Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:К вопросу о механизме действия бета-ацетил-, бета-метил-дигоксинов, строфантинов K и G на систему контрактильных белков миокарда в норме и при недостаточности сердца

Р Г Б О Д На правах рукописи

1 3 Шй 139В

КАРСАНОВ ВАСИЛИЙ НИКОЛАЕВИЧ

К ВОПРОСУ О МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ БЕТА-АЦЕТИЛ-, БЕТА-МЕТИЛ-ДИГОКСИНОВ, СТРОФАНТИНОВ КИС НА СИСТЕМУ КОНТРАКТИЛЬНЫХ БЕЛКОВ МИОКАРДА В НОРМЕ И ПРИ НЕДОСТАТОЧНОСТИ СЕРДЦА

14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА, 1996

Работа выполнена в Республиканском научно-исследовательском центре медицинской биофизики Минздрава Республики Грузия

Научные руководители:

академик АМН РГ, профессор Г. С. Турманаули

кандидат биологических наук, Г.В. Сукоян

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Н.В. Каверина

доктор медицинских наук, профессор Г.Я. Шварц

Ведущее учреждение: Российский государственный медицинский

университет Минздравмедпрома России

Защита состоится "_"_ 1996 года в_'

на заседании диссертационного совета Д 001.25.01 в НИИ

фармакологии РАМН

/125315 Москва, Балтийская ул. 8/

С диссертацией можно ознакомиться в научной части института Автореферат разослан "_"_ 1996 года

Ученый секретарь диссертационного совета

канд. мед. наук Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на более чем 220-летний опыт применения сердечных гликозидов (СГ) в лечебной практике, механизм их действия оставался неизвестным и развитие терапевтической тактики происходило эмпирически. Более того в последние годы поставлено под сомнение даже терапевтическая ценность дигиталиса в лечении недостаточности сердца (HC) (Fleg и соавт., 1982; Taggart и соавт., 1983; Packer и соавт., 1993).

Из всех гипотез молекулярного механизма действия СГ наиболее широкое признание получила гипотеза угнетения JVa^Ä*-АТФазы сарколеммы, которое через цепочку взаимозависимых процессов приводит к повышению Ca в саркоплазме и активации генерации силы исполнительным аппаратом, системой контрактильных белков (Repke и соавт., 1965; Langer и соавт., 1972; Charlemagne и соавт., 1993). И это несмотря на то, что убедительно доказать справедливость этой гипотезы не удалось. Наоборот, было показано, что терапевтические концентрации СГ, вызывающие положительный инотропный эффект, Na+,K^-АТФазу не угнетают (Erdman и соавт., 1980; Adams и соавт., 1982; Finet и соавт., 1982) и даже активируют ее (Aceto & Vassalle, 1993). Это противоречит гипотезе угнетения Na+,тС+-АТФазы. Smith & Braunwald (1980) считают, что угнетение Na+, А^-АТФазы - механизм токсического действия СГ. Следовательно, для объяснения положительного ино-тропного действия СГ необходимо искать другой молекулярный механизм.

Ранее было показано, что ß-ацетилдигоксин (рАД) и строфантин К (CK) оказывают непосредственное действие на систему контрактильных белков нормального миокарда (Н.В. Карсанов, Э.И. Гучуа, 1984; Н.В. Карсанов и соавт., 1989, 1992) и миокарда при НС (Н.В. Карсанов и соавт., 1990). Более того установлено, что механизм инотропного действия этих СГ включает повышение термодинамической и механической эффективности сократительного процесса. Эти результаты позволили дополнить объяснение действия СГ in vivo на экономичность сократительного процесса через урежение частоты сердечных сокращений, увеличение скорости сокращения миокарда и более полного изгнания крови из хамер сердца (В.В. Гацура, А.Н. Кудрин, 1983) четвертым важным механизмом, механизмом повышения эффективности использования энергии, экономичности преобразования химической энергии з механическую энергию в системе контрактильных белков мио-сарда.

Цель работы. Выяснить молекулярный механизм действия СГ на систему контрактильных белков миокарда в норме и при НС; установить целевую зону действия СГ в актомиозиновом ансамбле (AMA).

Научная новизна. Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие, что рАД, р-метилдигоксин (рМД) и СК в отличие от оуабаина оказывают воздействие на структуру (конформацию) и функциональную активность AMA - повышают величину и скорость генерации силы, интенсивность гидролиза АТФ и экономичность преобразования энергии. Установлены оптимальные концентрации и диапазоны биологической активности рАД, рМД, СК, дигоксина, К-строфантозида, амринона и милри-нона на систему контрактильных белков нормального миокарда.

Впервые продемонстрировано, что РАД, рМД и СК повышают Сг-чувствительность системы контрактильных белков нормального миокарда, при ранней НС при окклюзии коронарной артерии (ОКА) и нормализуют ее при тяжелой НС, обусловленной токсико-аллергическим миокардитом (ТАМ). Впервые показано, что рАД, рМД и СК в норме и при НС увеличивают кооператив-ность функционирования СВМ, тонкой нити. Установлено, что оуабаин ни на ¿^-чувствительность, ни на кооперативность СВМ, не содержащих функционально активные мембранные структуры не действует. Впервые показано, что в системе контрактильных белков тонкая нить, ее основной белок актин, является местом приложения действия СГ. В пользу этого свидетельствует и установленное в работе изменение конформационного состояния актина, по крайней мере, его С-концевой области, как в случае нормального миокарда, так и при НС.

Практическая значимость. Работа вносит большой вклад в развитие биофизической фармакологии, в частности в изучение механизма действия СГ, применение которых по сути и сегодня остается экспериментом у постели больного. Применение биофизических методов исследования позволило автору идентифицировать рецептор СГ в системе контрактильных белков и обосновать дифференцированное применение ряда СГ в лечении НС. Автор впервые на субклеточно. - молекулярном уровне обосновывает и подчеркивает роль СГ не только в стимуляции сократительного процесса, но и в диссоциации AMA, в расслаблении системы контрактильных белков, нарушение которого и подходы к его коррекции имеют большое значение в патогенезе НС.

-г-

Реализация результатов работы: Полученные данные использованы при разработке нового кардиотонического препарата "Рефрактерина", который сегодня проходит клинические испытания в клиниках РФ.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 15 февраля 1996 г на совместном заседании Республикан-

ского научно-исследовательского центра медицинской биофизики Минздрава РГ, лаборатории биофизики НИИ экспериментальной и клинической терапии и отдела фармакотерапии НИИ клинической и экспериментальной кардиологии им. акад. М.Д. Цинамзгваришвили Минздрава РГ. Диссертация рекомендована к защите.

Материалы диссертации доложены на Всесоюзной студенческой конференции, 1986; заседаниях общества медицинских биофизиков РГ, 1994-1995; конгрессе "Человек и лекарство", 1996.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на

_ страницах, состоит из введения, глав посвященных обзору

литературы, описанию материалов и методов работы, собственных результатов их обсуждения и выводов. Список цитируемой литературы содержит _ работ, опубликованных в печати РФ, стран

СНГ и_зарубежных источников. Работа содержит_таблицы и_рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проведена на изолированной системе контрактильных белков, пучках глицеринизированных волокон миокарда (ПГВМ), скицированных волокнах миокарда (СВМ) и реконструированных волокнах миокарда (РВМ), образованных из теневых волокон (ТВМ) и миозина, а также на актине и миозине миокарда нормальных животных и животных с НС, обусловленной токсико-аллергическим миокардитом 10 - дневной продолжительности (ТАМюдп) и ранней НС, развившейся в связи с окклюзией коронарной артерии 15 минутной продолжительности (ОКА15 мин)- В работе использованы сердца 130 кроликов массой 2-4 кг, породы шиншилла и 22 беспородных собак-самцов, массой 14-18 кг. Из них 70 кроликов были нормальные, а 60 - с ТАМю дп; 13 собак нормальные и 9 - с ОКА15 miih-

ТАМ воспроизводили по методу C.B. Андреева и М.В. Соколова (1968), ОКАЙМИ,, - путем перевязки левой нисходящей ветви коронарной артерии сердца в верхней ее трети.

Определение показателей внутрисердечной гемодинамики проводили с помощью специального катетера, соединенного с монометриче-

- 3 -

ским датчиком мингографа ЕМТ-34 (фирмы Siemens-Elema, Швеция). Одновременно регистрировали ЭКГ во втором стандартном отведении. ПГВМ получали по методу Szent-Györgyi (1949). Сократительный ответ ПГВМ в условиях ауксотонического, близкого к изометрическому, сокращения, регистрировали на тензометрическом устройстве с коэффициентом упругости пружины, равным 3.5 Н/м (Н.В. Карсанов и соавт., 1983). АТФ-иницируемое (конечная концентрация АТФ в кювете 5 мМ) сокращение ПГВМ изучали в среде: 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 20 мМ трис-ЯСУ, pH 8.2, рСа 5.7. СВМ получали по методу Г.В. Сукоян и соавт. (1985), основанному на методе Magid & Reedy (1980). Полученные по этому методу СВМ, сохраняют ультраструкгурную организацию саркомера, а по данным 10% ДСН ПААГ электрофореза и нормальное соотношение основных и минорных белков миофибрилл. Однако такие СВМ не содержат функционально активные мембраны митохондрий, саркогагазматического рети-кулума, сарколеммы и триад. ТВМ получали из СВМ, после его фиксации в кювете тензометра, путем экстрагирования миозина по Yanagida & Oosawa (1978). средой, содержащей 0.47 M (или 0.6 M в случае ТВМ. (Тм+Тн)) KCl, 5 мМ NaN3, 10 мМ MgCl2, 2 мМ ЭГТА, 10 мМ АТФ, 0.5 мМ ФМСФ, 1 мМ ДТТ, 15 мМ имидазол, pH 7.0, рСа>8, ц 0.49, но без добавления тритона Х-100. РВМ получали путем инкубации ТВМ в кювете тензометра с миозином в течение 120 мин. Сокращение СВМ и РВМ изучали в среде, содержащей 0.1 M KCl, 2 мМ MgCl2, 5 мМ NaN¡, 0.5 мМ ДТТ, 0.5 мМ ФМСФ, 5 мМ АТФ, 4 мМ Cä-ЭГТА буфер, рНТА, рСа 5.0, ц 0.123. Ca,Mg-АТФазную активность СВМ и РВМ определяли в среде сокращения по интенсивности высвобождения неорганического фосфата (Kodama и соавт., 1986) за одну и пять мин. Изменение свободной энергии^ G ) гидролиза АТФ рассчитывали исходя из данных Gibbs, Chapman (1985), согласно которым ДG при гидролизе 1 M АТФ, равно 57 кДж. Мечение Цис 374 мономерного и фибриллярного актина миокарда 1,5-IAEDANS (5-{2-[iodoacetyl-amino]ethyl}aminonaphthalene- 1-sulfonic acid) проводили по методу Miki и соавт. (1987) и IAF (5-(iodoacetamino)fluorescein) по методу Taylor и соавт. (1981). Спектры флуоресценции регистрировали на флуориметре фирмы MPF-4, Hitachi (Япония). Определение содержания свободных ионов Ca в средах проводили с использованием Са-селекгивного электрода F 2110 Ca на титраци-онной системе RTS-80 фирмы Радиометр (Дания). Связывание Ca СВМ определяли радиоизотопным методом с использованием 45Ca и 3Н-глюкозы по методу Fuchs (1977). Определение количества AMA образованных сильной связью (АМАСС) вели через одну (в конце периода генерации силы) и через 5 мин после инициации сокращения по методу Lovell & Harrington (1980), Ueno & Harrington (1981) в модификации для миокарда Azarcón и соавт. (1985). Электрофорез белков СВМ, РВМ, ТВМ проводили по методу Laemmli (1970). Относительное содержание фракций в электрофореграмме определяли на денситометре с интегратором фирмы Bender & Hobein (Швеция). Содержание белка в ПГВМ, СВМ, ТВМ и РВМ определяли по методу микрокьельдаля, а актина и миозина микроби-уретовой реакцией. Статистическую обработку результатов проводили по^

.4. Я/1Я Ml/crv

числа случаев независимых и зависимых групп. Значимость различий средних (/) оценивали по критерию /Стыодента (Г.Ф. Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Действие СГ на систему контрактнльных белков миокарда нормального сердца. Кривые доза-зависимого эффекта (рис 1) свидетельствуют, что в условиях ауксотонического сокращения, оптимальные концентрации прямого положительного действия на систему контрактильных белков равны в случае рМД - 10~8 М, рАД, дигоксина, СК, К-строфантозида - 10~б М, а инотропных средств негликозидной природы, амринона и милринона - 10 4 М.

Рис. 1 Доза-зависимое действие различных сердечных гликозидов и ино-фопньтх средств негликозидной природы: [ШД (ланитоп) - <3 ; ди-гоксин - О ; рАД - О ; СК - Л ; К-строфантозид - ;

шринон - О ; милринон - Л ■ Все символы - среднее арифметике кое 3-8 измерений со своей ошибкой средней. Заштрихованная зона -сонтрольный уровень с ошибкой средней.

Оуабаин в концентрациях 10"8, 10 б, 10 4 и 10"3 М ни поло-кительного, ни отрицательного инотропного эффекта на систему сонтрактильных белков не оказывает (на рис 1 данные не представлены). _ 5 _

По широте биологической активности действие СК превосходит действие всех исследованных субстанций. Его активность простирается на дистанцию концентраций в 5 порядков (от 10"9 до 10"4 М). Возможно это связано с тем, что СК состоит из К-строфантозида и собственно СК. За ним следуют (ЗМД, который положительное инотропное действие оказывает в диапазоне концентраций 10"9-10"6М, рАД - 10 8-10 5 М и К-строфантозид -10"7-10"4М. После этих субстанций идут средства негликозидной природы проявляющие инотропное действие в пределах 2.5-3.0 порядков - 10 б-10-3 М.

На основании приведенных данных мы, в дальнейшем, нашу исследовательскую работу сосредоточили на изучении трех СГ: рАД, рМД и СК, причем в условиях изометрического сокращения, генерации максимальной силы.

Действие СГ на сократительные свойства изолированной системы контрактильных белков, СВМ нормального сердца в условиях изометрического сокращения. СК (Ю-6 М), рАД (Ю-6 М) и рМД (10"8 М) в оптимальных концентрациях, в условиях максимальной нагрузки и насыщающей концентрации Са, рСа 5, увеличивают величину развиваемого изометрического напряжения СВМ сверх максимальной Ся-активации в 1.6, 1.3 и 1.7 раз соответственно (примерно в такой же степени, что и в условиях ауксото-нического сокращения ПГВМ, близкого к изометрическому). При этом интенсивность гидролиза АТФ увеличивается под влиянием СК сверх Сйг-активации в 1.5, рАД в 1.55 и рМД в 1.45 раз. В результате интегральная экономичность преобразования энергии возрастает по сравнению с нормой в случае СК и рМД и остается на уровне нормы под влиянием рАД (табл).

При рассмотрении сократительного ответа СВМ на СГ по фазам сократительного процесса оказалось, что в фазе генерации силы скорость развития напряжения под воздействием рМД не изменяется, тогда как под влиянием рАД и особенно СК возрастает. При этом все три СГ в первую же минуту вызывают одинаково выраженную тенденцию к увеличению А <7 гидролиза АТФ. В результате интенсивность преобразования энергии в напряжение под воздействием рМД и рАД в фазе генерации силы возрастает без изменения экономичности сократительного процесса, в случае же СК реализуется путем количественного и качественного повышения преобразования энергии системой контрактильных белков миокарда (табл). В фазе поддержания напряженного состояния СВМ нормального сердца под воздействием оптимальной концентрации РАД поддерживает большее, чем в контроле напряжение при уве-

личении Д Gгидролиза АТФ в 2 раза, СК в 1.6 раз, а рМД, наоборот, уменьшении в 1.23 раза. В результате экономичность сократительного процесса под воздействием рМД и СК увеличивается, причем в большей степени в случае рМД. Под воздействием же рАД остается в пределах контрольного уровня.

Таким образом, полученные в этом разделе результаты позволяют говорить об увеличении под воздействием СК, рАД и РМД величины генерируемой силы и Д G гидролиза АТФ сверх максимальной чисто Ог-активации системы контрактильных белков и сопровождается качественным изменением преобразования энергии в сторону повышения экономичности сократительного процесса.

В отличие от рассмотренных СГ, оуабаин (10~6 М) не увеличивает, развиваемое СВМ напряжение, Д G гидролиза АТФ и не влияет на экономичность преобразования энергии системой контрактильных белков.

Действие СГ на формирование АМАСС СВМ нормального сердца. Молекулярный механизм. Оказалось, что СВМ на различные СГ, в разные фазы сократительного процесса отвечает формированием неодинакового количества АМАСС с разной структурой и функциональной активностью.

В фазе генерации силы в случае рАД и (ЗМД число АМАСС практически от контрольного значения не отклоняется, однако в случае СК резко возрастает (до максимального). Скорость генерации силы единичным АМАСС, как и в случае целостного волокна, под воздействием всех трех СГ существенно увеличивается, причем в наибольшей степени в случае рАД. Это сопровождается увеличением скорости гидролиза АТФ АМАСС под влиянием рАД и рМД, тогда как в случае СК Д G гидролиза АТФ остается в пределах контрольного значения. В результате экономичность генерации силы единичным AMA в случае рАД и рМД в норме существенно не изменяется, а в случае СК возрастает (табл).

В фазе поддержания напряженного состояния генерация силы в норме осуществляется значительно большим числом АМАСС, чем в фазе сокращения. При этом характеристики ансамблей существенно изменяются - время жизни АМАСС в случае СК возрастает в 7.6 раз, Д<7гидролиза АТФ уменьшается почти в 7 раз, скорость цитирования AMA замедляется, а экономичность преобразования энергии возрастает в два раза.

Изменение свободной энергии гидролиза АТФ, величины генерируемой силы, количества и времени жизни АМАСС в процессе сокращения СВМ нормального животного и при НС, обусловленной ТАМщ дп, под влиянием рАД, (ЗМД и СК

период показатель НОРМА

контроль I (п=13) СК (п=12)

интеграль- Рмакя мН/мм2 29.515.4 46.8±5.6а

ные параметры Лбжжй мДж/мг (5 мин) Р/Ав, мН/мДж 70.9±3.8 0.41±0.03 106.7±2.2а 0.54±0.05а

с1Р1ШмаКо мН/мм2 мин ^генерации ^/2 67.3±4.5 22.1+2.2 101.4+26.9" 17.Ш.5

Д6- мДж/мг МИН 39.1±3.0 47.6+5.4

кол-во АМАСС, пкмоль/мг 76.9±2.3 95.5±1.5

фаза генерации силы ^/моль АМАСС, мН/мм2мин Д бемоль АМАСС, мДж/мг мил 0.87±0.05 0.54±0.03 1.0710.1 С" 0.49±0.0б

/жизни АМАСС, с'1 5.8±0.2 6.7±1.1

р/ле, Н/Дж 1.80+0.13 2.22±0.23

Р, мН/мм2 29.5+5.4 46.8±0.6а

А 6- мДж/мГ мин 8.0+0.4 14.8+0.4ь

фаза поддержания напряженного состояния кол-во АМАСС, пкмоль/мг Р/иапъ АМАСС, мН/мм2 АО/моль АМАСС, мДж/мг мин /жизни АМАСС, мс 95.0±9.3 0.38±0.07 0.08+0.003 44.0±2.0 - 86.0+4.5 0.58+0.09ь 0.17±0.02ь 17.0+3.0ь

Р/ АС, мН/мДж 3.68+0.2 3.4±0.2а

1 выхода на плато , с 57.6±2.2 57.6+2.4

Примечание: сравнений а - с НС; ь - с нормой; с - с СК;

-е-

Таблица

НОРМА НС

РАД рмд контроль II ск РАД РМД

(п=13) (п=6) (п=7) (п=7) (п=7) (ч=7)

38.9+1.7а 48.1+4.8" 10.8±1.1" 25.7±1.9а 24.2+2.1а 27.842.33 <=

110.2+1.7а 94.944.5" 38.1±4.3Ь 76.0+7.1а 68.3+11.1а 69.3±12.5а «

0.37±0.02а 0.5140.04" Л 0.26±0.05ь 0.34±0.02а е 0.39+0.06а 0.40±0.05а е

77.444.4° 68.844.1° 30.7+3.6" 68.744.3а с 77.044.9я 81.744.3а е

17.5+1.3 23.1+2.5° а 19.1+2.3" 11.341.2ас 9.5+1.83 е 10.2+1.За е

45.3+3.6 45.5+6.3 25.3+1.4" 30.3+3.За 35.5+5.1а 35.6+4.63

67.04.7 67.2+5.7° 73.013.8 45.040.93 е 41.0+1.6®с 40.342.8а с

1.2540.08" 1.08±0.06ь Л 0.47+0.03" 1.6740.10«е 1.72+0.12ае 1.82+0.15а "е

0.78±0.08ь с 0.68+0.06" с 0.35+0.03" 0.7240.063 с 0.7740.12а е 0.55+0.08" ° а

4.9+0.4 5.040.5° 6.4±0.4 4.840.83 4.440.63 б.ИО.в'1

1.90+0.10 1.6140.23° 1.3+0.3" 2.13+0.22 2.4540.33 " е 2.28+0.13а "е

38.941.7а 48.1+4.8" с 10.8±1.1" 25.7+1,9а 24.2+2.1а 27.842.33 е

17.040.6" 6.5±0.5Ь ° а 4.3+0.3" 9.640.4я "с 8.241.1а е 8.2541.80°

54.9+3.5а 91.8+7.5'1 73.3+2.4" 82.743,7а 70.5+1.9" °е 78.543.4е1 е

0.6940.07" 0.52±0.06ь ч 0.1540.02" 0.4140.03а 0.3540.04а е 0.4740.06а

13140.06" с 0.07+0.06° <• 0.06+0.003" 0.15±0.03а" 0.17+0.043 ь 0.16+0.033 "е

7.3±1.4Ь с 39.0+5.8° а 51.0+6.0 19.0+3.0" а 24.0+2.0а " « 21.043.0аЬе

2.240.2" с 7.4±0.5Ь с ч 2.30+0.15" 2.73+0.2а "е 2.05+0.25" 2.9440.16а " е

45.6±5.6 39.0+5.8" 0 82.5+2.3" 49.2+3.5а 43.7+1.2ае 46.7+2.3а

1 - с РАД; е - с нормой + СГ соответствующий / Р <■ О, СГ- о, с&У

- 9 -

Под влиянием СК и рМД в фазе поддержания напряженного состояния сила генерируется максимально возможным числом АМАСС - путем полной или почти полной мобилизации резервных возможностей системы. В случае же рАД число АМАСС в фазе поддержания напряженного состояния относительно контрольной величины уменьшается в 1.7 раз и 1.2 раза относительно числа АМАСС в фазе генерации силы (табл). Таким образом, оптимальные концентрации рАД и СК на АМАСС оказывают противоположное воздействие. Замена ацетильной группы на метальную приближает действие модифицированного дигоксина к действию СК. На преобразование энергии рМД, как и СК, воздействует путем изменения свойств, конформации АМАСС. В частности, высокая экономичность генерации поддерживающей силы в случае рМД, как и СК, связана с "компактной" конформацией АМАСС, характеризующейся большой продолжительностью жизни. При этом оказалось, что поддерживающая сила, генерируемая единичным АМАСС под воздействием РАД возрастает в 2.3 раза, СК в 1.9 раз, а в случае рМД в 1.7 раз. Д О гидролиза АТФ увеличивается в 3.9 и 2.1 раз в случае рАД и СК соответственно и не изменяется в случае рМД. Скорость циклирования АМАСС при этом в случае рАД возрастает в 6 раз, СК в 2.6 раза, а рМД практически остается в пределах контрольной величины. В результате экономичность преобразования энергии единичным АМАСС в случае рАД падает в 1.7 раз, рМД возрастает в 2 раза, а СК остается в пределах нормы. При всех этих сдвигах конформационное состояние АМАСС изменяется таким образом, что доступность миозина для трипсина в случае рАД относительно контрольной величины в фазе поддержания напряженного состояния возрастает, а под воздействием СК и рМД уменьшается. Вывод: и СК, и РАД, и рМД действуют на формирование и свойства АМАСС.

Действие СГ на ¿^-чувствительность и кооперативное™ функционирования системы контрактнльных белков миокарда нормального сердца. Под действием СК (Ю*6 М) Са-чуствительность СВМ в норме повышается - полумаксимальное напряжение генерируется при рСа равном 6.7, а полумаксимальное А (7 гидролиза АТФ происходит не при рСа 6.5, как в контроле, а при 6.65. Максимальные напряжения и А <7 гидролиза АТФ достигаются, как и в контроле при рСа 6.0. При этом в процессе снижения рСа переход напряжения и А (У гидролиза АТФ от минимума к максимуму имеет ^-образный характер (рис 2); отмечается тесная взаимосвязь между величиной генерируемой силы и А <7 гидролиза АТФ (/-=0.93, Р<0.001). И это несмотря на то, что количество свя-

иН/мм2

занного Са в СВМ при его преинкубации со СК относительно нормы не изменяется - равно 1.29+0.08 нмоль'45! Сй/мг. В присутствии 2 мМ это означает, что все 3 центра связывания Са2+ на Тн- С заняты Са2+. Кооперативность б^-индуцируемого сократительного ответа системы контрактильных белков под воздействием СК(как по величине генерируемой силы;так и Д (7 гидролиза АТФ увеличивается в 1.5 раза. В случае применения СК, внесение в среду 8 мМ ЭГТА не ведет к столь же быстрому, как в контроле расслаблению волокна - время полумаксимального расслабления возрастает до 58±10 с, а время полного расслабления (снижения напряжения до исходного уровня) до 2.10+0.25 мин.

Под действием рАД (10"6М) кривая Са-чувствительности сдвигается влево на 0.25 единиц (рис 2) и резко повышается кооперативность Са-ответа (в 1.6 раз). Максимальное напряжение, развиваемое СВМ, превосходит ¿^-индуцированное (без гликозида), в 1.4 раза. Количество связываемого при этом Са в СВМ, также остается на уровне нормы. Сопряжение процессов генерации силы и Л ¿7 гидролиза АТФ остается высоким (г =0.91, /*<0.001), а скорость расслабления СВМ возрастает (рис 2).

Под действием рМД (Ю-8 М) Су-чувствительность и кооперативность Са-ответа СВМ повышается в такой же степени, как и под влиянием СК, но в несколько меньшей, чем в случае ¡ЗАД - рСа^о сдвигается влево на 0.17±0.03 единиц, а кооперативность ¿^-ответа повышается в 1.45 раз (рис 2). Количество связанного '451 Са в СВМ и в этом случае соответствует норме. При этом сохраняется очень высокая степень координации

процессов генерации силы и гидролиза АТФ ( г =0.94, Р <0.001).

. 11-

Р.

40

30

20

Ю

СОКРАШМЕ

О 60 по

РАССЛАБЛЕНИЕ

1_МИН

Рис. 2 Действие СГ на Са-чувствителъность и процесс расслабления СВМ нормального сердца; СК - □ ; (ЗАД - О ; РМД - Л ; норма - е.

Максимальная скорость и время полного расслабления под воздействием рМД существенно от контрольных не отличаются (рис 2).

Под действием оуабаина (^-чувствительность и коопера-тивность сокращения СВМ, а также скорость расслабления волокна в результате удаления свободных ионов Са не изменяются. Количество связываемого Са, также как4 и в контроле равно 1.24±0.07 нмоль 1451Сз/мг.

Место приложения СГ в системе контрактильных белков миокарда нормального сердца,, РВМ из ТВМ нормального сердца, преинкубированного (в кювете измерительного блока тензометра) со СК (л =6) или РАД (л =6), или рМД (л =6) в концентрации 10~6, 10"6 и 10~8 М соответственно и миозина нормального сердца, не подвергшегося воздействию СГ, после замены среды преинку-бации на сокращающую, не содержащую СГ, генерирует при всех изученных СГ силу превосходящую контрольную примерно в 1.45 раза (рис ЗАа), а А б гидролиза АТФ примерно в 1.5 раза (рис ЗАб).

2

Р, мН/мм А о, мДж/мг * 5 мин

12

8 4 О

Рис. 3 Действие СГ на АС? гидролиза АТФ и напряжение, развиваемое РВМ, образованным из ТВМ (А) и ТВМ_(тм+Тн) (Б) и миозина нормального миокарда (Аа1, А61, Ба1, Б61) и миокарда при НС (Аа2, А62, Ба2, Б62); контроль I -О; контроль II СК -ЕЗ; РАД -СШ; РМД

Альтернативные опыты с РВМ, в которых до реконструкции волокна с СК (п =4) или рАД (л =3), или рМД (л =3), было преинкубировано не ТВМ, а миозин (затем отмытый от свободного СГ) продемонстрировали, что такое волокно генерирует силу и гидролизует АТФ в такой же степени, что и контрольное.

При преинкубации ТВМ лишенного Тм-Тн комплекса (Са-ночувствительное), с СК (л =6) или рАД (л =4) или рМД (л =5) оказалось что в этом случае РВМ генерирует, по сравнению с контролем, в 1.3-1.4 раза большее напряжение (рис ЗБа) и это сопровождается в 1.4-1.5 раз большим Л С гидролиза АТФ (рис ЗБб).

Р, мН/мм

А <5> мДж/мг * 5 мин №1

Эти опыты позволяют сделать вывод, что мишенью СК, рАД: И/ рМД является тонкая нить нормального миокарда (саркомера) и местом приложения инотропного действия СГ является ее основной белок, актин.

Действие СГ на конформациоиное состояние С-концевого участка актина миокарда нормального сердца. Под воздействием СК (10"6 М; п= 5) максимум флуоресценции меченого 1.5 1АЕОАЫ8 Цис 374 мономерного актина несколько смещается в коротковолновую сторону, а интенсивность флуоресценции относительно контроля возрастает в 1.2±0.1 раз. Влияние (ЗАД (10*6 М; п~4) и рМД (10"8 М; п— 4) на С-концевую область актина более выражено - интенсивность флуоресценции превосходит контрольную в 1.45 и 2.1 раза соответственно.

Под воздействием СК максимум излучения Ф-актин-1.5 1АЕВА№ по сравнению с контролем не смещается, однако его интенсивность по сравнению с Г-актином уменьшается в 1.26 раз <0.01). При этом интенсивность свечения метки в 1.26±0.05 раз (в такой же степени как и в мономерном актине) превосходит квантовый выход флуоресценции 1.5 ТАЕБАКБ - Ф-актина нормального сердца. рАД и рМД, в отличие от СК, дают более существенное увеличение квантового выхода - в 1.5 и 1.7 раз по сравнению с контролем соответственно.

Аналогичные результаты получены и при использовании другой специфической метки на Цис 374 - 1АР. Интенсивность флуоресценции Ф-актина в максимуме излучения (^макс=513-515 нм) под влиянием СК 0=4), рАД {п =4), рМД (л =4) увеличивается в среднем в 1.3, 1.65, 1.75 раз соответственно.

Таким образом, исследованные СГ изменяют микроокружение Цис 374 - конформациоиное состояние С-концевой области, как мономеров актина, так и протомеров Ф-актиновой нити.

Действие СГ на систему контрактильных белков миокарда

при НС. При НС, развившейся в связи с ТАМюда„ интегральная способность СВМ левого желудочка сердца кролика генерировать напряжение относительно нормального значения уменьшается на 63.4%, скорость генерации силы - на 54.4%, а Д (7гидролиза АТФ -на 46.3%. В результате резко снижается экономичность сократительного процесса (табл).

В еще большей степени, при ТАМюда страдает процесс расслабления системы контрактильных белков миокарда. Время падения напряжения до полумаксимального растягивается до 45.5±8.7 с (в норме - 26.6 с), а до исходного - до 2.2±0.6 мин (в

- 13 -

норме - 1.28 мин) - процесс расслабления замедляется более чем в 1.7 раз.

Действие РАД, рМД и СК in vitro на систему контрактиль-ных белков миокарда при НС проявляется в увеличении интегральной величины генерируемой силы (в 1.5-1.7 раза) и ^¿/гидролиза АТФ (в 1.2-1.5 раза) (табл). В результате под воздействием этих СГ параметры сокращения СВМ при НС достигают значений нормы. Экономичность сократительного процесса в случае всех трех СГ также возрастает (в норме под воздействием РДД она не изменяется), однако опять-таки лишь до уровня нормы.

РАД, рМД и СК при НС восстанавливают, утерянную при ТАМ, способность AMA сопрягать процессы генерации силы и гидролиза АТФ. Это, по-видимому, и лежит в основе повышения экономичности преобразования энергии при НС под влиянием модифицированных дигоксинов и СК.

В фазе генерации силы при ТАМюдп скорость развития напряжения под влиянием СК, рАД и рМД возрастает (в 2.2, 2.5 и 2.7 раз соответственно) и достигает (в случае СК) или превышает (в случае рАД и рМД) нормальный уровень (табл). Это сопровождается увеличением скорости AG гидролиза АТФ в 1.2, 1.4 и 1.4 раз соответственно (табл). В результате в фазе генерации силы под воздействием всех трех СГ экономичность сократительного процесса превышает не только уровень наблюдаемый при НС в 3.5-3.9 раз, но и уровень экономичности в норме в 1.9-2.1 раз.

В фазе поддержания напряженного состояния при ТАМюдп под воздействием всех трех СГ происходит примерно одинаковое повышение поддерживаемой силы (относительно ТАМюдп несколько более чем в два раза), A G гидролиза АТФ (примерно в два раза), что ведет к увеличению экономичности сократительного процесса в 1.2-1.3 раза - до уровня нормы.

На процесс расслабления СВМ при ТАМюдп наиболее выраженное действие, также как и в норме, оказывает РАД. рМД также улучшает процесс расслабления, но в несколько меньшей степени, а СК существенного влияния не оказывает. Оуабаин прямого действия на систему контрактильных белков миокарда при НС, как и в норме, не оказывает.

Действие СГ на формирование АМАСС СВМ при НС. Молекулярный механизм. При НС, развившейся в связи с ТАМюдп, в фазах генерации силы и поддержания напряженного состояния под воздействием всех СГ количество АМАСС резко уменьшается. -14-

Время жизни АМАСС при ТАМюдп в фазе генерации силы под воздействием СК и (ЗАД относительно контрольного значения уменьшается в 1.3 и 1.4 раза соответственно, а рМД - заметно не изменяется. При этом примечательно, что в фазе поддержания напряженного состояния время жизни АМАСС в случаях рАД и рМД не изменяется, а СК даже возрастает. Под влиянием всех трех СГ скорость циклирования AMA в фазах генерации силы и поддержания напряженного состояния увеличивается.

В фазе генерации силы уменьшение числа АМАСС при ТАМю дп под воздействием всех трех СГ происходит на фоне резкого увеличения (по сравнению с контролем) величины генерируемого единичным АМАСС напряжения. Можно сделать важный (для клиники) вывод - в фазе генерации силы под влиянием СГ сократительная активность системы контрактильных белков миокарда при НС увеличивается не за счет увеличения количества АМАСС, а в результате структурных изменений в AMA, ведущих не только к количественному увеличению преобразования энергии, но и к выраженному качественному ее изменению, причем не только под воздействием СК и рМД, но и (ЗАД, который в случае нормального волокна качественного воздействия на преобразование энергии не оказывает. При этом рост экономичности превышает не только уровень ТАМю дп» но и нормы. Этот феномен существенно отличает действие рАД при НС от его действия на нормальное волокно. Характерной чертой действия и СК и рМД является их выраженное влияние на экономичность преобразования энергии (в сторону повышения) в фазе поддержания напряженного состояния.

Действие СГ на Са-чувствительность и кооператнвность системы контрактильных белков миокарда, СВМ, при НС, обусловленной ТАМюдп. При ТАМюдп, несмотря на резкое снижение величины генерируемого СВМ напряжения Сд-чувствительность волокна повышается, а чувствительность процесса гидролиза АТФ к Са исчезает. Однако кооператнвность процесса генерации силы резко снижается. Это обусловлено разобщением процессов генерации силы и гидролиза АТФ, нарушением функционирования структуры, ответственной за сопряжение в СВМ (AMA) этих двух явлений. Есть основание считать, что эта структура локализована в актине.

Под влиянием СК (10 6 М) при высоких значениях рСа (7.2-6.7) кривая роста напряжения, развиваемого СВМ при ТАМю да приближается к норме (рис 4Б). Дальнейшее снижение рСа вызывает резкое нарастание напряжения, которое достигает

- 15-

мДж/мг ■ Змии

максимума, как и в норме, при рСа 6.0, а рСа^о становится равным 6.55 (сдвигается вправо на 0.15 и существенно не отличается от нормы). В результате ¿»-образный переход от минимальных к максимальным значениям становится значительно круче, чем в контроле (рис 4В). Кооперативность процесса генерации СВМ

напряжения, по сравнению с контролем, возрастет в 1.3 раза. Кривая зависимости АД гидролиза АТФ от рСа из параллельной оси абсцисс возвращается к 5-образной; рСа^о равно 6.68 (рис 4А), а коэффициент Хилла 1.9±0.2. Восстановление положительной кооперативности Са, А^-АТФазной активности СВМ при НС, по-видимому, обусловлено восстановле-нием под влиянием СК сопряжения процессов генерации силы и гидролиза АТФ (г =0.63, Р<0.05).

лб.

¿0

60

40

20

&0 7.0 6Д 10 40 р Са

Рис, 4 Действие СГ на Са-чувствительность СВМ при НС, развившейся в связи с ТАМюдп- А - зависимость Л С? гидролиза АТФ от рСа; Б -зависимость напряжения, развиваемого СВМ от рСа; В - относительное изменение напряжения, развиваемого СВМ, от рСа. Норма - • ; ТАМ - х , СК - О ; РАД - о ; РМД - А ■

- 16 -

Под влиянием рАД кривая перехода развиваемого СВМ напряжения от минимума к максимуму, индуцированного изменением рСа от 7.2 до 6.0, при ТАМюдп вплотную приближается к нормальной (рис 4Б,В), Са-чувствительность СВМ нормализуется. Нормализуется и зависимость А С гидролиза АТФ от рСа, переход AG гидролиза АТФ от минимума к максимуму принимает S-образный характер (рис 4А). В результате коэффициент кооперативное™ C/7-ответа, оцененный по величине генерируемой силы возрастает до 2.2±0.2, а Л (7пиролиза АТФ до 2.15±0.13.

При ТАМюдп под воздействием (ЗМД ^-образные кривые зависимости величины развиваемого напряжения и Д G гидролиза АТФ в области высоких значений рСа (7.2-6.7) по отношению к контролю (ТАМ) снижаются в степени, превышающей степень снижения, как под влиянием РАД, так и СК (рис 3). В результате рСа^остановится равным 6.35, а коэффициент кооперативности Са-ответа 2.2±0.2, как процесса генерации силы, так и Ai?гидролиза АТФ.

Под воздействием оуабаина при НС, как и в норме, ни Са-чувствительность, ни кооперативность (^-ответа СВМ не изменяются.

Место приложения СГ в системе коптрактилышх белков миокарда при НС. При ОКА] 5 ми, РВМ, образованные из ТВМ зоны ишемии и миозина миокарда нормального сердца генерируют силу на 67% (в случае СВМ на 70%), а Д G гидролиза АТФ на 55% (в случае СВМ на 65%) меньше контрольного РВМ из ТВМ и миозина нормального сердца (рис 3). Замена в таком гибридном волокне миозина на миозин зоны ишемии не ведет к сколько-нибудь существенному изменению этих показателей.

РВМ из ТВМ и миозина зоны ишемии, как и СВМ зоны ишемии, сохраняет Сг-чувствительностъ и кооперативность Са-ответа.

РВМ, содержащее только патологический миозин (зоны ишемии) и нормальное ТВМ по всем показателям ведет себя как абсолютно нормальное волокно. Это дает основание заключить, что в основе снижения силы и Д G гидролиза АТФ при НС, развивающейся в связи с ОКА is ми„, лежит изолированное изменение свойств ТВМ, тонкой нити (Г.В. Сукоян и соавт., 1994; Д.Р. Татулашвили и соавт., 1994).

В такой же степени снижаются эти параметры и в случае

РВМ, образованного из ТВМ сердца кролика с ТАМ и миозина

нормального миокарда. Таким образом, снижение генерируемой

-17-

силы, и в случае ОКА, и при тяжелой НС, развивается в связи с ТАМ является следствием нарушений в тонкой нити.

Оказалось, что и в отсутствии Тм+Тн комплекса (рис 3) РВМ, содержащее ТВМ сердца собаки с OKAj5 „щ, генерирует напряжение и гидролизует АТФ меньше контрольного в такой же степени, как и СВМ при ОКА15 мщ (я =4) - рис 3 (неопубликованные данные Г.В. Сукоян и соавт., цитируется с разрешения авторов) .

Таким образом, не изменения в Тм+Тн регуляции, а изолированное поражение основного белка тонкой нити, актина, лежит в основе снижения сократительной способности системы контрак-тильных белков при НС. И так, как было показано, что преинку-бация in vitro СВМ со СК или РАД, или РМД ведет к увеличению генерируемой силы и способности гадролизовать АТФ, нами были поставлены опыты с изолированной преинкубацией ТВМ и миозина с СГ и образования из них РВМ.

Преинкубация ТВМ зоны ишемии при OKAi5MHH с рМД (Ю-8 М, п =4) или рАД (Ю-6 М, п =4) или СК (10"6 М, п =4) в течение 40 мин перед реконструкцией волокна с интактным миозином ведет к повышению величины генерируемой силы в 1.8-1.6 раз (рис ЗАа2) и Д Gгидролиза АТФ в 1.4-1.6 раз (рис ЗБ62). Альтернативная преинкубация с этими же СГ миозина до реконструкции с ТВМ не ведет к существенному изменению ни величины развиваемого напряжения, ни Д Gгидролиза АТФ.

РВМ из ТВМ.(хм+тн) зоны ишемии сердца собаки с ОКА15 мин> преинкубированного с рАД (10"® М; п —4) или рМД (10*8 М; п —4) или СК (10 6 М; п =4) и миозина миокарда нормальной собаки генерирует силу в 1.6, 1.45 и 1.5 раз превышающую соответственно величину напряжения развиваемого волокном реконструированным из ТВМ_(тм+тН) зоны ишемии и миозина нормальной собаки - достигает величины силы генерируемой волокном, полученным из ТВМ.(тм+Тл) и миозина нормального миокарда (рис ЗБа2). Д G гидролиза АТФ РВМ, содержащего ТВМ_сгм+Тн) преинкубированного с СГ также возрастает и достигает интенсивности гидролиза АТФ РВМ из ТВМ_(тм+тн) и миозина нормального сердца (рис ЗБ62). Результаты этих опытов позволяют заключить, что структурой, на которую направлено действие СГ в миофибрил-лах миокарда при НС является Ф-актиновая нить.

Действие СГ на конформационное состояние актина миокарда при НС. При НС, развившейся в связи с ТАМюдп (л =3) и при ОКА15 мин (л =4), интенсивности флуоресценции С-концевой

-18-

области мономерного и фирбиллярного 1.5 IAEDANS-меченного актина, в отличие от нормы, существенно не отличаются.

Под воздействием СК интенсивность флуоресценции Г-актин-1.5 IAEDANS увеличивается по сравнению с контролем в 1.5 раз, рАД - 1.6, а рМД - 2.15 раз. После образования нитей Ф-актина из мономерного актина преинкубированного с СГ квантовый выход флуоресценции, по сравнению с квантовым выходом Г-актина, в случае СК, рАД и рМД уменьшается в 1.5, 1.2 и 1.3 раза, соответственно - под влиянием этих СГ актин восстанавливает способность изменять конформацию в процессе образования нитей (в процессе перехода из мономерного в протомерное состояние), утерянную при НС, как по нашим данным, так и данным кругового дихроизма (Н.В. Карсанов & Б.Г. Джинчвелашвили, 1990) и электронной микроскопии (Т.Г. Самсонидзе, Н.В. Карсанов, 1994).

Следовательно, СГ (рАД, рМД и СК) при НС изменяют третичную структуру актина в области С-конца и приближают ее к нормальной, способной изменяться при включении молекулы в качестве прсггомера в Ф-актиновую нить.

Таким образом, получены первые данные о способности СК, рАД и рМД изменять конформационное состояние актина при НС, что открывает новые перспективы в исследовании механизма положительного инотропного действия СГ на миокард.

ОБСУЖДЕНИЕ

Таким образом, рАД, рМД, СК, К-строфантозид и ди-гоксин, а также амринон и милринон, в концентрациях на два порядка (на четыре в случае рМД) превышающих концентрации СГ (рис 1) на изолированную систему котрактильных белков, не содержащую функционально активные сарколемму, мембраны сарко-плазматического ретикулума, триад и митохондрий, оказывают непосредственное положительное инотропное воздействие. Оуабаин прямым положительным инотропным действием на эту систему не обладает. Рост генерируемого напряжения и Д G гидролиза АТФ системой контрактильных белков под влиянием рАД, рМД и СК намного превышает максимальный уровень этих показателей наблюдаемый при чисто Сд-активации сократительного процесса (рис 2). Установлено, что СГ свое воздействие на СВМ осуществляют через AMA. В случае СВМ нормального сердца действие рМД и СК ведет к повышению экономичности сократительного процесса AMA, тогда как рАД повышает преобразование энергии лишь количественно без изменения экономичности ис-

- 19-

пользования энергии AMA (табл). Оказалось, что рАД переводит конформацию AMA в более "открытую", более доступную для про-теолиза, тогда как CK, и в меньшей степени рМД, наоборот, в более "компактную" конформацию АМАСС, препятствующую про-теолетическому расщеплению миозиновой головки в области 5020 кД доменов.

В развитие гипотезы, постулирующей функционирование в изолированной системе контрактильных белков (Н.В. Карсанов и соавт., 1989, 1990), миокарде (Gibbs & Chafarían, 1985) регулятора термодинамической и механической эффективности сократительного процесса показано, что уровень экономичности функционирования этой структуры в AMA определяется не только степенью сопряженности процессов генерации силы и гидролиза АТФ, но и свойствами СГ, а также их концентрацией. Показано, что увеличение концентрации CK и рМД на порядок, в случае системы контрактильных белков нормального миокарда ведет к исчезновению эффекта повышения экономичности сократительного процесса (Н.В. Карсанов и соавт., 1996). Большое значение имеет и функциональное состояние, конформация AMA - CK эффективно действует (повышает экономичность преобразования энергии) в фазе генерации силы, рМД в фазе поддержания напряженного состояния (табл). Примечательно, что замена в модифицированном ди-гоксине ацетильной группы на метальную, в случае нормального миокарда, отдаляет действие рМД от действия рАД и приближает к действию CK. Поскольку в обоих случаях модифицируется агли-кон, можно считать, что агликон и прикрепляющийся к нему радикал играют важную роль в определении характера действия СГ на AMA. Наконец, метилирование уменьшает оптимальную концентрацию дигоксина на два порядка и расширяет диапазон концентраций биологической активности в большей степени, чем рАД.

В отличие от нормы, в фазе генерации силы под влиянием всех трех СГ, относительно контрольного значения, происходит уменьшение количества АМАСС. При этом повышение величины генерируемой системой контрактильных белков силы и Д G гидролиза АТФ происходит в результате максимальной активации, способности каждого АМАСС генерировать силу и гидролизовать АТФ (табл). Оказалось, что при НС скорость циклирования АМАСС под воздействием СГ возрастает, и несмотря на это, экономичность сократительного процесса не снижается, а наоборот, повышается. Это согласуется с представлениями Kushmerick & Davis (1967); Steiger & Rüegg (1969), согласно которым хемомеханический коэффициент

использования энергии может оставаться неизменным и быть чув-

- 20 -

ствительным к скорости преобразования энергии только при очень больших или очень малых скоростях циклирования AMA. В основе повышения экономичности использования энергии AMA при НС под влиянием изученных СГ лежит восстановление сопряженности процессов генерации силы и гидролиза АТФ, полностью разобщенных при НС, обусловленной ТАМю да.

Привлекает внимание факт, имеющий весьма важное теоретическое и практическое значение: тогда как рАД в оптимальной концентрации в случае нормального миокарда на экономичность преобразования энергии системой контрактильных белков воздействия не оказывает (или даже понижает ее в фазе поддержания напряженного состояния), при НС экономичность преобразования энергии он резко повышает. При этом особенно важно, что ¡ЗАД повышает экономичность сократительного процесса в фазе генерации силы, отличающейся большой энергоемкостью и относительно низкой экономичностью (Дж. Бендолл, 1970).

Особо следует отметить, что именно рАД, из всех изученных СГ, оказывает наиболее выраженное воздействие на способность AMA, как нормального миокарда, так и при НС, переходить из состояния сильного связывания в состояние, конформацию, слабой связи - на способность системы контрактильных белков расслабляться. рМД улучшает процесс расслабления, однако, только при НС и в менее выраженной степени, чем рАД. СК на диссоциацию AMA при НС не влияет, но в норме скорость расслабления системы контрактильных белков замедляет. Выше отмеченные моменты повышают ценность рАД и рМД в выборе СГ при лечении НС, нарушение диастолической функции при которой играет важную роль в механизме развития патологического процесса.

И наконец, из клинических данных известно, что НС, развившаяся на почве воспалительных поражений миокарда, а также застойной, алкогольной и дилатационной кардиомиопатиях, характеризуется рефрактерностью к СГ. Из наших данных следует, что в условиях нормального содержания в среде АТФ и Са2+, система контрактильных белков миокарда при НС, развившейся в связи с ТАМю дп не рефрактерна к действию СГ и должна отвечать на их применение положительным инотропным эффектом, сопровождаемым повышением экономичности сократительного процесса. Это позволяет считать, что рефрактерность миокарда к СГ при НС, развившейся в связи с воспалительными поражениями, не обусловлена несостоятельностью системы контрактильных белков. Нет сомнений, что при создании необходимых условий в клетке СГ могут использоваться для лечения рефрактерных форм НС.

Действие СГ при насыщающих концентрациях Са на AMA не единственный механизм их влияния на систему контрактильных белков. СГ повышают СЬ-чувствительность и кооперативность Са-ответа СВМ нормального сердца м при ранней НС,нормализуют ^-чувствительность и кооперативность £7<?-ответа СВМ при тяжелой НС, развившейся в связи с ТАМю дп-

Результаты с РВМ продемонстрировали избирательное действие СК, рАД и рМД на тонкую нить, ее основной белок актин, как в случае нормального миокарда, так и при НС. В частности, установлено, что СГ изменяет ориентацию С-концевой области протомера актина в Ф-актиновой нити.

Полученные результаты позволяют считать, что актин является местом действия СГ в системе контрактильных белков. СГ повышает конформационную подвижность актина миокарда, резко сниженную при НС.

Следует отметить, что в условиях целостности организма, в частности при НС, прямое действие СГ на систему контрактильных белков кардиомиоцита, по-видимому, сочетается с его воздействием на сердечно-сосудистую систему через нормализацию (восстановление) функциональной активности барорецепторов, который интенсивно поглощают СГ (Ferguson и соавт., 1989), а также через их влияние на вегетативную нервную систему и другие механизмы.

ВЫВОДЫ

1. Сердечные гликозиды: строфантин К, К-строфантозид, р-ацетилдигоксин, р-метилдигоксин, дигоксин, а также амринон и милринон на систему контрактильных белков нормального миокарда оказывают прямое положительное инотропное действие. Максимальный эффект рМД оказывает при концентрации 10~8 М, дигоксин, р-ацетилдигоксин, строфантин К и К-строфантозида при Ю-6 М, а амринон и милринон 1СИ М. Наибольший диапазон биологической активности имеет строфантин К, наименьший амринон и милринон.

2. Строфантин К и р-метилдигоксин, в оптимальных концентрациях, на экономичность сократительного процесса системы контрактильных белков нормального сердца, оказывают количественное и качественное воздействие, а р-ацетилдигоксин только количественное. „ 0

3. Строфантин К, р -ацетилдигоксин и р-метилдигоксин в случае нормального миокарда повышают Й7-чувствительность и кооперативность Са-ответа системы контрактильных белков тонкой нити.

4. В основе стимуляции сократительного ответа системы контрактильных белков миокарда сердечными гликозидами лежит изменение конформационного состояния актомиозинового ансамбля, основного белка тонкой нити.

5. При тяжелой недостаточности сердца р-ацетилдигоксин, р-метилдигоксин и строфантин К повышают до нормы величину генерируемой силы, интенсивность гидролиза АТФ, и сопряженность этих процессов в актомиозиновом ансамбле; нормализуют ^/-чувствительность и повышают кооперативность бЬ-ответа системы контрактильных белков тонкой нити.

6. При недостаточности сердца р-ацетилдигоксин в фазе генерации силы резко повышает экономичность функционирования актомиозинового ансамбля.

7. В системе контрактильных белков миокарда при недостаточности сердца, как и в норме, целевой зоной действия сердечных гликозидов, рецептором р-ацетилдигоксина, р-метилдигоксина и строфантина К является основной белок тонкой нити - актин.

8. р-ацетилдигоксин ускоряет (улучшает) процесс расслабления системы контрактильных белков нормального миокарда • •

, и при недостаточности сердца; р-метилдигоксин на процесс расслабления системы контрактильных белков нормального миокарда не влияет, но несколько его улучшает при недостаточности сердца; строфантин К замедляет (ухудшает) процесс расслабления нормального миокарда, однако при недостаточности сердца дополнительного замедления не вызывает.

9. Оуабаин (строфантин-О) на изолированную систему контрактильных белков, не содержащую функционально активную сарколемму, мембраны саркоплазматического ретикулума, триад и митохондрий непосредственного действия не оказывает.

10. Рефрактерность миокарда при недостаточности сердца, обусловленной воспалительными поражениями миокарда, не связана с ареактивностью системы контрактильных белков к сердечным гликозидам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. О различии механизмов действия ß-ацетилдигоксина, строфантина К и оуабаина. Бюлл. экспер. биол. мед., 1992, №2, С. 146-149 (в соавторстве с Н.В. Карсанов, Г.В. Сукоян, Д.Р. Татулашвили, Л.Д. Мамулашвили).

2. Влияние ß-ацетилдигоксина на кальциевую чувствительность скицированных миокардиальных волокон. Материалы 49-ой Конференции Студенческого Научного Общества им. И.Р. Тархнишвили, Тбилиси, 1986, С. 109.

3. Действие сердечных тликозидов на систему контрактильных белков миокарда при сердечной недостаточности. Материалы III Российского Нац. Конгресса "Человек и Лекарство", 1996, С. 132 (в соавторстве с Д.Р. Татулашвили, Г.В. Сукоян).

4. Актин - рецептор сердечных гликозидов. Материалы III Российского Нац. Конгресса "Человек и Лекарство", 1996, С. 132 (в соавторстве с Г.В. Сукоян, Д.Р. Татулашвили).

5. Сравнительная эффективность и различия в молекулярном механизме инотропного действия некоторых сердечных гликозидов и негликозидных кардиотропных средств на систему контрактильных белков миокарда. Экспер. и клин, фармакол., 1996, №3, С. 27-30 (в соавторстве с Н.В. Карсанов, H.H. Кипшидзе, Г.В. Сукоян, Э.И. Гучуа, Д.Р. Татулашвили, Е.В. Яровая, В.А. Магалдадзе).