной ИГМ. В первые 2-5 ч после воспроизведения ИГМ у крыс наблюдались наиболее тяжелые симптомы повреждения центральной нервной системы в виде арефлексии, судорог, спастического паралича конечностей, тонического напряжения мышц туловища, бокового положения.

К 1-м суткам после эпизода ИГМ в контрольной группе погибло 34% животных. Смертность в группе крыс, леченных диборнолом, была в 3 раза ниже и составила 11% (рис. 4). Несмотря на то, что к этому сроку наблюдения средний балл неврологического дефицита у выживших крыс обеих групп достоверно не различался (табл. 3), отмечена отчетливая тенденция к уменьшению под влиянием диборнола количества животных с тяжелыми неврологическими нарушениями (6 баллов и выше) и соответствующее достоверное увеличение количества животных со средней степенью неврологического дефицита (3-5 баллов) (табл. 4).

К 3-м суткам после тотальной транзиторной ИГМ в контроле смертность крыс достигала максимальных значений (41%) и в течение последующего периода наблюдения летальность не увеличивалась. В опытной группе гибель животных к этому сроку была существенно ниже (18%) и далее не изменялась. Структура тяжести неврологических расстройств у выживших животных контрольной и опытной групп к 3-м суткам была сходной (рис. 4).

В последующие сроки восстановление неврологического статуса у животных, леченных диборнолом, происходило более высокими темпами. Так, к 5-м и 7-м суткам средний балл неврологического дефицита в опытной группе был соответственно в 1,9 и 1,7 раза ниже значения у контрольных крыс. К 5-м суткам в данной группе отмечено достоверное снижение в 4 раза количества животных с тяжелым неврологическим дефицитом и увеличение в 2,2 раза числа крыс с легкими изменениями неврологического статуса (табл. 4).

100 90

80 70

1 2 3 4 5 6 7 суг

Рис. 4. Влияние курсового (7 суток) внутрижелудочного введения диборнола (100 мг/кг) на выживаемость животных (%) после тотальной транзиторной ишемии головного мозга. 1 — контроль (п=37); 2 - диборнол (п=33). Здесь и в таблицах 3 и 4: + — р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы.

Таблица 3

Влияние курсового (7 суток) внутрижелудочного введения диборнола (100 мг/кг) на средний балл неврологического дефицита крыс после тотальной транзиторной ишемии головного мозга

Группа животных 1-е сутки 3-й сутки 5-е сутки 7-е сутки

Контроль (п=37) 7,1±1,0 4,9±0,5 5,3±0,8 3,6±0,6

Диборнол (п=33) 6,1±0,8 4,2±0,6 2,8±0,4+ 1,9±0,3+

Таблица 4

Влияние курсового (7 суток) внутрижелудочного введения диборнола (100 мг/кг) на выраженность неврологического дефицита у крыс после тотальной транзиторной ишемии головного мозга (% от общего числа животных в группе)

Группа Степень неврологического 1-е 3-й 5-е 7-е

животных дефицита сутки сутки сутки сутки

Контроль Легкая (менее 2 баллов) 10,0 19,0 26,3 45,5

(п=37) Средняя (3-5 баллов) 20,0 38,1 31,6 31,8

Тяжелая (более 6 баллов) 70,0 42,9 42,1 22,7

Диборнол Легкая (менее 2 баллов) 5,3 35,0 57,9+ 66,7

(п=33) Средняя (3-5 баллов) 57,9+ 40,0 31,6 33,3

Тяжелая (более 6 баллов) 36,8+ 25,0 10,5+ 0+

Таким образом, в условиях модели тотальной транзиторной ИГМ диборнол проявлял выраженный нейропротекторный эффект, повышая выживаемость животных и ускоряя восстановление неврологического статуса.

Главным механизмом нейропротекторной активности «ловушек» свободных радикалов является способность ингибировать процессы ПОЛ [Ьуёеп Р., Wahlgren N.0., 2000]. Данную способность диборнола оценивали на модели неполной ИГМ, сопровождающейся активацией процессов ПОЛ. Так, после 5-дневной неполной ИГМ у крыс контрольной группы выявлено увеличение содержания в ткани мозга ДК, ТК и ОШ на 62%, 68% и 73% соответственно по сравнению с ЛО животными. Индекс окисления липидов мозга у крыс данной группы был выше на 14%, что значимо отличалось от аналогичного показателя ЛО крыс (рис. 5).

отн. ед.

0,2

0,15 -

0,05 -

I I Ложнооперированные Н Контроль I I Диборнол

Основания Шиффа

Индекс окисления липидов

Рис. 5. Влияние курсового (5 суток) внутрижелудочного введения диборнола (100 мг/кг) на содержание продуктов перекисного окисления липидов и индекс окисления липидов в мозговой ткани крыс с неполной ишемией головного мозга.

Здесь и в последующих рисунках и таблицах: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы.

Диборнол проявлял антиоксидантную активность, ограничивая накопление ДК, ТК и ОШ в ткани головного мозга в условиях неполной церебральной ишемии на 27%, 30% и 26% соответственно по сравнению со значениями в контрольной группе (рис. 5). Кроме того, диборнол снижал индекс окисления липидов на 11% по сравнению со значениями у контрольных животных.

Одним из основных направлений патогенетической терапии ишемических повреждений является улучшение перфузии ткани мозга. Реперфузия наиболее эффективна в течение первых 3-6 ч после инсульта [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; ЬапзЬе^М.й. е!а1., 2008].

В первой серии экспериментов исследовали влияние диборнола на мозговой кровоток при однократном подкожном введении. У животных контрольной группы наблюдалась тенденция к снижению САД в течение опыта. Величина мозгового кровотока в течение 1 ч была стабильной, а в последующие 30 мин

наблюдения отмечена незначительная тенденция к снижению. Наблюдаемые изменения, очевидно, отражают условия эксперимента (наличие операционной травмы и использование наркоза) (рис. 6).

Значения САД у крыс, получавших диборнол, в течение всего периода наблюдения достоверно не изменялись. Начиная с 5 мин после введения диборно-ла и до конца наблюдения, отмечен рост мозгового кровотока со стабилизацией на повышенном по сравнению с исходным уровне в период с 45 до 90 мин опыта. В период с 60 по 90 мин значения мозгового кровотока у крыс опытной группы были достоверно выше значений в группе контроля (рис. 6).

Мозговой кровоток

мл/мин 11

10

9

/

Системное артериальное давление

мм рт.ст. 125

95

80

65

50

0 5 10 15 30 45 60 75 90 мин 0 5 10 15 30 45 60 75 90 мин

Рис. 6. Влияние подкожного введения масляного раствора диборнола (100 мг/кг) на динамику мозгового кровотока и системного артериального давления. 1 - контроль; 2 - диборнол.

Таблица 5

Влияние курсового (3 суток) внутрижелудочного введения диборнола (100 мг/кг) на мозговой кровоток

Группа животных Мозговой кровоток, мл/мин

Контроль (п=5) 5,1±0,4

Диборнол (п=5) 7,0±0,6+

Во второй серии экспериментов исследовали влияние диборнола на мозговой кровоток при курсовом внутрижелудочном введении. Установлено, что дибор-

нол увеличивает мозговой кровоток на 37% по сравнению со значениями группы контроля (табл. 5).

Таким образом, диборнол как при однократном подкожном, так и при курсовом внутрижелудочном введении способен увеличивать мозговой кровоток.

Нарушения мозгового кровообращения сопровождаются синдромом повышенной вязкости крови (СПВК), который формируется в результате патологических изменений различных реологических показателей: повышения вязкости крови и плазмы, увеличения гематокрита и содержания фибриногена в плазме крови, гиперагрегации эритроцитов и ухудшения их деформируемости. Развитие СПВК приводит к расстройству микроциркуляции и ограничению доставки кислорода к тканям и органам [Сои11 В.М. е1 а1., 1991]. Кроме того, при ишемическом инсульте нарушения реологических свойств крови играют ключевую роль в формировании очагового поражения ткани мозга [Суслина З.А., 2001].

Гемореологическую активность диборнола исследовали на модели неполной ИГМ. На пятые сутки после создания модели неполной ИГМ у животных контрольной группы наблюдалось повышение вязкости крови во всем диапазоне скоростей сдвига на 14-51% по сравнению со значениями у ЛО животных (рис. 7). Очевидно, что в ухудшение вязкости крови вносит ощутимый вклад возрастание вязкости плазмы (в 1,2 раза), которое в свою очередь, вероятно, обусловлено повышенным содержанием в плазме крови фибриногена (в 1,9 раза) (рис. 8).

Рис. 7. Влияние курсового (5 суток) внутрижелудочного введения диборнола (100 мг/кг) на вязкость крови и доступность кислорода для тканей при разных скоростях сдвига у крыс с неполной ишемией головного мозга. 1 - ложноопе-рированные; 2 - контроль; 3 - диборнол.

Кроме вышеуказанных сдвигов макрореологических показателей, возрастание вязкости крови при неполной ИГМ у крыс было обусловлено и микрореологическими изменениями: повышением агрегации эритроцитов и ухудшением их деформируемости.

Гематокрит

мПа-с Вязкость плазмы 1,7

Рис. 8. Влияние курсового (5 суток) внутрижелудочного введения диборнола (100 мг/кг) на гематокрит, вязкость плазмы, содержание фибриногена и полупериод агрегации эритроцитов у крыс с неполной ишемией головного мозга. 1 -ложнооперированные; 2 - контроль; 3 - диборнол.

Рис. 9. Влияние курсового (5 суток) внутрижелудочного введения диборнола (100 мг/кг) на индекс деформируемости эритроцитов у крыс с неполной ишемией головного мозга. 1 - ложнооперированные; 2 - контроль; 3 - диборнол.

Так, повышение агрегационной активности эритроцитов выразилось в сокращении полупериода агрегации на 44% по сравнению со значениями JIO животных, что может быть отчасти обусловлено увеличением содержания в плазме крови фибриногена (коэффициент корреляции г=0,92; р<0,05) (рис. 8).

Об ухудшении деформируемости эритроцитов свидетельствовало снижение индекса их деформируемости во всем в исследуемом диапазоне скоростей сдвига на 23-26% относительно значений показателя у ЛО крыс (рис. 9).

Вышеописанные сдвиги исследуемых показателей в контрольной группе животных свидетельствуют о формировании СПВК. Это согласуется с данными о наличии этого синдрома у больных с острыми нарушениями мозгового кровообращения и у животных с моделями ИГМ [Плотников М.Б. и др., 1996; Sza-paryL.atel.,2004].

Ухудшение деформируемости и повышение способности эритроцитов к спонтанной агрегации негативно влияет как на вязкостные свойства крови, так и на основную функцию эритроцитов - обеспечение тканей кислородом [Stoltz J.F. et al., 1991]. У крыс с неполной ИГМ значения показателя, характеризующего доступность кислорода для тканей, были достоверно ниже по сравнению со значениями у ЛО животных (на 10-12%) (рис. 7).

Диборнол улучшал реологические свойства крови. При равных значениях гематокрита в опытной и контрольной группах, у животных, получавших диборнол, вязкость крови во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига была ниже на 8-30% по сравнению со значениями в контрольной группе (рис. 7). Снижение вязкости плазмы у крыс данной группы в сравнении с контролем коррелировало со снижением содержания фибриногена в плазме крови (г=0,86; р<0,05) (рис. 8). Под влиянием исследуемого соединения происходило отчетливое улучшение показателей микрореологии, о чем свидетельствует не только снижении агрегационной способности эритроцитов, но и улучшение их деформируемости. Индекс деформируемости эритроцитов у животных данной группы был больше на 14-22% по сравнению со значениями у контрольных крыс (рис. 9). Ослабление агрегации эритроцитов, проявившееся в повышении полупериода агрегации эритроцитов, коррелировало со сниженным содержанием фибриногена в плазме крови животных, получавших диборнол (г=0,94; р<0,05) (рис. 8). Значение показателя доступности кислорода для тканей было выше на 4-8% в сравнении с таковыми у животных контрольной группы (рис. 7).

Таким образом, диборнол способен проявлять гемореологические эффекты в условиях неполной ИГМ у крыс за счет влияния как на плазменные (фибриноген, вязкость плазмы), так и клеточные факторы реологии крови (деформируемость и агрегацию эритроцитов).

Атеротромбоз и тромбоэмболия сосудов являются основной причиной подавляющего большинства острых ишемический нарушений мозгового кровообращения [Суслина З.А. и др., 2006]. К тому же, важным в терапии инсульта является предотвращение реэмболий [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001].

На модели внутрисосудистого тромбоза, индуцированного железа хлоридом [Максименко A.B., Тищенко Е.Г., 1999], была оценена антитромбогенная активность диборнола в сравнении с пентоксифиллином.

У всех животных контрольной группы после воздействия на сосудистую стенку железа хлорида (II) происходила полная остановка кровотока по сонной артерии в среднем через 20±2 мин. Через сутки после окклюзии средняя масса тромба в стенозйрованных сосудах составляла 1,2±0,2 мг.

В группе крыс, получавших пентоксифиллин (5 суток внутрижелудочно, в дозе 400 мг/кг), полной остановки кровотока по сонной артерии в течение 90 мин после снятия аппликации железа хлорида (II) не наблюдалось, однако отмечалось снижение кровотока относительно исходного значения на 31±12%. На следующие сутки в просвете сонных артерий у крыс этой группы тромбов не обнаружено. Полученные результаты согласуются с данными о том, что применение пентоксифиллина уменьшает тромбообразование [КгирШзЫ К. й а1., 1992].

Диборнол при внутрижелудочном курсовом (5 суток) введении в дозе 100 мг/кг предотвращал падение кровотока в течение всего периода наблюдения и к 90-й мин его уровень составил 87% от исходного значения. Через сутки в просвете сонных артерий у крыс этой группы тромбов не обнаружено.

Таким образом, на модели внутрисосудистого тромбоза продемонстрирована антитромбогенная активность диборнола, которая по выраженности не уступает пентоксифиллину.

Для изучения механизмов антитромбогенного действия были выполнены эксперименты по оценке влияния диборнола на агрегацию тромбоцитов, анти-тромбоцитарную активность сосудистой стенки и функцию эндотелия в условиях модели неполной ИГМ.

В исследовании влияния диборнола на обратимую агрегацию тромбоцитов амплитуда АДФ-индуцированной агрегации (конечная концентрация АДФ 4-106 М) у интактных животных составила 28±1%.

Рис. 10. Влияние однократного внутрижелудочного введения диборнола (100 мг/кг) и пентоксифиллина (400 мг/кг) на амплитуду АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. 1 - интактные крысы; 2 - пентоксифиллин; 3 - диборнол. + - р<0,05 по сравнению со значениями у интактных животных.

После введения пентоксифиллина амплитуда агрегации была на 32% ниже аналогичного показателя у интактных крыс (рис. 10).

Диборнол вызывал снижение амплитуды АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов на 39% по сравнению со значениями у интактных животных (рис. 10).

Таким образом, диборнол способен снижать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов крыс. Эффект диборнола не уступает по выраженности анти-тромбоцитарному действию пентоксифиллина.

Изучение влияния диборнола на антйтромбоцитарную активность сосудистой стенки проводили в условиях неполной ИГМ. Исходная амплитуда необратимой агрегации тромбоцитов (индуктор'- АДФ в конечной концентрации 4-10"5 М) у ЛО животных составляла 41±2%. После инкубации сегмента брюшной аорты ЛО животных с богатой тромбоцитами плазмой ЛО крыс амплитуда агрегации уменьшилась до 7±1%, что было на 83% ниже значения до инкубации (табл. 6).

После инкубации богатой тромбоцитами плазмы ЛО животных с сегментом брюшной аорты крыс контрольной группы амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов составила 20±5%, что в 3 раза превышало показатель у ЛО животных. Следовательно, неполная ИГМ у крыс приводит к истощению антитромбоцитарной активности сосудистой стенки.

Амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов после инкубации сегмента брюшной аорты крыс с неполной ИГМ, получавших диборнол (5 суток внутрижелудочно, в дозе 100 мг/кг), составила 10±2%, то есть была на уровне значений, близких к норме (табл. 6). Данный факт свидетельствует о способности диборнола повышать антитромбоцитарную активность эндотелия аорты в условиях неполной ИГМ.

Таблица 6

Влияние инкубации сегмента брюшной аорты в богатой тромбоцитами плазме ложнооперированных животных на амплитуду АДФ-индуцированной (4-Ю 5 М) агрегации тромбоцитов

Группа животных Амплитуда агрегации тромбоцитов, %

До инкубации

Ложнооперированные (п=5) 41±2

После инкубации с сегментом аорты

Ложнооперированные (п=5) 7±1*

Ишемия головного . Контроль (п=5) 20±5**

мозга Диборнол (п=5) 10±2,+

Примечание:*- р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных до инкубации; * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных

животных после инкубации; + - р<0,05 по сравнению со значениями у контрольных животных после инкубации.

Большое значение в развитии сосудистых заболеваний головного мозга имеют не только структурные изменения церебрального сосудистого русла, но и нарушения функциональных свойств сосудистой стенки [Домашенко МЛ. и др., 2007].

Эндотелий, вырабатывая различные биологические вещества, принимает непосредственное участие в поддержании сосудистого тонуса, антитромбоген-ности сосудистой стенки, регуляции адгезии и агрегации тромбоцитов, проявляет про- и антикоагулянтную, фибринолитическую активность, участвует в процессах воспаления и ангиогенеза. Понятие «дисфункции эндотелия» включает в себя структурные и функциональные изменения, выражающиеся в неадекватном образовании в эндотелии биологически активных веществ [Петрищев Н.Н. и др., 2003]. Одним из патологических состояний, сопровождающихся эндотелиапьной дисфункцией, является ишемия головного мозга [Ваизова О.Е. и др., 2006; МаПшег-ЯеуеПез Б. е£ а1., 2008].

В экспериментах по оценке функционального состояния эндотелия у контрольных животных с неполной ИГМ КЭД составил 2,9±0,2, что на 38% превышало значение в группе ЛО крыс (табл. 7) и свидетельствовало о развитии у крыс с неполной ИГМ эндотелиальной дисфункции. Описанные изменения функции эндотелия согласуются с данными о формировании эндотелиальной дисфункции при ишемическом и реперфузионном повреждении тканей головного мозга у крыс [Магйпег-КеуеНеБ Б. й а!., 2008].

В группе крыс с неполной ИГМ, получавших диборнол, КЭД был меньше на 32%, чем показатель контрольной группы (табл. 7). Полученные результаты подтверждают наличие защитного действия диборнола в отношении эндотелия сосудов.

Таблица 7

Влияние курсового (5 суток) внутрижелудочного введения диборнола (100 мг/кг) на коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД, отн. ед.) у крыс с неполной ишемией головного мозга

Группа животных КЭД

Интактные (п=7) 2,2±0,2

Ложнооперированные (п=7) 2,1±0,1

Контроль (п=7) 2,9±0,2*

Диборнол (п=7) 2,2±0,2+

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных;

+ - р<0,05 по сравнению со значениями у контрольных животных.

Таким образом, среди производных о-изоборнилфенола в опытах in vitro и in vivo выбраны перспективные соединения, обладающие антирадикальной, ан-тигипоксической активностью и низкой токсичностью. На модели тотальной транзиторной ИГМ вьивлена нейропротекторная, а на модели внутрисосуди-стого тромбоза - антитромбогенная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (диборнола). Нейропротекторное действие диборнола является комплексным и обусловлено как нейронапьным (снижение интенсивности ПОЛ в мозговой ткани), так и экстранейрональными (повышение мозгового кровотока, улучшение реологических свойств крови) эффектами. В основе ан-титромбогенного действия диборнола лежит его способность снижать агрегацию тромбоцитов, повышать антитромбоцитарную активность сосудистой стенки и проявлять эндотелийпротекторный эффект.

Полученные данные позволяют рекомендовать диборнол для клинических j испытаний в качестве нейропротекторного средства в остром и реабилитационном периодах ишемического инсульта.

ВЫВОДЫ

1. Среди исследованных производных о-изоборнилфенола 4-метил-2,6-диизоборнилфенол и 2-метил-6-изоборнилфенол проявляют антирадикальную активность, превосходящую активность ионола, а 4-метил-2,6-диизоборнилфенол обладает умеренной антигипоксической активностью.

2. У исследованных производных о-изоборнилфенола установлена зависимость токсичности от степени экранирования фенольного гидроксила: увеличение степени экранирования фенольного гидроксила существенно снижает токсичность соединений.

3. На модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга 4-метил-2,6-диизоборнилфеноЛ при курсовом введении проявляет нейропротекторную активность, снижая гибель животных и ускоряя восстановление неврологического статуса.

4. Нейропротекторное действие 4-метил-2,6-диизоборнилфенола обусловлено его способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов в ткани мозга, увеличивать мозговой кровоток и улучшать реологические свойства крови.

5. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол при курсовом введении ослабляет выраженность синдрома повышенной вязкости крови: снижает вязкость крови и плазмы, содержание фибриногена в плазме крови, агрегацию эритроцитов и улучшает деформируемость эритроцитов, что способствует увеличению доступности кислорода для тканей.

6. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол при курсовом введении в условиях модели артериального тромбоза у крыс предотвращает тромбообразование за счет ослабления агрегации тромбоцитов, повышения антитромбоцитарной активности сосудистой стенки и эндотелийпротекторного эффекта.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Антитромбогенная и антитромбоцитарная активность производного о-изоборнилфенола // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008. - Т. 145, № 3. - С. 296-299 (соавт. Плотников М.Б., Смольякова В.И., Кучин A.B. и др.).

2. Связь структуры и токсичности в ряду производных изоборнилфенола // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: Материалы конференции / Под ред. В.В. Жданова. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2007. 7 С. 35-37.

3. Гемореологическая активность производных q-изоборнилфенола// Гемореоло-гия и микроциркуляция: Материалы международной конференции. -Ярославль: Изд-во ЯГПУ им. К.Д. Ушинского, 2007. - С. 160 (соавт. Плотников М.Б., Смольякова В.И., Кучин A.B. и др.).

4. Новые производные изоборнилфенола - основа для разработки средств профилактики и лечения тромбофилических состояний // Химия и медицина: Тезисы докладов VI Всероссийского научного семинара с Молодежной научной школой. - Уфа: Гилем, 2007. - С. 80-81 (соавт. Плотников М.Б., Смольякова В.И., Кучин A.B. и др.).

5. Влияние производного о-изоборнилфенола на показатели перекисного окисления липидов в тканях головного мозга при ишемии у крыс // Науки о человеке: Материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Ого-родовой, Л.В. Капилевича. - Томск: СибГМУ. - 2008. - С. 111-112 (соавт. Смольякова В.И.).

6. Пространственно-затруденные фенолы в предупреждении артериального тромбоза у крыс // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии: Материалы IV Всероссийской конференции. - М., 2009. -С. 386-387 (соавт. Плотников М.Б., Смольякова В.И., Чернышева Г.А. и др.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

ДК - диеновые конъюгаты

ДФПГ - 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил

ИГМ - ишемия головного мозга

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ОШ - основания Шиффа

ПОЛ - перекисное окисление липидов

САД - системное артериальное давление

СПВК - синдром повышенной вязкости крови

ТК - триеновые конъюгаты

■ I

»4 \ \

Отпечатано в ООО «Графика» 634050, Россия, г. Томск, ул. Беленца, 17 тел. (382-2) 52-65-15 Заказ №1594 от 29.04.2009 Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы. Нарушения мозгового кровообращения представляют собой важную медицинскую и социально-экономическую проблему. В России ежегодно инсульты переносят более, чем 450 тысяч человек. Около 50% из них умирают к концу года с момента заболевания (25% в течение первого месяца). Трудоспособными остаются лишь около 15% пациентов, остальные становятся инвалидами, нуждающимися в медико-социальной помощи до конца жизни. Численность этой категории пациентов в России превышает 1 млн. человек. Острые нарушения мозгового кровообращения занимают второе место среди причин смерти и первое место среди причин первичной инвалидности. Кроме того, в последние годы отмечен рост заболеваемости (в 3,3 раза) и смертности (в 1,3 раза) по сравнению с данными 70-х годов [35, 50] .

Недостаточно эффективное лечение острых и хронических расстройств кровообращения головного мозга ведет к ухудшению качества жизни пациентов, снижению социальной и семейной адаптации, повышению риска развития повторных острых нарушений мозгового кровообращения и, в конечном счете, к росту смертности и сокращению продолжительности жизни [50].

Проблеме нарушений мозгового кровообращения посвящается ежегодно большое количество научных публикаций, отражающих значительную динамику представлений о патогенезе расстройств мозгового кровообращения, различное отношение к тактике и стратегии профилактики, диагностики, лечения данной группы заболеваний. По-прежнему сложной и спорной остается проблема защиты клеток мозга от повреждающих воздействий при острой и хронической недостаточности мозгового кровообращения [205]. Несмотря на огромное количество работ, в настоящее время не существует ни одного средства с абсолютно доказанной эффективностью (нейропротекцией) при ишемии мозга [241] .

Одним из основных и универсальных механизмов повреждения клеток ткани мозга в условиях нарушения мозгового кровообращения является оксидантный стресс. Ввиду этого актуальным является применение в терапии нарушений мозгового кровообращения нейропротекторных средств, обеспечивающих метаболическую защиту головного мозга, к которым относятся антиок-сиданты и антигипоксанты [123, 147].

В институте химии Коми НЦ УрО РАН синтезирован ряд производных о-изоборнилфенола, относящихся к группе пространственно-затрудненных фенолов, представители которой обладают высокой антиоксидантной активностью [102].

Цель исследования: изыскание и изучение соединений, обладающих нейропротекторной и антитромбогенной активностью, в ряду производных о-изоборнилфенола.

Задачи исследования:

1. Провести скрининг в ряду производных о-изоборнилфенола с целью выявления соединения, обладающего высокой антирадикальной, антигипоксической активностью и низкой токсичностью.

2. Исследовать нейропротекторную активность отобранного производного о-изоборнилфенола в условиях модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга.

3. Изучить механизмы нейропротекторной активности отобранного производного о-изоборнилфенола:

- влияние на процессы перекисного окисления липидов в ткани мозга;

- эффект на мозговой кровоток;

- влияние на реологические свойства крови.

4. Оценить антитромбогенную активность отобранного производного о-изоборнилфенола на модели внутрисо-судистого тромбоза.

5. Изучить механизмы антитромбогенной активности отобранного производного о-изоборнилфенола:

- влияние на агрегацию тромбоцитов;

- влияние на антитромбоцитарную активность сосудистой стенки;

- эндотелийпротекторный эффект.

Научная новизна. Впервые в ряду новых полусинтетических производных о-изоборнилфенола выявлены соединения, обладающие антирадикальной, антигипоксической активностью и низкой токсичностью.

Впервые установлено, что 4-метил-2,б-диизоборнилфенол обладает нейропротекторной активностью: повышает выживаемость после тотальной транзиторной ишемии головного мозга и ускоряет восстановление неврологического статуса у животных .

Впервые показано, что в основе нейропротекторного действия 4-метил-2,б-диизоборнилфенола лежит его способность ин-гибировать процессы перекисного окисления липидов в ткани мозга, увеличивать мозговой кровоток и улучшать реологические свойства крови.

На модели артериального тромбоза у крыс впервые выявлена антитромбогенная активность 4-метил-2,б-диизоборнилфенола, в основе которой лежит его способность снижать агрегацию тромбоцитов, повышать антитромбоцитарную активность сосудистой стенки и проявлять эндотелийпротекторный эффект.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты обосновывают целесообразность проведения клинических исследований 4-метил-2,б-диизоборнилфенола у больных с острыми и хроническими нарушениями мозгового кровообращения.

Результаты исследований 4-метил-2,6-диизоборнилфенола изложены в виде отчета по специфической активности и острой токсичности для предоставления в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения».

Публикации. По материалам проведенных исследований опубликовано б работ, из них 1 в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК.

Патенты. Патент № 2347561 «Средства, обладающие геморео-логической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью». Патент № 2351321 «Средство, увеличивающее мозговой кровоток».

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 131 странице машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 2 62 источника, из них 91 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 7 рисунками.

97 ВЫВОДЫ

1. Среди исследованных производных о-изоборнилфенола 4-метил-2,б-диизоборнилфенол и 2-метил-б-изоборнилфенол проявляют антирадикальную активность, превосходящую активность ионола, а 4-метил-2,б-диизоборнилфенол обладает умеренной антигипоксической активностью.

2. У исследованных производных о-изоборнилфенола установлена зависимость токсичности от степени экранирования фенольного гидроксила: увеличение степени экранирования фенольного гидроксила существенно снижает токсичность соединений.

3. На модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга 4-метил-2,б-диизоборнилфенол при курсовом введении проявляет нейропротекторную активность, снижая гибель животных и ускоряя восстановление неврологического статуса .

4 . Нейропротекторное действие 4-метил-2,6диизоборнилфенола обусловлено его способностью ингиби-ровать процессы перекисного окисления липидов в ткани мозга, увеличивать мозговой кровоток и улучшать реологические свойства крови.

5. 4-Метил-2,б-диизоборнилфенол при курсовом введении ослабляет выраженность синдрома повышенной вязкости крови: снижает вязкость крови и плазмы, содержание фибриногена в плазме крови, агрегацию эритроцитов и улучшает деформируемость эритроцитов, что способствует увеличению доступности кислорода для тканей.

6. 4-Метил-2,б-диизоборнилфенол при курсовом введении в условиях модели артериального тромбоза у крыс предотвращает тромбообразование за счет ослабления агрегации

98 тромбоцитов, повышения антитромбоцитарной активности сосудистой стенки и эндотелийпротекторного эффекта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день в качестве нейропротекторов предложено достаточно большое число препаратов с различными механизмами действия [182, 205, 227]. Эффективность большинства из этих препаратов была продемонстрирована в эксперименте, но не была доказана в клинике [238, 258].

Нейрометаболические, функциональные и морфологические особенности нервной системы, многофакторность патогенеза, зональность и этапность ишемического повреждения создают чрезвычайно сложные условия для успешного использования препаратов нейропротекторного действия [50]. Клиническая неудача подавляющего большинства нейропротекторов обусловлена целым рядом объективных причин. Во-первых, сроки начала терапии в клинике, в отличие от эксперимента, оказываются в основной массе случаев за пределами так называемого терапевтического окна. Поэтому изменения, происходящие в тканях, значительно опережают по скорости применяемое воздействие [205, 258] . Во-вторых, особенностью нарушений мозгового кровообращения является значимый вклад реперфузии как в процесс сохранения клеток, так и в их повреждение. Отсутствие реперфузии предполагает, что очаг займет максимальный объем. К тому же, в условиях отсутствия кровотока затруднена или вообще невозможна доставка препарата к месту событий [174, 204, 229]. Восстановление же кровотока включает новые и усиливает старые механизмы повреждения [14] . В-третьих, ряд нейропротекторных средств по своим фармакологическим свойствам далек от идеального: не проникает через гематоэнцефалический барьер, не попадает в зону пенум-бры, не может развить свой эффект на уровне сосудистой стенки [204, 258]. В-четвертых, предшествующее ишемии повреждение мозга могло создать такие условия, при которых эффект нейропротекции может быть минимальным (сахарный диабет, высокая артериальная гипертензия) [225] . В-пятых, ише-мический инсульт - состояние гетерогенное не только по патогенезу, но и по локализации и размерам очагов поражения, что предполагает некоторую разницу в создавшихся при ишемии метаболических и гемодинамических условиях и, соответственно, потребностях (нейромедиаторные особенности различных областей мозга, особенности кровоснабжения) [204]. Наконец, особую сложность для оценки эффективности нейропротекторных средств в клинике, в отличие от эксперимента, представляет собой стандартизация групп исследуемых пациентов, адекватная рандомизация, обеспечивающая равномерное распределение признаков и случайных факторов. Проблему представляет собой также выбор оценки исходов заболевания [230, 243, 258].

В большинстве работ осуществляется своего рода моноподход к терапии нарушений мозгового кровообращения. Имеется очень небольшое количество публикаций, в которых представлены первые попытки применить нейропротекторы в определенной последовательности и дать такому применению патогенетическое обоснование [258] . Еще реже встречается комплексный подход в назначении нейропротектора (патогенетически обоснованная комбинация с остальной терапией, учет стадии повреждения головного мозга и перфузионных потребностей очага, сопутствующей патологии) [192, 205].

Недостаточное внимание уделялось до последнего времени и реперфузионному компоненту повреждения, однако, внедрение тромболизиса в неврологическую практику ведения больных с ишемическими нарушениями мозгового кровообращения и ранняя доставка больных в стационар позволяют существенно изменить и интенсифицировать существующие подходы к нейропротекции [222, 258].

Наряду с терапией острых нарушений мозгового кровообращения лечение хронической недостаточности мозгового кровообращения является серьезной проблемой для неврологов и терапевтов. Это патологическое состояние требует комплексного подхода к диагностике, лечению и назначению лекарственных препаратов, влияющих на различные звенья патогенеза дисцир-куляторной энцефалопатии: артериальную гипертензию, тромбо-филию, гипоперфузию мозговой ткани. В первую очередь, это средства, влияющие на систему гемостаза, гипотензивные препараты, вазодилататоры, нейрометаболические средства [139]. Наилучшим при выборе препарата является вариант сочетания нескольких свойств в одном лекарственном средстве [258]. Ожидаемые эффекты от подобных препаратов - это прямое и опосредованное улучшение микроциркуляции, улучшение метаболизма мозговой ткани, антиоксидантное и антиагрегантное действие. Многие средства, обладающие комплексным эффектом, реализуют свои воздействия опосредованно, нормализуя гомео-стаз нейронально-глиальных ансамблей или метаболизм на уровне эндотелиально-глиального взаимодействия [5 0] . Современные представления о многофакторности патогенеза, гетерогенности ишемического инсульта, внедрение новых методов лечения создают предпосылки для более взвешенного и доказательного подхода к проблеме нейропротекции при острой и хронической недостаточности мозгового кровообращения [258].

В последнее время оксидантный стресс рассматривается как один из ведущих факторов патогенеза нейродегенеративной патологии. Оксидантный стресс развивается в случае недостаточности системы антиоксидантной защиты при резком усилении окислительных процессов [102, 147].

Особая опасность развития оксидантного стресса в центральной нервной системе определяется значительной интенсивностью окислительного метаболизма мозга, составляющего 2% от общей массы человека, а утилизирующего до 20-25% всего потребляемого кислорода [13]. Интенсивность потребления кислорода нейронами в десятки раз превышает потребности других клеток и тканей (350-450 мкл 02/г в 1 мин по сравнению с 70-90 мкл 02/г в 1 мин для сердца, 1,6-2,4 мкл 02/г в 1 мин для скелетных мышц) [13, 65]. Дополнительными факторами развития оксидантного стресса в ткани мозга является высокое содержание в ней липидов (50% сухого вещества), ненасыщенные связи которых являются субстратом для ПОЛ; ас-корбата (в 100 раз больше, чем в периферической крови) , при определенных условиях способного участвовать в качестве прооксиданта в неферментативных процессах ПОЛ. Активность ферментативных антиоксидантных систем (каталазы, глутатион-пероксидазы) в мозге значительно ниже, чем в других тканях, что еще больше повышает риск развития оксидантного стресса [50] .

Одним из первых повреждающих агентов, образование которого интенсивно происходит в условиях оксидантного стресса, является суперкоксид-радикал. Дальнейшее развитие последовательных реакций с его участием по Haber-Weiss приводит к появлению особенно активных гидроксил-радикалов, перекиси водорода и пероксинитрита [2 08].

Высокореакционноспособные радикалы кислорода вызывают окисление биомолекул, а также инициируют цепные процессы перекисного окисления в мембранных липидах [186, 226], прямое окислительное повреждение нуклеиновых кислот и белков [17 6, 216]. В связи с этим важным является своевременная нейтрализация повреждающих интермедиатов кислорода.

Исходя из этих представлений первым этапом исследований явилось оценка способности испытуемых соединений нейтрализовать свободные радикалы. В экспериментах in vitro было установлено, что наиболее выраженную антирадикальную активность среди исследуемых производных о-изоборнилфенола проявляет 4-метил-2,6-диизоборнилфенол. При этом полнота нейтрализации свободных стабильных радикалов 4-метил-2,6-диизоборнилфенолом превосходит таковую у ионола и сам процесс нейтрализации протекает более интенсивно.

Высокая антирадикальная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола обусловлена наличием объемных заместителей в орто-положении фенольного кольца - изоборнильных групп и необъемного в пара-положении, представленного ме-тильной группой, что согласуется с представлениями о влиянии орто- и пара-заместителей фенольного кольца на выраженность антирадикальной активности [102, 141].

Развитию оксидантного стресса в условиях ишемического повреждения предшествуют нарушения кровообращения в мозге. Снижение перфузии ткани мозга сопровождается уменьшенной доставкой кислорода для тканей из кровеносного русла клеткам, где он участвует в реакциях аэробного образования энергии, так как является субстратом терминального фермента митохондриальной дыхательной цепи - цитохромоксидазы. Результатом этих процессов является гипоксическое состояние, представляющее собой сложный фазный процесс, в основе которого лежат последовательные изменения свойств митохондри-ального ферментативного комплекса [131].

Применение средств, позволяющих снизить энергозатраты и уменьшить выраженность постгипоксических церебральных функционально-морфологических расстройств, является одним из наиболее важных методов первичной и вторичной нейропротек-ции [1, 87, 156].

Учитывая важность антигипоксической терапии в условиях ишемических повреждений головного мозга, было проведено исследование по оценке антигипоксической активности производных о-изоборнилфенола на модели острой гипобарической гипоксии. В результате было установлено, что именно 4-метил-2,6-диизоборнилфенол обладает антигипоксической активностью, повышая резистентность организма к кислородной недостаточности .

Необходимо отметить, что за последние годы значительно изменились критерии, предъявляемые к исследуемым соединениям - потенциальным лекарственным средствам. Внимание исследователей все больше направлено на поиск эффективных лекарственных средств, обладающих низкой токсичностью и широким диапазоном терапевтического действия [180, 187] . Кроме того, основным фактором прекращения клинических испытаний большинства наиболее эффективных нейропротекторов является широкий спектр серьезных побочных явлений [50].

Принимая во внимание данный факт, уже на первых этапах исследования активности производных о-изоборнилфенола была проведена оценка их острой токсичности. Это позволило уже на стадии скриннинговых испытаний выявить наиболее токсичные соединения и отобрать наименее токсичное для дальнейших исследований. Самым низкотоксичным (IV класс опасности) оказался 4-метил-2,б-диизоборнилфенол, для этого соединения ни при одном из способов введения в максимально допустимых объемах смертности достигнуть не удалось. Проведенные исследования также позволили выявить определенную закономерность, а именно зависимость токсичности от степени экранирования фенольного гидроксила у производных о-изоборнилфенола. Увеличение степени экранирования фенольного гидроксила существенно снижает токсичность соединений.

Таким образом, по результатам скрининга для дальнейших углубленных исследований потенциального нейропротектора было отобрано соединение - 4-метил-2,б-диизоборнилфенол, обладающее высокой антирадикальной активностью, антигипокси-ческим эффектом и низкой токсичностью.

В 80-х годах было установлено, что в самом раннем периоде острой фокальной ишемии мозга целесообразно использовать «ловушки» свободных радикалов и препараты, разрушающие перекиси. Вслед за этим было рекомендовано назначение токоферолов и каро-тиноидов, связывающих катализаторы и инактивирующих синглетный кислород. Однако в последствие при специальном изучении вклада этих препаратов в общий результат лечения, не выявлено их выраженного нейропротективного действия [195, 204, 241].

В экспериментальных исследованиях доказано наличие нейро-протекторных свойств у соединений, связывающих свободные радикалы, - достоверное уменьшение размеров инфаркта мозга на фоне их применения, что обосновывает необходимость дальнейших доклинических и клинических испытаний «ловушек» свободных радикалов [206, 223, 261].

Большое значение таким соединениям придается при вторичной нейропротекции, которая может быть начата относительно поздно -через 6-12 ч после сосудистого инцидента и должна быть наиболее интенсивной на протяжении первых 7 суток заболевания. Значимым при вторичной нейропротекции является использование подходов направленного прерывания отсроченных механизмов смерти клеток (отдаленных последствий ишемии): избыточного синтеза оксида азота, оксидантного стресса; активации микроглии и связанных с ней дисбаланса цитокинов, иммунных сдвигов, локального воспаления, нарушений микроциркуляции и гематоэнцефалического барьера; трофической дисфункции и апоптоза. Важно отменить не только терапевтическую значимость такой терапии, но и профилактическую. Коррекция отдаленных последствий ишемии приводит к замедлению развития церебрального атеросклероза и энцефалопатий в постинсультном периоде [50].

В исследованиях по оценки эффективности 4-метил-2,6-диизоборнилфенола, как нейропротектора, использовали модель тотальной транзиторной ишемии головного мозга у крыс. В условиях данной модели 4-метил-2,6-диизоборнилфенол повышал выживаемость в постишемический период и ускорял восстановление неврологического статуса животных. Эти результаты свидетельствуют о выраженной нейропротекторной активности 4-метил-2,б-диизоборнилфенола.

Одним из главных нейропротекторных механизмов «ловушек» свободных радикалов является ингибирование процессов ПОЛ в ткани мозга [227] , так как продукты ПОЛ представляют собой высокотоксичные соединения (диеновые и триеновые конъюгаты, основания Шиффа), которые оказывают повреждающее действие на мембраны и клеточные структуры [64]. Как следствие воздействия свободных радикалов и продуктов ПОЛ обнаруживаются сшивки биополимеров, явления набухания митохондрий и разобщения окислительного фосфолирирования, инактивация тиоловых ферментов, участвующих в дыхании и гликолизе, дальнейшее разрушение липидной основы мембран [65].

На модели неполной ишемии головного мозга, сопровождающейся оксидантным стрессом, 4-метил-2,6-диизоборнилфенол проявлял отчетливый антиоксидантный эффект, достоверно ограничивая накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Вместе с тем выявленная тенденция к возрастанию уровня а-токоферола в ткани ишемизированного мозга у животных, получавших 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, трудно объяснима. Сведения о изменении уровня а-токоферола в условиях церебральной ишемии противоречивы и неоднозначны. Известно, что в разных органах и разных участках ишемизированной ткани мозга изменение содержания а-токоферола происходит по-разному [14, 40, 204, 256]. Так, C.V. Chang и соавторы утверждают, что низкий уровень а-токоферола и каротиноидов в плазме крови сохраняется лишь в первые 24 ч после инсульта [188]. В отсроченный период после ишемического повреждения возможно восстановление уровня витамина Е [18 9], что, по-видимому, и наблюдали в контрольной группе животных.

Одним из основных направлений патогенетической терапии ишемических повреждений является улучшение перфузии ткани мозга [50, 174, 229] . Реперфузия наиболее эффективна на ранних стадиях развития инсульта. Однако известно, что даже через 5 мин после инсульта массивное возвращение крови в ишемизированную зону через включившиеся коллатерали или ре-васкуляризированный участок артерии не приводит к полной нормализации мозгового кровотока [50]. Чем длительнее доре-перфузионный период, тем меньше шанс быстро нормализовать ми кр о циркуляцию в ишемизированной зоне и тем выше риск дополнительного реперфузионного повреждения церебральной ткани: оксидантного, обусловленного включением кислорода в процесс свободнорадикального окисления, и осмотического, вызванного нарастанием цитотоксического отека вследствие избытка воды, осмотически активных веществ [179, 200, 224] . Целесообразность терапевтической реперфузии сохраняется в пределах 3-6 ч. Характер реперфузинной терапии определяется патогенетическими вариантом развития инсульта [193, 221] .

Поэтому важным было оценить способность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола увеличивать мозговой кровоток. Было установлено, что 4-метил-2,б-диизоборнилфенол как при однократном подкожном, так и при курсовом внутрижелудочном введении увеличивает мозговой кровоток, причем, не оказывая существенного влияния на системное артериальное давление. Необходимо отметить, что большинство используемых средств, увеличивающих мозговой кровоток, снижают артериальное давление [93] . Следовательно, можно предположить, что 4-метил-2,6-диизоборнилфенол проявляет свойства избирательного церебрального вазодилататора.

Нарушения мозгового кровообращения, сопровождаются синдромом повышенной вязкости крови (СПВК), о чем свидетельствуют данные экспериментальных и клинических исследований [33, 49, 191].

СПВК формируется в результате патологических изменений различных реологических показателей: повышения вязкости крови и плазмы, увеличения гематокрита, гиперфибриногене-мии, гиперагрегации эритроцитов и ухучшения их деформируемости [24 0, 24 8]. Развитие СПВК вызывает замедление потока крови, приводит к расстройству микроциркуляции, повышению общего периферического сопротивления и ограничению доставки кислорода к тканям и органам [249]. Наличие СПВК у больных повышает риск тромбообразования [183].

Кроме того, при ишемическом инсульте по типу гемореоло-гической микроокклюзии, эти нарушения (гиперфибриногенемия, повышение вязкости крови, увеличение агрегационной активности форменных элементов крови) играют ключевую роль в формировании очагового поражения мозга [145] .

Известно, что ряд соединений из группы пространственно-затрудненных фенолов и другие антиоксиданты, способны проявлять гемореологическую активность, воздействуя на разные реологические факторы [68, 121, 237].

На выбранной нами модели ишемии головного мозга, адекватно отражающей сдвиги основных гемореологических показателей при нарушении мозгового кровообращения [33], было установлено, что 4-метил-2,6-диизоборнилфенол ослабляет выраженность СПВК, снижая содержание фибриногена в плазме крови и ее вязкость, улучшая деформируемость эритроцитов и снижая их агрегацию в условиях неполной ишемии головного мозга у крыс. Наблюдаемые изменения реологических свойств крови у животных, получавших 4-метил-2,6-диизоборнилфенол, способствовали увеличению доступности кислорода для тканей.

Атеротромбоз и тромбоэмболия сосудов являются основной причиной подавляющего большинства острых ишемических нарушений мозгового кровообращения [146]. Установлено, что в общей структуре развития ишемических нарушений мозгового кровообращения эмболический механизм является превалирующим и по данным разных авторов составляет от 50 до 90% [112, 185]. К тому же, важным в терапии инсульта является предотвращение реэмболий [50]. Недаром борьба с тромбозами является одной из важнейших задач медицины XXI века [145] . В связи с этим целесообразным являлось исследование антитром-богенной активности 4-метил-2,б-диизоборнилфенола.

В используемой нами модели тромб в артерии формируется в результате свободнорадикального повреждения сосудистой стенки [91]. Обработка сосуда железа хлоридом (II) локально активирует процессы перекисного окисления липидов, вследствие чего накапливаются липидные перекиси. Высокий уровень липидных перекисей может подавлять синтез простациклина эндотелием сосудистой стенки, вызывая сдвиг равновесия ПГ12/ТХА2 в сторону увеличения тромбоксана [38], который является сильным индуктором агрегации тромбоцитов и сосудосуживающим фактором. Повышение его уровня создает условия для активации тромбоцитарного звена и формирования артериального тромба [233].

4-Метил-2,б-диизоборнилфенол при курсовом внутрижелудоч-ном введении полностью предотвращал тромбообразование. Наблюдаемая антитромбогенная активность производного о-изоборнилфенола может быть обусловлена его антиоксидантными свойствами, благодаря чему ослабляется накопление липидных перекисей в сосудистой стенке и, как следствие, подавляются процессы тромбообразования.

С другой стороны 4-метил-2,б-диизоборнилфенол проявлял антитромбоцитарный эффект, подавляя АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов, и повышал антитромбоцитарную активность сосудистой стенки. Это особенно важно, учитывая то, что нарушения мозгового кровообращения, сопровождаются сниженной антитромбоцитарной активностью эндотелия сосудистой стенки и повышенным риском тромбообразования [116, 148].

Таким образом, большое значение в развитии сосудистых заболеваний головного мозга имеют не только структурные изменения церебрального сосудистого русла, но и нарушения функциональных свойств сосудистой стенки [55] .

Эндотелий, вырабатывая различные биологические вещества, принимает непосредственное участие в поддержании сосудистого тонуса, антитромбогенности сосудистой стенки, регуляции адгезии и агрегации тромбоцитов, проявляет про- и антикоа-гулянтную, фибринолитическую активность, участвует в процессах воспаления и ангиогенеза [54, 257]. Находясь в непосредственном контакте с кровью, эндотелий получает сигналы как гуморальным путем, так и при непосредственном взаимодействии клеток крови с чувствительными структурами эндоте-лиоцитов и при изменении напряжении сдвига.

Понятие «дисфункции эндотелия» включает в себя структурные и функциональные изменения, выражающиеся в неадекватном образовании в эндотелии различных веществ. В более узком смысле зачастую представляют эндотелиальную дисфункцию, как недостаточную продукцию оксида азота, поскольку он принимает участие в регуляции практически всех функций эндотелия и наиболее чувствителен к повреждению [54, 219, 257].

Одним из патологических состояний, сопровождающихся эн-дотелиальной дисфункцией, является ишемия головного мозга. Нарушения функции эндотелия при ишемии наблюдаются у больных, а также воспроизводится на моделях [29, 55, 228] .

4-Метил-2,6-диизоборнилфенол способен проявлять эндоте-лийпроекторную активность, снижая выраженность эндотелиаль-ной дисфункции в условиях ишемии головного мозга.

96

Таким образом, среди производных о-изоборнилфенола в опытах in vitro и in vivo выбраны перспективные соединения, обладающие антирадикальной, антигипоксической активностью и низкой токсичностью. На модели тотальной транзиторной ИГМ выявлена нейропротекторная, а на модели внутрисосудистого тромбоза - антитромбогенная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (диборнола). Нейропротекторное действие диборнола является комплексным и обусловлено как нейрональ-ным (снижение интенсивности ПОЛ в мозговой ткани), так и экстранейрональными (повышение мозгового кровотока, улучшение реологических свойств крови) эффектами. В основе анти-тромбогенного действия диборнола лежит его способность снижать агрегацию тромбоцитов, повышать антитромбоцитарную активность сосудистой стенки и проявлять эндотелийпротектор-ный эффект.

Полученные данные позволяют рекомендовать диборнол для клинических испытаний в качестве нейропротекторного средства в остром и реабилитационном периодах ишемического инсульта .