Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение взаимосвязи полиморфизма систем групп крови и N-ацетилирования с риском развития рака прямой кишки и с целью индивидуализации терапии

На нравах русопсн

Маркарова Екатерина Т(асильевна

Изучение взаимосвязи полиморфизма систем групп крови и N-а метилирован и я с риском развития рака прямой кишки и с целыо индивидуализации терапии

14.00.25 - фармакологии, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 20С7

Работа выдачисма в Центре теоретических ьрйблсм физико-химической фармакологии РА}].

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических паук I олденкпвн-На плова Ирина ВасильевЩ

доктор биологических паук Радкеннч ЛгадмнДа Александровна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОНПОНКНТЫ:

доктор медипнпскнх 'к. профессор Часухнна I :| Iи11.1 Дмнтриевна

доктор медицинских !.■ у-.. профессор Комиссарова Помп:) Алексеевна

»ЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии паук.

Д002.252.01 при Центре теоретических проблем фтико-хнмическоп фармакологии РАН но адресу; 119991 ГО 1-1, Москва, ул. Косыгина, Д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться а библиотеке Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Автореферат разослан "_19 " марта 2007 года

Ученый секретарь

Диссертационного сонета Д 0112.252.01 Доктор Г'Ж> логических паук

Л,А, Радкеннч

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертационной работы Частота заболеваемости той или иной патологией в разных популяциях различна, и это отличие связано не только с различными экологическими и социальными условиями, но также обусловлено генетическими различиями, приводящими к вариабельности в метаболических параметрах (Пирузян Л А , 2004, Пирузян Л А и соавт, 2004, Пирузян А Л, 2005) Такие метаболические отличия зачастую мо.«ут Г .ль обусловлены однонуклеотидными заменами (БЫР) в колирующих последовательностях генов, что приводит к модуляции функционирования белкового продукта увеличению, снижению или полному отсутствию активности белка Определение значения отдельных генов, их полиморфизмов и вариаций в проявлении индивидуальных фенотипов человека позволит приблизиться к пониманию биологической сущности заболеваний, а получаемые при таком подходе данные дадут возможность выделять группы риска развития исследуемой патологии Заболевание может развиваться в случае неблагоприятного сочетания полиморфных генов, вклад которых в развитие патологического процесса будет различным (Алтухов Ю П , Курбат* ва С Л , 1984, Жукова О В с соавт , 2005) При этом следует принимать во внимание и индивидуальный полиморфизм генов, продукты которых могут и не иметь прямого отношения к данной патологии А именно, индивидуальные генетические особенности организма, определяющие кинетику метаболических превращений лекарственных препаратов, канцерогенов окружающей среды, индустриальных и пищевых источников

Рак прямой кишки по распространенности и причине смертности населения занимает одно из первых мест среди злокачественных опухолей во многих экономически развитых странах Заболеваемость этой формой рака стоит на втором месте после рака легких у мужчин и рака молочной железы у женщин, а по уровню смертности эта патология находится после рака легких, опережая опухоли желудка, предстательной железы и все другие локализации Колоректальный рак в структуре онкологической заболеваемости составляет в странах Европы и Америки от 9 до 14% Ежегодно в мире регистрируется около 800 ООО больных раком этой локализации и 440 000 смертей от этого заболевания Рост заболеваемости наблюдается и в России в 1980 году злокачественные образования этой локализации были диагностированы у 16 человек на 100 000 населения, а в 2000 году этот показатель приблизился к 25 Проблема ранней диагностики опухолевого процесса одна из насущных в современной онкологии Рост заболеваемости и смертности, скудная симптоматика на ранней стадии заболевания, сходство ее с различными заболеваниями толстой кишки, поздняя обращаемость пациентов за квалифицированной медицинской помощью являются определяющими факторами того, что 30-40% пациентов в последующем подвергаются радикальному лечению

л

В связи с этим, актуальными являются исследования, посвященные поиску и идентификации генетических факторов риска этой патологии с целью разработки новых скрининговых программ профилактики и донозологической диагностики, а также индивидуального подбора лекар'гвеь'.ых препаратов в клинике Следует подчеркнуть, что для определения фенотип-специфичных генов заболевания, необходимо применять генетический анализ к различным клиническим группам больных, при этом клинический фенотип каждого пациента должен быть охарактеризован досконально В связи с этим, разработка новых подходов в донозологической диагностики на основе анализа клинических, биохимических и генетических характеристик больных является важной медико-генетической задачей

Цель исследования• разработать подходы донозологической диагностики рака прямой кишки на основе сравнительного анализа клинических, биохимических и генетических характеристик здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки с целью индивидуализации фармакотерапии и профилактики Определены следующие задачи исследования

- Провести сбор информационного и клинического материала у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки,

- Создать компьютерный регистр больных раком прямой кишки на основании информационного материала ИИК (индивидуальная информационная карта),

- Определить особенности распространения классических генетических маркеров (ABC» Rh.-,us, MN, Kell) у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки,

- Провести сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования в московской выборке волонтеров,

- Провести анализ ассоциации полиморфных вариантов гена NAT2 (N-ацетилтрансферазы 2) с риском развития рака прямой кишки,

- Изучить особенности клинических проявлений у пациентов с различным генетическим полиморфизмом системы групп крови и ацетилирования

- Разработать и предложить новый подход для донозологической диагностики, индивидуальной профилактики, а также оптимизации терапии рака прямой кишки, основанный на анализе метаболического и генетического статуса индивидуумов

Научная новизна и практическая значимость работы Показано, что разработанные и апробированные нами критерии Индивидуальной информационной карты (ИИК), позволяют получать необходимую информацию для индивидуального описания пациента с раком прямой кишки Впервые показано, что при определении риска развития рака прямой кишки следует

использовать совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме систем групп

* *

крови и ацетилирования Продемонстрированы возможности подхода, основанного на интеграции

клинических обследований и результатов молекулярно-генетических исследований, выявлять группы риска развития онкологической патологии ректального отдела кишечника Установленное разнообразие среди пациентов с раком прямой кишки по генотипу и фенотипу NAT2 с доминированием медленного N-ацетилирования (NAT2*5/*5) позволит индивидуализировать и оптимизировать фармакологическую и лучевую терапию с учетом известной более высокой чувствительности медленных N-ацетиляторов к побочному действию лекарств и канцерогенов Апробация результатов работы Результаты работы были представлены на III Съезде Биофизиков России, (Воронеж, 2004 г), III съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке сов^меЛгае состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2004), XI и XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), на заседании научного семинара Института общей генетики им Н И Вавилова РАН и на семинарах лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им Н И Вавилова РАН

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также

выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на _ страницах

машинописного текста, включая 7 таблиц и 25 рисунков Список цитируемых лите *атур!ых источников включает_наименование

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ПО ГЛАВАМ ГЛАВА 1 Обзор литературы. Приводятся литературные данные о структуре генома человека и его полиморфизме В первом разделе приводится описание основных видов генетического полиморфизма и их значимость для медицины Описывается генетический полиморфизм системы групп крови и корреляция фенотипов групп крови с заболеваемостью и смертностью Здесь же описывается генетический полиморфизм системы N-ацетилирования у человека, рассматриваются методы определения фенотипа и генотипа N-ацетилирования, представляются литературные данные о связи генетического полиморфизма в системе N-ацетилирования с развитием ряда патологий, в том числе и онкологических Во втором разделе суммированы данные о раке прямой кишки, кратко освещены вопросы эпидемиологии, приводятся современные классификации заболевания, описаны методы диагностики и лечения, кратко рассмотрены основные этиологические факторы

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования

Популяционные выборки Москвы Исследования больных раком прямой кишки

ч

проводили в ГКБ №24 (под руководством доктора медицинских наук, профессора В Б Александрова) Обследованная выборка включала 104 пациента с раком прямой кишки Сбор информационного материала проводили с использованием Индивидуальной Информационной Карты (ИИК), которая включает более 40 критериев Клинический материал был получен также от

волонтеров, которые проживают в г Москва В эксперименты по определению фенотипа ацетилирования были включены 131 человек, по определению генотипа ацетилирования - 168 человек, для выявления взаимосвязи между фенотипом и генотопом ацетилирования - 75 человек Генотипирование клинического материала. Определение антигенной специфичности групп

* V

крови систем ABO, Rhesus, Kell-Chellano, MNNs проводили стандартными серологическими методами агглютинации эритроцитов на плоскости и в пробирках [Иммуносерология (нормативные документы), 1998] Для оценки достоверности различий по частотам фенотипов между двумя группами обследованных использовали стандартные статистические методы [Плохинский, 1970] Определение фенотипа ацетилирования проводили по методу Bratton & Marshall (1938) в нашей модификации Фенотип N-ацетилирования определяется как скорость ацетилирования сульфадимезина и рассчитывается как соотношение АЦС к ОБС (в %) Выделение геномной ДНК проводили из лимфоцитов крови согласно [Sambrook, Russell, 2001]

V *

Генотип NAT2 был охарактеризован с помощью результатов гибридизации на биочипе [Глотов с соавт, 2005]

ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Анализ клинических данных пациентов с раком прямой кишки

Первоначально, Индивидуальная Информационная Карта (ИИК), разработанная ранее [Пирузян А Л , 2005], и модифицированная нами, была использована для сбора информационного материала о пациентах с раком прямой кишки На основе данных ИИК был создан компьютерный регистр данных о пациентах с раком прямой кишки, в эксперимент были включены 104 пациента Анализ базы данных о пациентах с раком прямой кишки позволил продемонстрировать возможности предложенных критериев для выявления как индивидуальных, так и общих особенностей больных этой патологией, а также для классификации пациентов по сходным показателям В таблице 1 представлены данные клинических характеристик пациентов с раком прямой кишки

Как видно из представленных результатов, большинство пациентов с раком прямой кишки, которые были включены в исследование, составляют индивидуумы в возрасте старше 50 лет (более 80%), у большинства пациентов, взятых в исследование, пыяв^на высокодифференцированная аденокарцинома При этом отмечено, что у мужчин несколько выше процент больных с высокодифференцированной аденокарциномой, и несколько ниже - со среднедифференцированной аденокарциномой Сопутствующие патологии отмечены у более 90% пациентов с раком прямой кишки Возможно, высокий процент пациентов с сопутствующими заболеваниями связан с тем, что большинство пациентов составляют индивидуумы старше 50 лет Относительно высокий процент пациентов (более 30%) имеет в анамнезе патологические изменения, такие как кисты, опухоли, полипы и гиперплазии, и эти пациенты могут быть отнесены

к группе риска развития рака прямой кишки Клиницистам следует обращать внимание на таких индивидуумов до постановки диагноза рак прямой кишки и рекомендовать им сдачу пробы на

скрытую кровь и пальцевое исследование ежегодно, а также раз в 3 года - фиброколоноскопию

* »

или ирригоскопию

Таблица I Клинические характеристики пациентов с раком прямой кишки

Клинические Всего Мужчины Женщины

характеристики

Возраст

До 50 лет 14 45 55

Старше 50 лет 86 58 42

Гистологическая

форма 65 56 44

ВДА 25 47 53

СДА 3 53 47

НДА 8 44 56

Прочие

Сопутствующие 98 90 100

патологии (всего)

Патологические

изменения(опухоли, 31 32 30

кисты, полипы,

гиперплазии)

Наследование

Не знают 80 40 60

Знают (Да/Нет) 20(11/9) 8 (5/3) 13(8/5)

Чувствительность к

лекарственным 14 6 8

препаратам

Примечание все данные представлены в процентах ВДА, С ДА, НДА - высоко-, средне и низкодифференцированная аденокарценома, прочие - инвазивный плоскоклеточный, перстневидноклеточный и плоскоклеточный неороговевший.

Для выяснения вопроса о роли наследования в развитии рака прямой кишки был проведен анализ базы данных о пациентах (табл 1 ) Как видно из представленных данных, только 20% пациентов ответили утвердительно о наличии или отсутствия наследственности онколог; гесклми заболеваниями среди родственников первой и второй степени родства При этом только приблизительно у 10% пациентов есть родственники, имеющие онкологические заболевания в анамнезе Низкий процент наследуемости рака прямой кишки (10%), выявленный при анализе базы данных, по-видимому, не отражает общей картины наследования патологии, что связано с тем, что большинство пациентов (80%) не имеют сведений о своих родственниках

Известно, что большинство экзогенных и эндогенных соединений, включая лекарственные препараты и токсические вещества, попадая в организм, подвергаются биотрансформации Индивидуальный ответ на ксенобиотики, включая лекарственные препараты, 'лвля'гся

биотранссформации могут изменить риск развития ряда патологий, связанных с воздействием канцерогенного вещества Анализ базы данных о пациентах позволил выявить более 10% индивидуумов, у которых отмечена лекарственная чувствительность

На основании изложенного выше можно заключить следующее критерии для индивидуального описания пациента с раком прямой кишки, разработанные и апробированные нами, обеспечивают необходимой информацией о патологическом процессе, позволяют ^олу^ать унифицированные данные, которые можно легко формализовать, и создавать на их основе стандартизированные (унифицированные) базы данных о патологии Следует особо подчеркнуть, что, по нашему мнению, использование совокупности унифицированных критериев для описания пациента позволит проводить сравнительный анализ экспериментальных данных, получаемых различными исследователями, как в области изучения патогенеза и генетики патологии, так и в области индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов

3 2 Сравнительное изучение полиморфизма систем групп крови у пациентов с раком прямой кишки и здоровых индивидуумов московской выборки Т

Цель данного раздела работы - выяснить имеются ли различия в особенностях распространения классических генетических маркеров у практически здорового населения и пациентов с раком прямой кишки в московской выборке Для этой цели, клинический материал пациентов с раком прямой кишки (104 пациента) был проанализирован с использованием стандартных методов реакции агглютинации Результаты генотипирования здоровых индивидуумов (700 человек) были любезно предоставлены к б н О Л Курбатовой (Институт общей генетики им Н И Вавилова РАН) Выбор генетических маркеров систем групп крови, основан на данных, имеющихся в литературе о корреляции полиморфизма системы групп крови с заболеваемостью, заживлений ран и смертностью от заболеваний (Алтухов Ю П , Курбатова О Л , 1984, Жукова О В ссоавт,2005)

На основании результатов типирования полиморфизма системы групп крови были рассчитаны частоты фенотипов по каждой из изученных систем наследственного полиморфизма в двух группах индивидуумов - больных раком прямой кишки и «здоровых» с использованием теста х2 (данные в автореферате не приводятся) В группе пациентов с раком прямой кишки частота гена В достоверно выше по сравнению с контрольной группой В контрольной группе соотношение числа лиц с группами крови А и В составляет примерно 2 1, а в группе пациентов это соотношение -примерно 1 1 Следует также отметить что наблюдается тенденция к снижению доли лиц с фенотипом АВ в группе пациентов, по сравнению с контрольной группой Распределение фенотипических комбинаций, рассмотренных как система генотипов трех тесно сцепленных локусов (локус Ос1, Сс и Ее), в сравниваемых группах достоверно не отличается Распределение генотипов двух тесно сцепленных локусов в сравниваемых группах достоверно отличается =

24,05; d.f, - 1; Р<0,001), причем различия в основном ¿¡вязаны с избытком гомозигот МЫ в группе пациентов. В результате этого соотношение ММ и MN в группе пациентов составляет приблизительно 3 : 1, а в группе контроля соотношение эт их фенотипов - приблизительна^? : ■ .

Л>|я оценки такого статистического показателя как соотношение шансов (Odds Ratio), который характеризует исследуемый признак либо как «маркер риска», либо как «протективный маркер», Использовали метод таблиц сопряженности 2x2 с вычислением статистик связи (с поправкой Изйтса на непрерывность). На рисунке 3.1 представлены данные попарного сравнении частот генотипов в группах здоровых и пациентов с раком прямой кишки, сила ассоциаций оценена в значениях показателя соотношения шансов (OR).

Распределение частот фенотипов системы групп крови у пациентов с раком прямой кишки и здоровых индивидуумов

о

о а & a3mmmn nn ctdd&

Контроль I • Паииентъ(.

Рис. 3.1. Распределен^ частот фенотипов системы групп крови у пациентов с рако^ npi/ioñ КйШ(еи и здоровы* индивидуумов. (Ж - соотношение шансов.

При сравнении частот фенотипов системы трупп крови выявлена следующее: отмечена тенденции к снижению частоты генов MNсистемы MNs (р<0,0005) и повышение частоты гена В системы ARO (р<0,001) и частоты гомозизот ММ сйстелш jVINs (р^О.ОООЗ) в группе пациентов по сравнению с контролем. Это означает, что индивидуумы с фенотипом В и имеющие генотип ММ могут быть включены в группу рнеха развития рака прямой кишки, тогда как чпдинидуумы. имеющие генотип MN могут проявлять низкую рред расположенность к данной патологии. Следует также подчеркнуть, что результаты генетического полиморфизма системы групп крови у

Следует также подчеркнуть, что результаты генетического полиморфизма системы групп крови у пациентов с раком прямой кишки и здоровых индивидуум, полученные нами, позволяют предложить иммуногенетические маркеры системы ABO и MNs в качестве генетических маркеров для выявления индивидуумов с повышенным риском развития рака прямой кишки

3.3. Сравнительное изучение результатов генотипирования и фенотипирования по полиморфизму N-ацетилирования в московской выборке волонтеров

i

Цель данного раздела работы - выяснить, на сколько точно можно определить фенотип NAT2 на основании результатов генотипирования, используя метод гибридизации ДНК на олигонуклеотидной матрице (биочип) Такое исследование проведено для российской популяции впервые

Первоначально, фенотип ацетилирования был определен в группе волонтеров (131 индивидуум) методом тестирования скорости ацетилирования сульфадемизина, как описано в разделе Материалы и методы Согласно имеющимся в литературе данным, к быстрым ацетиляторам (БА) относят индивидуумов, у которых в клиническом материале (моча^ через 6 часов уровень проацетилированного сульфадемизина составлял от 70% и более В таблице 3 2 представлены данные по распределению волонтеров московской выборки на быстрых и медленных ацетиляторов (БА и МА) на основании результатов фенотипирования (количественное определение скорости N-ацетилирования)

Таблица 3 2 Частота фенотипов быстрых и медленных ацетиляторов по локусу NAT2 в московской выборке волонтеров, рассчитанная согласно данным фенотипирования и генотипирования

Метод Быстрые ацетиляторы Медленные ацетиляторы *

*абс % абс %

Фенотипирования 71 54 60 46

Генотипирования 93 55 75 45

Примечание *абс - абсолютное значение

Как видно из представленных данных, доля медленных ацетиляторов в московской выборке

волонтеров составляет 46% Полученные результаты характеризуют, прежде всего, распределение

* *

индивидуумов на БА и МА в выборке волонтеров, но не характеризуют распределение между БА и МА в российской популяции в целом

Далее, было проанализировано распределение волонтеров группы медленных и быстрых ацетиляторов по скорости ацетилирования Как видно из представленных данных, в каждой

■ ЧС ".i' ifAt \'M '1 . LI Á I l-.il те T* I, tí É1JS Tg .TS Hit.

СКОРОСТЬ Л " Ц1' ТИМ И . >'(ín НИ

L ._______________-_____1

Рнс. 3.2. Распределение индивидуумов по скорости ацетилнровання. По оси абсцисс отмечены количественные показателя скорости ацетиляровання, tro оси ирдипиг - число индивидуумов с соответствующими количественными показателями скорости анетилнрованни. Число обследуемых волонтером составляет 131 человек.

Генотипирование по гену NAT2 в московской выборке волонтеров (168 индивидуумов)

определяли методом гибридизации Д11К на биочипе. На биочипе расположены пробы длиной от

¡5 Ш гг.О., соответствующие одной ю вариабельных позиций в гене NAT2, восемь т которые

принадлежат к известным м несен с-мутациям (С1')0Т, Gl'И Л, 1341С, <¡364A, (i 59II A, A803G.

t

АЯ45С и GS57A) к дне - к молчащей мутации (С282Т и С759Т). Выбор именно этих мутаций в гене NAT2 не случаен. Следует отметить, что, несмотря на то, что частоты встречаемости аллелей NAT2 значительно варьируют в разных популяциях, к наиболее распространенным среди европеоидов медленным аллелям относят кластеры NAT2*5 (Т341С и AX03G) и NÁT2*6 (С282Т и G590A} (в скобках указана характерная мутация), кластер №17'*? (С282Т и G857A) представлен в основном у монголоидов, a NAT2*! 4 (О) VIA) - только у негроидов.

На основании результатов генсгипирований рассчитывали предполагаемые фенотипы: процент медленных ацетиляторов в выборке волонтеров составил 45% и достоверно не отнимается от результатов, полученных при определении фенотипа ацетилирования методом тестирования скорости ацетилирования (табл. 3.2.). Для тою, чтобы выяснить наличие взаимосвязи между фенотипом как точным количественным показателем ацетилируюшей способности и генотипом как качественным показателем ацетилирующей способности (быстрый или медленный) нами проведено сравнение по этим показателям у 75 индивидуумов (данные в автореферате не приводятся). Было показано, что только в 87% (у 62 из 75 индивидуумов) обнаружена полная конкордантность между фенотипом и генотипом. Выявленные несоответствия могут быть

обусловлены рядом причин присутствием иных вариантных аллелей с другим сочетанием мутаций в исследуемой популяционной выборке, наряду с хорошо изученными вариантными аллелями в других популяциях, присутствием других молчащих мутаций (Т111С и С481Т), которые могут изменять структуру мРНК и тем самым повлиять на процессинг, транспорт мРНК в цитоплазму и эффективность трансляции, наличием мутаций в промоторной области гена NAT2, которые могут приводить к уменьшению экспрессии гена и, как следствие, к уменьшению скорости ацетилирования При этом показано, что для одного и того же генотипа количественные значения скорости ацетилирования варьируют в широких пределах (данные в автореферате не приводятся)

На основании полученных данных и сравнительного анализа можно сделать сггдуюпие заключения Метод определения ацетилирующей способности индивидуума для выявления фенотипа ацетилирования за одно измерение позволяет суммировать все известные полиморфизмы и количественно определить уровень ацетилирования у индивидуума и может быть предложен для количественной оценки скорости ацетилирования и более точного предсказания риска токсичности или положительного эффекта от применения лекарственных препаратов Метод гибридизации ДНК на олигонуклеотидной матрице (биочипе) позволяет точно определять генотипы и аллели, а также распределение частот аллелей и генотипов в популяционных выборках индивидуумов и может быть предложен для попул.-»ио1 • ых исследований генетического полиморфизма ацетилирования индивидуумов без фенотипирования, в том числе, с целью установления корреляции предрасположенности к заболеваниям данного индивидуума с генотипом ацетилирования

3.4 Сравнительное изучение полиморфизма систем N-ацетилирования у пациентов с раком прямой кишки и здоровых индивидуумов московской выборки

Цель данного раздела работы - выяснить имеются ли различия в особенностях распространения частот аллелей и генотипов гена NAT2 у практически здорового населения и пациентов с раком прямой кишки в московской выборке "

Для этой цели использовали метод гибридизации ДНК на биочипах и геномную ДНК, выделенную из клинического материала пациентов с раком прямой кишки (104 пациента) и здоровых индивидуумов (99 человек) На основании результатов генотипирования образцов ДНК пациентов и здоровых индивидуумов была рассчитана частота аллелей и генотипов NAT2 в сравниваемых группах Сравниваемые группы заметно отличаются только по частоте аллеля NAT2*4 («быстрый» аллель) - частота аллеля NAT2*4 снижена в группе пациентов, однако различия не достигают порога статистической значимости (данные в автореферате не приводятся) На рисунке 3 4 представлены данные попарного сравнения частот генотипов NAT2 в группах

здоровых и Ьациентов с раком прямой кишки, сила ассоциаций оценена в значениях показателя соотношения шансов (OR).

Распределение генотипов МАТ2 в группе пациентов с раком прямой кишки и здоровых индивидуумах

Генотипы

а Пациенты i ■ Здоровые:

1'ис. 3.4. Распределение частот генотипов NAT2 и сравниваемы* группах.

При сравнений генотипов NAT2 были выявлены следующие закономерности: отмечена тенденция к повышению частоты генотипов ЩАТ2*5/*5, NAT2*5/I2 и NAT2*6/*6 и снижение частоты генотипов NAT2*4/*5, NAT2*4/6 и NAT2*5/*6 п группе пациентов по сравнению с контролем. При этом, достоверные отличия показаны только для генотипа V-)Т2*5/*5 (р<0,0б) и NAT2*4/*5 (р<0,02). Это означает, что индивидуумы, имеющие генотип NAТ2*5/*5, могут быть включены в группу риска развития рака прямой кишки, тогда как индивидуум^ имеющие генотип NAT2*4/*5, могут проявлять низкую пред расположенность к данной патологии. Известно, что NAT2 полиморфизм имеет клинический интерес, поскольку генетические дефекты в ацетилировании могут выступать в качестве факторов риска возникновении целого ряда заболеваний, и том числе и онкологических. Следует подчеркнуть, что результаты генетического полиморфизма NAT? у пациентов с раком прямой кишки и здоровых индивидуум, полученные нами, позволяют предложить эти генетические маркеры для определения риска развития рака прямой кишки. Исходя из результатов генотип ированик, были рассчитаны частоты фенотипов N-ацетилирования в сравниваемых группах (данные в автореферате не приводятся), " груше пациентов отмечена тенденция к увеличению числа индивидуумов с медленным фенотипом N-ацетилироьания, однако эти отличия статистически не достоверны.

3 5 Взаимосвязь генетического полиморфизма в системах групп крови и ацетилирования с риском развития рака прямой кишки и чувствительностью к лекарственным препаратам

Для того, чтобы выяснить взаимосвязь между генетическим полиморфизмом системы групп крови и N-ацетилирования и риском развития рака прямой кишки был проведен анализ ^азы данных клинических и молекулярно-генетических характеристик пациентов с paKonji прямой кишки I

Первоначально было рассчитано распределение пациентов с различными гистологическими формами рака прямой кишки в зависимости от предполагаемых генетических факторов! риска В качестве генетических факторов риска рассматривались - группа крови В (система ABO), генотип ММ (локус MNs) и генотип NAT2*S/*5 Для выяснения вклада предполагаемого фактора риска в развитие той или иной гистологической формы рака прямой кишки показатели, характерные для каждого генетического маркера, сравнивали с таковыми для общей совокупности огал<",ых генотипов каждой из исследуемых полиморфных систем Было установлено, что доля пациентов, имеющих генотип ММ, как возможный генетический фактор риска развития патологии, практически для всех гистологических форм аденокарценомы выше по сравнению с остальными генотипами этой системы Для других потенциальных генетических маркеров риска развития патологии (группа крови В и генотип NAT2*5/*5) такой корреляции не выявлено Следует отметить, что в этом анализе каждый генетический маркер (потенциального риска развития патологии) был рассмотрен отдельно от других генетических маркеров риска

Как было показано выше, индивидуумы, имеющие генотип MN или генотип ЛЛГ2 '¡/*5 могут проявлять низкую предрасположенность к данной патологии Это означает, что эти индивидуумы имеют так называемые «протективные» генотипы В связи с этим возникает вполне справедливый вопрос почему у индивидуумов, имеющих «протективные» генотипы, развивается исследуемая патология'' Для того, чтобы ответить на этот вопрос был проведен анализ базы данных клинических и молекулярно-генетических характеристик пациентов В ходе этого анализа было рассчитано распределение пациентов с различными гистологическими формами рака прямой

кишки в зависимости от наличия у них совокупности предполагаемых генетических факторов

*

риска (рис 3 5)

¡s

Распределение пациентов с разными гистологическими формами рака примой кишки и зависимости ог числа генетических факторов риска развития патологии

Всего 1 ГМ 2ГМ ЗГМ Нет

Рис. 3,5, Распределение пациентов с разными гистологическими фирмами рака причин кишки R зависимости от наличии совокупности генетических факторов риска развития патологии. ПДА, СДЛ, ИДА — высоко-, средне- и ишкодиффереицированиая адеиокарцеиомьц соответственно. Прочие - другие гистологические формы рака примой кишки. Всего - ойшее число пациентов, имеющих соответствуй)щий генетический фактор риска. 1ГМ, 2ГМ и ЗГМ - число пациентов, именпцнх одни, два и три генетически); маркера риска развитии патологии^ соответственно. Hei - число пациентов, которые не имели ни одного Генетического маркера [шска развития рака примой кишки.

При этом. было Доведено сравнение числа пациентов с разными гистологическими формами патологии а следующих группах: группа пациентов, которые имеют хотя бы один генетический маркер (либо группа крови И (система ABO,), либо генотип A/M (локуе MNs), либо генотип NAT2*5/*5y, группа пациентов, у которых дна генетических маркера сочстаны (либо группа крови В (система ABO) и генотип ММ (локус MNs); либо группа крови В (система ABO) и генотип NA Т2 *5/*5; либо генотип ММ (локус MNs) и генотип NAT2*S/*5)\ группа Педиеь'гов, имеющих совокупность генетических маркеров риска развития патологии (группа крови В (система AI30), генотип ММ (локус MNs) и генотип NAТ2*5/*5) и :руппа пациентов, которые не имею i ни ОДНОГО генетического маркера риска разви тие патологии.

Следует отметить, что более половины пациентов, имеют два сочетай я ых генетических маркера риска развития пашюгии (рис. 3.5). При этом, более, чем у половины пациентов этой группы наряду с двумя сочетании ми маркерами риска выявлен хотя бы один «протективный» генетический маркер (либо генотип MN, либо re потоп NAT2*4/*5).

Далее сила ассоцилции между числом генетических маркеров и риском разви гия рака прямой кишки была оценена в значениях показателя соотношение гшшеов (рое. 3.6).

Pili:, Сила ассоциации между числом генетических маркеров и риском развития рака прямой кишки, 1ГМ, 2ГМ и ЗГМ - Число генетических маркеров у индивидуумов

Как видно ич лреастааленйЫх на рисунке 3.6. результатов, при сравнении групп пациентов, имеющих генетические маркеры и ие имеющих таковых, достоверные отличия выявлены только для пациентов, имеющих два генетических маркера (2ГМ) (р<0,001). Полученные результаты свидетельствуют о том, что индивидуумы, имеющие два генетических маркера, имеют Высокую вероятность развитая рака прямой кишки.

Таким образом, результаты исследований продемонстрировали, что при определении риска развития рака прямой кишки следует использовать совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме системы групп крови и ацетил и рования. Корректность ЭТОГО заключения подтверждают и другие результаты анализа базы данных клинических и монекулярно-генетических характеристик пациентов с раком прямой кишки (рис. 3.7 и 3.8).

Первоначально, было рассчитано распределение пациентов, имеющих такие патологические изменения как полипы, опухоли, «етастазы, кисты и гиперплазии в зависимости от наличия генетических факторов риска развития патологии - группы крови В, генотипа ММ и NAT2*5/*5 (.ад.чные в автореферате не приводятся). Результаты исследований показали, что доля пациентов! имеющих гиперплазии, опухоли, кисты, полипы и метастазы в анамнезе, а также имеющие генотип ММ, как возможный генетический фактор риска развития патологии, выше но сравнению с остальными генотипами этой системы. Для потенциальных генетических маркеров риска развития патологии в системе группы кропи ARO такой корреляции не выявлено. При этом, практически все пациенты, имеющие гиперплазии, опухоли, кисты, полипы и метастазы в анамнезе, характеризовались генотипом NAT2*5/*5.

Далее было рассчитано распределение пациентов, имеющих гиперплазии, опухоли, кисты, ПОЛИПЫ и метастазы к анамнезе, в Зависимости от наличия у них совокупности предполагаемых

Сила ассоциации момду чнепом генетических маркеров и риской развития рака прямой кишки

генетических факторов риска (данные в автореферате не приводятся). При этом, было проведено сравнение в следующих группах: группа пациентов, которые имеют хотя бы один генетический маркер (группа крови Л или генотип ММ или генотип Л''.-1Т2*5/*5)~, фуппа пациентов, у >это;-1Х выявлены два генетических маркеров одновременно (группа крови В и генотип ЫМ\ группа крови I3. и генотип МАТ2*5/*5\ генотип ММ и генотип Л'/]Г2*5/*Ь)\ группа пациентов, имеющих совокупность генетических маркеров риска развития патологии (группа крови В, генотип ММ и генотип ЫАТ2*5/*5) и группа пациентов, которые не имеют ни одного генетическою маркера риска развития патологии. Результаты проведенного исследования показали, что число пациентов, которые не имеют ни одного генетического маркера риска, весьма незначительно (1 пациент из 35 имеющих и анамнезе патологические изменения), остальные пациенты имели хотя бы один генетический маркер риска развития патологии При этом около половин*.! тш'ЛХ пациентов, имеют одновременно два генетических маркера риска развития патологии (данные в автореферате не приводятся).

Для того, чтобы оцепить силу ассоциации между числом генетических маркеров и возможным риском развития патологических изменений (опухолей, метастаз, кист, гиперплазии) у пациентов с раком прямой кишки проведен анализ базы клинических, биохимических и генетических данных о пациентах. Сила ассоциации была оценена в значениях показателя соотношение шансов (рис. 3.7).

Сила ассоциаций между числом генетических маркёров и риском развития патологических изменений у пациентов с раком примой кишки

Рис. 3.7, Сила ассоциаций между числом генетических маркеров (I'M) и риском развития патологически* изменений (опухолей, полипов, кист, метастаз и гиперплазии) у пациентов с раком прямой кишки. П'М, 2ГМ и ЗГМ - число генетических маркеров в индивидуумов.

Как видно из представленных на рисунке 3.7. результатов, достоверные отличия выявлены для пациентов, имеющих два генетических маркера (2ГМ р<0,0006). При сравнении друзяк

групп пациентов достоверных отличий не выявлено. Па основании полученных результатов можно сделать вполне обоснованное заключение, что индивидуумы, у которых выявляются два генетических маркера, имеют предрасположенность к развитию новообразований, в том числе и онкологических, а также к развитию различных гиперпластических процессов.

Как уже упоминалось выше, большинство пациентов, имеющих гиперплазии, опухоли, кисты, полипы и метастазы в анамнезе, характеризуются генотипом N.4Т2*5/*5 Мы оценили силу ассоциации между генотипом ЫАТ2*5/*5 и риском развития патологических изменений у пациентов с ракам прямой кишки как показатель соотношения шансов (рис. 3,8). П;ч э~. ■ м. |-руппа пациентов с патологическими изменениями была разделена на пациентов, имеющих генотип ШТ2*5/*5 и на пациентов, имеющих другие генотипы ЫАТ2. Полученные данные свидетельствуют о том, что пациенты с раком прямой кишки, имеющие генотип ИАТ2*5/*5 могут быть ВКЛючеНН в группу риска более агрессивного ¡¡регрессирования опухолевого процесса (метастаз пропан не), а также вероятного формирования нового опухолевого заболевания.

Сила ассоциации между генотипом Г.А1 /*г>."5 и риском развития патологических изменений у пациентов с раком прямой кишки

во 70 60 X

^ ДО 30 20 10 о

^еегс пациенты е

шик* - .<1

ПИПШИШШ1

Рис. 3.8. Сила ассоциации между генотипом Р1ЛТ2*5/*5 к риском развития патологических изменений (опухоли, полипы, кисты, гиперплазии и метастазы) в пациентов с раком прямой кишки

Анализ базы данных позволил выявить еще интересный факт - все пациенты (6 человек), В анамнезе которых отмечено еще одно онкологическое заболевание другой локализации, были гомозиготами как но гену ШТ2 (имели генотип МАТ2*5/*5 или ЫАТ2*6/*(>), так и по системе Л/Л1' (имели генотип ММ или МУ). Это свидетельствует в пользу того факта, что гомозиготы являются менее приспособленными генотипами в отношении устойчивости к развитию заболевании

Как уже описано в разделе 3,1,. при анализе базы данных о пациентах с раком прямой кишки выявлено более 10% индивидуумов, у которых отмечена лекарственная чувствительность. При этом, было выявлено, что пациенты, у которых отмечена чувствительность к лекарственным

препаратам имели *5 или *6 аллель гена NAT2 и следующие генотипы NAT2*4/*6 (2 пациента), NAT2*S/*12 (2 пациента), NAT2*5/*5 (2 пациента), NAT2*5/*6 (2 пациента), NAT2*6/*6 (2 пациента), NAT2*6/*7 (2 пациента) Следует отметить, что все пациенты, у которых отмечена чувствительность к лекарственным препаратам (аллергическая реакция на ряд препаратов), характеризуются медленным или промежуточным фенотипом ацетилирования, который определен исходя из результатов генотипирования

Заключение

Выявление вариаций последовательностей генома в генофондах человеческих популяций, выяснение их значимости и вклада в проявление фенотипических признаков, и, в частности, в предрасположенности к развитию определенных заболеваний, или в чувствительности к определенному лекарственному препарату может послужить основой генетической и метаболической паспортизации индивидуумов для медицинских целей Самым важным, на наш взгляд, в таких исследованиях является интеграция клинических обследований и результатов лабораторных исследований Для такой интеграции необходимым условием является создание стандартизированных (унифицированных) баз данных информационного материала и результатов лабораторных исследований о пациентах с патологией На основании результатов анализа клинических характеристик пациентов с раком прямой кишки показано, что для создания баз данных могут быть использованы разработанные и апробированные нами критерии Индивидуальной информационной карты (ИИК), которые позволяют получать необходимую информацию для индивидуального описания пациента с раком прямой кишки Помимо этого критерии позволяют учитывать наследственную предрасположенность к заболеванию, .факиры окружающей среды и образ жизни индивидуума, получать унифицированные данные, которые можно легко формализовать, и создавать на их основе стандартизированные (унифицированные) базы данных о патологии Следует особо подчеркнуть, что, по нашему мнению, использование совокупности унифицированных критериев для описания пациента позволит проводить сравнительный анализ экспериментальных данных, получаемых различными исследователями, как в области изучения патогенеза и генетики патологии, так и в области индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов

Проведенный анализ клинического материала позволил выявить особенность в распространении классических генетических маркеров системы групп крови у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки, а именно, снижение частоты генов MN системы MNs и повышение частоты гена В системы ABO и частоты гомозизот ММ системы MNs в группе пациентов по сравнению с контролем На основании этих результатов, иммуногенетические маркеры системы ABO и MNs предложены в качестве генетических маркеров для выявления индивидуумов с повышенным риском развития рака прямой кишки

Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму К-ацетилирования показал, что доля медленных ацетиляторов (МА), определяемая с использованием двух подходов, достоверно не отличается 46% (при фенотипировании) и 45% (при генотипировании) Показано, что абсолютные значения скорости ацетилирования варьируют в широких пределах для быстрых и медленных ацетиляторов Продемонстрировано, что фенотип ацетилирования может быть экстраполирован из результатов генотипирования гена К'АТ2

Проведенный анализ клинического материала позволил выявить особенности в распространении частот аллелей и генотипов гена ИАТ2 у практически здорового населения и пациентов с раком прямой кишки в московской выборке Статистически достоверно показано преобладание у пациентов с раком прямой кишки группы генотипа ИАТ2*5/*5 и <у«ш»чие частоты генотипов ИА Т2 *4/*5 по сравнению с контролем

Использование подхода, основанного на интеграции клинических обследований и результатов молекулярно-генетических исследований, позволило заключить следующее при определении риска развития рака прямой кишки следует использовать совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме системы групп крови и ацетилирования Это заключение базируется на результатах о взаимосвязи сочетанного полиморфизма в системах групп крови и ацетилирования с риском развития рака прямой кишки, а именно, показано, что индивидуумы с двумя сочетанными генетическими маркерами риска имеют высокую вероятность разв «гия чка прямой кишки Помимо этого, установлено, что пациенты с раком прямой кишки, имеющие два генетических маркера риска развития патологии или генотип ЫАТ2*5/*5, могут быть включены в группу риска более агрессивного прогрессирования опухолевого процесса (метастазирование), а также вероятного формирования нового опухолевого заболевания Таким образом, получены результаты, экспериментально подтверждающие возможности подхода, основанного на интеграции клинических обследований и результатов молекулярно-генетических исследований, выявлять группы риска развития онкологической патологии

Выводы * '

1 На основании результатов анализа клинических характеристик пациентов с раком прямой кишки показано, что для создания баз данных могут быть использованы разработанные и апробированные нами критерии Индивидуальной информационной карты (ИИК), которые позволяют получать необходимую информацию для индивидуального описания пациента с раком прямой кишки

2 Выявлены особенности в распространении классических генетических маркеров системы групп крови у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки итмечено

снижение частоты генов MN системы MNs и повышение частоты гена В системы ABO и частоты гомозизот ММ системы MNs в группе пациентов по сравнению с контролем

3 На основании сравнительного анализа результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования в московской выборке показано, что фенотип ацетилирования может быть экстраполирован из результатов генотипирования гена NAT2

4 Выявлены особенности в распространении частот аллелей и генотипов гена NAT2 у практически здорового населения и пациентов с раком прямой кишки в московской выборке Показано статистически достоверное преобладание у пациентов с раком прямой кишки группы генотипа NAT2*5/*5 по сравнению с контролем

5 Показано, что совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме системы групп крови и ацетилирования (сочетание генетических маркеров группы крови В, локуса ММ и генотипа NAT2*S/*5), может быть использована для выявления групп риска предрасположенности к раку прямой кишки

6 Установлено, что пациенты с раком прямой кишки, имеющие два генетических маркера риска развития патологии или генотип NAT2*5/*5, могут быть включены в группу р^ска более агрессивного прогрессирования опухолевого процесса (метастазирование), а также вероятного формирования нового опухолевого заболевания

7 Установленное разнообразие среди пациентов с онкологическим заболеванием по генотипу и фенотипу NAT2 с доминированием медленного фенотипа (генотип NAT2*5/*5) позволит индивидуализировать и оптимизировать фармакологическую и лучевую терапию с учетом известной более высокой чувствительности медленных N-ацетиляторов к побочному действию лекарств и канцерогенов

• л

ПУБЛИКАЦИИ

1 Радкевич Л А , Коршунов И Б , Пынько Н Э , Морозова Н В , Маркарова Е В, Нечаев Д С , академик Пирузян Л А ПОИСК БИОХИМИЧЕСКИХ ПРЕДИКТОРОВ ФЕНОТИПА NAT2 С ЦЕЛЬЮ ОПТИМИЗАЦИИ ПРОФИЛАКТИКИ И ФАРМАКОТЕРАПИИ ПРИ ЦИРРОЗЕ ПЕЧЕНИ //ДАН, 2005, т 400, № 3, с 400-403

2 И В Голденкова-Павлова, С А Брускин, Р М Абдеев, Е В Маркарова, С Г Бигвава, Л А Радкевич, Ж М Кожекбаева, А С Глотов, О А Гра, А С Заседателев, Т В Наседкина, X А Курданов, Э С Пирузян СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ФЕНОТИПИРОВАНИЯ И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПО ПОЛИМОРФИЗМУ ' N-АЦЕТИЛИРОВАНИЯ У ЧЕЛОВЕКА//Генетика 2006, том 142, 8, с 1143-1150

ЗОВ Жукова, Ю В Шнейдер, И Ю Морозова, И Н Шильникова, А В Семиков, И В Голдинкова, М К Саркисова, М О Раджабов, Е В Маркарова, Ан Л Пирузян ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ И ПСОРИАЗ В ТРЕХ ЭТНИЧЕСКИХ ГРУППАХ ДАГЕСТАНА //Генетика 2005, том 41, №12, с 1702-1706

4 Радкевич Л А , Морозова Н В , Сошинский И С , Маркарова Е.В , Габриелян J1 И , Нечаев ДС, Стасенок ФЛ, Соколова НП ВЗАИМОСВЯЗЬ СМЕРТНОСТИ ОТ РЯДА ХРОНИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ С ЧАСТОТОЙ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ФЕНОТИПА БЫСТРОГО N-АЦЕТИЛИРОВАНИЯ В ЭТНИЧЕСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ //III Съезд Биофизиков России, 2429 июня 2004 г , Воронеж, Тезисы докладов, том II, с 563 .

5 Морозова Н В , Маркарова Е. R., Радкевич Л А ЗАВИСИМОСТЬ СМЕРТНОСТИ ПРИ РЯДЕ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ ОТ ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ФЕНОТИПА БЫСТРОГО N-АЦЕТИЛИРОВАНИЯ В ЭТНИЧЕСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ //Сборник материалов 3 съезда генетиков и селекционеров «Генетика XXI века современное состояние и перспективы развития» 6-12 июня 2004, с 92

6. Морозова Н В , Пынько Н Э , Сошинский И С , Маркарова Е.В., Габриелян Л И , Маркова Л М, Стасенок Ф Л , Радкевич Л А СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СМЕРТНОСТИ ПРИ РАКЕ ПЕЧЕНИ И ЖЕЛУДКА В ЭТНИЧЕСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ, ОТЛИЧАЮЩИХСЯ ЧАСТОТОЙ ВСТРЕЧАЕМОСТИ ФЕНОТИПА БЫСТРОГО N-АЦЕТИЛИРОВАНИЯ С ЦЕЛЬЮ ОПТИМИЗАЦИИ ПРОФИЛАКТИКИ И ФАРМАКОТЕРАПИИ /Яезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 19-23 апреля 200ч г, Общероссийский общественный фонд "Здоровье человека" М , 2004, стр 550-551

7 Морозова Н В , Пынько Н Э , Сошинский И С , Маркарова Е.В , Габриелян Л И , Радкевич Л А ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ФЕНОТИПА БЫСТРОГО N-АЦЕТИЛИРОВАНИЯ И ФАТАЛЬНЫХ ИСХОДОВ ПРИ РЯДЕ ХРОНИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ В ЭТНИЧЕСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ С ЦЕЛЬЮ ОПТИМИЗАЦИИ ПРОФИЛАКТИКИ И ФАРМАКОТЕРАПИИ //Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 19-23 апреля 2004 г, Общероссийский общественный фонд "Здоровье человека" М , 2004, стр 550

8 Радкевич Л А , Остапчук Н В , Пынько Н Э , Морозова Н В , Сошинский И С , М%лкакова Е В , Габриелян Л И , Стасенок Ф Л ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ НАРУШЕНИЙ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА ПРИ ЦИРРОЗЕ ПЕЧЕНИ У КРЫС В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФЕНОТИПА N-АЦЕТИЛИРОВАНИЯ //Тезисы докладов XI Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 19-23 апреля 2004 г, Общероссий:кий общественный фонд "Здоровье человека" М , 2004, стр 826

9 Маркарова Е В , Гюльазизова К С , Кабаков Е А , Радкевич А Д , Щукин А А , Пынько НЭ, Сухинина ГП, Николаева ИС, Радкевич Л А ВЗАИМОСВЯЗЬ ФЕНОТИПА N-АЦЕТИЛИРОВАНИЯ С РИСКОМ РАЗВИТИЯ РАКА ПРЯМОЙ КИШКИ //Тезисы докладов XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 19-23 апреля 2007 г

• V

10 Ан Л Пирузян, И В Голденкова - Павлова, Р М Абдеев, И М Корсунская, Е Е Агафонова, П И Ахмедова, Е В. Маркарова, С Г Бигвава, М К Саркисова, Л А Пирузян ИИК КАК ЭФФЕКТИВНЫЙ ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ СБОРА И АНАЛИЗА ИНФОРМАЦИИ О МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫХ ПАТОЛОГИЯХ НА ПРИМЕРЕ ПСОРИАЗА Молекулярная медицина, 2007, № 4 (в печати)

Частота заболеваемости той или иной патологией в разных популяциях различна, и это отличие связано не только с различными экологическими и социальными условиями, но также обусловлено генетическими разл'ичиь'ми, приводящими к вариабельности в метаболических параметрах [Пирузян J1.A., 2004; Пирузян Л.А. и соавт., 2004; Пирузян А.Л. 2005]. Такие метаболические отличия зачастую могут быть обусловлены однонуклеотидными заменами (SNP) в кодирующих последовательностях генов, что приводит к модуляции функционирования белкового продукта. Такими модуляциями могут быть: увеличение, снижение или полное отсутствие активности белка. Определение значения отдельных генов, их полиморфизмов и вариаций в проявлении индивидуальных фенотипов человека позволит приблизиться к пониманию биологической сущности заболеваний, а получаемые при таком подходе данные позволят выделять группы риска развития исследуемой патологии. Заболевание может развиваться в случае неблагоприятного сочетания полиморфных гейов, вклад которых в развитие патологического процесса будет различным [Алтухов Ю.П. Курбатова O.JI„ 1984: Жукова О.В. с соавт. 2005]. При этом следует принимать во внимание и индивидуальный полиморфизм генов, продукты которых могут и не иметь прямого отношения к данной патологии. А именно, индивидуальные генетические особенности организма, определяющие кинетику метаболических превращений лекарственных препаратов. канцерогенов окружающей среды, индустриальных и пищевых источников.

Рак прямой кишки (колоректальный рак) по распространенности и причине смертности населения занимает одно из первых мест среди злокачественных опухолей во многих экономически развитых странах. Заболеваемость этой'форХюй рака стоит на втором месте после рака легких у мужчин и рака молочной железы у женщин, а по уровню смертности эта патология находится после рака легких, опережая опухоли желудка, предстательной железы и опухоли всех других локализаций. Ежегодно в мире регистрируется около 800 ООО больных раком этой локализации и 440 000 смертей от этого заболевания. Рост заболеваемости наблюдается и в России: в 1980 году злокачественные образования этой локализации были диагностированы у 16 человек на 100 000 населения, а в 2000 году этот показатель приблизился к 25. Проблема ранней диагностики опухолевого процесса одна из насущных в современной онкологии. Рост заболеваемости и смертности, скудная симптоматика на ранней стадии заболевания, сходство ее с различными заболеваниями толстой кишки, поздняя обращаемость пациентов за квалифицированной медицинской помощью являются определяющими факторами того, что 30-40% пациентов в последующем подвергаются радикальному лечению. В связи с этим, актуальными являются исследования, посвященные поиску и идентификации генетических факторов риска этой патологии с целью разработки новых скрининговых программ профилактики и донозологической диагностику, а также индивидуального подбора лекарственных препаратов в клинике.

Следует подчеркнуть, что для определения фенотип-специфичных генов заболевания, необходимо применять генетический анализ к различным клиническим группам больных, при этом клинический фенотип каждого пациента должен быть охарактеризован досконально. В связи с этим, разработка новых подходов в допозологической диагностики на основе анализа клинйческих, биохимических и генетических характеристик больных является важной медико-генетической задачей.

В планируемом исследовании предполагается разработать подходы донозологической диагностики рака прямой кишки на основе сравнительного анализа клинических, биохимических и генетических характеристик здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки. Исходя из цели исследования, определены следующие задачи:

- Провести сбор информационного и клинического материала у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки:

- Создать компьютерный регистр больных раком прямой кишки на основании информационного материала ИИК (индивидуальная информационная карта);

- Определить особенности распространения классических генетических маркеров (ABO, Rhesus. MN. Kell) у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки:

Провести сравнительный анализ результатов фенотипировгчшя . и генотнпирования по полиморфизму N-ацетилирвоания в московской выборке волонтеров;

- Провести анализ ассоциации полиморфных вариантов гена NAT2 (N-ацетилтрансферазы 2) с риском развития рака прямой кишки;

- Изучить особенности клинических проявлений у пациентов с различным генетическим полиморфизмом системы групп крови и ацетилирования.

- разработать и предложить новый подход для донозсшогической диагностики рака прямой кишки, основанный на анализе метаболического и генетического статуса индивидуумов.

Научная новнзна и практическая значимость работы. Показало. 'по разработанные и апробированные нами критерии Индивидуальной информационной карты (ИИК). позволяют получать необходимую информацию для индивидуального описания пациента с раком прямой кишки. Впервые показано, что при определении риска развития рака прямой кишки следует использовать совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме систем групп крови и ацетилирования. Продемонстрированы возможности подхода, основанного на интеграции клинических обследований и результатов молекулярно-генетических исследований, выявлять группы риска развития онкологической патологии ректального отдела кишечника. Установленное разнообразие среди пациентов с раком прямой кишки по генотипу и фенотипу NAT2 с доминированием медленного N-ацетилирования (NAT2*5/*5) позволит индивидуализировать и оптимизировать фармакологическую и лучевую терапию с учетом известной более высокой чувствительности медленных N-ацетиляторов к побочному действию лекарств и канцерогенов.

Выводы

1. На основании результатов анализа клинических характеристик пациентов с раком прямой кишки показано, что для создания баз данных могут быть использованы разработанные и апробированные нами критерии Индивидуальной информационной карты (ИИК). которые позволяют получать необходимую информацию для индивидуального описания пациента с раком прямой кишки.

2. Выявлены особенности в распространении классических генетических маркеров системы групп крови у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки. Отмечено снижение частоты генов MN системы MNs и повышение частоты гена В системы АВО и частоты гомозигот ММ системы MNs в группе пациентов по сравнению с контролем.

3. На основании сравнительного анализа результатов фенотипнрования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования в московской выборке показано, что фенотип ацетилирования может быть экстраполирован из результатов генотипирования гена NAT2.

4. Выявлены особенности в распространении частот аллелей и генотипов гена NAT2 у практически здорового населения и пациентов с раком прямой кишки в московской выборке. Показано статистически достоверное преобладание у пациентов с раком прямой кишки группы генотипа NAT2*5/*5 по сравнению с контролем.

5. Показано, что совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме системы групп крови и ацетилирования (сочетание генетических маркеров группы крови В. локуса ММ и генотипа NAT2*S/*S), может быть использована для выявления групп риска предрасположенности к раку прямой кишки.

6. Установлено, что пациенты с раком прямой кишки, имеющие два генетических маркера риска развития патологии или генотип NAT2*5/*5, могут быть включены в группу риска более агрессивного прогрессирования опухолевого процесса (метастазирование), а также вероятного формирования нового опухолевого заболевания.

Установленное разнообразие среди пациентов с раком прямой кишки по генотипу и фенотипу NAT2 с доминированием медленного N-ацетилирования (NAT2*5/*S) позволит индивидуализировать и оптимизировать фармакологическую и лучевую терапию с учетом известной более высокой чувствительности медленных N-ацетиляторов к побочному действию лекарств и канцерогенов.

Заключение

Выявление вариаций последовательностей генома в генофондах человеческих популяций, выяснение их значимости и вклада в проявление фенотипических признаков, и. в частности, в предрасположенности к развитию определенных заболеваний, или в чувствительности к определенному лекарственному препарату может послужить основой генетической и метаболической паспортизации индивидуумов для медицинских целей [Пирузян JI.A, 1990; 2004; 2005]. Самым важным, иа наш взгляд, в таких исследованиях является интеграция клинических обследований и результатов лабораторных исследований. Для такой интеграции необходимым условием является создание стандартизированных (унифицированных) баз данных информационного материала и результатов лабораторных исследований о пациентах с патологией.

На основании результатов анализа клинических характеристик пациентов с раком прямой кишки показано, что для создания баз данных могут быть использованы разработанные ранее [Пирузян Ан.Л., 2005] и апробированные нами критерии Индивидуальной информационной карты (ИИК). которые позволяют получать необходимую информацию для индивидуального описания индивидуумов [Жукова О.В. и др. 2005; Пирузян Ан.Л. и др., 2005; Голденкова-Павлова И.В. и др. 2006]. Помимо этого критерии позволяют: учитывать наследственную предрасположенность к заболеванию, факторы окружающей среды и образ жизни индивидуума; получать унифицированные данные, которые можно легко формализовать, и создавать на их основе стандартизированные (унифицированные) базы данных о патологии. В нашем исследовании апробированы критерии ИИК. разработанной ранее и модифицированной нами для сбора информационного материала о пациентах с раком прямой кишки. Показана возможность предложенной ИИК для создания унифицированной базы данных о пациентах, а также для выявления общих, групповых и индивидуальных особенностей исследуемой патологии. Пополняя и используя базу данных, полученную с помощью унифицированных критериев ИИК. в дальнейшем возможна разработка скрининговых программ, направленных на профилактику патологий. Кроме этого. ИИК с унифицированными критериями является корректным инструментом для эпидемиологических исследований и генетического анализа патологии. Следует особо подчеркнуть, что. по нашему мнению, использование совокупности унифицированных критериев для описания пациента позволит проводить сравнительный анализ экспериментальных данных, получаемых различными исследователями, как в области изучения патогенеза и генетики патологии, так и в области индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов.

Проведенный анализ клинического материала позволил выявить особенности в распространении классических генетических маркеров системы групп крови у здоровых индивидуумов и пациентов с раком прямой кишки. Так. в группе пациентов чаще, чем можно было ожидать, исходя из свойств московского генофонда, представлены фенотипы ММ системы MNs и В системы АВО. Судя по значению критерия сопряженности у} для данного расчета (Таблица 3.1.) отмеченное выше смещение пациентов от групповых свойств АВО и MNs населения Москвы статистически достоверно. Фактором, который обусл*влюает это достоверное отклонение, может служить признак, который положен в основ)' формирования группы - развитие рака прямой кишки. На основании этих результатов, иммуногенетические маркеры системы АВО и MNs предложены в качестве генетических маркеров для выявления индивидуумов с повышенным риском развития рака прямой кишки.

Как уже отмечалось выше, соотношение быстрых и медленных ацетиляторов значительно варьирует в популяциях с различным этническим и географическим происхождением [Радкевич JI.A. и др. 2005; Mohrenweiser H.W. et al. 2003]. Индивидуальные и этнические различия в ацетиляторной способности полиморфной NAT2 оказывают влияние на терапевтический эффект и наличие побочных эффектов некоторых используемых в клинике лекарств [Пирулн Г:Л., 1990: 2004: Пирузян J1.A. и др., 2003, 2005; Johnson J., 2003]. Большинство данных в современной литературе касаются полиморфизмов в популяциях европеоидов, афроамериканцев, но очень мало известно о других этнических группах. Следует отметить, данные по распределению фенотипов ацетилирования. характерных для населения России, отсутствуют. Есть одиночные сведения по некоторым регионам по определению генотипа NAT2 для выявления ассоциаций полиморфизмов гена NAT2 с рядом патологий [Артамонов В.В. и др., 2004; Вавилин В.А. и др., 2002; Викторова Т.В. и др., 2003; Макарова О.В. и др., 2003; Пирузян JI.A. и др. 2004; Радкевич Л.А. и др., 2005; Grant D. М. et al., 1997; Hamasaki Т. et al., 2003; Stattery M.L. et al., 1998; Vineis P., Martone Т., 1998]. При этом, в основном, исследуются описанные в литературе мутации гена NAT2, и не учитывается тот факт, что в российской популяции могут быть уникальные генотипы NAT2. данных о которых не имеется в мировой литературе. Следует отметить, что N-ацетилтрансфераза проявляет типичный генетический полиморфизм, поскольку быстрый или медленный фенотип коррелирует с определенным генотипом NAT2. который обусловлен мутациями в нуклеотидной последовательности этого гена.

При этом, в литературе нет данных о взаимосвязи между генотипом и фенотип N-ацетилирования для российской популяции в целом, и для московского региона, в частности. Исходя из вышесказанного, был проведен сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования. Проведенные исследования показали, что соотношение быстрых и медленных ацетиляторов (БА и МА). определяемое с использованием двух подходов, достоверно не отличается: 46% (при фенотипировании) и 45% (при генотипировании). Показано, что абсолютные значения скорости ацетилирования варьируют в широких пределах, как быстрых, так и медленных ацетиляторов. Продемонстрировано, что фенотип ацетилирования может быть экстраполирован из результатов генотипирования гена NAT2. .

В последние годы предрасположенность людей к различным заболеваниям, включая онкологические, связывают с индивидуальной активностью генетически детерминированной системы декотсикации ксенобиотиков, прежде всего с N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2). Взаимосвязь между индивидуальной активностью N-ацетилтрансферазы и развитием патологий не случайна. Она обусловлена тем. что в результате разной активности фермента происходит образование генотоксических промежуточных метаболитов, которые могут индуцировать развитие патологий, и. прежде всего, онкологических. Следует отметить, что сведения о роли NAT2 в предрасположенности к раку прямой кишки в литературе противоречивы. В связи с изучение прогностического значения фенотипа ацетилирования в развитии рака прямой кишки, был проведен анализ клинического материала, полученного от пациентов. Проведенный анализ позволил выявить особенности в распространении частот аллелей и генотипов гена NAT2 у практически здорового населения и пациентов с раком прямой кишки в московской выборке. Статистически достоверно показано преобладание у пациентов с раком прямой кишки группы генотипа NAT2*5/*5 и снижение частоты генотипов NAT2*4/*5 по сравнению с контролем.

Таким образом, была установлена роль изученных полиморфных локусов систем ABO, MNs и NAT2 человека как факторов, обуславливающих риск развития рака прямой кишки. Следует отметить, что статистический характер исследования имеет свои ограничения: изученные полиморфные признаки могут рассматриваться только как факторы риска в статистическом смысле, поскольку, проявля.я се(;я в достаточно большом ряду наблюдений, на достаточно большой когорте пациентов, в каждом конкретном индивидуальном случае они могут быть использованы лишь для вероятностного прогноза риска развития патологии. Ценность такого прогноза всецело обусловлена его вероятностью [Рычков Ю.Г. и др. 1985]. В среднем для каждого из отдельных признаков (фенотипов) - группа крови В, генотип ММ и генотип NAT2*5/*5 - вероятность его проявления как фактора риска развития рака прямой кишки составила в среднем 26% (рис. 3.20), что весьма весомо для больших контингентов людей, и вместе с тем весьма ориентировочна для индивидуального случая. Это побудило нас рассмотреть сочетанный эффект всех признаков и исследовать их как совокупность маркеров риска. Для этой цели был использован подход, основанный на интеграции клинических обследований и результатов генотипирования. В работе Рычков Ю.Г. и соавторами [1985] схожий подход, основанный на применении системы генетических маркеров человека, был использован для разработки прогноза риска гнойных осложнений раневого поражения. Результаты нашего исследований подтверждают необходимость использования системы маркеров и позволяют заключить следующее: при определении риска развития рака прямой кишки следует использовать совокупность генетических маркеров, основанных на полиморфизме системы групп крови и ацетилирования. Прогностическая ценность выявленной за счет анализа совокупности генетических маркеров оказалась намного выше, чем у отдельных признаков (маркеров) в нее входящих. Вероятность того, что совокупность двух и трех генетических маркеров проявит себя как фактор риска развития рака прямой кишки, составила 69% против 31% для отдельного признака (рис.3.23). Это весьма весомо не только для больших контингентов больных, но и в индивидуальном случае. Помимо этого, вероятность того, что совокупность двух и трех генетических маркеров проявляют себя как факторы более агрессивного прогрессирования опухолевого процесса (метастазирование). а также вероятного формирования нового опухолевого заболевания, составила 76% против 24% для отдельного признака. Следует также подчеркнуть, что 2/3 пациентов с раком прямой кишки, у которых выявлены такие патологические изменения как образование опухоли, метастазы, гиперплазии, имели генотип NAT2*S/*5. Знание того, что совокупность генетических маркеров и генотип NAT2*5/*5 могут определять метастазирование и формирование нового опухолевого ьроць-са. побудит клиницистов выявлять эти генетические маркеры у пациентов, тем более что определение их не требует больших затрат труда, времени и средств.

Наиболее перспективный путь дальнейшего развития предложенного подхода для выявления генетических факторов риска развития рака прямой кишки. а также, вероятно, и других патологий, связан с пополнением набора генетических маркеров риска, чтобы свести фактор случайности и непредсказуемости к пренебрежительно малой величине.

Таким образом, в работе разработан подход, основанный на интеграции клинических обследований и результатов молекулярно-генетических исследований (выявление генетического полиморфизма), и экспериментально подтверждена возможность такого подхода, выявлять группы риска развития онкологической патологии.