Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Разработка количественного метода определения метаболитов бенз(а)пирена в экскретах животных и изучение индивидуальных и видовых особенностей их экскреции



СЙВОЧКИНЙ Ирина Витальевна

РЙЗРЙПОТКЙ КОЛИЧЕСТВЕННОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ БЕНЗ( а ШИРЕНА В ЭКСКРЕТАХ ЖИВОТНЫХ И ИЗУЧЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ И ВИДОВЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ИХ ЭКСКРЕЦИИ

14.00.14. Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических нацк

Санкт-Петербцрг-1995

Работа выполнена р научно-исследовательском институте онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Министерства Здравоохранения и Медицинской Промышленности Российской Федерации.

Научный руководитель:

г- доктор медицинских наук А.Я. Лихачев

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук Л,К. Бератейн

- доктор био."огическихких наук, профессор D.O. Коблаков

Ведуцее научное учреждение: Центральный научно-исследовательский рентгёно-радшлсгический институт Министерства Здравоохранения и Медицинской Промышленности Российской Федерации

Защита диссертации состоится " "...........1995 г,

в " " часов на заседании специализированного совета НИИ онкологии им, проф. H.H. Петрова Министерства Здравоохранения и Медицинской Промышленности Российской Федерации по адресу: 189646, Санкт-Петербург, Песочный-2, Ленинградская ул.. 08.

С диссертацией мовно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " "........."........1995 г.

Учений секретарь специализированного совета доктор ыедицинских наук

Е.В. ДЕМИН

Актуальность про б лемы

Канцерогенную угрозу для человека представляет мнокество различных химических соединений, в том числе полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) (Томатис Л., 198?; ШС, 1984). Среди последних наиболее опасен бенз(а)пирен (БП), что обусловлено его высокой канцерогенной активностью и широким распространением в окружающей среде (ШС. 1990 ).

Однако хорошо известно, что среди индивидуумов, имеющих практически равную канцерогенную нагрузку, рак развивается лииь у части из них. Это обусловлено неодинаковой чувствительностью . организма к действию канцерогенных агентов. Изучение факторсв, определявших индивидуальную чувствительность к ним, вазно для прогнозирования риска возникновения злокачественных новообразований. Одним из таких факторов являются особенности метаболизма канцерогенов. Многочисленными исследованиями показано, что ПАУ, включая БП, относятся к веществам, которые под действие : ферментных систем организма претерпевают различные пре-ращения, ведущие как к их активации (образованию канцерогенных метаболитов), так и к дезактивации (образовании неканцерогенных метаболитов) (Кобляков В.А.. 1990; РеНопеп К., 01рр1 е А., 1995 ), Независимо от пути попадания в организм, метаболизм этих соединений происходит преимущественно в печени.

На гзрвом этапе метаболизма образуется множество метаболитов БП: эпоксидов и фенолов. Фенолы, например, 3-гпцрокси-бенз(а)пирен (3-ОН-БП), в основном являются слабо-, или неканцерогенными соединениями. Эпоксиды превращаются, в свои очередь, в соответствующие дигидродиолы, такие как 7,8-дигидродиол БП (7,8-БП), 4.5-дигидродиол БП (4,5-БП) и 3.10- дигидродиол БП <9.10—БП). которые могут окисляться, образуя'соответствующие дисл-эпоксиды. Основную роль в канцерогенезе играет 7,8-БП, из которого в результате последующего окисления образуется бен-(а)пирен-7.9-диол-Э,10-эпоксид (БПДЭ) - конечный канцерогенный метаболит БП. В то не время основным продуктом инактивации 5П является 3-0Н-5П (ШС. 1984; РеНог.еп К.. 01рр1е'А,, 1995 ).

На основании данных об индивидуальных колебаниях активности ферментов (так называемый метаболический фенотип), от которых зависаг особенности метаболизма БП и, следовательно, соотношение образующихся метаболитов, теоретически представляется возможным

производить изучение индивидуальной чувствительности организма-к его канцерогенному действии по количественному определению метаболитов.

Большинство методов, использовавшихся для этого ранее, были инвазивнчми (анализ компонентов крови, проб тканей). В работе предпринята попытка создать неинвазивный. основанный только на исследовании экскретов, метод определения метаболитов БП. Идея определения чувствительности организма к БП по исследованию экскреции его метабо.гчтов представляется целесообразной, поскольку она базируется на одном из ключевых этапов канцерогенеза. Ранее метаболиты БП в различных биологических кидкостях исследовались разными методами СIАЯС. 1984, 1986 ), в основном с использованием видкостной хроматографии высокого разрешения. Однако она малоприменима для большого количества проб, а последнее необходимо для обследования достаточно репрезентативного контингента людей, тдвергшихся воздействию БП. Для такого исследования требовалось разработать надекный, сравнительно простой и доступный метод количественного определения основных метаболитов БП. При разработке метода был использован накопленный в НИИ онкологии опыт-применения фторесцентно-спектрального анализа ПйУ с избирательным возбуждением флюоресценции для определения того или иного соединения в смеси ПйУ без их хроматограричеекого разделения.

Цель исследования

Основной целью работы являлась разработка адекватного спектрально-флюоресцентного метода количественного определения маркерных метаболитов БП в экскретах яивотных и исследование с его помощью индивидуальных и видовых особенностей их выведения из организма.

Для достивения этой цели били поставлены следующие задачи:

1) Разработать методику экстракции метаболитов БП: продуктов его метаболической активации (4,5-, 7,8- и 9.10—БП> и детоксикации

С3—ОН-БП) из мочи и кала животных, подвергнутых воздействию БП.

2) Разработать спектрально-флюоресцентную методику количественного определения указанных метаболитов БП в экстрактах, без их хроматографического разделения.

3) Изучить- индиэидуальние и видовые особенности экскреции указанных метаболитов БП с мочой и калом крыс и обезьян.

подвергнутых его воздействий в различных дозах.

Каучная новизна исследовани я

В ходе выполнения диссертационного исследования впервые разработана методика количественного определения ряда метаболитов БП спектрально-флворесцентннм методом в смеси, без их хроматографцческого разделения. Преимущество такой методики состоит в том, что она позволяет уменьшить потери метаболитов, неизбежные при фракционировании пробы. Важной особенностью разработанной методики является ее высокая чувствительность и избирательность.

С помощью указанной методики впервые исследована динамика экскредаи с мочой и калом метаболитов БП - маркеров его биологической активации и дезактивации, и определены их индивидуальные уровни в экскретах у крыс, а также у обезьян -животных, биологически наиболее близких к человеку.

Практическая значимость

Разработанная методика, позволяющая определять индивидуальные уровни экскреции метаболитов БП. в случае обнаружения корреляции между уровнем экскреции метаболитов БП и его канцерогенным эффектом, может быть использована для оценки индивидуальной" чувствительности к БП. Последнее важно для формирования групп повыиенного риска среди рабочих производств, где не удается исключить контакт с БП. а также среди контингента людей, имеющих с ним бытовой контакт.

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые разработана высокочувствительная спектрально-флюоресцентная методика, позволяющая количественно определять маркерные метаболиты БП - продукт его детоксикации 3-ОН-БП, а также продукт его метаболической активации 7,8-БП в экскретах иивотных, подвергнутых воздействию этого соединения.

2. Обнаружена зависимость степени экскреции метаболитов БП от -его дозы.

3. Отмечен значительный индивидуальный разброс в экскреции

7,8-БП и З-ОН-БП с максимумом экскреции на 2-4-й день после введения БП.

4. Исследованы видовые различия в экскреции метаболитов БП у крыс и обезьян.. Обнаружена больная экскреция метаболитов БП у крыс, пс сравнению с обезьянами, при однократном знутрибрюшинном , воздействии БП в одинаковых гозах. Однако отношение количеств активных и неактивных метаболитов БП у обезьян было выие. чем у крыс.

5. Проведенные исследования дают возмокность изучения зависимости индивидуальной чувствительности к канцерогенному действию БП от особенностей экскреции его маркерных метаболитов.

Апробация работы

Материалы диссертации долохены на 1-м Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака" (Москва, Черноголовка, 30 сентября -3 октября 1987 г.). Республиканской научной конференции "Механизмы канцеро- и .пейкогенеза" (Киев, 30 января - 1 февраля 19Э0 г.). 15-м Мекдунаропноы противораковом конгрессе (Гамбург, Германия, 16 - 22 августа 1990 г.), Неядународной конференции "Значение исследований на яивогных для оценки онкологического риска у человека" (Остин, Техас. Ш, 5-8 декабря 1990 г.). Международной конференции по экологической и промышленнной токсикологии (Бангкок. Таиланд, 22 - 26 июля 1991 г.), 1-й Мегдународной конференции "Биомониторинг и маркеры чувствительности к раку: их роль в молекулярной эпидемиологии г, оценке риска" (Гавайи, С51А, 26 октября - 1 ноября 1991 г.), 16-м Международном противораковом конгрессе (Дели, Индия, 30 октября -5 ноября 1994 г.). совместной научной конференции лабораторий онкоэкологии, экспериментальных опухолей, канцерогенных агентов НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова МЗМПРФ (10 октября 1995г.)

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 20 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методоЕ исследования, четырех глав с изложением результатов

-ч-

собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и указателя литературы, включающего 28 работ отечестЬенных и 130 раСот зарубеяных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТН

Материалы и методы исследования

В работе были использованы: БП фирмы "Buchs" (Швейцария); а также стандартные метаболиты БП:

(±)-транс-7,8-дигидрокси-7,8-дигидробензо(а)пирен (7.8-БП). (+)-транс-9,Ю-дигидрокси-9,10-дигидробензо(а)пирен (9,10-БП), (-t)-TpaHC-4,5-дигидрокси-4.5-дигидробензо( а )пирен (4,5-5П), 3-гидрчкси-бензо(а)пиреи f3—ОН—БП). полученные от "Chemical Repository" (Национальный институт рака, Бетезда, США).

Оля'деконъюгации были использованы следующие ферменты: арилсульфатаза из Helix pouatia. 1000 ед/мкл ("Boehringer Mannheim", ФРГ) и ^-глюкуронидаза (^-D-Glucuronide glucuronosohydrolase) из печени быка, тип В-1, 100 ед/мкл ("Signa", США).

В работе применилась ионообменная смола fimberlite XAD-2 С"Rohm & Haas", США), 8 качестве внутреннего стандарта применялся бензСg.h,i )перилен (БПЛ) фирмы Rutgersne'rke-AG Zueigniedariassung Rauxel Castrop Rauxel 2 (ФРГ).

Метаболиты БП и приготовленные из них ст:ндартные растворы в абсолютном этиловом спирте хранили в жидком азоте.

Спектры смеси метаболитов БП и отдельных метаболитов записывали на спектрофлпоримятре HPF-4 ("Hitachi.", Япония). Количественное определение различных ПДУ производили с помощью монохроматического 9озбуждения их флюоресценции светом с определенней, специфичной длы каждого из них длиной волны при температуре жидкого азота. Это обеспечивает высокую чувствительность и избирательность их определения, так как глубокое охлаждение среды, в которой происходит процесс возбуждения и излучения определяемых и сопутствующих им молекул, приводит к резкому сужению полос (пиков) их спектров флюоресценции к возбуждения (поглощения) - так называемые квазилинейчатые спектры (йпольский З.В. и др., 1952). Это создает благоприятные условия для избирательного возбуждения флюоресценции определяемого метаболита и вещества - внутреннего

стандарта и последующей обработки спектрограмм. Такой метод используется для анализа неизмененного БП (Дикун П.П. и др.. 1964). Однако для выявления его метаболитов он применен впервые. В работе обнаружено, что метаболиты 511 обладают специфическими спектра;.ьнб-флворесцентными характеристиками. Это делает возможным их избирательное возбуждение в смеси, что должно уменьиить неизбежные потери и разрушение нестойких метаболитов, происходящие при фракционировании пробы. Для записи спектров в качестве растворителей применили н-октан и этилацетат, как соединения, наименее искажающие спектр элюата.

Эксперименты проводились на 116 неинбредных крысах - самцах линии ЛИО (Anls'nov U.N. et al., 1989) разводки вивария НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова с массой тела около 150 г, а также ьа 5 обезьянах - самцах Macaca fasclcularis разводки Онкологического научного центра Республики Грузия с массой 2-6 кг.

Растворенный в подсолнечном масле БП (10 мг/мл) вводили однократно внутрибркшинно в различных дозах; 1, 10, 100 и 200 мг на 1 кг массы тела. Такой метод введения обеспечивал точную дозировку препарата, его последующее попадание через систему воротной вены в печень и тем самым дальнейший метаболизм и экскрецию метаболитов.

Начиная с момента введения БП крысы находились в индивидуальных обменных клетках, где у них на холоду ежедневно собирали мочу и • кал. Период сбора экскретов у животных одной из групп составлял 5 суток - срок, который должен быть достаточным для полного метаболизма введенного БП. что было показано в опытах на мышах (Camus A.M. et al.. 1984), а также 8 или 15 суток у животных других групп. Собранные суточную мочу и кал сразу же замораживали и хранили в холодильнике при -4°С.

Обезьяны после введения БП были помещены в индивидуальные клетки, где у них ежесуточно собирали кал-(собирать мочу оказалось технически невозможным) в течение 5-8 суток. После этого их умерщвляли с помощью ингаляции хлороформа, затем у всэх обезьян был взят кал из кишечника и у 2 из них удалось собрать мочу из мочевого пузыря.

Для экстракции метаболитов БП из экскретов модифицировали методику Саши« A.M. и соавт. (1984). Мочу размораживали, ее рН доводили до 8,0 и при комнатной температуре центрифугировали при 2500 g 30 минут, чтобы избавиться от нерастворимых осадков.

Водный экстракт кала получали гомогенизированием и трехкратной экстракцией после взбалтывания на шиттель- аппарате (15 м: нут) с последующим центрифугированием при 2500 g 20 минут. Экстракты . трижды пропускали через колонку (5 мм х 10 см) с сорбентом йгаЬегlite XP.D-2, показавшим 902-ую эффективность экстракции метаболитов. Содержимое из колонок элюировали 10 мл ац:-тона, элюаты объединяли и затем обезвоживали добавлением. 2-3 г безводного сульфата натрия. Пробы концентрировали под вакуумом до полного удаления ацетона. В каждую пробу добавляли 2,5 мл 75 тМ фосфатного буфера (ph 7,4) и ферменты деконъюгации: ^-глюкуронидазу (700 ед) и арнлсульфатазу (900 ед). Инкубацию производили 1 час при 37°С в атмосфере азота. Далее из инкубационного раствора производили 3 последовательные экстракции метаболитов 5П 10 мл этилацетата; экстракты объединяли. Этилацетат был избран в связи с его лучшей экстрактивной способностью в отношении метаболитов БП. по сравнению с н-октаном.

Каждую пробу делили на 4 параллельных и измеряли в них'на спектрофлюориметре MPF-4 концентрации метаболитов БП п. собственной методике. Запись каждой пробы производили трижды. Статистическую обработку результатов проводили методом регрессионного анализа и по непэраметрическому критерию "U" Вилкоксона-Манна-Уитни (Лакмн Г.Ф.. 1973).

Результаты исследования и их обсуждение

1; Разработка спектрально-флюоресцентного метода количественного определения метаболитов 5П в экскретах.

Разработка метода состояла из следующих этапов: 1) исследование спектральных свойств стандартных метаболитов БП "а спектрофлюориметре HPF-4 (Hitachi, Япония); 2) разработка методики количественного определения маркерных метаболитов.БП; 3) подсчет количеств метаболитов БП в экскретах животных, подвергнутых воздействию ЕЛ.

Были записаны спектры возбуждения стандартных метаболитов БП, которые образуются при сканировании длины волны возбуждения при Фиксированной длине волны флюоресценции, соответствующей длине волны аналитического пика исследуемого вещества, подбираемой экспериментально, и спектры флюоресценции, которые проявляются

■ -8в результате сканирования длины волны флюоресценции пои Фиксированной длине волны возбуждения (Дикун П.П., 1959). Резуль-аты опытов с растворами метаболитов БП в этилацетате приведены в таблице I.

Таблица I.

Длины волн спектров возбуждения и флюоресценции некоторых метаболитов БП в этилацетате.

Метаболит БП Длина волны Длина волны

возбуядения, ни флюоресценции, нм

3—ОН—БП 405 431: 458

7.В-БП 537: 153; 370,5: 373.5 394; 407: 316,5

9,10-БП 299.5: 321: 331; 343; 347,5 401; 425 406; 411;

4,5-БП 276,5; 287; 300; 312; 326 365; 335; 369; 409 377;

В таблице подчеркнуты аналитические линии спектров возбуядения и флюоресценции, использоваввиеся в последующих йсследопакиах.

Были записаны также спектры флюоресценции смеси всех четырех метаболитов БП при характерных для каждого из них длинах волн возбуждения. Эти исследования показали,•что при соответствуюцей денному метаболиту длине волны возбундения характерный пик Флюоресценции на спектрограмме принадлежит именно ему. Остальные метаболиты токе флюоресцируют при таких условиях, но при этом они практически не искажают спектр определяемого метаболита. Таким образом, оказалось возмояным исследовать метаболиты БП в смеси, без их хроматогрефического разделения.

Предел чувствительности спектрально-флюоресцентного метода количественного определения маркерных метаболитов БП, найденный

при понощи разбавления 'смеси стандартных метаболитов БП экстрактом мочи контрольных животных, составил 0.02 мкг того или-иного метаболита БП в пробе. Сравнение этих результатов с аналогичными литературными данными свидетельствует о том, что благодаря использованию- квазилиягйчатых спектров флюоресценции при температуре гадкогс азота селективность и чувствительность разработанного метода не уступает таковым при определении таких же метаболитов с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения.

Поскольку в экскретах животных, получазиих БП. не удалось надежно выявить 4,5-БП'и 9,10-БП, е дальнейшей работе проводили количественный анализ только "маркерных" метаболитов 5П - ?.8-БП (маркера активации) и 3-0Н-5П (маркера дезактивации).

Чтобы найги количественное критерии, позволяющие определять маркерные метаболиты БП, был применен метод внутреннего стандарта, в качестве которого был избран БЛ5. Этот метод в лаборатории онкозкологии Института широко используется при определения БП в различных продуктах (Дикун П. П., 1984). Однако для определения метаболитов БП он был применен впервые в этой работе. БПЛ был избран потому, что он не присутствует в исследуемых пробах, а его Флюоресценция Еозбундается на длинах волн возбуждения метаболитов БП. Важно, что он дает четкий пик флюоресценции на длине волны, равной 419 км. не совпадающей с длинами воля флюоресценции маркер.шх метаболитов БП (рис. 1).

С помощью сравнения высот пиков флюоресценции известных количеств того или иного метаболита БП и высот-пиков-флюоресценции добавленных в пробу известных количеств БПЛ был составлен график зависимости отношений количеств сгпредвляеаого метаболита ЕП а БПЛ и отношений высот пиков флюоресценции метаболита БП и БПЛ. на котором для каждого определяемого метаболита 'БП был сбнаруген удобный для расчетов участок, олисызаемый следующая формулой линейкой зависимости:

V количество метаболите БП _ л Н метаболита БП . п.

количество "БТИ----ЕГБП75-+ И.

где Н - высота пика флюоресценции. Для З-ОН-БП линейная зависимость была обнаружен* на участке графика, где значение

Н З-ОН-БП - I- гг

—— * а .6-ЕП - на участке, где значение

" н'бпл" ^ 1« ° результате проведенных расчетов было

усуансглеко. чт: коэффициенты й и В имеют следующие гнгчекия:

-ю-

\

Рис, 1. Спектры флюоресценции снеси двух метаболитов БП (7,8-БП и З-ОН-БП) с добавкой БПЛ:

а) 7,8-БП: б) З-ОН-БП.

1- пик флюоресценции метаболита БП:

2- пик флюоресценции БПЛ. добавленного в определяемый экстракт.

По оси абсцисс - длина волны "флуоресценции, нм. по оси ординат - интенсивность флюоресценции.

коэффициент А: для З-ОН-БП - 0.0038; для 7.8-5П = 0,131; коэффициент В: для З-ОН-БП = 0,0033: для 7,8-БП = -0,012.

2. Экскреция мэтаболитоз БП у крыс, получаввих разные ;:зы БП.

В процессе перехода к работе с экскретами были исследованы метаболиты БП в моче 10 крыс, получавших разные дозы ЕП: 1. 10 и 100 мг/кг кассы телз. В пробах мочи крыс, которым ееодили 1 мг БП/кг массы тела, достоверно не были обнарухенн как 7,8-БП, так и З-ОН-БП. а при дозах БП 10 и 100 мг/кг массы тела оба эти метаболита БП уверенно определялись (табл. 2). При этом количества

таблица 2.

Средние дровни экскреции с мочой за 5 суток маркерных метаболитов 5П у крыс (мкг/кг массы тела" после введения БП в различных дозах С мг/кг ).

доза БП 7.8-БП 3-ОН-БП

1 н.о.* н.о.

10 2.0 1.1

100 21.4 13.4

200 26.8 13.7

* : н.о. - не обнаружено

обоих ме.аболнтов в пробах мочи крыс, получивши БП в цозе 10 иг/кг веса, оказались на порядок меньше, чем в пробах мочи крыс, получивших дозу. 100 мг БП 'кг веса, то есть в этом случае имелась линейная зависимость уровня экскреции маркерных метаболи.ов БЬ от его дозы. Однако дальнейшее увеличение дозы БП до 200 мг/кг уже не зызывало пропорционального увеличения экскреции метаболитов БП, При этой дозе БП часть en выводилась в неизмененном виде с мо«ой к калом¡ что свидетельствовало о перенасыщении им ф°рментннх систем организма. Таким сбразсч, можно говорить об обнарукении прьной линейной зависимости доза-эффект, определяемой по налыии каркерных метаболитов в экскретах, в диапазоне доз БП до 100 иг/кг. Это позволяет применить разработаннуп методику для оцешм уровня экспозиции БП при дезах воздействия до 100 мг/кг массы тела в этом диапазоне доз БП.

3. Определение индивидуальных уровней .суммарной зкекгецин метаболитов БП у крыс, получазаих БП в дозе. 200 мг/кг массы тела.

Этот эксперимент был проведен на 68 крысах. Известно, что при использованной дозе и способе введения опухоли возникапт лииь у части крыс (Hlr-зкаиа Т. et al, 1979 ), что вално при изучении индивидуальной чузстзнтельности к действии канцерогенов. Экскреты собирались в течение 5 суток, суточные порции мочи или кала каждой крысы объединялись.

Опыты показали, что количества метаболитов БП в экскретах отдельных кивотных сильно различаются, Уаксимальные количества ?,8-БП пребывали минимальные в иоче в 42,2 раза, в кале - в 39,8 раз. Уровни экскреции 3-ОН-БП б моче различались в 13,5 раз. в кале - е 8,6 раз. Это свидетельствует об особенностях метаболизма БП у разных крыс. Теоретически монно предположить, что вероятность возникновения опухолей зависит от соотношения активных и неактивных метаболитов БП, Поэтому анализировалось такге отношение 7,8-БП к 3-ОН-БП - показатель, обозначенный как коэффициент К, Он такие сильно варьирует С рис. 2). При этом нет корреляции менду значениями коэффициента К в моче и в кале, а рассчитанные суммарно для мочи и кала, они оказались близки к соответствующим значениям для кала. Это, очевидно, связано с более высокими концентрациями метаболитов БП в кале, чем в моче. Коэффициент К в моче, кале и суммарно в обоих экскретах оказался низким (0,5 - 3) у большинства крыс.

15

13

9

(

3

О

.о г 4 б в

Рис. 2. Разброс индивидуальных соотношений 7.8-БП/З-ОН-БП в моче и каль крыс, получавших БП в дозе 200 мг/кг массы тела.

Т—1-Г - ' 1 1 • . . 1 • _

' 1

— С • • • ♦ • » -

• « • * » я I* *»Ь • * « - •• И ( ' 1 . л« 1 1 1 • * • • ' 1 Г 1 I , ,"

По оси абсцисс по оси ординат

- значения 7,8-БП/З-ОН-БП е моче,

- значения 7,8-БП/З-ОН-сП ? кале.

-134.' Изучение индивидуальна* особенностей динамики экскреции метаболитов БП у крыс.

! В этом эксперименте 19 крысам бил введен БП в дозе 200 мг/кГ массы тела. У 16 крыс исследовали ежедневную экскрецию в течение 5 дней, а у остальных 3 крыс - в течение 15 дней. Помимо того, у 4 крыс экскреты были собраны через 30 дней после воздействия. ' Результаты этого эксперимента приведены на рис. 3, З-ОН-БП и, в особенности. 7,8-БП выделялись из организма в основном с калом. Количества метаболитов БП в экскретах были максимальными на 2-4-й дни после воздействия и далее постепенно снижались. Через 5 дней выводилась только часть метаболитов, экскреция продолжалась и через 15 дней. Однако их уровни в экскретах через этот срох наблюдения были значительно ниже, чем на 2-4-й дни после введения БП (Р<0,05), а через 30 дней после воздействия метаболиты не бкли найдены на в моче, ни в кале. Следует отметить большие индивидуальные различия в суточной экскреции метаболитов БП. причем ризмах колебаний не зависел от дня после рведения канцерогена. Однако индивидуальные колебания в количествах суммарно вызеденных метаболитов БП сглаживались, и через 5. 8 и 15 дней-они были значительно ниже, чем за каждый день отдельно.

Выявленные особенности динамики экскреции метаболитов БП-отражают, по-видимому, специфические условия опыта: внутрибрюшинный способ введения канцерогена, растворенного в масле, вводившегося в дозе, которая "перегружает" ферментные системы, участвующие в метаболизме БП, и которая вызывает их индукцию. Сглаживание индивидуальных различий при анализе суммарного выведения метаболитов БП свидетельствует, на нап взгляд, о том, что они обусловлены, ке только общей способностью организма к метаболизму БП, но и особенностями его токсикокинетики: интенсивности всасывания, метаболизма, экскреции. В связи с этим встает вопрос о тех показателях экскреции метаболитов БП, которче могут быть маркерными для метаболического статуса организма и, соответственно, индивидуального канцерогенного риска. В этой работе установлено, что суточные показатели экскреции метаболитов БП и их соотношение у одного и того же животного в различные дни опыта резко колеблются. Поэтому при -анализе индивидуальных особенностей-их экскреции, по-видимому, следует испольговать только показатели

По оси аосцисс - дни после введения БП. по оси ординат - количества зкскретирогэнных метаболитов оП. «кг/кг Ееса тела ± стандартная оа?иб;;э.

сумгарной экскрецми за все дни опыта. Видимо, выбранный в предыдущем эксперименте основной срок наблюдения С5 дней) вполне достаточен для оценки индивидуальных особенностей метаболигма БП по характеру экскреции его метаболитив, потому что в это время наиболее полно проявляется индивидуальные особенности Функционирования метаболизирующей БП ферментной системы.

5. Сравнение видовых и индивидуальных особенностей экскреции метаболитов БП у обезьян и ¿рыс после его однократного внутрибришинного введения.

В этом эксперименте было использовано 5 обезьян Macaca fasclcularis и 4 крысы, Животным вводлли БП з дозе 100 мг/кг массы тела. У обезьян ежесуточно собирали кал. а у крыс - кал ;; мочу.

В результате исследований у яивотных были выявлены значительные суточные и индивидуальные различия в экскреции метаболитов БП (рис. 4). Колебания индивидуальных количеств обоих метаболитов БП при анализе их суммарного Елведения за 5 и за 8 дней в сравнении с суточными различиями уменьшались. У крыс ?.8-с>П выводился из организма б основном с калом (около 802), тогда как З-ОН-БП - с мочой и-калом практически в одинаковых количествах. У обезьян оба метаболита выводились преимущественно с калом. При этом их экскреция, за исключением экскреции 7.В-БП на 2-й и 5-й день после воздействия, в расчета на единицу массы тела, была значительно ниже (Р<0,05), чем у крыс. У всех обезьян в кале, взятом из кишечника, содержание обоих метаболитов БП было в несколько раз ббльшим, чем в кале, голученном в те же сутки лослэ дефекации. Последнее', возможно, связано с нестабильностью метаболитов или с особенностями их всасывания стенками кишечника. Максимальная экскреция-метаболитов БП у крыс и обезьян отмечена чере^ 2-4 дня после его введения. Вместе с тем -экскреция метаболитов у них происходила медленнее, чем у мышей (Cauus А-.М. et al. 1984).

Рассчитывался также коэффициент К. У тех и других ягаотных он отличался индивидуальной вариабельностью: максимальные значения коэффициента К отличались от минимальных з 1,5-2 раза как у крыс, так и у обезьян. Однако его значение достоверно выше (Р<0.05) у обезьян, чем у крыс (29.4 и 5,4. соответственно). Это указывает на то. что при общем сравнительно низком уровне метаболизма БП у обезьян процесс активации данного канцерогена

1 а 3 4 1 • 7 >•

7.В-БП 3-ОН-БЛ

Рис. 4. Экскреция метаболитов БП в кале обезьян (а) и крас (б) после введения БП.

По оси абсцисс - дни после введения РП, по оси ординат - количества зкскрегированнцх метаболитов гП, мкг/кг массы тела. В правом верхнем углу - номер низотного.

лреобладает над его дезактивацией. Поэтому можно предположить, что резистентность обезьян к канцерогенному действии БП (Александров В.н., Забежинский Н.А., 1981; Еениаивили Д.И. 1973; Adanson R.H. et al, 1970) «ose? определяться не только особенностями его метаболизма, но и иными факторами, например, больней эффективностью репарации ДНК. как установлено в опытах с другими канцерогенами (Лихачев А.Я., 1987).

вывода

1. Впервые разработана высокочувствительная спектрально-флюоресцентная методика, позволяющая количественно определять маркерные метаболиты БП (З-ОН-БП и 7,8-БП) г экскретах животных, подвергнутых воздействию БП. Методика основана на избирательном возбуждении флюоресценции этих ПАЗ в экстрактах без их хроматографического разделения.

2. В опытах с однокра-ным введением 5П крысам в дозах 1. 10, 100 и 200 мг/кг веса тела обнаружена зависимость доза-эффект, регистрируемая по выделению маркерных метаболитов. 'Зависимость является прямой, с тенденцией к насыщению при дозе около 200 мг/кг бега тела, что свидетельствует о перегрузке ферментных систем.

3. Исследована динамика гчсчреции метаболитов БП с мочой и калом крыс, подвергнутых однократному внутрибрюииннэму воздействию БП в дизе 200 мг/кг веса тела. Оонаружено, что максимум наблюдался нэ 2-й - 4-й день после введения БП.

4. Обнаружен значительный индивидуальный разброс количеств 7.8-БП и З-ОН-БП и их соотно&ений в экскретах крыс, подвергнутых воздействию БП в дозе 200 мг/кг массН -тела, свидетельствующий об особенностях активности ферментных систем и- токсикокинетики метаболитов БП.

5. Исследованы видовые различия в экскреачи метаболитов БП у крыс и обезьян, подвергнутых однократному снутрибрвшинному воздействию БП в дозе 100 мг/кг веса тела. Обнаружен больяий уровень экскреции метаболитов БП у крыс по сравнению с обезьянами, но у обезьян отмечено преобладание процесса активации БП над

-1.8-

де¿активацией (соотношение 7,8-БП/З-ОН-БП больше).

6. Проведенные исследования создают реальные методические возможности для изучения зависимости индивидуальной чувствительности к канцерогенному действию БП от особенностей экскреции ег*о маркерних метаболитов.

Выраиаю сердечную признательность руководителю диссертационной работы д.м.н. Алексею Яков^эвичу Лихачеву за постоянное внимание к работе. Приношу глубокую благодарность д.м.н. Забекинскому М.Д, за ценные советы при обсуждении работы, а также своим коллегам проф. Дикуну П.П., к.б.н. Ямшаносу В.А., Мосьпан 0.0., Быкову й.В. и др. за помощь в выполнении работы. Выражаю глубокую благодарность такте проф. Бениашвили Д.И. (Онкологический научный центр Республики Грузия) за участие в эксперименте с обезьянами и д-ру Ь. КееГег (Национальный институт рака, Бетезда, США) за предоставление стандартных метаболитов БП,

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оппеделение метаболитоз бенз(а)пирена в моче крыс спектрально-флюоресцентным иетодои//Тез. докт. 1 Всесоюз, совещания "Биофизика рака .- К.. 198?. - С. 49-50. (соавт.: Дикун П.П.. Ямшаьов В.А., Лихачеь А.Я.).

2. Теоретические основы и возможные пути прогнозирования индивидуальной чувствительности к канцерогенному действию полици лических ароматических углеводородов//Вопр. Онкол,- 1989,Т. 35- N 4.- С. 407-415. (соавт.: Лихачев А.Я.).

3. Индивидуальные особенности экскреции метаболитов

бенз(а )пирена после его внутрибрюиинного введения обезьянам// В кн.: ';Новые подходы к организации противораковой борьбы, диагнос.ике и профилактике злокачественных опухолей" ОКЦ МЗ ГССР, Тбилиси, 1989, С. 137-143. (соавт.: Лихачев А.Я.. Дикун П.П., ЗабеаынскиГ «!.й.. Туркия Н.Г., Кра^нянская П.Н.. Адамия И.К... Хомерики Р.В.. Ахалкаци Д.А.. Османова В.Р.. КокрашЕил" Ц.Й., Берд^дзе, К,И.. Сартания Ы.С.. Ненадзе М.З., Чарухчан С.А., Бениашвили Д.И,),

-194. Разработка неинвази^ного метода оценки индивидуальных особенностей метаболизма бенз(а')пирена в опытах на крысах и обезьянах//В кн.: "Механизмы канцеро- и лейкогенеза" (Тез. яокл.) fiH УССР НПО им. Р.Е. Кавецкого, Ккев, 1990. С. 14-*5.(соавг.: Бениапвили Л.13.. Дикун П.П., Забекинский M.ft., Лихачев ft.Я.).

5. Experimental approach to predictity Individual susceptibility to carcinogens: non-invasive test for benzo(a)pyrene 'BP) netaboliSJi/Zln:" Poster flbstr. 15th Intern. Cancer Congr.", 1990. P. 79.(соавт.: Лихачев ft.Я., Бениаивили Д.И., Дикун П.П., Забекинский М.Й.).

6. Индивидуальные особенности экскреции метаболитов бенз(а)п,1рена у крыс//8опр. Онкол.- 1990.-Т. 36.-Н 10.- С. 1221- 1226. Ссоавт.: Лихачев Н.Я., Дикун П.П., Забекинский M.ft., Ямшанов В.ft.).

7. Relevance of quantitation of. benzofalpyrene metabolites In aninal excretes, to-evaluate individual hunan cancer risk/An: Relevance of aninal studies to the evaluation of hunan cancer risk. Barton Creek Conference Resort, Austin, Texas', USft.-1990.-P. 1.7. -(соавт.: Лихачев ft.Я., Бениаивили Д.0., Быков В.Ю., Дикун П.П., Непомнящая О.Б., Ермилов В.Б.. Забекинский M.fl.).

I

8. Видовые и индивидуальные различия в выведении метаболитов бенЛа)пирена у обезьян и крыс после однократной экспозиции// Зксперим. Онкология - 199Г.-Т. 13. -N 3.- С. 15-18. (соавт.; Лихачев ft.Я.. Бениаивили Д.ИГ.. Забекинский И.ft-).

9. Studies on correlation between individual rates of benzo(a )pyrsr.e netabolisa-and susceptibility to Its carcinoguic effect in outbred r-ats//In:'-"International Conference on Environmental and Industrial Toxicology: Research and Applications", Bangkok, Thailand - 1991, P. 24. (соавт.: Лихачев А.Я., Забекинский M.ft.).

10. Biomarkers for individual susceptibility to carcinogenic agents//fibstr. In: Blonenitoring and susceptibility markers in human cancer: applications in nolecular epidemiology end risk assessment. Kailua-Kona, Hawaii, USA, 1991, P, 15. (соавт.:

Лихачев А.Я., Бениашвили fl.D,, Быков В.Ю., Дикун П.П., Тындык II.Л., Ермилов д.5., Забеяинский И.А'.).

It. Relevance of quantitation of benzo[a]pyrene mrtabolites in animal excretes to evaluate indlvHual human cancer risk// In: Relevar.ce of Animal Studies to the Evaluation of Human Cancer Risk. R. D'Amato, T. Slaga, C. Henry and H. Far land-Eds.. Progress «n Clinical and Biological Research.- 1992.- Uo'l. 374, P. 435-452. (соавт.: Лихсчев А.Я., Бениашвили Д.Ill,, Быков В.10.. Дикун П.П., Тындык М.Л., Ермилов В.Б.. Забеиипский М.А.),

12. Сравнительное изучение индивидуальных особенностей экскреции метаболитов бенз(а)пирена и его каьцерогененого эффекта у крыс// Вопр." онкол.-1992.-Т.38. -N 8.- С. 950-956. (соавт.: Лихачев

А.Я., Забеиинский НА.. Дикун П.П.. Тындык М.Л., Филатов В.Н.).

13. Biomarkers for individual susceptibility to carcinogenic agents: excretion and carcinogenic risk of benzoCalpyrene netabolites//E .vironmentai Health Perspectives. 1992, 98, P. 211— . 214.(соавт.: Лихачев А.Я., Бениашвили Д.Si., Быков В.Ю.. Дикун

П.П., Тындык М.Л., Ермилов В.Б.. Забеиинский Н.А.).

14. Molecular markers of individual susceptibility to environmental carcinogens//In: Lecture Abstracts of XYIth Intern. C?ncer Congr,, New Delhi, India, 1S94, P. 91. (соавт.: Лихачев А.Я.. Бениашвили Д.И., Быкое В.И.. Казанова О.И., Тындык М.Л., Ермилое В.Б.. Забеиинский М.А,).