Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Экспрессия сплайс-вариантов мРНК гена IL-4 в мононуклеарных и эритроидных клетках человека и функциональная характеристика рекомбинантного IL4δ2

На правах рукописи

СИЛКОВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ

ЭКСПРЕССИЯ СПЛАИС-ВАРИАНТОВ мРНК ГЕНА ^-4 В МОНОНУКЛЕАРНЫХ И ЭРИТРОИДНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ТЬ-452

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск-2005

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательский институт клинической иммунологии сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

СВ. Сенников

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор,

А. И. Аутеншлюс И. Г. Козлов

Ведущая организация:

ГНЦ научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов МЗ РФ, г Санкт-Петербург

Защита состоится «_»_2005 г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д 001.001.01 ГУ НИИ клинической

иммунологии СО РАМН по адресу:

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан <<_>>_2005 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Тг О.Т. Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Активное изучение системы цитокинов позволило к настоящему времени сформировать общие представления, характеризующие данную систему регуляции. Система цитокинов обладает такими свойствами, как универсальность, саморегуляция, полифункциональность и полиморфность [Oppenheim, Feldmann, 2001] В последние несколько лет обозначилось новое направление в исследованиях цитокинов, связанное с изучением изоформ цитокинов, образующихся при альтернативном сплайсинге. Альтернативный сплайсинг как механизм формирования различных белковых продуктов одного гена без изменения его организации достаточно широко используется при экспрессии различных генов человека, и гены цитокинов не являются исключением [Lopez, 1998, Atamas, 1997]. Альтернативный сплайсинг активно участвует в формировании полиморфизма системы цитокиновой регуляции, а изоформы белков цитокинов значительно расширяют регуляторные функции различных цитокинов, поскольку обладают свойствами отличными (или противоположными) от полноразмерных белков [Tsytsikov et al., 1996, Atamas, 1997 Zav'yalov et al., 1997]. Этот факт может серьезно дополнить современное представление о цитокиновой регуляции гемо- и иммунопоэза, а также может дать в руки клинических иммунологов специфические биологические препараты с новыми свойствами [Atamas, 1997]. В этом контексте несомненный интерес представляет сплайс-вариант IL-4 человека с делецией второго экзона - IL-452. Данная изоформа имеет тканеспецифический характер экспрессии и проявляет себя как антагонист IL-4 в экспериментах с иммунокомпетентными клетками [Atamas et al., 1996, Arinobu et al., 1999]. Установлено, что мРНК IL-452 присутствует в различных типах иммунокомпетентных клеток, однако в клетках тимуса и бронхоальвеолярного лаважа наблюдается преобладание мРНК над мРНК IL-4, в сравнении с

мононуклеарными клетками периферической крови [Klein et al., 1996, Alms et al., 1996, Atamas et al., 1996]. Наличие сплайс-вариантов IL-4 в других типах клеток пока не изучено.

В работах [Arinobu et al., 1999, Atamas et al., 1996] были исследованы эффекты рекомбинантного белка оказываемые на различные типы

иммунокомпетентных клеток, и установлено, что в отношении Т-клеток, В-клеток и моноцитов проявляет свойства естественного антагониста

IL-4 и отменяет его эффекты. Предполагаемый механизм действия сплайс-варианта - конкурентное блокирование рецептора IL-4 без активации сигнальных путей. Однако фибробласты в равной степени отвечают как на IL-4, так и на IL-482, что свидетельствует о возможной активации рецептора чельта-формой [Atamas et al., 1999].

Таким образом, в отношении экспрессии сплайс-вариантов гена IL-4 и биологических свойств белка остается достаточно много не

изученных вопросов, ответы на которые позволят определить функции и значимость сплайс-варианта IL-452 в регуляторных реакциях, определяемых геном IL-4. Эти вопросы связанны с детекцией сплайс -варианта IL-4 в нелимфоидных клетках и способностью IL-452 к активации сигнала на различных типах рецепторов IL-4. Кинетика изменения уровня полноразмерной и альтернативной форм мРНК IL-4 также требует изучения.

В этой связи представлялось актуальным в данной работе прояснить некоторые моменты экспрессии сплайс-вариантов гена IL-4 в различных клешах и более полно охарактеризовать биологическую активность рекомбинантного белка

Цель работы - Изучить экспрессию сплайс-вариантов мРНК гена IL-4 в мононуклеарных клетках периферической крови и в эритроидных клетках человека и охарактеризовать биологическую активность рекомбинантного белка IL-452 в культуре мононуклеарных клеток.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать динамику изменения уровня мРНК IL-4 и IL-452 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека.

2. Определить наличие слайс-вариантов мРНК гена IL-4 в эритроидных клешах человека.

3. Изучить влияние рекомбинантных белков IL-4 и IL-452 на пролифератив1гую активность мононуклеарных клеток человека.

4. Определить эффекты рекомбинантных белков IL-4 и на синтез IgE и экспрессию CD23 В-клетками в культуре мононуклеарных клеток человека.

5. Охарактеризовать эффекты рекомбинантного IL-452 на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками человека в культуре.

6. Исследовать, полученные рекомбинантные белки IL-4 и IL-452 на наличие специфической биологической активности.

Научная новизна работы. Впервые показано, что альтернативный сплайсинг гена IL-4 происходит не только в иммунокомпетентных клетках, но и в эритрокариоцитах фетальной печени и костного мозга человека.

Продемонстрировано, что в стимулированных митогеном мононуклеарных клетках человека определяются две формы мРНК гена IL-4, причем пик уровня мРНК IL-452 наблюдается на 3 часа, а пик мРНК IL-4 на 6 часов.

Впервые установлено, что рекомбинантный белок может

выступать как антагонист, так и как агонист полноразмерной формы IL-4 в различных иммунологических реакциях мононуклеарных клеток периферической крови in vitro. В частности, рекомбинантный выступает как агонист при активации экспрессии CD23 на поверхности В-клеток и при регуляции экспрессии IL-4 в культуре мононуклеаров человека, где его стимулирующий эффект аналогичен действию

рекомбинантного ^-4. Эффект, оказываемый 11_,-452 на продукцию ^-6 мононуклеарными клетками, противоположен ингибирующему действию полноразмерного белка ^-4.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые сведения об экспрессии 1Ь-452 и его биологических эффектах, дополняющие картину функционального значения альтернативного сплайсинга в регуляторных функциях системы цитокинов.

Показано, что альтернативный сплайсинг пре-мРНК имеет место при экспрессии гена ^-4 в эритроидных клетках, что свидетельствует о возможном участии сплайс-варианта в регуляции гемопоэза.

Наличие у рекомбинантного белка человека свойств антагониста

и агониста указывает на способность этого белка к трансдукции специфического сигнала.

В результате исследования получены и охарактеризованы рекомбинантные белки ^-4 и 1Ь-482 человека, обладающие специфической активностью, которые могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов их действия на клетки-мишени и в перспективе для диагностики и иммунотерапии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Ген ^-4 в мононуклеарных клетках периферической крови и эритроидных клетках человека экспрессируется с участием альтернативного сплайсинга.

2. 1Ь-452 способен как стимулировать, так и ингибировать влияние ^-4 и обладает собственными эффектами на мононуклеарные клетки периферической крови человека.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г.), 2) 7-ом всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003 г.), 3) объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004г.), 4) 8-ом всероссийском научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г.), 5) семинаре научного отдела ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Объем и структура работы. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 102 страницах машинописного текста, включающего 16 рисунков и 3 таблицы. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 206 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Эритроидные ядросодержащие клетки

Для получения обогащенной популяции эритроидных ядросодержащих клеток человека в ходе нашего исследования использованы фетальная печень (ФП) 17-20 недели развития плода и костный мозг (КМ) практически здоровых доноров. Прерывание беременности проводилось по социальным показателям. Фетальные ткани печени выделяли из абортивного материала и исследовали на отсутствие основных вирусных и бактериальных инфекций. У всех доноров костного мозга было получено информированное согласие на процедуру забора биологического материала и разъяснены цели исследования.

Выделение эритроидных клеток и субпопуляций эритрокариоцитов проводили, как описано ранее [Крысов, 2001, Инжелевская, 2001, Sennikov et al., 2004]

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МНК ПК)

В качестве источника мононуклеарных клеток использовали гепаринизированную (50 Ед. гепарина на 1 мл крови) венозную кровь доноров. МНК выделяли стандартным методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина [Boyum, 1968]. МНК культивировали в среде RPMI - 1640 содержащей: 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ICN Inc.), 2 мМ/л L-глютамина, 100 мг/л ампицилина и 50 мг/л гентамицина. Концентрация клеток в начале культивирования составляла 1хЮ6/мл. Жизнеспособность клеток не изменялась в процессе культивирования и составляла не менее 98%, по окраске трипановым синим. Рекомбинантные цитокины

В работе использованы рекомбинантные человеческие белки: rhIL-lß, rhIL-2, rhIL-4, rhIL-6, rhIFN-y (R&D System, UK), и rhIL-10 (PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ). Изоформа интерлейкина-4 - pnIL-452, была любезно предоставлена Л.Р. Птицыным (ГНЦ РФ ГосНИИ «Генетика», г. Москва) [Ptitsyn et al., 1999, Vasiliev et al., 2003]. Также были использованы рекомбинантные белки IL-4 и полученные в совместной работе с

НИИХБиФМ СО РАН и ООО "Центр инженерной иммунологии" г. Новосибирск.

Изучение пролиферативной активности

Пролиферативную активность оценивали по включению 3Н-тимидина. Результаты представляли в виде среднего счёта (имп/мин) из трёх идентичных культур. Для исследования влияния IL-4 и IL-482 на пролиферативную активность можмгуклеаров периферической крови, клетки культивировали в присутствии рекомбинантных белков в системах без митогена и в присутствии митогенов: КонА (Pharmacia, Sweden) в дозе 5 мкг/мл или ЛПС (Sigma, USA; серотип 055:В5) в дозе 10 мкг/мл. Определение синтеза IgE в культуре

Для изучения продукции IgE в культуре, МНК культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах в количестве 2x105 клеток на лунку в объеме 200 мкл в течение 14 дней [Arinobu et al., 1999]. По завершении срока инкубации кондиционированную среду собирали и оценивали уровень IgE, используя набор lgE-ИФА-БЕСТ-стрип (ЗАО Вектор-Бест, Новосибирск), согласно инструкции производителей.

Определения уровня экспрессии CD 23

МНК ПК человека культивировали 24 часа как описано ранее в присутствии рч1Ь-4 и/или P4IL-452. Далее клетки 1x106 инкубировали с моноклональными антителами к CD20 мечеными фикоэритрином и к CD23 мечеными FITC (ООО «Сорбент», г. Москва). Клетки фиксировали и проводили проточный цитофлюориметрический анализ. Результаты представлены как процент CD23+CD20+ клеток от CD20+ В-клеток.

Определение уровня продукции цитокинов мононуклеарами in vitro

МНК ПК человека культивировали 48 часов в 24-луночных планшетах в условиях описанных выше. Количественную оценку уровней цитокинов в кондиционных средах проводили на электрохемилюминометре ORJGEN Analyzer (IGEN Inc., USA), как описано ранее [Крысов с соавт., 2000, Sennikov et al., 2003]. Поликлональные и моноклональные антитела (AT) приобретались у фирмы R&D System (UK).

Выделение суммарной клеточной РНК

Суммарную РНК выделяли из клеток методом фенольной экстракции [Chomczynski, Sacchi, 1987]. Качество выделенной РНК оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (Chemapol, Чехословакия) Концентрацию и чистоту РНК оценивали на спектрофотометре "Милихром" при длинах волн 260 и 280 нм.

Реакция обратной транскрипции (ОТ)

1мкг суммарной РНК денатурировали в присутствии 0,5мкг праймера oligo(dT)i6 при 70°С 5 минут и переносили на лед. Реакционная смесь содержала 1мкг суммарной РНК, 0,5мкг oligo(dT)|6, 500 мкМ каждого dNTP (Sigma, USA), 20ед - M-MuLV обратной транскриптазы (Сибэнзим, Новосибирск). Реакционный буфер прилагался к обратной транскиптазе и содержал 2 мМ МпС12, 20мМ Трис-HCI (рН 8,3 при 25°С), ЮОмМ KCI, 1мМ дитиотрейтол (ДТТ). Реакцию проводили в объеме 20 мкл в течение 1,5 часов при 37°С, денатурировали фермент при 95°С 5 минут. Хранили полученные образцы кДНК при -20° С.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР проводили в амплификаторе "РТС-200 DNA Engine" (MJ Research inc., USA). Реакционная смесь в объеме 20 мкл содержала 2 мкл смеси после реакции обратной транскрипции, 2 ед. Taq-ДНК полимеразы (Сибэнзим, Новосибирск), 0,5 мкМ каждого из праймеров, 250 мкМ смеси четырех dNTP. Реакционный буфер прилагался к ДНК-полимеразе и содержал бОмМ трис-HCl (рН= 8,5 при 25° С), 100 мМ KCI, 1,5 мМ MgCI

ЮмМ 2-меркаптоэтанола, 1мМ ДТТ. Режим тсрмоциклирования зависел от состава праймеров и длины амплифицируемого фрагмента и рассчитывался с использованием программ «Primer Premier» и «NetPrimer» (Premier Biosoft International, USA).

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. В качестве маркера молекулярного веса использовали гидролизат плазмиды pUC19, полученный при расщеплении рестриктазаой Kzo9I (СибЭнзим, Новосибирск), негативными контролями служили препараты «неревертированной РНК» и реакция «без матрицы». После проведения электрофореза гель окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл). Продукты полимеразной цепной реакции визуализировали в ультрафиолетовом свете, молекулярный вес фрагментов и интегральная оптическая плотность бэндов (IOD) оценивалась с помощью видеоденситометра и пакета прикладных программ "ImageMaster®VDS"(Pharmacia Biotech, USA).

Праймеры к последовательности гена GAPDH, IL-2, IL-4, IL-6 были синтезированы в НИИ ХБиФМ СО РАН, г. Новосибирск: GAPDH, размер продукта 640 п.о.: 5'-AGG CTG GGG СТС ATT TGC AGG-3' и 5'-TAG CCA AAT TCG TTG TCA TAC CAG-3'; IL-4, размер продукта 288 п.о. [Atamas, 1996] 5'- GGC A AC TTT GTC САС GGA С AC A AG -3' и 5'- GGT ТСС TGT CGA GCC GTT TCA GGA -3'; IL-6, размер продукта 640 п.о. [Kestler, 1995] 5'-ATG AAC TCC TTC ТСС АСА A-3' и 5'-CTA CAT TTG CCG AAG AGC C-3*

Конструкция и синтез конкурентных последовательностей

Конкурентные матрицы для проведения количественной оценки мРНК сплайс-вариантов гена IL-4 синтезировали в однораундной ПЦР с использованием праймеров со свободными 5'-концами, содержащими последовательности праймеров для IL-4. В качестве гетерологичной матрицы использовали ДНК плазмиды pUC19. Для получения конкурента полноразмерной формы IL-4 использовали праймеры 4flF и 4fd2R, а для конкурента IL-452 праймеры 4dlF и 4fd2R. Для полноразмерного IL-4: (4flF) 5'-CGA GTT GAC CGT AAC AGA CAT GGG AAC CGG AGC TGA-3'; для IL-452: (4dlF) 5'-CAG AGC AGA AGA ACA CAA CTG GGA ACC GGA GCT GA-3'; общий обратный праймер: (4fd2R) 5'-TGG CTT CCT TCA CAG GAC AGG CCC CAG TGC TGC AAT-3'. После амплификации продукты анализировали в 1% агарозном геле, бэнд содержащий специфическую ДНК конкурента, вырезали, элюировали из геля и очищали, используя «QIAEX® II Gel extraction kit» (QIAGEN, Germany), согласно инструкции производителя. Количество ДНК конкурентов и качество очистки определяли на спектрофотометре «Милихром». Таким образом, удалось получить специфические гетерологичные конкуренты размером 300 и 299 п.о., отличные только по 20 нуклеотидам в концевой последовательности, комплементарной прямым праймерам.

Конкурентная ПЦР

Количественная оценка уровня мРНК гена IL-4 человека проводилась методом ОТ-конкурентной ПЦР. Для проведения анализа по 1мкл реакционной смеси после ревертировани вносили в 10 пробирок. Пять пробирок содержали «супермикс» для амплификации IL-4 и соответственно титрованные дозы ДНК конкурента для полноразмерной формы, а пять «супермикс» для амплификации IL-452 и титрованные количества ДНК конкурента для сплайс-варианта. Таким образом, реакционные смеси отличались только по конкурентной ДНК, ее количеству и по специфическому праймеру, в остальном условия амплификации аналогичны, приведенным выше. Праймеры: HIL4e2: CGA

GTT GAC CGT AAC AGA CAT -IL-4 (экзон 2), HIL4el/3: CAG AGC AGA AGA АСА CAA CTG - IL-4S2 (экзоны 1 и 3), HIL4e3: TGG CTT CCT TCA CAG GAC AGG - (экзон 4). Количественную оценку уровня мРНК в

каждом эксперименте получали при построении линейной регрессии, относя по оси абсцисс значение Iog2 отношения IOD конкурент/IOD мишень, а по оси ординат Iog2 концентрации ДНК конкурента. При таком построении точка пересечения линейной функции с осью ординат отражает значение концентрации кДНК в реакции. При построении графиков использовали показатели интегральной оптической плотности бэнда (IOD) и коэффициент кь При расчете концентрации кДНК использовали коэффициент к2. Коэффициент kj компенсирует отличие сигнала IOD, связанное с различием в длине последовательностей конкурента и мишени, а коэффициент к2 компенсирует отличие в количестве матрицы связанное с одно- и двухцепочечной структурой мишенной кДНК и конкурентной ДНК. Формула расчета коэффициента: k|=lt/lc , где It - длина продукта ПЦР мишени в п.о., 1с - длина продукта ПЦР конкурента в п.о. В наших условиях эти коэффициенты были следующие: для полноразмерного варианта IL-4 к,=242/300=0,8 , для IL-452 к,=213/299=0,7 , к2=2 в обоих случаях.

Статистический анализ результатов

Статистическую обработку результатов исследования проводили, используя дисперсионный анализ и критерии множественных сравнений в программе статистической обработки «БИОСТАТИСТИКА» (Primer of Biostatistics 4.0). В подписях к иллюстрациям приведены значения критерия F и уровня значимости Р.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. ДЕТЕКЦИЯ мРНК IL-4 И IL-4S2 В МОНОНУКЛЕАРНЫХ И ЭРИТРОИДНЫХ ЧЕЛОВЕКА.

Поскольку имеющиеся в литературе сведения об экспрессии IL-452 получены на иммунокомпетентных клетках и на образцах различных тканей [Sorg et al., 1993, Alms et al., 1996], мы предположили возможность образования сплайс-вариантов мРНК IL-4 в других типах клеток, для

которых показана экспрессия гена 1Ь-4, в частности эритроидных При исследовании мРНК гена 1Ь-4 в эритрокариоцитах, выделенных из фетальной печени и нормального костного мозга, были выявлены две формы мРНК, соответствующие 1Ь-4 и 1Ь~452 (Рис. 1), а соотношение количеств мРНК 1Ь-452/1Ь-4 определялось в пределах от 0 до 0,19. Кроме того, при исследовании экспрессии гена 1Ь-6 в эритроидных клетках, проводимом параллельно, также была обнаружена ранее описанная изоформа 1Ь-652. Факт наличия сплайс-вариантов мРНК в эритроидных клетках был подтвержден нами и при исследовании клеток эритроидных колоний, выращенных в полужидких средах из клеток фетальной печени и костного мозга.

Рис. 1. Детекция мРНК цитокинов в эритрокариоцитах человека, выделенных из фетальной печени (А) и костного мозга (Б). После выделения эритроидные клетки культивировались 24 часа в безсывороточной среде. М - маркер молекулярного веса ДНК -риС19/Кго91 (955, 585, 341,258 п.о.). 1Ь-4 -288 п.о., 1Ь-462 - 240 п.о., 1Ь-6 -640п.о., 1Ь-652 -450 п.о.

Таким образом, впервые установлено, что в эритокариоцитах выделенных из фетальной печени и нормального костного мозга человека детектируются альтернативно сплайсированные варианты мРНК как 1Ь-6, так и изучаемого нами 1Ь-4. Полученные факты свидетельствуют об использовании эритроидными клетками механизмов регуляции экспрессии генов 1Ь- 4 и 1Ь-6, являющихся важными факторами индукции гемопоэза и пролиферации эритроидных клеток, как в период эмбрионального развития, так и во взрослом организме [Яепшск еГ а!., 1987]. В частности, в роли антагониста вполне может служить фактором, сдерживающим активность пролиферации эритроидных предшественников через блок рецептора 1Ь-4, на поверхности эритроидных клеток. Однако немаловажным этапом на пути выяснения роли изоформ цитокинов в регуляторных процессах является выяснение факторов влияющих на уровень и динамику экспрессии сплайс-вариантов.

Для количественной оценки уровня мРНК 1Ь-4 и 1Ь-452, в МНК стимулированных митогеном, был разработан подход на основе конкурентной ПЦР с внутренними стандартами. При таком подходе каждый из вариантов мРНК амплифицируются отдельно в присутствии титрованных доз синтетических конкурентов, относительно которых

производится расчет и сравнение их количества.

Конкурентные ДНК синтезировали, как описано в главе материалы и методы. В результате были получены два специфичных конкурента для каждого из вариантов мРНК гена ГЬ-4 отличающиеся только структурой 20 п.о. 5'-концевой последовательности. После очистки конкурентов из агарозного геля и определения концентрации ДНК в полученных препаратах были приготовлены разведения каждой из конкурентных последовательностей. Далее эти разведения использовались в ОТ-конкурентной ПЦР при проведении определения уровней мРНК гена Ш-4. Результаты, полученные при исследовании мононуклеарных клеток от пяти разных доноров, представлены на рисунке 2.

Рис. 2. Динамика изменения уровня мРНК ГЬ-4 и 1Ь-452 (А) и соотношения мРНК 1Ь-452/1Ь-4 (Б) в культуре МНК, стимулированных митогеном КонА, в зависимости от продолжительности культивирования клеток. Результаты представлены как M±SD для пяти разных экспериментов.

Используя конкурентный анализ, удалось оценить кинетику и соотношение мРНК IL-452 и IL-4 в МНК периферической крови человека при их культивации in vitro. Так при анализе мРНК гена JL-4 в свежевыделенных клетках соотношение количества мРНК IL-452/IL-4 изменялось в пределах от 0 до 30 % в разных образцах. Далее при митогенной активации клеток в культуре уже через 1 час наблюдалось значительное увеличение количества обоих форм мРНК, при этом уровень сплайс-варианта достигал значений от 50 до 70 % относительно полноразмерной формы. В клетках культивированных более 3 часов отмечается снижение количественного соотношения мРНК, при этом уровень имел более выраженную тенденцию, чем IL-4, что

обусловливает заметное падение соотношения мРНК IL-452/IL-4 с практически полным возвратом к первоначальному уровню в 48 часовых культурах. Следует отметить, что кинетика уровня мРНК IL-452 имеет выраженный пик в интервале от 1 до 3 часов, в то время как уровень полноразмерной мРНК имеет незначительные изменения в интервале от 1 до 6 часов и снижается в более поздние сроки, сохраняя свое доминантное положение. Таким образом, установлено что под воздействием внешних стимулов активирующих клетки происходит изменение в соотношении полноразмерного и альтернативно сплайсированного вариантов мРНК гена IL-4. Сведения об изменении уровня мРНК IL-4 и IL-452 и их соотношения в клетках человека при их активации и при некоторых патологических процессах свидетельствуют о возможной роли в регуляции

эффектов IL-4. Для прямого подтверждения данного предположения и выяснения функций несомненно, необходимо исследование

белковой формы этого сплайс-варианта. Кроме того, такие исследования помогут определить эффекты, оказываемые изоформой на различные типы клеток и механизмы передачи сигнала используемые сплайс-вариантом.

ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ.

В ряде работ по изучению биологических эффектов рч1Ь-452 указывается, что этот белок выступает, как антагонист полноразмерной формы, который связывается с рецептром IL-4, но не передает сигнал в клетку [Arinobu et al., 1999, Atamas et al., 1996]. Следовательно, по своей пространственной структуре схож с полноразмерной формой

белка. В данной работе исследовалась способность рекомбинантных белков IL-4 и IL-452, полученных в совместной работе с НИИХБиФМ СО РАН и ООО «Цетр инженерной иммунологии», взаимодействовать со специфическими поли- и моноклональными антителами против полноразмерного IL-4 в реакции иммуноанализа. Полученные результаты (Рис. 3) свидетельствуют, что полученный рч1Ь-4 связывается антителами при иммуноанализе идентично фирменному преппрату рч!Ь-4 (R&D Systems).

определяемая -концентрация (нг/мл) □ •'ЮиЫЛШ^СОШО

■ rhlL-4 (Н) □ rtilL4d2(H) □ rtilL-4d2 (M)

П

i J ■

1 1 1 1 1 1 500 100 10 1 0,1 0,01 0 внесенная концентрация (нг/мл)

Рис. 3. Сравнительный ЭХЛ иммуноанализ рекомбинантных белков. Концентрации белков определены относительно калибровочной построенной по результатам анализа IL-4 (R&D). (М) - рекомбинантный белок, полученный в ГНЦ РФ ГосНИИ «Генетика». (II) - рекомбинантные белки полученные в НИИХБиФМ и ООО «Центр инженерной иммунологии».

При аналогичном анализе препарата рч1Ь-452 обнаружено, что этот белок значительно менее эффективно связывается антителами к IL-4. Так дозозависимое изменение уровня ЭХЛ-сигаала наблюдается в диапазоне концентраций pnIL-452 от 100 до 500 нг/мл, при этом сходный уровень сигнала наблюдается при использовании p4lL-452 (Н) в концентрации 500 нг/мл и рч1Ь-4 (Н) в концентрации 10 нг/мл (Рис. 3). В диапазоне концентраций рч1Ь-452 менее 10 нг/мл уровень ЭХЛ-сигнала не имеет дозовой зависимости и остается неизменно низким.

Далее были проведены исследования биологической активности полученных белков по эффекту на пролиферацию МНК ПК. Клетки культивировали 72 часа в присутствие моноклональных «AHTH-CD3» антител (ООО «Сорбент», Москва) и различных доз рекомбинантных белков IL-4 и IL-452. Как отмечено на рисунке 4, 1L-4 оказывал достоверное костимуляторное влияние на пролиферацию Т-клеток в культуре МНК ПК, а IL-452 отменял стимулирующее действие IL-4. Сама изоформа при этом не имела значимого влияния на пролиферацию клеток в культуре. Таким образом, получены два рекомбинантных белка, обладающих ранее описанной в литературе [Atamas et al., 1996] специфической биологической активностью и пригодных для исследования взаимных эффектов IL-4 и IL-452 па различные клетки мишени.

90000 -i-!-

i 80000 ---

| 70000 ---

| 60000 --ЩШ--I-т-I-

50000 ■ —-J^-HS---Üb-—

40000 -I—^Я-SB-П-H--HL-

30000 -I—^B-^B-H-^B-^fl-^fl—

20000 -1—^B-Hj-H-H—И—|B—

1000o° II I I I I II

rhlL-4 (нг/мл) 0 5 5 5 0 0

rtilL-4d2 (нг/мл) 0_0_100 500 100 500

Рис. 4. Эффект рекомбинантных IL-4 и IL-482 на пролиферацию клеток в культуре МНК ПК. Клетки культивировали 72 часа в присутствии моноклональных AHTH-CD3 антител (0,5мкг/мл). Дозы рекомбинантных белков указаны в нг/мл. Результаты представлены как M±SD (имп/мин) для пяти различных культур. * - статистически значимое отличие (F= 2,7 Р = 0,04).

Далее исследование биологических эффектов дельта-формы проводилось с использованием рекомбинантного белка IL-452, предоставленного Л.Р. Птициным.

ЭФФЕКТЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ IL-4 И 1L-452 НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОНУКЛЕРНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА.

В проведенных экспериментах введение в культуру рекомбинантного IL-4 достоверно повышало уровень пролиферации МНК относительно нестимулированного контроля. При совместном применении рчШ-4 и рчШ-482, последний отменял стимулирующее влияние pqIL-4 в дозозависимой манере. При этом сам не имел значимого влияния на

пролиферативную активность клеток. Результаты экспериментов проведенных в 14 различных культурах представлены на рисунке 5.

Поскольку IL-4 известен как эффективный костимулятор клеточной пролиферации [Mitchell et al., 1989], было проведено исследование эффектов рчШ-4 и рч1Ь-452 на пролиферативную активность МНК ПК в культуре, стимулированной субоптимальными дозами митогенов. В этой серии экспериментов рекомбинантные белки показали эффекты на пролиферацию МНК ПК аналогичные полученным в культурах без митогенной стимуляции. IL-4 выступал костимулятором клеточной пролиферации, а IL-452 отменял его стимулирующий эффект, сам при этом не демонстрировал значимого влияния на пролиферацию мононуклеров (результаты в автореферате не приведены). Кроме того, при использовании митогенов в культуре, эффекты рекомбинантных белков были менее выраженными особенно в случае использования Т-клеточного митогена -КонА.

Г 4000

*

I 3000

г

3 2000

1000

0 4—

гГ>11_-4 (нг/мл) гМЫШ (нг/мл)

5

5 5

100 500 100 500

Рис. 5. Влияние гЫЬ-4 и гЫЬ-452 на пролиферацию МНК ПК человека. Клетки культивировали 72 часа в концентрации 1х106 клеток/мл. Результаты представлены как М+8Б (имп/мин) для культур 14 доноров. * -значимая стимуляция пролиферации (Р=7,25, Р = 0,001).

Таким образом, установлено, что рч1Ь-452 обладает свойствами антагониста по отношению к полноразмерному варианту белка, в дозозависимой манере отменяя его стимулирующее действие на пролиферацию МНК ПК человека в культуре. Свойства рч1Ь-482 сохраняются при введении в культуру дополнительного митогенного стимула. Полученные нами результаты согласуются со сведениями, опубликованными ранее, где дельта-форма отменяла костимуляторное влияние 1Ь-4 на пролиферацию Т-клеток, активированных другим стимулятором - анти-СОЗ антителами [АГашая е! а1., 1996].

ЭФФЕКТЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ 1Ь-4 И ИЪ-452 НА ПРОДУКЦИЮ IgE И ЭКСПРЕССИЮ СБ23.

Известно, что 1Ь-4 играет важную роль в регуляции функционального состояния В-клеток, в частности он является ключевым фактором, стимулирующим синтез иммуноглобулинов Е, а также принимает участие в контроле уровня экспрессии низкоаффинного рецептора к ^Е (СБ23) на В-клетках [СИошага!, БапсИегсаи, 1997]. Также ранее описан факт отмены стимулирующего действия 1Ь-4 на синтез ^Е и эскпрессию СБ23, опосредованный 1Ь-452 [АппоЬи ег а!., 1999]. Таким образом, нашей следующей задачей была проверка свойств в отношении функций В-

клеток. Кондиционные среды МНК ПК, культивированных 14 дней в присутствии рекомбинантных 1Ь-4 и/или 1Ь-452, были проанализированы методом ИФА для определения уровня ^Е. Обнаружено что и в этом случае дельта-форма ведет себя как антагонист полноразмерного варианта, но при этом не оказывает непосредственного влияния на продукцию ^Е, рисунок 6. Полученные данные согласуются со сведениями, имеющимися в литературе [АппоЬи й а!., 1999].

Параллельно оценивалось влияние на уровень экспрессии

С023 В-клетками. МНК ПК человека культивировали в присутствии II.-4 и/или 1Ь-452 в течение 24 часов. Процент С023+С020+ позитивных клеток

оценивали на проточном цитофлюориметре Рекомбинантный 1Ь-4 усиливал экспрессию СБ23 на СБ20+ В-клетках На рисунке 7 видно, что при совместном использовании с 1Ь-4, 1Ь-452 не только не отменял стимулирующего действия последнего на экспрессию СБ23, но напротив, выступал синергистом 1Ь-4, усиливая его эффект. Таким образом, рч11_,-452 проявил себя и как антагонист полноразмерного белка 1Ь-4 в отношении В-клеток, отменяя стимулирующее действие 1Ь-4 на продукцию ^Е в культуре МНК ПК человека, и как синергист, усиливая стимулирующее действие на экспрессию СБ23.

Рис. 6. Эффект рч1Ь-452 на продукцию ^Е в культуре МНК ПК человека. Представлены результаты (М±8Б) для 14 культур полученных от разных доноров. * - значимые изменения (Р=3,9 Р=0,03).

Рис. 7. Эффект рч1Ь-4 и рч1Ь-452 на экспрессию СБ23 В-клетками. Результаты представлены как процент дубль-позитивных (С023 СБ20 ) клеток от общего числа С020+ клеток для 8 культур МНК ПК. Скобкой обозначены значимые изменения (Р = 4,97 Р = 0,001)

Объяснение этого факта, возможно связано с тем, что экспрессии СБ23

В-клетками зависит как минимум от двух Т-клеточных сигналов: от прямого действия 1Ь4 и от взаимодействия белков СБ40/СБ40Ь [СИаИа е! а1., 1999], а также может изменяться под влиянием других цитокинов [Еоигшег е! а1., 1992]. Кроме того, для СБ23 показано наличие растворимой формы, образующейся при ферментативном отщеплении трансмембранного домена от этого белка [Вайеппап ег а!., 1996, Боигшег й а1., 1992]. Второе возможное объяснение - 1Ь-452 может иметь двойственность эффектов и проявлять свойства, как антагониста, так и агониста, то есть активировать рецепторный комплекс с запуском альтернативных сигнальных каскадов. В этой связи стоит сказать, что на основе анализа пространственных моделей белков 1Ь-4, 11^-452 и рецепторных субъединиц: предполагалось, что

дельта-форма теряет аминокислотные участки необходимые для активации рецепторных комплексов 1Ь-4, вследствие делеции 16 аминокислотных остатков и изменения пространственной организации молекулы [/аУуа1оу е! а1., 1997]. Однако по другим сведениям пространственная организация а-спиралей в молекуле 1Ь-452 сохраняется [УааКеу е! а1., 2003]. Таким образом, факт блокирования различных типов гетеродимерных рецептаров молекулой остается пока без экспериментального доказательства, а

предположение о возможности активации рецепторного комплекса дельта-формой 1Ь-4 имеет право на существование, по крайней мере, для некоторых типов клеток (или типов рецепторов). В частности, идентичность в эффектах 1Ь-4 и 1Ь-452 наблюдался в отношении фибробластов, которые в равной степени усиливают пролиферацию и синтез коллагена под действием как полноразмерного, так и альтернативного варианта II-4 [АГатав ег а1., 1999]. Аналогичный активирующий эффект обнаружен нами при исследовании его

влияния на продукцию цитокинов в культуре МНК ПК человека.

ВЛИЯНИЕ РЕКОМБПНАНТНЫХ БЕЛКОВ П.-4 И 1Ы52 НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ МОНОНУКЛЕАРАМИ В КУЛЬТУРЕ.

]Ь-4 является одним из ключевых цитокинов Тх^типа и имеет влияние на различные типы иммунокомпетентных клеток, в том числе и опосредованное, через продукцию других цитокинов [Слотам, ВапсИегеаи 1997]. Как уже говорилось, эффекты рч1Ь-452 на Т-, В-клетки и моноциты бьши ранее исследованы и установлено, что данная изоформа является антагонистом ГЬ-4. В тоже время влияние рч1Ь-452 на продукцию цитокинов ранее не изучалось. В связи с этим была проведена количественная оценка продукции цитокинов в кондиционных средах 48-часовых культур МНК ПК человека, культивированных в присутствии рекомбинантных ]Е-4 и/или 1Ь-482. В проведенных исследованиях не обнаружено значимых эффектов рч1Ь-452 на продукцию 1ИР, 1Е-2,11^-10 и ШЫ-у. Однако уровень синтеза ]Ь-6 в культуре МНК ПК достоверно

понижался в присутствии рч1Ь-4, а рч1Ь-452 дозозависимо отменял это ингибиторное влияние, подтверждая тем самым гипотезу естественного антагониста. Тем не менее, сама изоформа при этом обладала выраженным стимулирующим действием (рис. 8).

При исследовании продукции 1Ь-4 в культуре МНК не обнаружено аналогичной закономерности, напротив, изоформа эффективно стимулировала синтез 1Ь-4 клетками. Этот эффект наблюдается как при изолированном применении так и при совместном внесении в

культивационную среду рч1Ь-482 и рч1Ь-4. В присутствии полноразмерного и альтернативного вариантов рекомбинантных белков их стимулирующее действие на синтез 1Ь-4 усиливалось и имело дозозависимый характер (рис 9). Аналогичные результаты были получены при исследовании продукции 1Ь-4 в кондиционных средах клеток предварительно инкубированных с рекомбинантными белками.

Рис. 8. Эффект рч1Ь-4 и рч1Ь-452 на продукцию 1Ь-б в культуре МНК ПК. Представлены результаты (М±8Б) для 20 культур полученных от разных доноров. *- значимые изменения (Б = 12,64 Р = 0,0001).

Рис. 9. Эффект рч1Ь-4 и рч1Ь-482 на продукцию 1Ь-4 в культуре МНК ПК. Представлены результаты (М±8Б) для 20 культур полученных от разных доноров. * - значимые изменения (Б = 15,33 Р = 0,0001).

Таким образом, в данной экспериментальной модели конкурентные взаимоотношения IL-4 и IL-452 сохраняются, однако каждый из белков в отдельности проявляет выраженный оппозитный эффект на продукцию IL-6. В основе установленного факта, возможно, лежит механизм конкуренции IL-4 и IL-452, при котором рч1Ь-452 блокирует рецепторные комплексы 1L-4 и таким образом снимает негативный контроль IL-4 на продукцию IL-6. Однако, это предположение не нашло подтверждения при исследовании продукции IL-4. В этом случае эффекты рекомбинантных белков не отличались, обе изоформы проявляли стимулирующее действие на продукцию IL-4. Если в отношении IL-4 позитивная ауторегуляция экспрессии является установленным фактом, то в отношении данный факт установлен впервые и входит в противоречие с устоявшейся гипотезой естественного антагониста блокирующего рецептор и не активирующего каскад внутриклеточных сигналов. Следовательно, в отношении регуляции продукции цитокинов можно предполагать наличие двух механизмов действия дельта-формы. С одной стороны возможен механизм блокирования активации внутриклеточных сигнальных путей IL-4, с другой остается вероятность активации альтернативных внутриклеточных сигналов. В пользу второго предположения имеется ряд фактов: 1) IL-452 активирует фибробласты аналогично IL-4 [Atamas et al., 1999], 2) рч1Ь-452, как и рч1Ь-4 активирует экспрессию CD23 В-клетками, 3) IL-452, как и IL-4, может участвовать в позитивной ауторегуляции экспрессии гена IL-4. Тем не менее, оба эти предположения пока не имеют прямого экспериментального подтверждения, поскольку исследований, направленных на выяснение изменений в системах передачи сигнала и в уровне экспрессии факторов транскрипции в ответ на пока не

проводилось. В тоже время известно, что альтернативные типы гетеродимерных рецепторных комплексов, связывающих 1L-4 на разных типах клеток, определяют различные пути внутриклеточной передачи сигнала и спектр ткаиеспецифичных эффектов [Callará et al., 1996, Doucet et al., 1998, Kruscetal., 1999].

Таким образом, предположение о различных механизмах действия IL-452 в зависимости от типа связывающего рецептора имеет право на существование и является возможным механизмом реализации двойственных эффектов

Обобщая полученные результаты можно заключить, что в проведенных экспериментах сплайс-вариант мРНК - IL-452 детектируется не только в иммунокомпетентных клетках, но и в эритрокариоцитах фетальной печени и костного мозга человека, а количественное соотношение сплайс-вариантов мРНК гена IL-4 изменяется при митогениой активации мононуклеарных клеток человека. Рекомбинантный белок IL-452 проявил двойственность эффектов, оказываемых на мононуклерные клетки периферической крови в культуре. С одной стороны он действует как

антагонист 1Ь-4: отменяет действие 1Ь-4 на пролиферацию клеток, синтез ^Е и продукцию 1Ь-6, с другой стороны обладает свойствами самого 1Ь-4: усиливает экспрессию СБ23 на В-клетках и стимулирует продукцию 1Ь-6 и 1Ь-4. Известно несколько типов рецепторов для ИЛ-4 и можно предположить, что способность в различных тестах выступать

антагонистом или агонистом 1Ь-4 вероятно определяется типом рецептора, с которым взаимодействует лиганд.

ВЫВОДЫ

1. мРНК определяется как в иммунокомпетентных, так и в эрироидных клетках человека, что свидетельствует об участии альтернативного сплайсинга в экспрессии эритрокариоцитами этого цитокина.

2. В мононуклеарных клетках периферической крови, стимулированных конканавалином А, наблюдается индукция обоих форм мРНК гена 1Ь-4 с пиком мРНК 1Ь-452 на 3 часа, а мРНК 1Ь-4 на 6 часов, что указывает на изменение количественного соотношения сплайс-вариантов при активации клеток.

3. Полученные рекомбинантные белки 1Ь-4 и 1Ь-482 обладают специфическими эффектами на пролиферативную активность мононуклеарных клеток человека.

4. Эффекты 1Ь-4 на пролиферативную активность, уровень секреции ^Е и продукцию 1Ь-6 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови отменяются при внесении 1Ь-452, что свидетельствует о наличии у изоформы свойств антагониста.

5. Рекомбинантный белок 11--462 стимулирует экспрессию СБ23 на В-клетках и продукцию 1Ь-4 и 1Ь-6 мононуклеарными клетками человека, что указывает на его способность к трансдукции сигнала.

6. Экспрессия гена 1Ь-4 в клетках человека происходит с образованием полноразмерной и альтернативно-сплайсированной по второму экзону форм мРНК, а рекомбинантные белки этих сплайс-вариантов обладают разным спектром биологической активности, что значительно расширяет роль продуктов гена ТЬ-4 в регуляции иммунных реакций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Sennikov S.V., Silkov A.N., Krysov S.V., Injelevskaya T.V., Kozlov V.A.. Expression of alternative spliced variants of cytokine mRNA in human erythroid cells . // J. Leukoc. Biol. Suppl., 2001, S.73, p.35.

2. Сенников СВ., Силков А.Н., Козлов В.А. Роль альтернативного сплайсинга генов цитокинов в формировании полиморфной структуры цитокиновой сети. // Медицинская иммунология, 2001, т.З, № 3, стр.389400.

3. Сенников СВ., Силков А.Н., Крысов СВ., Инжелевская Т.В., Козлов В.А. Экспрессия альтернативных сплайс-вариантов мРНК цитокинов в эритроидных клетках человека. Тезисы докладов IV съезда иммунологов и аллергологов СНГ.// Аллергология и иммунология. 2001, т.2, №2, стр.14.

4. Сенников СВ., Силков А.Н., Козлов В.А. Полиморфная структура системы цитокинов. // В Сб. "Клиническая иммунология в практическом здравоохранении" Барнаул 2002, стр.62-73.

5. Силков А.Н., СВ. Крысов, Т.В. Инжелевская, СВ. Сенников, В.А. Козлов. Экспрессия альтернативных форм мРНК IL-4 и IL-6 в эритроидных клетках человека. Материалы международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет». // Цитокины и Воспаление., 2002, т.1, №2, стр.20

6. Сенников СВ., Силков А.Н., Козлов В.А. Аллельные варианты и изоформы цитокинов в диагностике и патогенезе иммунопатологических состояний. // Иммунология. 2002, в.7, №4, стр.243-250

7. Силков A.M., Гавриленко В.А., Денисова В.В., Гришина Л.В., Сенников СВ., Козлов В.А. Экспрессия изоформ мРНК гена IL-4 и биологическая активность рекомбинантного hIL-482. Материалы 7 Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 23-26 июня

2003, // Медицинская иммунологя, 2003, т.5, №3-4, стр. 429.

8. Silkov A.N., Gavrilenko V.A., Denisova V.V., Grishina L.V., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Alternative splicing of hIL-4 mRNA isoforms and bioactivity of rhIl-452. // Proceedings of the annual meeting 2003 of the ISICR. Cytokines, signaling and diseases. S. 329.

9. Снлков А.Н., Яцснко О.П., Филиппенко М.Л., Воронина Е.Н., Храпов Е.А., Жукова А.В., Денисова В.В., Гришина Л.В., Козлов В.А., Сенников СВ. Альтернативный сплайсинг мРНК ИЛ-4 и ИЛ-6 у человека и мыши. Тезисы доклада объединенного иммунологического форума. Екатеринбург 31 мая- 4 июня 2004. // Russian Journal of Immunology 2004, V9, Supplement l,p.48.

10. Silkov A.N., Gavrilenko V. A., Denisova V.D., Grishina L.V., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Effect of rhIL-452 on PBMC in Vitro. // In "Immunology

2004. Cytokine Network, and Regulatory Cells, Signaling, and Apoptosis", 2004, Medimond, Inernatiuiu! proceedings, p.367-372

11. Яценко О.П., Силков А.Н., Филиппенко М.Л., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Козлов В.А., Сенников СВ. Альтернативный сплайсинг мРНК ИЛ-4 И ИЛ-6 в клетках разных фетальных тканей мыши и человека. Материалы VIII Всероссийского научного форума с международным участием имени В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. // Медицинская иммунология, 2004 том 6, №3-5, стр. 264.

12. Sennikov S.V., Injelevskaya T.V., Krysov S.V., Silkov A.N., Kovinev I.B., Dyachkova N.J., Zenkov A.N., Loseva M.I., Kozlov V.A. Production of hemo-and immunoregulatory cytokines by the erythroblast antigen + and glycophorine A+ cells from human bone marrow. BMC Cell Biol. 2004 Oct 18;5(1):39

13. Сенников СВ., Силков А.Н., Козлов В.А.. Альтернативный сплайсинг в формировании полиморфной структуры системы цитокинов. // В сб.: «Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты» 2004, Новосибирск, Наука, стр7-23.

Заказ № 935. Тираж 100 экз. Печ. л. 1,0. Гарнитура Times New Roman. Типография ЗАО «ТамКон».

22 ДП ? 2005

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ . Активное изучение генов и их продуктов, участвующих в функционировании цитокиновой регуляторной сети позволило к настоящему времени сформировать общие представления, характеризующие данную систему регуляции. Система цитокинов обладает такими свойствами, как универсальность, саморегуляция, полифункциональность и полиморфность [140].

В последние несколько лет обозначилось новое направление в исследованиях цитокинов, связанное с изучением изоформ как самих цитокинов, так и их рецепторов, образующихся при альтернативном сплайсинге транскриптов. Альтернативный сплайсинг как механизм формирования различных белковых продуктов одного гена без изменения его организации достаточно широко используется при экспрессии различных генов человека, и гены цитокиновой сети не являются исключением [14, 81, 115, 125, 176]. Альтернативный сплайсинг активно участвует в формировании полиморфизма системы цитокиновой регуляции, а сплайс-изоформы белков цитокинов и их рецепторов значительно расширяют регуляторные функции различных цитокинов, поскольку обладают свойствами отличными (или противоположными) от полноразмерных белков [14, 14, 87, 190]. Исследования в данном направлении могут серьезно дополнить современное представление о регуляции гемо- и иммунопоэза новыми сведениями о механизмах контроля эффекторных функций цитокинов, а также могут дать в руки клинических иммунологов специфические биологические препараты с новыми свойствами [14].

Сказанное выше в полной мере можно отнести к сплайс-варианту IL-4 человека с делецией второго экзона - IL-452. Впервые делеционный сплайс-вариант мРНК гена IL-4 не содержащий последовательности 2 экзона и сохраняющий нормальную рамку считывания белка обнаружен в 1993 году [177]. Последующие исследования показали, что образование мРНК IL-452 имеет тканеспецифический характер, а рекомбинантный белок проявляет себя как антагонист полноразмерного IL-4 в экспериментах с иммунокомпетентными клетками [12, 15]. Установлено, что мРНК IL-452 детектируется в различных типах иммунокомпетентных клеток [105, 106]. Кроме того, имеются сведения, что в клетках тимуса и бронхоальвеолярного лаважа наблюдается преобладание мРНК IL-452 над мРНК IL-4, в сравнении с мононуклеарными клетками периферической крови [9, 15]. Наличие сплайс-вариантов IL-4 в других типах клеток пока не изучено, однако в ряде работ сообщается об обнаружении дельта-формы мРНК гена IL-4 в образцах тканей миндалевидной железы, легких, кишечника, тимуса и в тканях плаценты и амниохориона [16, 49, 106]. При изучении экспрессии гена IL-4 у пациентов с некоторыми патологиями также обнаружено изменение в уровнях полноразмерной - IL-4 и альтернативной - IL-452 форм мРНК [17, 74, 120, 158].

В работах [12, 15] были исследованы эффекты рекомбинантных белков IL-4 и IL-452, оказываемые на различные типы иммунокомпетентных клеток и установлено, что IL-452 проявляет свойства естественного антагониста IL-4 и отменяет его действие на функции Т-клеток, В-клеток и моноцитов. Предполагаемый механизм действия сплайс-варианта - конкурентное блокирование рецептора IL-4 без активации сигнальных путей, что было подтверждено при моделировании пространственной структуры белка IL-452 и белков образующих рецепторные комплексы IL-4 [204]. Однако фибробласты в равной степени отвечают как на IL-4, так и на IL-452, что свидетельствует о возможной активации рецепторов дельта-формой на этом типе клеток [17].

Таким образом, в отношении экспрессии сплайс-вариантов гена IL-4 и биологических свойств белка IL-452 остается достаточно много не изученных вопросов, ответы на которые позволят определить функции и значимость сплайс-варианта IL-452 в регуляторных реакциях, определяемых геном IL-4. Эти вопросы связанны с детекцией сплайс-варианта IL-4 в нелимфоидных клетках и способностью IL-452 к активации клеток через различные типы рецепторов IL-4. Кинетика изменения уровня полноразмерной и альтернативной форм мРНК IL-4 также требует изучения.

В этой связи представлялось актуальным в данной работе прояснить некоторые моменты экспрессии сплайс-вариантов гена IL-4 в различных клетках и более полно охарактеризовать биологическую активность рекомбинантного белка IL-452.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Цель работы: Изучить экспрессию сплайс-вариантов мРНК гена IL-4 в мононуклеарных клетках периферической крови и в эритроидных клетках человека и охарактеризовать биологическую активность рекомбинантного белка IL-452 культуре мононуклеарных клеток. Задачи исследования:

1. Охарактеризовать динамику изменения уровня мРНК IL-4 и IL-452 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека.

2. Определить наличие слайс-вариантов мРНК гена IL-4 в эритроидных клетках человека.

3. Изучить влияние рекомбинантных белков IL-4 и IL-452 на пролиферативную активность мононуклеарных клеток человека.

4. Определить эффекты рекомбинантных белков IL-4 и IL-452 на синтез IgE и экспрессию CD23 В-клетками в культуре мононуклеарных клеток человека.

5. Охарактеризовать эффекты рекомбинантного IL-452 на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками человека в культуре.

6. Исследовать, полученные рекомбинантные белки IL-4 и IL-452 на наличие специфической биологической активности.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые показано, что альтернативный сплайсинг гена IL-4 происходит не только в иммунокомпетентных клетках, но и в эритроидных ядросодержащих клетках фетальной печени и костного мозга человека.

Продемонстрировано, что в стимулированных митогеном мононуклеарных клетках человека определяются две формы мРНК гена IL-4, причем пик уровня мРНК IL-452 наблюдается на 3 часа, а пик мРНК IL-4 на 6 часов, что определяет изменение в соотношении сплайс-форм при активации клеток.

Впервые установлено, что rhIL-462 может выступать в роли антагониста и синергиста полноразмерной формы IL-4 в различных иммунологических реакциях мононуклеарных клеток периферической крови in vitro. В частности, rhIL-452 выступает как антагонист и ингибирует стимулирующее действие rhIL-4 на пролиферацию МНК и синтез IgE. В качестве агониста rhIL-452 выступает при активации экспрессии CD23 на поверхности В-клеток и при регуляции экспрессии IL-4 в культуре МНК ПК человека, где его стимулирующий эффект аналогичен действию rhIL-4. Эффект оказываемый rhIL-452 на продукцию IL-6 мононуклеарными клетками прямо противоположен ингибирующему действию полноразмерного белка rhIL-4.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Получены новые сведения об экспрессии IL-452 и его биологических эффектах, дополняющие картину функционального значения альтернативного сплайсинга пре-мРНК гена IL-4 в регуляторных функциях системы цитокинов.

Показано, что альтернативный сплайсинг пре-мРНК имеет место при экспрессии гена IL-4 в эритроидных ядросодержащих клетках, что свидетельствует о возможном участии сплайс-варианта IL-482 в регуляции гемопоэза.

Наличие у рекомбинантного белка IL-452 человека свойств антагониста и агониста, указывает на способность этого белка к трансдукции специфического сигнала.

В результате исследования получены и охарактеризованы рекомбинантные белки IL-4 и IL-452 человека, обладающие специфической активностью, которые могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов их действия на клетки-мишени и в перспективе для диагностики и иммунотерапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Ген IL-4 в мононуклеарных клетках периферической крови и эритроидных клетках человека экспрессируется с участием альтернативного сплайсинга.

2. IL-482 способен как стимулировать, так и ингибировать влияние IL-4 и обладает собственными эффектами на мононуклеарные клетки периферической крови человека.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003 г.), 2) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003 г.), 3) объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004г.), 4) 8-ом всероссийского научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г.).

САМОСТОЯТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕННОЙ РАБОТЫ.

Создание генетических конструкций и модификация бактериальных клеток (Е. coli) проводилась сотрудниками группы фармакогеномики НИИ ХБиФМ СО РАН, г. Новосибирск (руководитель к.б.н. М.Л. Филипенко). Получение и очистка рекомбинантных белков проводилась сотрудниками ООО «Центр инженерной иммунологии» г. Новосибирск (руководитель Н.М. Пустошилова).

Цитофлюориметрический анализ проводился на базе лаборатории клинической иммунологии НИИ КИ СО РАМН (зав. лаборатории д.м.н. B.C. Кожевников).

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИ КИ СО РАМН.

Автор выражает благодарность Л.Р. Птицыну (ГНЦ РФ ГосНИИ «Генетика», г. Москва) за любезно предоставленный для исследований препарат рекомбинантного белка IL-452.

Большую признательность автор выражает научному руководителю работы профессору, д.м.н. С.В. Сенникову за подробное конструктивное обсуждение полученных результатов, а также всем сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии за благожелательное отношение в ходе выполнения работы.

выводы

1. мРНК IL-452 определяется как в иммунокомпетентных, так и в эритроидных клетках человека, что свидетельствует об участии альтернативного сплайсинга в экспрессии эритрокариоцитами этого цитокина.

2. В мононуклеарных клетках периферической крови, стимулированных конканавалином А, наблюдается индукция обоих форм мРНК гена IL-4 с пиком мРНК IL-452 на 3 часа, а мРНК IL-4 на 6 часов, что указывает на изменение количественного соотношения сплайс-вариантов при активации клеток.

3. Полученные рекомбинантные белки IL-4 и IL-452 обладают специфическими эффектами на пролиферативную активность мононуклеарных клеток человека.

4. Эффекты IL-4 на пролиферативную активность, уровень секреции IgE и продукцию IL-6 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови отменяются при внесении IL-452, что свидетельствует о наличии у изоформы свойств антагониста.

5. Рекомбинантный белок IL-452 стимулирует экспрессию CD23 на В-клетках и продукцию IL-4 и IL-6 мононуклеарными клетками человека, что указывает на его способность к трансдукции сигнала.

6. Экспрессия гена IL-4 в клетках человека происходит с образованием полноразмерной и альтернативно-сплайсированной по второму экзону форм мРНК, а рекомбинантные белки этих сплайс-вариантов обладают разным спектром биологической активности, что значительно расширяет роль продуктов гена IL-4 в регуляции иммунных реакций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая полученные результаты можно заключить, что в проведенных экспериментах сплайс-вариант мРНК - IL-452 детектируется не только в иммунокомпетентных клетках, но и в эритрокариоцитах фетальной печени и костного мозга человека. Поскольку известно, что эритроидные клетки могут принимать участие в регуляции гемо- и иммунопоэза в фетальной печени и костном мозге человека, посредством продукции цитокинов, можно предполагать участие альтернативного сплайсинга в этой регуляции.

При изучении мРНК гена IL-4 установлено, что в мононуклеарных клетках периферической крови экспрессируется только 2 формы мРНК IL-4, причем при стимуляции клеток КонА наблюдается индукция экспрессии обоих форм мРНК, что указывает на влияние внешних стимулов на уровень экспрессии сплайс-форм IL-4. В культурах МНК человека при стимуляции митогеном пик экспрессии мРНК IL-452 приходится на 3 часа, а мРНК IL-4 на 6 часов.

Полученные в совместной работе рекомбинантные белки rhIL-4 и rhIL-452 обладают ранее описанными эффектами на пролиферативную активность МНК ПК. Данные, полученные при исследовании биологических эффектов этих белков подтверждают, что rhIL-452 в дозозависимой манере отменяет стимулирующее действие rhIL-4 на спонтанную и митогениндуцированную пролиферацию МНК ПК человека, что указывает на его свойства как антагониста по отношению к полноразмерному варианту белка IL-4.

Так же показано, что rhIL-452 отменяет стимулирующее действие IL-4 на продукцию IgE мононуклеарными клетками и усиливает стимулирующее действие IL-4 на экспрессию низкоаффинного рецептора к IgE (CD23), что указывает на его способность к трансдукции сигнала. Это предположение подтверждается и при исследовании эффектов рекомбинантных белков на продукцию цитокинов. Так установлено, что rhIL-452 не только дозозависимо отменял ингибирующее действие IL-4 на продукцию IL-6 мононуклеарными клетками, но и обладал способностью стимулировать продукцию этого медиатора. Кроме того, rhIL-452, как и сам rhIL-4 стимулировал синтез IL-4 мононуклеарными клетками периферической крови, выступая как позитивный регулятор, в то же время эффектов rhIL-452 на продукцию IL-ip, IL-2, IL-10 и IFN-y мононуклеарными клетками не обнаружено.

Исходя из полученных результатов, мы предполагаем возможным механизмом реализации двойственных эффектов IL-452 его способность связываться с различными типами рецепторов с активацией или без активации трансдукции сигнала, в зависимости от типа связывающего рецептора.