Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Иммунофармакологические аспекты индукции синтеза антител против канцерогенных веществ

В последнее время на стыке неинфекционной иммунологии и биохимической фармакологии сформировалась новая область науки -- иммунофармакология, решающая целый ряд чрезвычайно актуальных для биологии и медицины проблем. Среди них:

I) поиск и изучение механизма действия иммуномодуляторов: а. Иммунодепрессантов (иммуносупрессоров); б. Иммуностимуляторов (иммуноадъювантов);

II) поиск принципиально новых противоаллергических средств;

III) разработка теоретических основ сопряженной функции иммунологической и ферментативных систем, связанных с метаболизмом фармакологических веществ и других химических соединений (промышленные ксенобиотики, канцерогены, мутагены, токсины);

1У) получение антител к низкомолекулярным химическим соединениям (фармакологическим веществам, канцерогенам, эндогенным соединениям) и использование их для решения следующих задач:

1) для идентификации соответствующими антителами химических веществ в биологических жидкостях; изучение фармакокинетики веществ радиоиммунным, энзимоиммунным и другими родственными методами;

2) для снижения с помощью антител уровней некоторых активных эндогенных веществ, например, гормонов, холестерина и других веществ, при гормональных расстройствах, для контрацепции, при атеросклерозе и других заболеваниях;

3) для создания патологических моделей недостаточности определенных химических веществ в организме с помощью антител к этим веществам;

4) для защиты и терапии отравлений химическими веществами при помощи антител, связыващих и нейтрализующих эти вещества;

5) для повышения толейрантности к наркотикам и терапии наркоманий с помощью антител к наркотикам;

6) для пролонгированного нахождения в крови того или иного фармакологического агента в виде диссоциирующего комплекса с антителом;

7) для изучения механизмов действия определенных лекарственных средств;

8) Для изучения механизмов некоторых физиологических реакций;

9) для изучения конформационных различий родственных химических соединений;

10) для определения локализации химических соединений в биологических структурах, например, картирование локализации определенных нуклеотидов в рибосомах;

Имеются, по-видимому, и другие возможности применения антител в биологии и медицине. Ещё десять лет назад иммунофармаколо-гия в сознании многих специалистов, по сути дела, сводилась к изучению иммунодепрессантов и их применению при трансплантации органов и тканей, а также при так называемых аутоиммунных заболеваниях (Ковалев, Сергеев, 1972; Утешев, Бабичев, 1974; S'uw/tJo/z eta£, 1967; НЖскшр et ui , 1963). В 1972 году в СССР была опубликована первая книга по иммунофармакологии (Ковалев, Сергеев, 1972).

В последнее время получило интенсивное развитие направление иммунофармакологии, связанное с получением антител к различным низкомолекулярным соединениям: лекарствам, наркотикам, ядам, канцерогенам и др. (Ковалев, Полевая, 1981; 1985). Установлено, что при помощи таких антител молено существенно повысить устойчивость организма к некоторым низкомолекулярным химическим соединениям, например к барбитуратам, морфину, сердечным гликозидам (Ковалев, Лаврецкая, Меткалова, 1977; Ковалев, Полевая, Меткалова, 1979). Показано, что иммунизацией животных конъюгированными антигенами, содержащими в качестве гаптенных групп психотропные средства (морфин, фенобарбитал, этаперазин, аминазин и др.), можно существенно повысить устойчивость к токсическим дозам указанных агентов (Ковалев и др., 1977\ Smit/l d а£ , 1976). Определенное ослабление токсических эффектов, т.е. введением животным соответствующей антисыворотки или её ^-глобулиновой фракции, а также её Рав-фраг-ментами. Таким образом, открываются возможности для профилактики и терапии отравлений. Принцип действия антител при этом прост. Циркулируя в крови, они специфически связывают поступающие фармакологические вещества и препятствуют их попаданию в центральную нервную систему.

Этот принцип действия антител некоторые исследователи пытались применить для нейтрализации действия канцерогенов в организме. Показано, что иммунизация животных коньюгированным антигеном, содержащим в качестве гаптена производное 7,12-диметилбензантра-цена, значительно уменьшило частоту опухолей индуцируемых этим канцерогеном {ПМНеп , 1981). Аналогичный эффект выявлен у животных, имеющих антитела к 2-антриламину {Р&С& , РгсА , 1971). В других опытах, посвященных изучению влияния антител к химическим канцерогенам на развитие злокачественных опухолей, индуцируемых этими канцерогенами, получены противоположные результаты {CivdL? rial , 1978; Ковалев, Колесниченко, Полевая, 1980). Проблема иммунитета к канцерогенным веществам чрезвычайно актуальна, однако, для её решения требуется разнообразные интенсивные исследования. Данная диссертация посвящена именно этой проблеме.

Пятой задачей иммунофармакологии является изучение молекулярных механизмов индукции специфического иммунного ответа на попадающие в организм низкомолекулярные химические соединения. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям подробно рассмотрены в монографии И.Е.Ковалева и О.Ю.Полевой (1985).

В связи с вышеизложенным цель настоящей работы заключается в следующем: создание новых методов синтеза конъюгированных антигенов бенз(а)пирен-., 3-метилхолантрен-, бензидин-белок, базирующихся на применении определенных ферментов и их химических моделей. Такие коныогированные антигены могут быть использованы для получения антител к этим канцерогенам. Кроме того, конъюгированные антигены могут служить и реагентами для выявления антител к указанным веществам в сыворотке крови животных и человека. Важной задачей исследования является доказательство иммуногенности синтезированных конъюгатов и иммунохимическая характеристика получаемых с их помощью антител. Наконец, практически важной целью является установление и изучение иммунных реакций на указанные низкомолекулярные канцерогены у экспериментальных животных и у людей, имеющих производственный контакт с ароматическими полициклическими углеводородами и ароматическими аминами.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I.I. Методы синтеза коныагированных антигенов для получения антител к канцерогенам.

В последнее время особый интерес вызывают исследования, направленные на получение антител к низкомолекулярным канцерогенным соединениям. Для индукции антител к низкомолекулярным соединениям необходимо синтезировать искусственные конъюгированные антигены.

Коныогированные антигены, в которых в качестве гадтена содержались различные химические канцерогены, ранее были синтезированы изоцианатным, диазометодом и методом смешанных ангидридов. Ещё в 1937 году был описан синтез конъюгированного антигена (C^Ltich » blanks' t 1937 ), названного в то время "хемоантигеном", который получен путем связывания канцерогенного полициклического ароматического углеводорода - 1,2,5,6-дибензантрацена с лошадиным сывороточным альбумином изоцианатным способом. Впоследствии был получен ряд изоцианатов псшициклических ароматических углеводородов, таких как 3,4-бенз(а)пирен, 1,2-бензантрацен, 10-метил-1,2,-бензантрацен, антрацен (9eisez , Cietch , 1939; 1941 ) и связыванием изоцианатов канцерогенов с различными белками синтезированы соответствующие конъюгированные антигены {Cxeech , ^oniS , 1940, 1941 \Jorutf , Otuch , 1943 ). Например, конъюгаты 3,4-бенз(а)пирена и 10-метил--1,2-бензантрацена были синтезированы ( Creech. , 1941 ) по следующей схеме I:

N0Z z з,4-Бннз(с0пиррн г

Схема I.

С использованием изоцианатных производных также били связаны с белками п-диметшгаминофенол ( Peck ef at , 1952 ), 2-антрил-амин {PUsei , Czeec/i, 1939 ).

Большая группа канцерогенов, содержащих ароматическую аминогруппу, таких как бензидин, аминофлюорен, азокрасители, стильбе-ны, производные аминоазобензола, была присоединена к белку при превращении их в реакционноспособные диазониевые соли. Суть этого метода представлена на схеме 2: тщ+то

БЕЛОК

N&N- БЕЛОК о

Схема 2.

Поскольку ароматические диазониевые соли вступают в реакции азо-сочетания с активированными ароматическими ядрами и аминами, реакция присоединения гаптена осуществляется по остаткам тирозина, гистидина и триптофана в белковом носителе {Beiset ef od 1976; Btlangei, 1973; Коростелёва, 1975 ). Этот метод использовали при конъюгировании аминобензола, :п-амино-Л^Д/-диметиланилина

Qliuthexsf ei q£ > 197? ), стильбена

1935 ). Конъюгация происходит между стильбеновой молекулой и сывороточным альбумином, например, по остаткам тирозина (схема 3): Ч JT\ /гъ + kirn" сывороточный fCH3)2A/^CH=CH-Q-^ + AAb5VMUH--

СНb)zN ^-О

СИу-С--2 \ с-о

N4 сывороточный

АЛЬ&УММН

Схема 3.

Ацетиламинофлюорен также присоединяли к белку азосвязьго ( 9-ioyJ et at , 1976 ). Диазометодом получены и конъюгированные антигены, в которых канцерогенные азокрасители, например, о-аминоазотолуол, ковалентно связаны с макромолекулярным носителем ( Коростелёва и др., 1966; Ковалёв и др.,1984 ).

Полициклические ароматические углеводороды конъюгируют с белком не только посредством введения в молекулу углеводорода изоциа-натной, диазогрупп, но и- карбоксильной. Полученные полупродукты ковалентно связывают с белками методом смешанных ангидридов, принцип которого представлен на схеме 4:

О СИ* о

R-C-DH + ЧСН-СНг-0-С-(£ сн3

СИз 0 О v II и

- СН-СН-тО-С C-R+

СН3 О Л/Н-БЕЛОКсн^

СНз

Схема 4.

Метод прост, не требует выделения промежуточных активных производных и позволяет получить конъюгированные антигены, содержащие 10 -20 молекул полициклического ароматического углеводорода на молекулу альбумина. Таким образом, был присоединён к белку фторопроизвод-ный аналог диметилбензантрацена 5-фторо-12-метилбензантрил-7-уксус-ная кислота {ЩооШп »CQppatet , 1978 ) ( Схема 5 ).

СН; О

С Н* сИд

СНъ сн~сн2-счг-он сн3

БЕЛОК

Схема 5.

Антитела к низкомолекулярным соединениям, в том числе и к химическим канцерогенам, получают иммунизацией животных, таких как крысы, мыши, кролики, морские свинки, конъюгированным антигеном, содержищим в качестве гаптена канцероген. Однако, кролики являются наиболее удобными животными для получения высоких титров антитая. Иммунный ответ индуцируют, используя различные схемы иммунизации. Обычно антиген в дозе 25-40 мг/кг вводят в течение 8 недель многократно с интервалом от 7 до 14 дней в зависимости от выбранной схемы. Использование полного адъюванта Фрейвда позволяет вводить меньше дозы конъпгированного антигена и получить более высокие титры антител. Такой адъювант состоит из трех компонентов: минерального масла, ланолина и убитых микробактерий туберкулёза.

После введения искусственного конъюгированного антигена у экспериментальных животных вырабатываются антитела как на гаптен, так и на белок-носитель. Антитела к гаптену в присутствии антител к белковому носителю можно обнаружить следующими классическими методами: преципитации, фиксации комплемента, пассивной гемагглюти-нации. В этих методах используют реакцию связывания антител с антигеном, содержащим гетерологический белок-носитель. Важным условием адекватности результатов является торможение взаимодействия конъюгированного антигена с антисывороткой свободным гадтеном {ButPet , 1973 ).

Например, метод цреципитации был использован {ОшсА ^tanks' , 1937 ) для выявления антител к 1,2,5,6-дибензантрацену в крови у кроликов, которым вводили конъюгированннй антиген 1,2,5,6-дибенз-антрацен-белок. Специфичность антител исследована реакцией торможения преципитации. Было показано, что преципитация тормозится цри добавлении несвязанного гаптена, что свидетельствует о специфичности антител к 1,2,5,6-дибензантрацену. Аналогичным образом были определены антитела к бенз( а) пирену в сыворотке крови кроликов, иммунизированных конъюгатом бенз(а)пирен-белок {Омск ,

1941 ).

В следующей работе этих же авторов ( СшсА. , 1947 ) также методом преципитации были выявлены антитела в сыворотке крови кроликов к целому ряду полициклических ароматических углеводородов. В качестве гаптенов применяли такие углеводороды, как 3,4-бенз(а)пи-peH,j& -антрацен, 1,2,5,6-дибензантрацен, 1,2-бензантрацен, а в качестве белков-носителей различные альбумины: бычий сывороточный, яичный, а также человеческий сывороточный J7-псевдоглобулин. Специфичность антител определяли с использованием перекрёстных реакций преципитации мезду антисывороткой и тест-антигеном, содержащим в качестве гаптена родственные углеводороды. Антисыворотка, полученная от иммунизации животных коньюгированным антигеном 1,2-бензант-рацен.- бычий сывороточный альбумин, давала перекрестные реакции с конъюгатами, содержащими 3,4-бенз (а кирен, 1,2,5,6-дибензантрацен и 10-метил-1,2-бензантрацен. Таким образом, антитела, выработанные на определенный полициклический ароматический углеводород, обладают способностью связывать широкий круг родственных гаптену соединений. Этот факт можно объяснить наличием общих структурных элементов в полициклических углеводородах.

Интенсивность иммунного ответа зависит от количества црисоеди-ненного галтена к молекуле бежа. Оказалось, что наибольшее количество антител было выявлено в антисыворотке животных, которых иммунизировали конъюгатом, содержащим 15 - 20 молекул гаптена на иолекулу белка.

Другой метод, а именно, метод пассивной гемагглютинации, был применен для измерения уровня антител к бенз (а )пирену и диметил-бензантрацену (Cilittf d а£ , 1978; TompQ tCwdtf , 1979 ), в котором использовались эритроциты барана, связанные с коньюгированным антигеном канцерон-белок с помощью глутарового альдегида. Принцип этого метода заключается в том, что антитела к низкомолекулярным веществам вызывают агглютинацию корпускулярных частиц, таких как эритроциты или латекс, которые связаны с соответствующим веществом, его производным или конъюгатом этого вещества с белком {СШЫ , 1974; /Ьй?, et а£ ^ 1966).

В последнее время для выявления антител к низкомолекулярным соединениям используют радиоиммунологический метод, принцип которого заключается в следующей конкурирующей реакции: антитела Комплекс

Меченый гаптен -------меченый гаптен-антитело г----------------+

Немеченый гаптен Комплекс немеченый гаптен-антитело Специфические антитела связывают меченый гаптен и образуют комплекс гаптен-антитело, который можно выделять из реакционной смеси. Немеченые гаптены конкурируют с меченым гаптеном за активные центры антител. Сравнивая величины соотношений меченого гаптена, связанного с антителами, и свободного меченного гаптена в анализируемом образце в стандартных условиях с известным количеством гаптена, находят концентрацию биологически активного соединения. Этим методом с использованием радиоактивного гаптена, меченного изотопом были определены антитела к диметилбензантрацену (ДМБА) (Пкюйеп .СаррсшИ , 1978).

Следует подчеркнуть, что до сих пор для индукции антител к канцерогенам применяли конъюгированные антигены, содержащие в качестве гаптенов непосредственно канцерогены и тогда такие носители могли сами обладать канцерогенным действием, индуцируя злокачественные опухоли в процессе иммунизации. В работе {Jlkodkfl ,Саррсж(! , 1978) для индукции антител к диметилбензантрацену ( ДМБА ) применили искусственный конъюгированный антиген, в котором в качестве гаптена использовали неканцерогенный аналог ДМЕА - 5-фторо--12-метш1бензантрил-7 уксусную кислоту. Была изучена специфичность выявленных антител и продемонстрированы перекрёстные реакции с родственными соединениями, например, с бенз(а)пиреном. Антитела, индуцируемые таким антигеном, содержащим ' неканцерогенный гаптен, связввали и родственные канцерогенные вещества, такие как ДМБА и бенз(а)пирен. Следовательно, антитела к химическим канцерогенам можно получить и на основе безопасных конъюгированных антигенов. Такой подход к проблеме получения: антител к химических канцерогенам обладает, на наш взгляд, существенными цреимуществами по сравнению с другими выше изложенными способами.

Таким образом, к настоящему времени химическими методами синтезированы конъюгированные антигены, содержащие б качестве гаптен ов большой круг канцерогенов и получены антитела к ним, обладающие широкой субстратной специфичностью.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые ферментативные (с использованием пер-оксидазы хрена) способы получения конъюгированных антигенов, содержащих в качестве гаптена химические канцерогены - бенз(а)пи-рен, 3-метилхолантрен и бензидин.

2. Предложены новые химические методы синтеза конъюгированных антигенов с помощью химических моделей монооксигеназ и пер-оксидаз - реагента Фентона и м-хлорнадбензойной кислоты. На основе этих методов синтезированы конъюгированные антигены бенз(а)пи-рен-, 3-метилхолантрен-, бензидин-бычий сывороточный альбумин.

3. Разработаны способы получения диагностикумов-эритроцитов барана, ковалентно связанных с конъюгированными антигенами (канцероген-белок) и методы выявления антител к бенз(а)пирену, 3-метил-холантрену и бензидину с помощью реакции пассивной гемааглютинации.

4. Установлено, что иммунизация животных синтезированными нами коныогированными антигенами бенз(а)пирен-, 3-метилхолантрен-и бензидин-белок, индуцирует синтез антител к соответствующему химическому канцерогену.

5. Экспериментально установлен факт наличия антител к химическому канцерогену бензидину в сыворотке крови крыс, которым его вводили put os . Выявлена высокая гетерогенность интенсивности иммунного ответа на бензидин у индивидуальных животных.

6. Исследована взаимосвязь между интенсивностью иммунного ответа к бензидину в условиях хронического введения крысам и его токсическим эффектом. Установлена важная роль иммунной системы в нейтрализации токсического действия бензидина.

7. Установлено, что у 1Q% людей из 126 обследованных, имеющих производственный контакт с ароматическими полициклическими углеводородами и ароматическими аминами, в сыворотке крови содержатся антитела к бенз(а)пирену и бензидину.

1У. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема иммунологических реакций организма на низкомолекулярные соединения, являющиеся канцерогенами - несомненно крайне актуальна. Эта актуальность всё более возрастает в связи с увеличением использования химических соединений в промышленности и загрязнением ими окружающей среды. Проблема устойчивости организма к химическим соединениям - одна из центральных в фармакологии и токсикологии. Поэтому нами и была поставлена задача разработать методы выявления антител к бенз(а)пирену, 3-метилхолантрену и бензидину,являющимися широко известными низкомолекулярными канцерогенами. Принципиально новым в нашей работе является то, что конъюгированные антигены, необходимые для иммунохимических реакций, связанных с выявлением антител к канцерогенам или индукций" синтеза антител к канцерогенам у животных, были синтезированы, исходя из принципов теории иммунохимической функциональной системы гомеостаза (Ковалев, Полевая, 1985). Согласно этой теории,системообразующим фактором, объединяющим иммунологическую и монооксиге-назные системы для выполнения адаптивной функции являк?тся высоко-реакционноспособные метаболиты химических соединений, связывающиеся ковалентно с белками с формированием конъюгированного антигена. Анализ метаболической активации полициклических ароматических углеводородов (бенз(а)пирен, 3-метилхолантрен) и ароматических аминов (бензидин) позволил установить пути их метаболического превращения в высокореакционноспособные. Выявленные закономерности возможных путей метаболической активации низкомолекулярных химических соединений в организме под действием различных ферментов привели нас к мысли использовать ферменты для целенаправленного синтеза конъюгированных антигенов.

В качестве фермента, активирующего указанные выше низкомолекулярные соединения, мы использовали пероксидазу хрена. Нами впервые доказано, что с помощью этого фермента можно легко осуществить реакцию ковалентного присоединения как полициклических ароматических углеводородов, так и ароматических аминов. В результате этих исследований предложены новые методы синтеза конъюги-рованных антигенов.

В настоящее время интенсивно проводятся исследования по изысканию путей моделирования многочисленных ферментов, в том числе и монооксигеназ, осуществляющих гидроксилирование ароматических соединений. В работе мы также пошли по пути моделирования монооксигеназ с целью получения конъюгированных антигенов. Подобные работы ранее не проводились. Нами впервые установлено, что принцип химического моделирования монооксигеназ может быть с успехом использован для решения вышеуказанной задачи. Моделирование монооксигеназ шло по двум путям: а) по пути генерирования свободнора-^ дикальных реакций с помощью реагента Фентона и б) с помощью введения эпоксигруппы в участки молекулы, содержащие ненасыщенные двойные связи, с использованием м-хлорнадбензойной кислоты. Сами по себе указанные две реакции в химии широко известны, но для целей ковалентного присоединения низкомолекулярных веществ к макромолекулам ранее не применялись. Следовательно, значение данного раздела нашей работы заключается не только в разработке нового метода, но, что существенно более важно, в разработке новых принципов конъюгирования. Использование этих принципов переводит проблему синтеза конъюгированных антигенов на совершенно новый уровень. Следует отметить, что с помощью фермента и химических моделей ферментов конъюгированные антигены можно получать максимально похожими на те, которые образуются подобными механизмами и в самом организме при попадании в него изучаемых канцерогенных веществ. Кроме того, эта часть работы является не только развитием биотехнологии конъюгирования, но и вскрывает те молекулярные механизмы, с помощью которых организм сам синтезирует естественные конъюгированные антигены и включает тем самым иммунологическую адаптивную реакцию. Обнаруженное нами развитие иммунной реакции крыс на хроническое введение бензидина свидетельствует о том, что естественные конъюгированные антигены, содержащие канцерогены в качестве гаптенов, действительно интенсивно образуются и вызывают соответствующий иммунологический ответ, снижающий токсичность бензидина.

Конечной целью начатой работы, несомненно, является выяснение возможности иммунологической защиты организма от онкогенного действия канцерогенов. Однако, эта проблема, имеющая колоссальное фундаментальное значение, требует дальнейших серьёзных исследований, для проведения которых необходимы особые условия и финансирование. Наша работа является тем первым этапом, без которого невозможно решение указанной фундаментальной проблемы.

Практическим результатом этой работы явилось создание диаг-ностикумов для оценки канцерогенной нагрузки у людей, работающих в химической промышленности. Эти диагностикумы используются в настоящее время Институтом канцерогенеза ВОНЦ ЖН СССР при проведении эпидемиологических исследований.