Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Изучение возможности прогнозирования индивидуальной чувствительности к канцерогенному действию бенз(А)пирена по экскреции его метаболитов

На правах рукописи

р Г Б ОД

тындык

Маргарита Леонидовна

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К КАНЦЕРОГЕННОМУ ДЕЙСТВИИ БЕНЗ<А)ПИРЕНА ПО ЭКСКРЕЦИИ ЕГО МЕТАБОЛИТОВ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наик

Санкт-Петербэтт

1996

Работа выполнена s научко-иеиледовательском институте онкологии ин- проф. Н«Я»Петрова Министерства Здравоохранения к Медицинской Прояыилекнссти Российской Федерации-

Научные руководители:

- доктор медицинских наук Я - Я ■ Лихачев

- доктор недицинских наук Я•А• Забежинский

Официальные оппоненты!

- доктор биологических наук, профессор В.А- Кобляков

- доктор биологических наук С.Д. Иванов

Ведущее научное учреждение; Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт Министерства Здравоохранения и Медицинской Прокыыленности Российской Федерации

Запита диссертации состоится " " ...........1996 г.

в __ часов на заседании специализированного совета

К-074.38-01 НИИ онкологии им- проф. H.H. Петрова Министерства Здравоохранения и Медицинской Промышленности Российской федерации по адресу! 189646t Санкт-Петербург, Песочный-2, Ленинградская ул-t 6В.

С диссертацией ножно ознакомиться 8 Библиотеке института.

Автореферат разослан " ..............1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор яедицмнских наук

Е.В. ДЕШН

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ

ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ к КАНЦЕРОГЕННОМУ ДЕЙСТВИЮ БЕНЗ(А)ПИРЕНА ПО ЭКСРЕКЦИИ ЕГО МЕТАБОЛИТОВ

Актуальность проблены

В современном лире подавляющее число июлей имеет бытовой или производственный контакт с агентами различной природы! вызывающими или способствующими развития рака- Однако даже при практически равной канцерогенной нагрузке, рак развивается лишь у части индивидуумов- Это свидетельствует о той, что люди различаются е восприимчивости к действии канцерогенных агентов•

Яозтону одним из путей снижения онкологической заболеваемости населения, наряда с максимально возможный уменьшением канцерогенной нагрузки, является выявление лиц, инеюъшх повышенную чувствительность к канцерогенный факторам различной природы-

Среди последних существенную роль играют полициклические ароматические углеводороды (ПАУ >- Они образуются в результате неполного сгорания различны* органических соединений- Содержащие их продукты (сажа, смолы, минеральные масла, табачный дын и др.) относятся к числу основных канцерогенных факторов, вызывавших рак у человека•

Среди всего многообразия ПАУ основную угрозу представляет, по современный представлениям, 6енз(а)пирен (БШ- Он образуется в значительных количествах и, согласно заключению экспертов Мевдународного агентства по изучению рака, является соединение», опасным для человека iIfiRC, 19B7J- Позтоиу идентификация биомаркеров, которые могли бы способствовать выявлению лиц о повышенной чувствительностью к БП, является принципиально важной задачей■

Разрабатывается несколько подходов для решения этой задачи. Учитывая, что канцерогенный риск в значительней степени обусловлен уровнем образования аддуктов канцерогенов с ДКК, больыое внимание уделяется изучению аддцктсзЕ БП с ДНК- Однако их изучение у человека во многих случаях затруднено, поскольку взятке нуьлого количества ткани для выделения ¿ЩК из тронного к канцерогвнвеку действию органа (например, легкого) редко soohojkhü. Поэтому часто изучают аддукты ЕП с ДНК лэйксцитсзс-1 но в ряде работ показано отсутствие корреляции между уробняяи аддуктов ЕП с ДНК лейкоцитов и других тканей (Van Shooter; F-Y- et аЗ.,1992). В последние годы при анализе канцерогенного риска уделяется также внимание повреждении! ДНК свободными радикалами, образующимися при воздействии на организм различных канцерогенов. Маркером

повреждения ДНК свободными радикалами кислорода считается аддукт 8-гидроксидезоксигуанозин (8-ОН-дГ)- Однако его определение в ДНК связано с описанными выше сложностями получения соответствующих образцов ткани-

Уровень аддуктгов ДНК зависит от количества образующихся канцерогенных метаболитов• Поскольку процесс метаболической активации совершается при участии различных ферментов» связанных с цитохромом Р450 < предпринимались попытки сопоставить риск возникновения опухолей» вызываемых канцерогенами» в том числе БПч со спектром различных изоформ P45Q. В ряде работ удалось показать различив в ферментном спектре у онкологических больных и здоровых лиц» что может свидетельствовать о существовании так называемого метаболического Фенотипа» характерного для лиц с повышенной чувствительностью к возникновению опухолей при действии ПАН (Bartsch Н- et al-.1992). Однако в целом результаты этих исследований оказались противоречивыми» поскольку при участии одних и тех же изоформ может происходить как метаболическая активация» так и деактивация канцерогенов. Поэтому начало развиваться направление исследований» связанных с изучением образования активных канцерогенных и неактивных метаболитов БП. Для БП маркерным канцерогенным метаболитом является его 7,8-диол (7,8-БП). Именно из наго образуется диолэпоксид, повреждающий ДНК, что приводит к злокачественной трансформации - Для оценки процесса метаболической деактивации БП может быть использовано определение неактивного метаболита 3-гидрокси-БП (3-ОН-БП)- Перспективным является изучение уровня экскретируекых метаболитов БП, которое может дать косвенное представление об индивидуальных особенностях его метаболизма-Адекватный флюоресцентно-спектральный метод разработан в лаборатории онкозкологии КИИ онкологии им. проф- H.H.Петрова (Савочкина И-В- и др., 1990). Этот метод может быть применен в исследованиях у человека, потому что он является неинвазивнын. В экскретах можно определять и аддукты канцерогенов, высвобождаемые из ДНК в процессе ее репарации и катаболизма. Первые работы в этой направлении проводятся за рубежом. В частности, анализируется содержание в моче В-ОН-дГ (Tagessem С* et al.» 1992J-

Следует отметить, что до последнего времени не проводилось изучения уровня экскреции наркерных метаболитов БП и его связи с

канцерогенным эффектов. Это необходимо для выявления наиболее

показательных параметров их экскреций! позволяющих

прогнозировать индивидуальную чувствительность к канцерогенному действию БП.

Цель и задачи исследования

Основной целью исследования являлось изучение возможности прогнозирования индивидуальной чувствительности к канцерогенному действию БП по особенностям экскреции его маркерных метаболитов: продукта метаболической активации БП - 7,8-БП и детоксикации -3-ОН-БП-

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи!

1• Сравнить в опытах на крысах, подвергнутых однократному воздействию БП» индивидуальна!? оссёенности экскреции с ксчой и калом маркерных нетаболитов БП с чувствительностью г его канцерогенному действию-

2- Сравнить индивидуальные уровни экскреции маркерных метаболитов БП с конечным канцерогенный эффектом у крыс после нногократиого введения БП-

3- Сравнить у одних и тех же животных после однократного воздействия БП индивидуальные уровни экскреции 7,8-БП и 3-ОН-БП с уровняли образования аддуктов БП с ДНК -

4- Изучить индивидуальные особенности экскреции с кочой маркерных метаболитов БП у людей, имеющих с ник производственный или бытовой контакт.

5- Сравнить уровни экскреции 7,В-БП и 3-ОН-БП у курящих больных раком легкого и здоровых курильщиков-

6- Сравнить уровни экскреции метаболитов БП с почаЛ с содержанием в моче В-ОН-дГ-

Научная новизна исследования

Впервые произведено индивидуальное сравнение различных параметров экскреции маркерных метаболитов БП и особенностей его канцерогенного действия у крыс, подвергнутых однократному или многократному воздействию БП-

В опытах с однократный введением БП впервые выявлена тенденция к более раннену развитию опухолей среди тех животных, у

которых с мочой выделялось меныае 7.8-БП. В то же время в средней у крыс с опухолями с мочой экскретировалось несколько больше 7,8~БП, чей у животных без опухолей-

Впервые установлено. что при многократной воздействии БП злокачественные новообразования развились у животных о максимальной экскрецией 7,8-БП с иочой после первого введения канцерогена•

Впервые у крыс* подвергнутых воздействию БП 1 сравнивали индивидуальные уровни экскреции о иочой метаболитов БП и образование его аддуктов о ДНК печени- Обнаружен параллелизм между их уровнями.

Впервые были изучены индивидуальные уровни экскреции о иочой 7,8-БП и 3-ОН-ВП у людей, имеющих производственный или бытовой контакт с БП- Изучены также уровни экскреции с иочой у этих людей 8-ОН-дГ- Корреляции между этими показателями не обнаружено.

Впервые сравнивалась экскреция маркерных метаболитов БП у курильщиков - больных раком легкого и здоровых курильщиков- И онкологических больных уровень экскреции метаболитов БП был ниже, чем у здоровых курильщиков.

Практическая значимость

Обнаруженная в опытах на животных корреляция между индивидуальной чувствительностью к канцерогенному воздействию БП и количествами 7,8-БП, экскретируеного о иочой, может быть апробирована для прогнозирования индивидуального онкологического риска у людей, инеюших производственный или бытовой контакт с этим канцерогенным агентом-

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Международной

конференции по экологической и промышленной токсикологии (Бангкок, Таиланд I 1991 г), 1-й Международной конференции "Биомониторинг и маркеры чувствительности к раку' их роль в молекулярной эпидемиологии и оценке риска" (Гавайи, США, 1991 г), ежегодной конференции Американской ассоциации исследования рака (Сан-?радциско, США, 1994 г->, 16-м Между.чарсмнон прстивораковон конгрессе (Лели, Индия, 1994 г-!, Международной конференция "От

исследования к профилактике" (Хельсинки, Финляндия, 1995 г-), а также на совместной научной конференции лабораторий онкоэкологии, экспериментальных опухолей, канцерогенных агентов НШ онкологии им-проф. Н.II-Петрова {24 октября 1995 г->- По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ-

Оо'ьек и структура диссертации

Диссертация изложена на страницах машинописного текста,

иллюстрирована ~13.таблицами и рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав с описанием материалов и методов исследования, изложением результатов собственных исследований, обсуждением полученных данных, а также выводов и указателя литературы, вклгечакниего ^/^работ отечественных и зарубежных авторов -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и метода исследования

В работе использовались следующие соединения: БП Фирмы "Buchs" (Швейцария)! бенз(g,h,i)перилен (БПА) фирны "Aldrich" (США), стандартные метаболиты БП: ( + )-транс-7, 8-ДJrгnдp(жcи~ 7,S-дигидpoбeнз( а)пирен (7,8-БП) и 3-гкдрокси-бенз(а)пирен (З-ОН-БП), а также стереоизоперы 7,8,9,10-тетролов БП! r-7,t-8,9,10; r-t,t-S,9,c-10; r-7,t-3,c-9,lQ и r-7,t-8,c-9,t-tO. Стандарты были получены от "Chemical Repository" (Национальный институт рака, США).

Для экстракции метаболитов БП из экскретов применялась ионообменная смола Araber]ite XAD-2 ("Sigasa", США). для их деконычгаиии - арилсульфатаза из Helix pomatia, 1000 ед/мкл ("Boehrinser Mannheim", ФРГ) и J!> -глккуронидаза из печени быка, тип В-1, 500 ООО ед/г ( "Si<sma" i США). При выделении ДНК использовали РККазу, тип 1 ("Sigma", США) •

Остальные реактивы (в основном растворители) были отечественного производства- Все они были химически чистыми и лишь в случае необходимости подвергались дополнительней очистке-Метаболиты и тетроды БП и приготовленные из них стандартные

о

растворы ь абсолютном этиловом спирте хранили при -70 С-

- в -

с

Ферментные препараты хранили при текперату^е -4 С-

Опыты были поставлены на 173 неинбредных крысах-самцах линии ЛИО <flnisiniov V.N. et al-, 1989) со средней массой тела 150 г-разводки вивария НИИ онкологии ии- проф- Н-Н-Петрова- Для анализа связи индивидуальных особенностей экскреции метаболитов БП с его канцерогенным эффектом было поставлено две серии опытов•

В первой серии канцероген вводили 19 подопытным крысам однократно внутрибритшнно в виде раствора в подсолнечном масле в концентрации 10 нг/ил. Разовая доза составляла 200 мг/кг нассы тела, что, по литературным данным (Hirakawa Т- et al-, 1979) достаточно для индукции опухолей примерно у половины яивотшлх- Во второй серии опытов БП вводили 51 крысе внутрибрдаиинно многократно в близкой суммарной дозе < Ю ин-ьекций по 10 мг БП/кг массы тела с интервалами в 10 дней) в форме водно-липидной эмульсии < Husains С-0-, 1979). 50 контрольным крысам внутрибрюшинно вводили водно-липидную эмульсию, не содержащую БП, по той же схеме.

После введения канцерогена крыс размещали в индивидуальных обменных клетках. Собранные за сутки экскреты замораживали и хранили в холодильнике. Период сбора составлял 5-8 дней.

Для экстракции из экскретов и анализа БП и его метаболитов использовались методики, разработанные в лаборатории

онкоэкологии НИИ онкологии им- проФ- Н-Н-Петрова <Дикун П-П- и др., 1984; Савочкина И-В. и др., 1990)-

БП из кала экстрагировали этанолом и очищали с помощью колоночной хроматографии на окиси алюминия, из ясчя

экстрагировали этиловым эфиром после предварительного гидролиза и очищали с помощью тонкослойном хроматографии на окиси алюминия- Метаболиты БП, которые, в отличие от БП, являются гидрофильными соединениями, выделяли из мочи и водного экстракта кала, пропуская их через колонку с ионообненной смолой Amber!?te XAD-2- Содержимое из колонок элюировали ацетоном, пробы высушивали под вакуумом и добавляли Ферменты деконьюгации: j3 - глмкуронидазу и арилсульфатазу- После инкубации метаболиты БП экстрагировали этилацетатон-

При спектрально-флюоресцентном анализе БП и его метаболитов использовали эффект Ипольского (Ипольсжий 3-В- и др., 1952), состоящий в оценке квазилинейчатых спектров флюоресценции ПА У при

температуре кипения жидкого азота. Исследования проводили на спектрофляюриметр© MPF-4 <"Hitachi"» Япония}« снабженном ионозсроматорам! позволяющим добиваться избирательного возбуждения Флюоресценции отдельных ПЛУ в иг смеси, избегая таким образом потерь и разрушений нестойких метаболитов БП, происходящих при их хроматографическом разделении. В качестве внутреннего стандарта при количественной оценке БП и его производных применяли БПЛ, добавляемый к пробе в известных количествах. Для селективного возбуждения использовали следующие длины волн! для БП - ЗВ8 ни, 7,8-БП - 353 нн, 3-ОН-БП - 405 нн- Анализировали следующие пики волн флюоресценции: БП - 403 ни, 7,8-БП - 394 нм, 3-ОН-БП - 431 нв, БПЛ - 419 ни (при анализе БП - 406 ни)• Уровень экскреции БП и его метаболитов выражали в мкг/кг массы тела крыс-

После сбора экскретов в обеих сериях опытов за животными следили на протяжении всей их жизни■ Крыс умерщвляли эфиром только в терминальном состоянии- Опухоли, а также органы с макроскопически обнаруженными патологическими изменениями

фиксировали в 10Й нейтральном формалине- После стандартной гистологической обработки срезы ткани окрашивали гематоксилин -эозинам- Классификацию новообразований проводили

соответственно рекомендациям Международного агентства пс изучению рака (Turusov V-S-, Mohr 1)., 1990)-

Для анализа связи особенности-;"' экскреции метаболитов БП с уровнями образования аддуктов БП с ДНК 10 крысам одкзкра^-чо вводили БП в дозе 15 мг/кг в подсолнечном яас^е, затек у животных 3 дня собирали ночу. 5 крыс Выло убито через 3 дня, а остальные 5 - через В дней после воздействия- У животных индивидуально определяли суточные уровни экскреции 7,8-БП и З-ОН-БП по описанной выше методике- 9 убитых животных определяли аддукты БП с ДНК печени по уровню тетролоз БП, образующихся при гидролизе ДНК.

Для этого была разработана следующая методика- Тетрода высвобождали из ДНК, выделенной из ткани печени Фенольным методом, с помощью ее гидролиза в 0,1Ы HCl s течение 3 ч. при +9о"с-Полученный гидролизат высушивали и экстрагировали из него тетроды трилды абсолютным этанолои- Для выделения тетролов использовали хроматографию на колонке с Сефадексом LH-23 С 0,5x90 cmJ- В качестве элкента использовали линейный градиент 30vi -~>95Ü этанола, 0,1 М форниата аммония, pH 6,75-

Образовавшиеся при гидролизе ДНК тетролы БП элшировались при концентрации этанола BS-SS'/. Затек анализировали их спектры флюоресценции при температуре жидкого acora на спектрофлюоринетре ITPF-4- Для записи спектра использовали метод синхронного сканирования с разницей длин волн 34 нв между мояохроматсрами возбуждения и эмиссии- Специфический синхронный флуоресцентный сигнал наблюдался при длине волны возбуждения 344 ни- Для количественного определения тетролсв в качестве снчтренвегс стандарта использовали БП- При таких условиях хрояатографироззния не происходило разделения стереоизокероЕ тетролоз БП-

Предварительная калибровка колошей СеФадеко LH-20 с помошьге стандартных тетродов БП позволила вывести Формулу, по которой и дальнейшем производился расчет количеств тетролоз; находившихся в пробах ДНК!

Ст = í kl х Нт/Нбп - к2 5 х Сбп X vn en/Vn т,

где Ст - концентраций тетролов НП;

líl^O, C14G2 í *:2-ü,CC017í

Нт - высота пшез Флуоресценции тетродов 53!

Нбп -высота пика флуоресценции БП?

С5п- концентрация БП

Vn т -объеи кробы» содержащей тетролы БП в пробирке, понеыаекой з прибор;

Vn бп - об-ьем дсбавки, содержащей БП, г? прс/б;;рке1 помещаемом в прибор•

Концентрацию тетролов выражали в пкг/яг ДНК. Предел измерения их составил 0,01 нкг в пробе-

Наряду с основныни сериями опытов, был проведен ряд дополнительных экспериментов- В частности, изучалась стабильность-маркерных метаболитов БП при различных температурах- Для оценки роли ферментов деконьигации в экскреции и анализе метаболитов БП были проведены эксперименты in vitro и in vivo- При этом сравнивали содержание метаболитов БП в экскретах крыс при обработке соответствующих экстрактов ,3 - глгекуронидазой и арилсульфатазой и без такой обработки- Через 48 час- после внутрибрюшинного введения крысам БП в дозе 100 мг/кг э водно-липидной эмульсии части животных внутривенно вводили -глюкуронидазу (22000 ед) и сравнивали экскрецию метаболитов

БП у животных, получавших и не получавших Фермент. Изучалась также эффективность биотрансФормации БП-

Для выявления индивидуальных особенностей экскреции с мочой маркерных метаболитов БП у людей проведено две серии исследований. В первой серии изучали экскрецию метаболитов БП у курильщиков табака. С этой целью собирали утреннюю порцию мочи у 22 курильщиков табака и 5 некурящих мужчин - жителей Санкт -Петербурга в возрасте 36-65 лет- 11 курильщиков не имели никаких признаков заболеваний, друтие 11 курильщиков были больными раком легкого- Все исследуемые лица не имели контактов с иными канцерогенными, токсичными, а такие радиоактивными веществами-

Во второй серии изучали экскрецию метаболитов БП у лиц с высоким уровней как производственной, так и бытоЕой экспозиции к БП, вызванной загрязнением окружающей среда. Исследования были проведены у жителей города Магнитогорска- Из них 21 человек <17 мужчин и 4 женщины - 1-я группа) были работниками кокос -химического цеха Магнитогорского металлургического комбината-Уровень БП в атиос^ере этого цеха в 500 раз превышал ПДК- Вторил группу составили 20 мулчин, не ккевцих производственного контакта с БП. В лиц обеих групп собирали утреннюю порцию ночи в конце рабочей неделиБ обеих сериях определяли объем ночи и концентрацию креатннина. Метаболиты из мочи экстрагировали так же- как з опытах на крысах? их количество выражали не только в мкг/кг массы тела, но и в нкмоль/нсль креатинина мочи. Во второй серии дополнительно изучали содержание в моче 8-ОН-дГ, который определяли по методу C-Taeesson и соавт.<1992) с помощью жидкостного хроматографа высокого разрешения-

Статистическую обработку результатов в зависимости от конкретных условий проводили: методом регрессионного анализа, корреляционного анализа, модифицированным методом Каплан-Иейера, с использованием ранговых коэффициентов Спирмана,

t-распределения Стьждента, F-распределения Фишера, критерия хи-квадрат и по непаранетрическии критериям Т-Иайта, "U" Вилкоксона-Манна-Уитни (Лакин Г-Ф-, 1973)-

- 10 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1• Изучение некоторых особенностей нетабализна БП

При хранении при разных темтературах экстрактов нетаболитов, выделенных из ночи крыс, получавших, БП обнаружено, что за 72 часа концентрация 7,8-БП, хранившегося при комнатной температуре, снижается в Ю раз, а при 0°С - практически не меняется. 3-ОН-БП не разрушался ни при комнатной, ни при нулевой температуре-

В опытах in vitro показано также, что в экстрактах ночи без декон-ьигации JÍ -гликуронидазой и арилсульфатазой определяется в средней в 1,4 раза меньше 7,3-БП ив 1,5 раза - 3-ОН-БП, чем после обработки этими ферментами- В опытах in vivo введение J-глюкуронидазы увеличивало зкскрецию 7,В-БП в среднем в 1,2 раза, а на уровень экскреции 3-ОН-БП оно не повлияло-

Эти исследования показали, что все манипуляции с материалом,

содержащим маркерные метаболиты БП, должны проводиться при

с

температуре не выше ОС, а для их лучшего выявления необходима обработка экстрактов ферментами деконъкгации, что и соблюдалось при проведении основных экспериментов.

Для изучения эффективности биотрансформации канцероген, растворенный в подсолнечном масле, был введен крысам однократно внутрибриыинно в дозе 200 мг/кг- Учитывая, что при таких условиях практически полное выведение маркерных метаболитов БП завершается через две недели <Савочкина И-В. и др-, 1990), мочу и кал собирали в течение 15 дней- При этом количество неизмененного БП, выведенного с мочой, составило 0,00032 'Л от его введенной дозы, а с калом - О,092 Я- В виде 7,8-дигндродиола БП был выведен с иочой в количествах, равных 0,029 с калом - 0,27 а в виде З-ОН-БП - соответственно п количествах, равных 0,007;4 и 0,ОЗУ.. Такин образом, лишь 0,42 V, БП было зкскретировано из организма в неизмененном виде или в качестве его маркерных метаболитов. Видимо, основная его часть выводилась в виде неидентифицированных в данной работе нетаболитов- Как известно (H'jmford J-L- et al-, 1995), большинство этих соединений -различные гидроксилированные продукты детоксикации БП, маркером которых является 3-ОН-БП, изученный в нашей раёоте.

- 11 -

2- Сравнительное изучение индивидуальных особенностей экскреции метаболитов БП и канцерогенного эффекта у крыс при его однократном внутрибришинном введении

В наибольших количествах метаболиты БП выводились через 2-4 дня после воздействия.

Первая опухоль была обнаружена на 123-к день опыта- До этого срока дожили 18 крыс, у 10 из них развились опухоли, а остальные крысы пали от интеркуррентных заболеваний С табл•15• Опухс .-ш

Таблиия 1 -

Сведения об индивидуальных уровнях метаболитов БП, экскретированных суммарно за 5 дней, и о канцерогенезе у крыс после однократного внутрибрюшкннаго введения БП в дозе 200 кг/кг -

Количества экскретированных Крыса с Продолжит-

Номер метаболитов БП, нкг/кг опухолью жизни, нассы тела ( +) или дни

---------------------------- без (- 5

крысы Моча Кал

7,8-БП 3-БП 7,а-БП 3-БП.

83 53,6 га 159,3 26,8 + 123

69 68,7 56,1 358,4 85,6 + 151

77 62,0 20,0 137,9 39,7 - 151

78 92,3 18,9 149,0 35,7 - 151

79 31 ,6 16,7 117,9 32,3 - 151

СО *> 30,2 10,1 64,5 13,9 4- 153

87 75,2 9,0 164,1 17,3 + 153

72 63,6 54,9 298,7 75,8 + 166

аз 59,1 13,2 143,5 16,8 + 196

74 38,9 31,1 210,5 5517 - 196

75 37,3 30,9 192,8 53,1 - 197

70 46,В 41,7 282,8 93,4 - 211

✓ 3 60,9 за,2 190,6 56,1 + 211

76 69,2 24,0 193,4 53,5 + 212

31 96,7 21,В 124,2 20,9 + 239

86 80,7 11,3 177,9 19,7 - 296

71 69,2 36,9 232,9 78,9 304

53 74,0 15,3 133,9 22,8 + 388

локализовались в Брюшной полости и имели вил множественных узлов, располагавшихся в большом сальнике, брыяейке и на поверхности париетальной брюшины, включая диафрагму- При гистологическом исследовании во всех случаях они были диагностированы как злокачественные фиброзные гистмоцитоиы различного строения-

Степень связи между концентрацией метаболитов БП в ноче кале с длительностью латентного периода развития опухали оценивали па величинан коэффициентов ¡ссрреляции, котсркс t-Ы/»: рассчитаны как по линейной, так и по экспоненциальной моделям-

Попило того, изучение влияния количеств эксгсретирсванкых метаболитов на длительность латентного периода возникновения новообразований, которую определяли по продолжительности жизни животных-опухоленосителей, осуществляли с помощью специально разработанного метода определения вероятности развития опухоли, основанного на известном подходе Kaplan-Meier (Kaplan E-L- Meier P-, X9S8). Анализ был осуществлен на основе значений экскретированных метаболитов в каждый из дней наблюдения в отдельности, а также по суммам их выделения в экскретах за последовательные периоды с интервалом в 1 день з течение 5 дней. Из числа изученных вариантов наиболее показательный маркером риска возникновения опухолей являлось количество 7,8-БП, выделившегося во 2-й день после воздействия. Тем не менее результаты наших наблюдений говорят о том, что оценку риска возникновения опухолей целесообразно проводить, оснозываясь на общем количестве 7,8-БП, выделившегося с мочой за весь 5-дневный период, поскольку случайные и ежедневные колебания ногут быть выраженными.

При расчетах по экспоненциальной модели были получены наибольшие значения коэффициентов корреляции для значений выделения 7,8-БП с мочой (рис-1). Однако и по той, и по другой модели сравниваемые параметры не имели статистической достоверности (р > 0,05).

Оценка вероятностей развития опухолей в динамике соответственно количеству выделенного метаболита показала, что их значения уменьшаются с возрастанием суммарного за 5 дней количества экскретированного с мочой метаболита. Однако зти корреляции также имели характер тенденции (р>0,05). Не было выявлено корреляций между латентным периодом обнаружения

- 13 -

опухолей и иными параметрами экскреции метаболитов БП.

420 370 320 270 230

170

150

0 _ 20 40 60 80

Рнс-1- Экпоиенциальная регрессионная кривая выделения 7,8-БП с мочой суммарно за 5 дней крысами с опухолями. По оси абсцисс - уровни экскреции метаболитов 7,8-БП икг/кг массы тела?

по оси ординат - продолжительность жизни, дни -

Следует отметить, что среднее количество экскгретированного с мочой 7,8-БП у крыс с опухолями оказалось несколько большим* чем у животных без опухолей (соответственно, 66,0 и 57,4 икг/кг5 Р>0,05>-

Таким образом, результаты исследования у крыс, подвергшихся однократному внутрибрюшиннону воздействию БП в дозе 200 мг/кг, показали, что, с одной стороны, чем большие количества 7,8-БП экскретировались с мочой у животных с опухолями, тем в последствии позднее опухоли развивались- С другой стороны, если этого метаболита БП зкскретировадось с мочой иного, то у данного индивидуума впоследствии наиболее вероятно развитие опухоли. Такие противоречивые и взаимно исключающий друг друга выводы, очевидно, можно об-ьяснить недостаточным количеством животных.

исспользеванных о исследовании для выявления изучаемых закономерностей- Зто подтверждает отсутствие статистической значииости в сравниваемых показателях.

3- Сравнительное изучение индивидуальных особенностей экскреции метаболитов БП и канцерогенного эффекта у крыс при его многократном внутрибрюшиннон введении

В этом исследовании БП вводили 51 крысе внзтрибрюшинно в форме водно-липидной эмульсии десятикратно- После 1-Й! 5-й и 10-й инъекции канцерогена животных помешали з индивидуальные обменные клетки и ежедневно собирали кал и кеч1;. 3 экскретах, суммированных за 8 дней, определяли концентрации 7,В-БП м 3-ОН-БП.

50 крысам контрольной группы вводили эмульсию бео БП-Наблюдение над животными обеих групп продолжалось до их гибели или до состояния крайней слабости, когда их умерщвляли-

Это исследование показало, что количества экскретируеных маркерных метаболитов БП, в особенности 7,8-БП, имели существенные индивидуальные различия- При этом индивидуальные соотношения выделения 7,В-ЕП и З-ОН-БП с мочой после 5-й и Ю-й инъекций практически не менялись (г=+0,37 и ссптветственно;

р=0,01>. Это указывает на сохранение метаболического Фенотипа при длительном воздействии БП и, следовательно, на правомерность измерения маркерных нетаболитов БП при таких условиях- После 5-й я особенно 10-й инъекции БП количества зкекретировйнногй 7,8-БП снизились е 2-4 раза, а 3-ОН-БП - в 1,5-2 раза, ло сравнению с 1-й инъекцией- Это происходило из-за возрастного снижения активности Ферментных систем, нетаболизирукэдих БП-

Новообразования развились у 22 из 51 подопытной тсрысы, доживших до времени обнаружения 1-й опухоли (120-й день спита! подкожная саркома на месте инъекции}, причем лишь у пяти это были опухоли внутренних органов: у одной крысы обнаружена линфосарнома легкого, у четырех других - злокачественные фиброзные гистиоцитояы брюшной полости с локальной диссеминзцией■ У 13 животных возникли подкожные саркомы я области инъекции канцерогена (из-за случайного попадания туда крайне малых и не ¡сонтролируеиых количеств эмульсии>, у одной из них - наряду с гистиоцитоной брюшной полости. Е контрольной группе» до 120-го дня дожило 39 крыс, и у одной из них ?«да обнаружена саркома брыжейки,

- 15 -

развившаяся вокруг паразита Cysticercus fasciolaris-

Была найдено превышение экскреции 7,8-БП с ночс-й после первого воздействия у животных, которые в дальнейшей погибли от новообразований внутренних органоЕ (рис- 2)-

7,8-БП икг/кг

I -й инъекций

20

Щ Щ

Щ рш

u-я инъекция

10-я инъекция

Рис-2- Количество 7,8-БП, экохретмройанного с мочой за 8 длэй после Енутрмёришинногс введения БП в дозе 10 иг/кг о интервалами б 10 дней

ЕЗ - животные с опухолью внутренних органов: ЕЗ - животные без опухоли внутренних органов

Это превышение было статистически значинын (р-0,01) при сравнении как с крысаии• имевшими подкожные опухоли, так и с крысами без опухолей внутренних органов н со всеми крысаии без новообразований- Однако при сравнении экскреции 7,8-БП с мочой у крыс с опухолями внутренних органов и без них, павших после 253 дня опыта, когда первая из таких опухолей была обнаружена, эти соотношения не были достоверными (р>0,05>-

Бсе остальные параметры экскреции метаболитов БП у крыс, имевших опухоли внутренних органов и у крыс, таковых не иневиих, существенно не различались -

Таким образом, опыты с многократными введениями БП продемонстрировали, что после его 1-го введения крысы с наибольшими уровнями экскреции канцерогенного метаболита БП, 7,8-БП, имели наивысшую чувствительность к его канцерогенному действию БП-

- 16 -

4- Сравнительное изучение индивидуальных уровней экскреции с ночей маркерных метаболитов БП и концентраций его аддуктов с ДШС печени крыс, подвергнутых воздействию БП-

Результаты этого исследования показали, что имелись значительные индивидуальный различия в уровнях как метаболитов БП, так и его тетролов, которые образуются из аддуктов при гидролизе ДНК. Среднее количество тетродов, обнаруженных через 5 дня, было в 5 раэ асльтиыг чем через В дкгй лосле воздействия -что указывает на эффективное функцке-шгрещакие систем репарации, устраняющих эти повреждения ДШС- Была обнаружена высокая стгггень корреляции между индивидуальными зроенякк Т,б-БП и: тетролоз через три дня после воздействия ЕП <г=+0,95? р\0,05? рио-З). В то же время не было обнаружено никакой взаимосвязи между уровнями З-иН-БЛ и 7,8-БП в моче, разно как между уровнями

- ; ■ • ' 1 1 1 ! . j i : :1 ! ; ~1! ~ t l 1 _

L -

р

1

j-

-

i— —

_

и -

j- -

i— '.....

t —

; У'

f

j- -

[ —

i" -

Г .• r--' ' - I- ! ! ! 1 1 t i ■ » i ' : t -

О О .'Л /.04 О'.Оо О.С-З 0.; 0.1£

Рис-3- Корреляционный анализ уровней 7,В-БП в моче и тетродов БП в ДНК печени крыс через три дня пос*1е однократного внутрибрюшинного введения БП в дозе 15 мг/'кг-По оси абсцисс - индивидуальные количества тетродов БП в

ДШС печени, нкг/нг ДНК? по оси ординат - индивидуальные уровни экскреции

метаболитов 7,В-БП, мгег/кг массы тела.

З-ОН-БП и тетродов- Не было обнаружено также никаких корреляций между сравниваемыми показателями у крыс, убитых через 8 дней после введения БП- Последнее неудивительно, так как моча была собрана за 5 дней до этого- Считывая, что уровни аддуктов ДНК с канцерогенани считаются наиболее надежными показателяни индивидуальной чувствительности к нии (Тогаа-Нз Ь., 1990), высокая степень совпадения их относительных значений с уровнями 7,8-БП дополнительно свидетельствует о перспективности определения последних для прогнозирования индивидуальной чувствительности к канцерогенному действию БП-

В целом результаты экспериментальных исследований связей параметров экскреции маркерных метаболитов БП с уровнем образования аддуктов БП с ДНК и канцерогенным эффектом оказались противоречивыми, что может быть связано как с незначительным количеством животных в отдельных сериях опытов, так и с особенностями экпозиции к канцерогену- В то же время удалось показать, что в наибольшей степени с чувствительностью к канцерогенному действию БП коррелирует уровень эксзсреции 7,8-БП с иочой-

5- Изучение экскреции маркерных метаболитов БП у людей, имеющих бытовой или производственный контакт с БП

Как и ожидалось, учитывая наблюдения, сделанные нами на животных, имелись значительные индивидуальные различия в уровнях экскреции с мочой 7,8-БП у курильщиков табака. Однако в среднем их количества были существенно выше у здоровых курильщиков -1,06+0,17 икг/кг массы тела в день, тогда как у курильщиков -больных раком легких и у некурящих эти значения составили соответственно 0,56+0,08 и 0,59+0,09 мкг/кг е день -

Сравнительно низкий уровень экскреции 7,8-БП с мочой у курильщиков - больных раком легких может быть следствием болыией активности у них ферментных систем, превращающих 7,3-БП в конечный канцерогенный метаболит - его диолэпоксид. Последний же в силу высокой реакционной способности эффективно взаимодействует с ДНК и иными нуклеофильныни молекулами клетки и, следовательно, появление его в моче маловероятно. Это предположение подтверждается известными сведениями о том, что активность систем метаболизма БП у больных ракой легких, вызванного курением,

повышена (А1ехапйгоу К- et а1 • , 1992)- В то же время присутствие 7,8-БП в моче некурящих и Фиэически здоровых индивидууноз свидетельствует о том, что они тоже инели контакт со сравнительно высокими концентрациями БП. Это указывает на высокую степень загрязненности окружаюшей среды города.

Исследования, проведенные у жителей Магнитогорска, подтверждают это предположение- Как можно видеть (рис.4), не было значительных различий в уровнях экскреции с мочой 7,8-БП у мужчин, инегеших или не икенвдих производственной экспозиции к 5Я-

Рис-4- Уровни экскреции с нсчой 7,8-БП <ккЯ/Н креагинина) у

рабочих - мужчин (1) и женщин (2) коксохимического цеха Магнитогорского металлургического комбината, и у мужчин г. Магнитогорска, не имеющих производственной экспозиции к БП ? 3) -

Однако в обеих группах его индивидуальные уровни различались з 5-7 Раз. У курильщиков уровни 7,8-БП в моче были выше, чен у некуряших- Содержание З-ОН-БП в яоче у людей исследованных групп было низким и вала мн'ьорматшзгшм-

Средкие уровни З-ОН-дГ были ниже в ясче не работающих на комбинате, по сравнении) с рабочими- Не было никакого соответствия между индивидуальными урогнани 7,8-БП и В-ОН-лГ (р>С,0Е>, что вполне объяснимо, поскольку происхождение обоих продуктов различно

Таким образом» результаты проведенных нами опытов на животных, так же как и исследования на людях» свидетельствуют о значительных индивидуальных вариациях в экскреции маркерных метаболитов БП. Это подтверждает наличие метаболического фенотипа, обуславливающего предрасположенность к канцерогенному действию БП. В работе удалось выявить определенные различия в уровнях экскреции 7,8-БП у пораженных опухолями животных и людей, по сравнению со здоровыми. Однако выявление характера связей особенностей метаболизма БП с индивидуальным риском рака требует дальнейших комплексных исследований с учетом эпидемиологических данных.

ВЫВОДЫ

1• Однократное виутрибрюшинное введение крысам раствора БП в подсолнечном масле в дозе 200 мг/кг вызвало развитие опухолей у десяти аз 18 животных, доживших до времени появления первой опухоли- Опухоли представляли собой злокачественные фиброзные гистиоцитомы брюшной полости.

2. После такого воздействия обнаружены значительные индивидуальные различия в количествах З-ОН-БП и 7,8-БП, экскретировавшихся с иочой и калом. При этом чем короче был латентный период обнаружения опухолей, тем меньшей была суммарная экскреция с мочой продукта метаболической активации БП, его 7,8-дигидродиола (7,8-БП). Однако эта зависимость носила характер тенденции. В то же время у крыс с опухолями с иочой экскретировалось суммарно 7,8-БП несколько больше?, чем у крыс, резистентных к указанному воздействию БП- Никакой взаимосвязи между иными параметрами экскреции метаболитов БП и его канцерогенным эффектом не было-

3- Десятикратное внчтрибрюыинное введение БП 51 крысе в форме водно-липидной эмульсии в разовой дозе 10 мг/кг с интервалами вежду введениями 10 дней оказало слабый канцерогенный эффект: опухоли внутренних органов развились у 5 крыс, у 4 крыс -злокачественные фиброзные гистиоцитомы и у 1 - лимфосаркома легкого -

4- Крысы» у которых многократное воздействие БП вызвало опухоли внутренних органов, после его перзого введения экскретировали с ночой 7,8-БП в значительно больших количествах, чей животные, у которых опухоли не развились-

5. Индивидуальные уровни экскреции с мочой 7,8-БП у крыс, подвергнутых однократному воздействю БП, имели высокую степень корреляции с его аддунтами в ДНК печени.

6- И рабочих индустриального центра, имевших производственный контакт с БП, и у индивидуумов, не имевших его, с мочой выводились в среднем одинаковые количества 7,8-БП, очевидно, вследствие значительного загрязнения среды обитания БП- Средние уровни экскреции с ночой 8-ОН-дГ были выше у работников комбината, однако не было корреляции между его индивидуальными уровнями и уровнями метаболитов БП-

7- Вровень 7,8-БП у курящих людей, вольных раком легкого, был

значительно ниже, чей у здоровых курильшикоб и некурящих людей -

8- Результаты проведенного исследования свидетельствуют о тон, что определение уровня экскреции с иочой 7,8-БП может быть использовано при установлении индивидуальной предрасположенности к канцерогенному действию БП и оценке канцерогенного риска-

Выражаю сердечную признательность своим научным руководителям, д-м-н- А-9.Лихачеву и д-м-н- П-А-Забежинсхому за постоянное внимание к работе, проф- П-П-Дикуну за ценные советы при ее обсуждении, доктору L-Keefer (Национальный институт рака, США) за помощь в получении стандартных метаболитов БП и его тетролов-

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕКЕ ДИССЕРТАЦИИ

1- Biomarkers for individual susceptibi1ity to carcinogenic agents/ZAbstr. In: Biomonitorinsr and susceptibility markers in human cancer: applications in molecular- epidemiology and risk assessment- Kailua-Kona, Hawaii, USA, 1991, P. 15- (соавт.: Лихачев А-Я-, Бениашвили Д-Ш-, Быков В-Ю-, Дюсун П-П., Савочкина

- 21 -

И. В. , Ермилов В.Б., Забежинский М. А. > .

2. Relevance of quantitation of bensotаЗругепе metabolites in animal excretes to evaluate individual human cancer risk// 1«! Relevance of Animal Studies to the Evaluation of Human Cancer Risk- R. D'Amato, T. Slaga, C. Henry and W. Farland-Eds-, Progress in Clinical and Biological Research.- 1992.- Vol- 374, P. 435-452. (соает-: Лихачев А-Я-, Бениаывили Д-Ш-, Быков В.И-, Ликуй П>П-, Савочкина И.В., Ериилов В-Б-, Забежинский М • А -) •

3. Сравнительное изучение индивидуальных особенностей экскреции метаболитов бенз(а)пирена и его канчерогененого эффекта у крыс// Вопр. онкол- -1992.-Т- 38 - -11 8-- С. 950-956. (соавт.: Лихачев A.S., Забежннский М-А-, Яикун П-П., Савочкина И-В-, Филатов Б-Н-).

4- Biomarkers for individual susceptibi1ity to carcinogenic asentsJ excretion and carcinogenic risk of ЬепгоГаЗругеззе znetabolites//Environments 1 Health Perspectives, 3992, 98, P. 211-214-Ссоавт-: Лихачев A.S-, БениашЕили Д.И-, Быков В-5П., Яикун П-П., Савочкина И-В-, Ериилов В-Б., Забеишский М-А-).

5. Assessment of individual cancer risk by monitoring susceptibility markers- Pharmacology and Toxicology, 1993, 73, Suppl-XI, 31- (соавт-: Лихачев А-Я-, Забежинсгсий H.A., Локтионова Н-, Казакова 0-И-, Ермилов 3-Б-, Бениаъгаили Я-ИП

6- Biological monitoring of carcinogens! implications for individual cancer risk. Inl International Archives of Occupational and Environmental Health-, 1993, 65, 3155-S158-(соавт»: Лихачев А-Я-, Бениашвили Д-И1-, Быков B.KJ-, Локтионоьа Н-А., Казанов® 0.И-, Ериилов В.Б., Яцук 0-С-, Забежинский Н.А.)

7. Molecular markers of individual susceptibility to environmental carcinogens/ZIn^ Lecture Abstracts of XYIth Intern. Cancer Coner-, Hew Delhi, India, 1994, P. 91- (соавт-: Лихачев А-Я-, Бениашвили Д-Ы., Быков В-Ш-, Казанова 0-И-, Савочкина И.В., Ериилов В.Б-, Забежинский М-А-).

8- Individual values of excretion of Ьепго(а)р7геяе

raetabolites and susceptibility to its carcinogenic effect in rats- Cancer Letters, 1994, 78, p-163-170-(соавт-: Лихачев ñ-З-, Забежинский M-ñ-, Быков В-Ю-, Дикун П-П-, Дыночка Л.й-, Непомнящая О-В-, Зцук 0.С-, Ермилов В-Б-)

9- Индивидуальные особенности экскреции метаболитов бенз/а/пирена у крыс и канцерогенный эффект при его многократной внутрибргоыинном введении в форме водно-липидной эмульсии- Экспериментальная онкология, 1994, 16, No 4-6, с-431-436- (соавт.: Забежинский M-ñ-, Лихачев Д-9-, Быков B.J5., Дикун П-П., Дымочка Л-А-, Непомнящая О-В-, йцук 0-С-, Ериилсв В-Б- >

10- Values of В(a)P-7,3~dioI urinary excretion as indicators cf individual sensitivity to B(a)P- Pr-oc. to- Assoc- Cancer-Research 1994, 55, p-157- (соавт-: Лихачев ñ-Я-, Забежинский íí-ñ-, Быков B-K-, Ермилов В-Б-)

11- Urinary excretion of bensof aipyrerie metabolites by the individuals of an industrial area in TJussia- Abstracts of International Conference "From Research to Ppo»a)tic»" Helsinki, Finland, 1955t p-76.(соавт-, Лихачев А.Я., Зцдк 0-C-, Ксвкина 3->