Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение тиреотропных свойств зюзника европейского (Lycopus europaeus L.)

На правах рукописи

□□3166084

АЙВАЗОВА Аревик Степановна

ИЗУЧЕНИЕ ТИРЕОТРОПНЫХ СВОЙСТВ ЗЮЗНИКА ЕВРОПЕЙСКОГО (ЬУСОРШ ЕШЮРАЕШ Ь.)

14.00.25 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

А 6

Москва-2008

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР)

Научный руководитель доктор медицинских наук, Колхир Владимир Карлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, Лобанова Елена Георгиевна

доктор биологических наук, профессор, Бабичев Василий Николаевич

Ведущая организация:

Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ)

Защита состоится 24 апреля 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.024 01 при ГУ научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В. Закусова по адресу 125315 Москва, Балтийская ул. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ научно-исследовательского института фармакологии им В В Закусова

Автореферат разослан 21 апреля 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Вальдман Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность научного исследования

Лечение и профилактика заболеваний щитовидной железы являются важными медико-социальными проблемами здравоохранения Несмотря на значительные достижения в области тиреоидологии, полученные за последние годы, численность пациентов с заболеваниями щитовидной железы ежегодно увеличивается На сегодняшний день эта эндокринная патология признана самой распространенной в мире (Е Н Hoogendoorn et al, 2006).

Дисфункция щитовидной железы может приводить к нарушениям работы всех без исключения органов и систем человеческого организма Наиболее частыми осложнениями тиреоидной патологи являются заболевания сердечно-сосудистой и нервной системы, а также изменения структуры щитовидной железы, ведущие к образованию различных форм зоба (В В Фадеев и др, 2005, R FDuyffet al., 2000, R W V Flynn et al. 2005, С WSiu et al, 2007, В OAsvold et al, 2007, S Ovadia et al, 2007)

Современные методы лечения заболеваний щитовидной железы не являются универсальными, поскольку наряду с достоинствами имеют ряд недостатков, таких как частые рецидивы и риск осложнений гормональной и антитиреоидной терапии (J Tajiri, 2004, D S Cooper, 2005, R D Chivu, 2006)

Поэтому поиск новых эффективных и безопасных лекарственных средств лечения заболеваний щитовидной железы является актуальной задачей современной фармакологии

Лекарственные растения являются, на наш взгляд, наиболее перспективным источником биологически активных веществ тиреотропного действия Целесообразность изучения лекарственных растений определяется их относительной безопасностью и наличием, широкого спектра фармакологической активности Сочетанное применение лекарственных растений с гормонами и тиреостатиками дает возможность снизить их побочные эффекты, а также проводить коррекцию различных симптомов заболевания щитовидной железы При этом наибольшее значений для исследования представляют растения способные, в первую очередь, оказывать влияние на функциональную активность и структуру щитовидной железы

К таким растениям относится зюзник европейский Ьусорт еигораеиБ Ь, (семейство Губоцветные - Ьатгасеае), вытяжки из которого проявляют выраженный тиреостатический эффект, сочетающийся со способностью снижать повышенное артериальное давление и тахикардию (МАи/тко1к е1 а1, 1985, Н Цг1Мегко$' е? а!, 1994, С Уопко$ е? а\, 2006) Анализ современного состояния вопроса показал отсутствие в литературе сведений об эффектах этого растения в условиях гипотиреоза, о действии на структуру щитовидной железы при зобной патологии и на центральную нервную систему В связи с этим изучение специфической тиреотропной активности зюзника европейского представляет теоретический и практический интерес для разработки нового лекарственного средства для лечения заболеваний щитовидной железы

Цель и задачи исследования

Целью работы является изучение тиреотропных свойств экстрактов из зюзника европейского для разработки на их основе лекарственного препарата для лечения заболеваний щитовидной железы

Для достижения поставленной цели в процессе исследования решали следующие задачи

1 Разработать эффективную модель функциональной и структурной патологии щитовидной железы у крыс

2 Изучить влияние зюзника европейского травы экстракта сухого и сока на уровень тиреоидных гормонов в условиях гипо- и гипертиреоза.

3 Изучить влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на процессы восстановления функциональной активности щитовидной железы с экспериментальным коллоидным зобом

4 Изучить поведение животных в тесте «открытое поле» в условиях экспериментального тиреотоксикоза и на фоне длительного введения зюзника европейского травы экстракта сухого.

5 Оценить тиреотропный эффект зюзника европейского травы экстракта сухого в условиях сочетанного применения с тиреостатиком мерказолилом

Научная новизна исследования

1 Впервые установлено тиреотропное действие зюзника европейского травы сока и экстракта сухого на животных в условиях эутиреоза, экспериментального гипотиреоза, гипертиреоза и зобной патологии

2. Выявлено влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на состояние центральной нервной системы крыс в условиях экспериментального тиреотоксикоза.

3. Установлено потенцирующее действие зюзника европейского травы экстракта сухого на тиреостатический эффект мерказолила при их сочетанном применении

4 Разработана модель экспериментального тиреотоксикоза на белых крысах, которая позволяет оценить влияние изучаемого лекарственного средства на функциональную активность щитовидной железы при избытке тиреоидных гормонов в крови, а также на процессы восстановления структуры щитовидной железы при экспериментальном коллоидном зобе

Теоретическая и практическая значимость работы

Настоящая работа является фрагментом комплексных исследований, проводимых в отделе экспериментальной и клинической фармакологии (руководитель д м н В.К Колхир) Всероссийского научно-исследовательского института

лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН) (директор Академик РАМН и РАСХН В.А Быков) по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2010 гг», задание 04 13 Разработка технологии производства высокоэффективных лечебных и профилактических препарат ов из растительного сырья Результаты проведенных нами экспериментов по изучению тиреотропной активности зюзника европейского показали перспективность его использования с целью разработки лекарственного средства для лечения заболеваний щитовидной железы

Результаты диссертационной работы вошли в основную часть материалов доклинического фармакологического досье для

предоставления в Россздравнадзор РФ с целью регистрации препарата из зюзника европейского травы экстракта сухого в качестве лекарственного средства для лечения гипо- и гипертиреоза

В Российское агентство по патентам и товарным знакам подана заявка №2007143562 от 27 11 2007 на изобретение «Способ моделирования тиреотоксикоза и коллоидного зоба» Разработанную экспериментальную модель тиреотоксикоза и коллоидного зоба можно рекомендовать для использования в экспериментальной фармакологии с целью изучения тиреотропного действия лекарственных средств.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на расширенных заседаниях отдела экспериментальной и клинической фармакологии и заседании секции ученого совета ВИЛАР (Москва, 2006, 2007), Международном конгрессе «Традиционная медицина 2007» (Москва, 2007) и «Всероссийской научной конференции молодых эндокринологов» (Москва, 2007)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 работ

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, собственных исследований, выводов и списка используемой литературы Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 27 рисунков, 228 литературных ссылок, из которых 112 иностранных

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на белых нелинейных крысах обоего пола массой 200-270г и мышах-самцах линии ВАЬВ/с массой 20-22г Исследования проводись с соблюдением правил, сформулированных в приказе «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» (МЗ СССР №755 от 12 081977) и в соответствии с методическими рекомендациями по «Экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Р У Хабриев, 2005)

Объектами исследования являлись

• зюзника европейского свежей травы сок (ЗС) (экстрагент 27% этанол)

• зюзника европейского высушенной травы экстракт сухой (ЗЭ) (экстрагент 40% этанол).

Острую токсичность зюзника европейского травы экстракта и сока определяли на мышах методом пробит анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Р У Хабриев, 2005)

Тиреотропный эффект экстракта и сока травы зюзника европейского изучали на известных моделях гипо- и гипертиреоза и разработанной нами новой модели экспериментального тиреотоксикоза у крыс

Экспериментальный гипотиреоз воспроизводили путем ежедневного перорального введения мерказолила (Акрихин, Россия) в дозе 10 мг/кг (Л Г Чугунова и др, 2001) Для моделирования гипертиреоза экспериментальным животным ежедневно вводили рег 05 препарат трийодтиронин (Берин-Хеми, Германия) в дозе 10 мг/кг (О К Еакоо е/ а1, 2005) Моделирование обеих патологий проводили в течение 6 недель, после чего у животных определяли содержание тироидных гормонов в сыворотке крови, взятой из хвостовой вены. Эти показатели служили исходным фоном патологии.

Экспериментальный тиреотоксикоз воспроизводили путем ежедневного перорального введения экспериментальным животным препарата тиреотом (Берин-Хеми, Германия), содержащего

комбинацию обоих тиреоидных гормонов 40 мг левотироксина (Т4) и 10 мг лиотиронина (Т3) Тиреотом вводили крысам ежедневного per os в еженедельно возрастающей дозе 25, 50, 100, 150, 200 мкг/кг в течение 6 недель, после чего, с целью подтверждения патологии тиреотоксикоза, 10 крыс были забиты декапитацией со взятием крови для определения уровня тироидных гормонов в сыворотке и выделением щитовидных желез для определения их массы и морфологического анализа ткани

ЗС вводили экспериментальным животным с гипо- и гипертиреозом в дозе 5 мл/кг в течение 6 недель

ЗЭ вводили крысам с экспериментальным тиреотоксикозом перорально в дозах 50 и 250 мг/кг в течение 4 недель

Для определения эффективности сочетанного применения ЗЭ с известным антитиреоидным препаратом группе из 10-ти экспериментальных животных вводили одновременно мерказолил (3 мг/кг) и ЗЭ в дозе 100 мг/кг Контролем монотерапии мерказолилом служили 10 крыс, получавших тиреостатик в суточной терапевтической дозе, в пересчете для крыс 3 мг/кг Эксперимент продолжался в течение 4 недель

Контролем нормофункции щитовидной железы служили 10 интактных крыс, которые получали дистиллированную воду У всех животных определяли содержание тиреоидных гормонов в сыворотке крови и проводили морфологический анализ тканей щитовидной железы

Состояние центральной нервной системы крыс оценивали по поведенческим реакциям в тесте «открытое поле», с использованием модели открытого поля норкового типа (Е С Балынина, И В Березовская, 1976) Тест проводили дважды, по истечении 6 недель развития тиреотоксикоза и после четырехнедельного лечения ЗЭ в дозах 50 и 250 мг/кг.

Для оценки функционального состояния щитовидной железы в сыворотке крови экспериментальных животных определяли содержание общих тиреоидных гормонов (тийодтиронина- Тз и тироксина- Т4) методом радиоиммунологического анализа с использованием наборов Total Т4 RIA KIT и Total Т3 RIA KIT фирмы Immunotech, Bekman (Чехия) {KA Прядко, 2000)

Морфологический анализ щитовидной железы крыс проводили общепринятыми методами (ГА Меркулов, 1969)

Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивались по традиционной методике гемотоксилин-эозином (О В Волкова, Ю К Елецкий, 1971). Для объективной оценки морфо-функционального состояния щитовидной железы определяли основные параметры тиреоидного эпителия, высоту фолликулярного эпителия, площадь ядер тироцитов, диаметр фолликулов Стереоскопическим методом точечного счета на гистологических срезах определяли относительный объем тканевых компонентов щитовидной железы фолликулярного эпителия, коллоида, интерфолликулярных тироцитов, десквамированных тироцитов, соединительной ткани, лейкоцитов и сосудистого русла В вариационном ряду диаметров произведен подсчет доли (%) фолликулов разных размеров, принимали за мелкие фолликулы - до 50 мкм, средние - до 100 мкм и крупные - свыше 100 мкм В 50 полях зрения проводили не менее 100 измерений в 40 фолликулах каждого образца, всего проводили не менее 400 измерений каждого показателя (О К Хмельницкий, 2002, В Л Быков 1975, К Ташкэ, 1980, Г Г Автандшов, 1990).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ статистического анализа $1ак$иса 6,0 ^а^оА, США) Использовали критерий Манна-Уитни, тест Вилкоксона для сравнения независимых и связанных выборок Для оценки значимости отличий между выборками с распределением, приближающимся к нормальному, использовали критерий Стьюдента. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05

Данные в тексте и таблицах представлены в виде Ме [25;75] (где Ме-медиана; 25 и 75 - 1-й и 3-й квартили) или (где М- средняя арифметическая, а Ж - среднеквадратическое отклонение). * -обозначаются статистически значимые отличия групп от аналогичных показателей у интактных животных, «модель» -обозначается разработанная модель тиреотоксикоза и коллоидного зоба.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Моделирование тиреоидной патологии

С целью определения тиреотропной активности зюзника европейского травы экстракта и сока на экспериментальных животных воспроизводили модели функциональной и структурной патологии щитовидной железы По результатам радиоиммунологического анализа моделирование

экспериментального гипотиреоза с использованием тиреостатика мерказолила приводило к снижению содержания обоих тиреоидных гормонов в сыворотке крови крыс (рис 1) При моделировании гиперфункции щитовидной железы, ежедневное введение крысам трийодтиронина приводило к повышению содержания Т3 в сыворотке крови крыс, существенно не влияя на уровень Т4 (рис 1) Однако у людей, при выраженном функциональном гипертиреозе, в крови повышено содержание Т4, которое коррелирует с уровнем Т3 Кроме того, оба тиреоидных гормона влияют на собственные рецепторы в некоторых клетках-мишенях

Поэтому для воспроизведения наиболее адекватной клинической картины экспериментального гипертиреоза у крыс эмпирическим путем нами была получена новая модель гиперфункции щитовидной железы, при которой гормональный статус был повышен за счет обоих тиреоидных гормонов Для этого экспериментальным животным вводили препарат тиреотом в еженедельно возрастающих дозах, что приводило к повышению в сыворотке крови Т3 и Т4 (таб 1) При этом наблюдалось значительное снижение массы тела крыс (таб) и увеличение относительной массы щитовидной железы 8,8±2,31 мг/кг (в норме 6,2±0,89 мг/кг) Морфологическое исследование щитовидной железы показало характерное изменение ее структуры- увеличение диаметра фолликулов, наряду с уменьшением высоты клеток тиреоидного эпителия и площади их ядер (таб 1), отмечалось также увеличение относительного объема коллоида и уменьшение суммарного объема тиреоидного эпителия и сосудистого русла Наличие деструктивных изменений щитовидной железы заключались в увеличении объема десквамированных тироцитов и стромы по сравнению с интактными животными (таб. 2) Можно предположить, что увеличение

относительной массы щитовидной железы при введении крысам тиретома происходило за счет чрезмерного накопления коллоида в каждом фолликуле

Следовательно, разработанная нами экспериментальная модель у крыс позволяет получить клиническую картину гипертиреоза в крови, а в тканях щитовидной железы создать патологию коллоидного зоба Полученные данные являются доказательством достоверности полученной нами модели, которую мы назвали моделью экспериментального тиреотоксикоза и коллоидного зоба.

Исследование безопасности зюзника европейского травы экстракта и сока

Для изучения тиреотропных свойств объектов исследования, предварительно изучали безопасность зюзника европейского травы экстракта и сока Результаты исследования «острой)-' токсичности показали, что средние смертельные дозы (ЛД50) при однократном внутрижелудочном введении мышам для ЗС составляют более 50 мл/кг, а для ЗЭ 9200±810 мг/кг, что позволяет считать ЗС и ЗЭ малотоксичными вещее гвами

Изучение влияния зюзника европейского травы сока и экстракта сухого на тиреоидный статус крыс в условиях гипо-,

гипер- и эутиреоза

Как видно на рис 1, ЗС повышал функциональную активность щитовидной железы в условиях гипотиреоза (р<0,05) и эутиреоза у крыс. При экспериментальной гиперфункции щитовидной железы тиреотропный эффект ЗС заключался в повышении уровня Т4 и значительном снижении содержании Тз в сыворотке крови крыс, что указывает на подавление периферической конверсии тиреоидных гормонов

интактная гипотиреоз гипотиреоз гипертареоз гипертареоз модель лечение ЗС модель лечение ЗС

Рис.1 Влияние зюзника европейского травы сока на содержание тиреоидных гормонов в сыворотке крови крыс в условиях гипо-, гипер- и

эутиреоза

Таким образом, установлено, что ЗС в условиях экспериментального гипотиреоза и эутиреоза повышает функциональную активность щитовидной железы крыс, а в условиях тиреоидной гиперфункции подавляет периферическую конверсию тиреоидных гормонов.

Изучение влияния зюзника европейского травы экстракта сухого на функциональную активность щитовидной железы в условиях разработанной нами модели экспериментального тиреотоксикоза у крыс

В условиях разработанной нами модели тиреотоксикоза ЗЭ, вводимый экспериментальным животным в дозе 50 мг/кг в течение 4 недель повышал уровень тироксина и снижал содержание трийодтиронина в сыворотке крови крыс. При этом наблюдалось значительное снижение показателя дейодирования тиреоидных гормонов, что указывает на подавление конверсии Т4 в Т3.

Таблица 1

Влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на уровень тиреоидных гормонов в сыворотке крови и массу тела крыс с экспериментальным тиреотоксикозом, Ме [25,75]

Группа Масса тела, г Т4 нмоль/л Т3 нмоль/л Индекс дейодирования т3/т4

интактная 366,7±30,31 39,95 [27,63, 49,84] 0,73 [0,60, 0,771 0,022±0,0141

Модель 174,4±26,97 46 80 [25,41; 55,05] 0,89 [0,58, 1,30] 0,023±0,0068

Модель+ЗЭ 50 мг/кг 337,8±33,36 58,52 [39,93, 67,73] 0,69 [0,55, 0,78] 0,014±0,0071

Модель+ЗЭ 250 мг/кг 371,7±25,42 43,52 [41,75, 56,78] 0,70 [0,60, 1,201 0,019±0,0121

ЗЭ, вводимый экспериментальным животным с

тиреотоксикозом в дозе 250 мг/кг, несколько повышал содержания в сыворотке крови крыс Т4, при этом значение Т3 было приближено к норме. Как видно из таблицы 1, ЗЭ в дозе 250 мг/кг в меньшей степени подавлял конверсию тиреоидных гормонов, на что указывает незначительное снижение индекса дейодирования тиреоидных гормонов (таб 1)

Таким образом, результаты радиоиммунологического анализа позволяют утверждать, что влияние ЗЭ на функциональную активность щитовидной железы крыс в условиях

экспериментального тиреотоксикоза связано с подавлением периферической конверсии тиреоидных гормонов, причем этот эффект более выражен при использовании меныцей дозы ЗЭ

Изучение влияния зюзника европейского травы экстракта сухого на структуру щитовидной железы в условиях экспериментального коллоидного зоба у крыс

При введении крысам ЗЭ в дозах 50 и 250 мг/кг происходили активные морфо-функциональные перестройки в щитовидной железе Как видно на рисунках 2-5 на большинстве срезах наблюдалось преобразование формы тиреоидного эпителия из плоского в

кубический, а в некоторых случаях - в высокий цилиндрический Так, при введении ЗЭ в дозе 50 мг/кг, высота тироцитов составила 9,0±2,69 мкм, а при введении ЗЭ в дозе 250 мг/кг - 10,0±3,05 мкм (в норме 8,2±2,69 мкм) Из таблицы 2 видно, что увеличение высоты тиреоидного эпителия сопровождалось увеличением площади ядер тироцитов Известно, что высота тироцитов напрямую коррелирует с площадью их ядер и увеличение этих показателей указывает на повышение функциональной активности щитовидной железы (О К Хмельницкий, 2002)

Таблица 2

Влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на морфометрические показатели щитовидной железы крыс с

экспериментальным коллоидным зобом_

Тканевые компоненты Единица измерения Ннтакггная Модель Модель+ ЗЭ 50 мг/К1 МоделЫ-ЗЭ 250 мг/кг

Фолликулярные тироциты % 33,7±9,11 20,9± 11,27 25,6±12,18 22,6±13,97

Коллоид % 39,9± 13,26 54,1±16,89 33,9±15,90 33,4±14,69

Строма % 5,2±4,07 9,8±10,42 13,б±16,11 13,4±13,88

Интерфолчнкулярные тироциты % 8,1±9,27 4,1±5,47 10,4± 11,00 12,4±12,07

Десквамнрованные тироциты % 1,3±2,60 5,9±11,30 8,3±12,57 12,8±17,56

сосуды % П,8±4,8 5,2±2,48 8,2±3,93 5,4±3,06

Диаметр фочлик>ла мкм 59,0±24,83 74,2±38,02 69,1±25,17 76,4±36,75

Высота эпителия мкм 8,2±2,69 6,1±1,89 9,0±2,69 10,0±3,05

Площадь ядер тиронитов мкм2 14,1±3,45 11,1*3,39 15^4,56 17,1±6,16

а б

Рис. 3 Щитовидная железа крыс с экспериментальным коллоидным зобом.

а б

Рис.4 Щитовидная железа крыс с экспериментальным коллоидным зобом, получавших зюзника европейского травы экстракт сухой в дозе 50 мг/кг.

зобом, мг/кг.

а б

Рис.5 Щитовидная железа крыс с экспериментальным коллоидным европейского травы экстракт сухой в дозе 250

ЩШЖШж

ШЯяж

йвШВР ШШ¡Ш

Рис. 6 Щитовидная железа крыс, получавших

^ дозе 3 мг/кг.

а б

Рис.7 Щитовидная железа крыс, получавших сочетано мерказолил и зюзника европейского травы экстракт сухой в дозе 100 мг/кг.

Окраска гемотоксилин-эозии. а- увеличение!0х25; б- увеличение 10x12,5.

Рис.2 Щитовидная железа интактных

Однако следует отметить, что процессы активации функции щитовидной железы при введении ЗЭ сопровождались элиминацией и склерозированием разрушенных ранее фолликулов В таблице 2 представлены морфометрические показатели относительного объема тканевых компонентов щитовидной железы крыс, получавших ЗЭ в разных дозах Следует отметить, что наличие процессов деструкции щитовидной железы при введении ЗЭ в дозе 250 мг/кг было связано со значительной активацией функциональной активности органа, об этом свидетельствует наличие прямой корреляционной связи числа десквамированных гироцитов с показателем высоты клеток тиреоидного эпителия (г=0,29) и с площади их ядер (г=0,32)

Таким образом, по результатам морфологического анализа установлено, что введение ЗЭ крысам с экспериментальным коллоидным зобом приводило к активным морфо-функциональным перестройкам и активации функции щитовидной железы

Исследование влияния зюзника европейского травы экстракта сухого на поведение крыс с экспериментальным тиреотоксикозом в тесте «открытое поле»

Для определения состояния центральной нервной системы крыс в условиях экспериментального тиреотоксикоза и на фоне лечения ЗЭ нами были изучены поведенческие реакции животных в тесте «открытое поле»

Согласно результатам представленным на рисунке 8, при экспериментальном тиреотоксикозе у крыс повысилась двигательная и ориентировочная активность, показатели которых составили 13,3±5,14 (в норме 10,6±6,51) и 7,5±3,36 (в норме 5,4±3,69) соответственно, различия с группой интактных животных были статистически значимыми на уровне значимости р<0,05 В нашем исследовании нарастание двигательной активности у крыс, наряду с увеличением ориентировочной реакции, указывает на возбуждение их нервной системы. При этом отмечено некоторое снижение исследовательской активности, на что указывает уменьшение числа «заглядываний» в норки - б,4±2,74 (в норме 7,5±4,23) Частота груминга, вертикальных стоек, напряжений хвоста и количество

болюсов у крыс с тиреотоксикозом и интактных животных была практически равной

квадраты

15л\

интактная

модель тиреотоксикоза

поднятие головы

норки

ГПУМИНГ

Рис 8 Поведенческие показатели крыс с экспериментальным тиреотоксикозом в тесте «открытое поле»

Четырехнедельное введение экспериментальным животным ЗЭ приводило к снижению практически всех поведенческих показателей (рис 9, 10) Так, двигательная активность крыс, получавших ЗЭ в дозах 50 и 250 мг\кг, была соответственно в 3 и 2,4 раза ниже, чем у крыс с тиреотоксикозом, и в среднем 2 раза ниже, чем у интактных крыс Показатель исследовательской активности крыс при лечении ЗЭ в дозе 50 мг/кг снизился до 3,9±2,03, а в дозе 250 мг/кг до 1,8±1,78 ( в норме 7,5±4,23) при р<0,05 Сходная тенденция отмечена также при анализе ориентировочной реакции и груминга Так, введение ЗЭ в дозах 50 и 250 мг/кг приводило к снижению числа поднятий головы при опоре на 3-4 лапы в 3 и 1,4 раза, а груминга - в 2 и 2,8 раза соответственно, по сравнению с показателями у интактных крыс При этом увеличилась частота проявлений напряжений хвоста в группе крыс с 3 до 6 при лечении ЗЭ в дозе 50 мг/кг и с 2 до 8 при назначении ЗЭ в дозе 250 мг/кг Число проявлений стереотипии и количество болюсов практически не отличалось от проявлений у интактных животных

Следует отметить, что на фоне общей тенденции к подавлению всех поведенческих показателей у крыс, получавших ЗЭ, прослеживается наличие динамики характерных эффектов, обусловленных применением разных доз экстракта Так, в дозе 50 мг/кг ЗЭ преимущественно подавлял двигательно-ориентировочную активность крыс, а в дозе 250 мг/кг наблюдалось значительное понижение исследовательской активности и груминга Описанные изменения в поведении животных указывают на усиление процессов торможения в разных отделах центральной нервной системы

квадраты

поднятие головы

—♦— интактная — ЗЭ 50 мг/кг —*—ЗЭ 250 мг/кг

модель тиреотоксикоза

норки

груминг

Рис 9 Влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на поведение крыс в «открытом поле»

Таким образом, по результатам теста «обрытое поле» установлено, что при экспериментальном тиреотоксикозе повышение содержания тиреоидных гормонов в сыворотке крови крыс приводит к усилению процессов возбуждения в нервной системе На фоне введения ЗЭ наблюдалась усиление процессов торможения в центральной нервной системе крыс, что выражалось в снижении практически всех поведенческих реакций животных. При этом в меньшей дозе (50 мг/кг) ЗЭ подавлял преимущественно двигательно-ориентировочную, а большой дозе (250 мг/кг), исследовательскую активность экспериментальных животных

Определение эффективности сочетанного применения зюзника европейского травы экстракта сухого с синтетическим тиреостатиком мерказолилом

Нами было также изучено тиреотропное действие ЗЭ в условиях сочетанного применения с мерказолилом. Ранее мы установили, что мерказолил в дозе 3 мг/кг, приводил к снижению уровня тироксина в сыворотке крови экспериментальных животных с тиреотоксикозом и незначительно влиял на уровень трийодтиронина (рис.10). При этом отмечалось увеличение абсолютной (28,2±6,16 мг) и относительной (8,9±1,03 мг/кг) массы щитовидной железы крыс (рис. 11). Результаты морфометрического анализа показали, что увеличение щитовидной железы при введении мерказолила связано, главным образом, с увеличением суммарного объема тиреоидного эпителия (фолликулярного и интерфолликулярного) (рис. 6 и 12). Эти данные соответствуют известному механизму тиреотропного действия мерказолила и его побочному струмогенному эффекту на щитовидную железу (В.Б. Шадлинский, 1998).

интактная мерказолил мерказолил и ЗЭ

Рис. 10. Влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на тиреоидный статус крыс при сочетанном введении с мерказолилом

При сочетанном введении мерказолила и ЗЭ в условиях тиреотоксикоза мы установили снижение уровня обоих тиреоидных гормонов (Т4 и Т3) в сыворотке крови крыс и при этом не было

отмечено значительного увеличения относительной и абсолютной массы щитовидной железы, в отличие от монотерапии мерказолилом (рис.11). Согласно данным основных морфометрических показателей (рис. 12), а также морфологической картине (рис.7), строение щитовидной железы было приближено к норме.

О ■+

интактная

! и фолликулярные тироциты | В етромя

| В десквамированные тироциты

мерказолил и зюзника экстракт И коллоид

ЕЗ интерфолликулярные тироциты ¡3 сосуды _

мерказолил

интактная мерказолил мерказолил и 33

Рис. 11. Влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на относительную массу щитовидной железы крыс при сочетанном введении с тиреостатиком мерказолилом ¡00%

80%

40%

Рис. 12. Влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на относительный объем тканевых компонентов щитовидной железы крыс при сочетанном введении с мерказолилом.

Следовательно, зюзника европейского травы экстракт сухой при его совместном применении с мерказолилом потенцирует антитиреоидный эффект тиреостатика, подавляя продукцию трийодтиронина, и при этом ЗЭ нивелирует отрицательное струмогенное действие мерказолила и нормализует функциональную активность щитовидной железы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного исследования показали, что зюзника европейского травы экстракт и сок проявляют выраженное тиреотропное действие

Определено, что зюзника сок в условиях пониженного и нормального содержания в крови экспериментальных животных тиреоидных гормонов, повышает функциональную активность щитовидной железы крыс, а в условиях тиреоидной гиперфункции подавляет конверсию Т4 в Т3, что, по всей видимости, связано с угнетением периферического дейодирования тиреоидных гормонов и является реакцией на интоксикацию организма избытком гормонов щитовидной железы Из литературных данных известно, что некоторые естественные и синтетические флавоноиды подавляют дейодирование тиреоидных гормонов и можно предположить, что этот эффект ЗЭ связан с содержанием в его составе лютеолин-7-гликозида

Изучено влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на процессы восстановления морфо-функциональной активности щитовидной железы, в условиях разработанной нами модели экспериментального коллоидного зоба у крыс. Установлено, что введение ЗЭ приводило к активации функции щитовидной железы

На основании результатов исследования зюзника европейского экстракта сухого установлено дозозависимое влияние этого растения на функциональную активность щитовидной железы и нервной системы крыс, так

• в меньшей дозе (50 мг/кг) введение ЗЭ, приводит к затормаживанию функции щитовидной железы и подавлению двигательно-ориентировочной реакции животных.

• при больших дозах (250 мг/кг) ЗЭ, стимулирует тиреотропную

функцию и подавляет исследовательскую активность животных

Интересным представляется возможность совместного использования зюзника европейского с синтетическим тиреостатиком мерказолилом Согласно результатам нашего исследования назначение такой комбинации препаратов указывает на наличие потенцированного действия у зюзника экстракта сухого, а также способности устранять отрицательный струмогенный эффект тиреостатика в условиях их сочетанного применения Из литературных данных известно, что причиной струмогенного эффекта мерказолила является повышение уровня ТТГ, стимулирующего рост щитовидной железы за счет увеличение массы тиреоидного эпителия (О К Хмельницкий,2002) В связи с этим мы можем предположить, что ЗЭ способен подавлять тиретропную стимуляцию щитовидной железы крыс, что очевидно обусловлено содержанием в его составе производных кофейной кислоты Так, по некоторым данным литоспермовая кислота может связываться с белковой частью молекулы ТТГ и тем самым блокировать стимулирование щитовидной железы и соответственно рост тиреоидного эпителия (Я Wagner, 1970, HSourgens, 1982).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Результаты проведенного исследования показывают перспективность использования зюзника европейского травы экстракта сухого и сока для проведения углубленного фармакологического изучения и дальнейшего клинического исследования с целью разработки на их основе лекарственного фитопрепарата для лечения гипо- и гипертиреоза

2 Разработанную экспериментальную модель тиреотоксикоза можно рекомендовать для использования в экспериментальной фармакологии с целью изучения тиреотропного действия лекарственных средств.

выводы

1 Разработана модель экспериментальной патологии щитовидной железы на белых крысах, позволяющая в крови животных воспроизвести клиническую картину тиреотоксикоза, а в тиреоидной паренхиме создать патологию коллоидного зоба

2 Зюзника европейского травы сок в условиях эутиреоза и экспериментального гипотиреоза повышает функциональную активность щитовидной железы

3 Зюзника европейского травы сок и экстракт сухой подавляют периферическую конверсию тиреоидных гормонов при гипертиреозе, причем данный эффект наиболее выражен при введении зюзника европейского травы экстракта сухого в дозе 50 мг/кг

4 В условиях экспериментального зоба длительное введение зюзника европейского травы экстракта сухого приводит к повышению функциональной активности щитовидной железы крыс

5 Зюзника европейского экстракт сухой проявляет дозозависимое влияние на поведение крыс с экспериментальным тиреотоксикозом в тесте «открытое поле». В меньшей дозе (50 мг/кг) экстракт преимущественно подавляет двигательно-ориентировочную, а большей дозе (250 мг/кг) -исследовательскую активность животных

6 Сочетанное применение зюзника европейского травы экстракта сухого и мерказолила приводит к потенцированию эффекта тиреостатика и нивелированию его отрицательного струмогенного действия

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Айвазова A.C. Возможности фитотерапии в лечении заболеваний щитовидной железы/ A.C. Айвазова. В К Колхир, Т Е Трумпе //Материалы международной конференции, посвященной 75-летию образования Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений.- 2006.- Том XVII - С 492-499

2 Айвазова A.C. Влияние экстракта травы зюзника европейского на поведение крыс с экспериментальным гипертиреозом в тесте «открытое поле» // Вестник бурятского государственного университета - 2007 -№8 - С.138-140

3 Изучение тиреотропных свойств травы зюзника европейского/ A.C. Айвазова, В К. Колхир, Т.Е. Трумпе, Л В Рогожина, Ц Ц Содбоев // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии - №1 -2008 - С 34-37

4 Айвазова A.C. Изучение влияния зюзника европейского травы сока на функциональную активность щитовидной железы в условиях гипо гипер- и эутиреоза у крыс/ A.C. Айвазова, В К Колхир, Т Е Трумпе // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сборник научных трудов - Пятигорск, 2008 - Вып 63 - С. 384-387

5. Айвазова A.C., Колхир В К. Изучение тиреотропного эффекта экстракта травы зюзника европейского в условиях сочетанного применения с тиреостатиком мерказолилом // сборник материалов конгресса (тезисы докладов) XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - М, 2008 -С 16

Подписано в печать 20 03 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 186 Тираж 80 эю

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat tu

Актуальность работы

Лечение и профилактика заболеваний щитовидной железы являются важными медико-социальными проблемами здравоохранения. Несмотря на значительные достижения в области тиреоидологии, численность пациентов с заболеваниями щитовидной железы ежегодно увеличивается. На сегодняшний день эта эндокринная патология признана самой распространенной в мире (Е.Н Hoogendoorn et al., 2006).

Дисфункция щитовидной железы приводит к тяжелым патологическим нарушениям работы других органов и систем человеческого организма. Наиболее частыми осложнениями тиреоидной патологии являются заболевания сердечно-сосудистой и нервной систем, а также изменения структуры щитовидной железы, ведущие к образованию различных форм зоба (В.В.Фадеев и др., 2005; R.F.Duyff et al, 2000; R. W. V. Flynn et al., 2005; C. W.Siu et al, 2007; B.O.Asvold et al., 2007; S. Ovadia et al., 2007).

Все осложнения тиреоидной патологии приводят к снижению качества жизни пациентов и, как правило, требуют длительного и комплексного лечения. Основным и единственным существующим методом лечения гипотиреоза является пожизненная заместительная терапия тиреоидными гормонами. При гипертиреозе используют наряду с консервативной тиреостатической-терапией, хирургическое лечение и терапию радиоактивным йодом. Современные методы лечения заболеваний щитовидной железы не являются универсальными, поскольку наряду с достоинствами, имеют ряд недостатков, таких как частые рецидивы и риск осложнений гормональной и антитиреоидной терапии (J.Tajiri, 2004; D.S.Cooper, 2005; R.D. Chivu, 2006).

Поэтому, поиск новых эффективных и безопасных лекарственных средств для лечения заболеваний щитовидной железы является актуальной задачей современной фармакологии.

Лекарственные растения являются, на наш взгляд, наиболее перспективным источником биологически активных веществ тиреотропного действия. Целесообразность изучения в этом направлении лекарственных растений определяется широким спектром их фармакологической активности и, как правило, относительной безопасностью при длительном применении: Сочетанное применение лекарственных растений с гормонами и тиреостатиками дает возможность снизить их побочные эффекты, а также проводить коррекцию различных симптомов заболевания щитовидной железы.

В настоящее время фитотерапия в тиреоидологии ограничивается применением, главным образом, седативных растений (валериана, пустырник, мелисса и др.), которые в комплексной терапии способны устранять нарушения со стороны нервной системы. Использование йодсодержащих растений (ламинария, фукус и др.) необходимо только при недостатке йода в» организме больного. В тоже время, наибольший интерес для исследования представляют растения, способные, в первую очередь, оказывать влияние на функциональную активность и структуру щитовидной железы.

К таким растениям относится зюзник европейский Ьусорт еигораеш Ь., (семейство Губоцветные - Ьат1асеае), вытяжки из которого проявляют выраженный тиреостатический эффект, сочетающийся со способностью снижать повышенное артериальное давление и устранять тахикардию (М.АцГтШк ег а\., 1985; НШМегко// & а1, 1994; С.Уопкоег а1, 2006). Анализ современного состояния вопроса показал отсутствие в литературе сведений об эффектах этого растения в< условиях гипотиреоза, о действии на структуру щитовидной железы при зобной патологии и на центральную нервную систему. В- связи с этим дальнейшее изучение специфической' тиреотропной активности зюзника европейского представляет теоретический и практический интерес для разработки нового лекарственного средства.

Цель и задачи исследования

Целью работы является изучение тиреотропных свойств экстрактов из зюзника европейского для разработки на их основе лекарственного препарата для лечения заболеваний щитовидной железы.

Для достижения поставленной цели в процессе исследования решали следующие задачи:

1. Разработать эффективную модель функциональной и структурной патологии щитовидной железы у крыс.

2. Изучить влияние зюзника европейского травы экстракта сухого и сока на уровень тиреоидных гормонов в условиях гипо- и гипертиреоза.

3. Изучить влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на процессы восстановления функциональной активности щитовидной железы с экспериментальным коллоидным зобом.

4. Изучить поведение животных в тесте «открытое поле» в условиях экспериментального тиреотоксикоза и на фоне длительного введения зюзника европейского травы экстракта сухого.

5. Оценить тиреотропный эффект зюзника европейского травы экстракта сухого в условиях сочетанного применения с тиреостатиком мерказолилом.

Научная новизна исследования

1. Впервые установлено тиреотропное действие зюзника европейского травы сока и экстракта сухого на животных в условиях эутиреоза, экспериментального гипотиреоза, гипертиреоза и зобной патологии.

2. Выявлено влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на состояние центральной нервной системы крыс в условиях экспериментального тиреотоксикоза.

3. Установлено потенцирующее действие зюзника европейского травы экстракта сухого на тиреостатический эффект мерказолила при их сочетанном применении.

4. Разработана модель экспериментального тиреотоксикоза на белых крысах, которая позволяет оценить влияние изучаемого лекарственного средства на функциональную активность щитовидной железы при избытке тиреоидных гормонов в крови, а также - на процессы восстановления структуры щитовидной железы при экспериментальном коллоидном зобе.

Теоретическая и практическая значимость работы

Настоящая работа является фрагментом комплексных исследований, проводимых в отделе экспериментальной и клинической фармакологии (руководитель - д.м.н. В.К.Колхир) Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН) (директор - академик РАМН и РАСХН В.А.Быков) по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2010 гг.», задание 04.13. Разработка технологии производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья. л

Результаты проведенных нами экспериментов по изучению тиреотропной активности зюзника европейского показали перспективность его использования с целью разработки лекарственного средства для лечения заболеваний щитовидной железы.

Результаты диссертационной работы вошли в основную часть материалов доклинического фармакологического досье для предоставления в Россздравнадзор РФ с целью регистрации препарата из зюзника европейского травы экстракта сухого в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний щитовидной железы.

В Российское агентство по патентам и товарным знакам подана заявка №2007143562 от 27.11.2007 на изобретение «Способ моделирования тиреотоксикоза и коллоидного зоба». Разработанную экспериментальную модель тиреотоксикоза можно рекомендовать для использования в экспериментальной фармакологии с целью изучения тиреотропного действия лекарственных средств.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на расширенных заседаниях отдела экспериментальной и клинической фармакологии и заседании секции ученого совета ВИЛАР (Москва, 2006, 2007), Международном конгрессе «Традиционная медицина 2007» (Москва, 2007) и «Всероссийской научной конференции молодых эндокринологов» (Москва, 2007).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, собственных исследований, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 27 рисунков, 228 литературных ссылок, из которых 112 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. Разработана модель экспериментальной патологии щитовидной железы на белых крысах, позволяющая в крови животных воспроизвести клиническую картину тиреотоксикоза, а в тиреоидной паренхиме создать патологию коллоидного зоба.

2. Зюзника европейского травы сок в условиях эутиреоза и экспериментального гипотиреоза повышает функциональную активность щитовидной железы.

3. Зюзника европейского травы сок и экстракт сухой подавляют периферическую конверсию тиреоидных гормонов при гипертиреозе, причем данный эффект наиболее выражен при введении зюзника европейского травы экстракта сухого в дозе 50 мг/кг.

4. В условиях экспериментального зоба длительное введение зюзника европейского травы экстракта сухого приводит к повышению функциональной активности щитовидной железы крыс.

5. Зюзника европейского экстракт сухой проявляет дозозависимое влияние на поведение крыс с экспериментальным тиреотоксикозом в тесте «открытое поле». В меньшей дозе (50 мг/кг) экстракт преимущественно подавляет двигательно-ориентировочную, а большей дозе (250 мг/кг) исследовательскую активность животных.

6. Сочетанное применение зюзника европейского травы экстракта сухого и мерказолила приводит к потенцированию эффекта тиреостатика и нивелированию его отрицательного струмогенного действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного исследования показали, что зюзника европейского травы экстракт и сок проявляют выраженное тиреотропное действие.

Определено, что зюзника сок в условиях пониженного и нормального содержания в крови экспериментальных животных тиреоидных гормонов, повышает функциональную активность щитовидной железы крыс, а в условиях тиреоидной гиперфункции подавляет конверсию Т4 в Тз, что, по всей видимости, связано с угнетением периферического дейодирования тиреоидных гормонов и является реакцией на интоксикацию организма избытком гормонов щитовидной железы (схема 1). Из литературных данных известно, что некоторые естественные и синтетические флавоноиды подавляют дейодирование тиреоидных гормонов и можно предположить, что этот эффект зюзника экстракт связан с содержанием в его составе лютеолин-7-гликозида.

Изучено влияние зюзника европейского травы экстракта сухого на процессы восстановления морфо-функциональной активности щитовидной железы, в условиях разработанной нами модели экспериментального коллоидного зоба у крыс. Установлено, что введение зюзника экстракт приводило к активации функции щитовидной железы.

На основании результатов исследования зюзника экстракта сухого установлено дозозависимое • влияние этого растения на функциональную активность щитовидной железы и нервной системы крыс, так:

• в меньшей дозе (50 мг/кг) введение зюзника экстракт, приводит к затормаживанию функции щитовидной железы и подавлению двигательно-ориентировочной реакции животных.

• при больших дозах (250 мг/кг) зюзника экстракт, стимулирует тиреотропную функцию и подавляет исследовательскую активность животных.

Интересным представляется возможность совместного использования зюзника европейского с синтетическим тиреостатиком мерказолилом. Согласно результатам нашего исследования назначение такой комбинации препаратов указывает на наличие потенцированного действия у зюзника экстракта сухого, а также способности устранять отрицательный струмогенный эффект тиреостатика в условиях их сочетанного применения. Из литературных данных известно, что причиной струмогенного эффекта мерказолила является повышение уровня ТТГ, стимулирующего рост щитовидной железы за счет увеличение массы тиреоидного эпителия (О. К.Хмельницкий,2002). В связи с этим мы можем предположить, что зюзника экстракт способен подавлять тиретропную стимуляцию щитовидной железы крыс (схема 1), что очевидно обусловлено содержанием в его составе производных кофейной кислоты. Так, по некоторым данным литоспермовая кислота может связываться с белковой частью молекулы ТТГ и тем самым блокировать стимулирование щитовидной железы и соответственно рост тиреоидного эпителия (H. Wagner, 1970; H.Sourgens, 1982).

Схема 1. Предполагаемый механизм действия экстрактов зюзника европейского Lycopus europaeus L. на гипоталамо-гииофизарно-тиреоидную систему.

Периферические ткшт

95