Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение метаболома зюзника европейского (Lycopus europaeus L.) и разработка субстанции тиреотропного действия

005013759

На правах рукописи

¿¿у/

ШЕЛУХИНА Наталья Александровна

ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛОМА ЗЮЗНИКА ЕВРОПЕЙСКОГО (X УСОРШ ЕиЯОРАЕиБ Ь.) И РАЗРАБОТКА СУБСТАНЦИИ ТИРЕОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 5 идр ЇШ

Москва-2012

005013759

Работа выполнена в ГІГУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Российской Академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЛАР РАСХН)

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук

кандидат биологических наук

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится 09 /£- в 14:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений ГНУ ВИЛАР РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЛАР РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат размещен на Интернет-сайте Высшей аттестационной комиссии (ВАК) Министерство образования и науки РФ: vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан «ХЪ> срВ&ріїЛЦ 2012 г.

Учёный секретарь Диссертационного Совета Д 006.070.01, ____

доктор фармацевтических наук Громакова А.И.

0

г

Сокольская Татьяна Александровна

Терёшина Наталья Сергеевна Антонова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) среди эндокринных нарушений организма человека заболевания щитовидной железы занимают второе место после сахарного диабета. В России этому недугу подвержено более 20 млн. человек. Так, согласно статистике каждый второй житель Подмосковья страдает тем или иным заболеванием щитовидной железы. А в некоторых районах России процент заболеваемости населения доходит до 95 %.

Причин этому множество - от йодного дефицита и неблагоприятной экологической обстановки до генетических нарушений. Из методов лечения заболеваний щитовидной железы предпочтение отдается заместительной гормонотерапии (ЗГТ), применению антитиреоидных средств (тиреостатиков), хирургическому вмешательству (тиреоидэктомия) и облучению радиоактивным йодом. Все перечисленные методы лечения сопровождаются значительным количеством противопоказаний и недостатков. Так, заместительная гормонотерапия подразумевает пожизненный прием препаратов гормонов щитовидной железы. Пациенты вынуждены увеличивать дозу препарата, в результате чего со временем собственная железа полностью прекращает функционировать, тем самым, превращая пациента в «пожизненного клиента» фармацевтических компаний.

Кроме того, прием препаратов тиреоидных гормонов имеет ряд противопоказаний и сопровождается множеством побочных эффектов, таких как тахикардия, нарушение сердечного ритма, аллергические реакции, нервное возбуждение, бессонница и т.д.

Хирургическое вмешательство зачастую сопровождается серьёзными осложнениями. Другими существенными недостатками оперативного удаления щитовидной железы являются: пожизненная заместительная гормонотерапия и высокий процент повреждения паращитовидной железы при проведении операции.

В растительном мире существуют виды растений, содержащие антитиреоидные вещества. Природные соединения растительного происхождения отличаются мягким действием. Среди растений в народной медицине издавна известен зюзник европейский (Ьусорт еигораеиз Ь).

Извлечения из зюзиика европейского активно используются в традиционной медицине для лечения гипертиреоидных состояний. В народной медицине разных стран зюзник европейский широко применяется для лечения базедовой болезни, тахикардии, сердечных заболеваний, неврозов. Кроме того, экстракт зюзника снижает повышенное артериальное давление и устраняет тахикардию - основные осложнения при лечении Ь - тироксином. При изучении фармакологических свойств зюзника европейского выяснили, что соединения, содержащиеся в составе данного растения, обладают выраженными антитиреоидным действием. Свойство извлечений из зюзника блокировать тирео стимулирующие антитела, не присущее ни одному из используемых в настоящее время антигипертиреоидных средств, позволяет рассматривать зюзник в качестве равноправного компонента комбинированного лечения диффузного токсического зоба, а при наличии непереносимости гормональных антитиреоидных средств -в качестве средства альтернативного лечения. Состав метаболома травы зюзника изучен недостаточно полно.

Разработка препаратов на основе зюзника европейского позволит лечить больных с тиреотоксикозом и улучшать их состояние. В связи с этим, проведение фармакогностического и фитохимического изучения Ьусорт еигораеш на предмет введения его в научную медицину, создание лекарственного препарата на его основе, разработка методов оценки его качества являются весьма актуальными задачами.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - провести изучение метаболома Ьусорт еигораеия, разработать технологию получения субстанции тиреотропного действия, метод стандартизации исходного сырья и сухого экстракта.

Для достижения поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить морфолого-анатомическое строение растения, установить диагностические признаки сухой цельной и измельчённой травы зюзника европейского.

2. Изучить состав метаболитов травы зюзника европейского.

3. Установить критерии подлинности сырья и препарата.

4. Разработать способ получения сухого экстракта из зюзника европейского и оформить лабораторный регламент (ЛР).

5. Разработать методику количественного определения БАВ, определяющих фармакологические свойства сырья и препарата, провести валидацию методики.

6. Установить параметры оценки качества и их числовые показатели для сырья и сухого экстракта, определить сроки хранения сырья и сухого экстракта.

7. Оформить проекты нормативных и технологических документов на зюзника европейского траву и зюзника европейского экстракт сухой.

Научная новизна работы

На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностические признаки сырья - сухой цельной и измельчённой травы зюзника европейского для установления подлинности.

Определён состав фенольных соединений в траве зюзника европейского, произрастающего в Подмосковье.

Подобраны параметры технологии получения сухого экстракта из травы зюзника европейского и разработан способ его получения.

Подобраны условия проведения качественного и количественного анализа фенольных соединений в сырье: зюзника европейского травы и в экстракте сухом. Впервые разработаны физико-химические методики контроля качества, как сырья, так и субстанции.

С учётом современных требований к стандартизации лекарственного растительного сырья и экстрактам сухим разработаны критерии для установления подлинности и контроля качества сырья -травы зюзника европейского и сухого экстракта из неё.

Практическая значимость работы

На основании проведённых исследований разработаны:

- проект ФСП «зюзника европейского трава»;

- проект ФСП «зюзника европейского травы экстракт сухой». Разработан и утверждён:

- лабораторный регламент ЛР 04868244-03-2010 на производство зюзника европейского травы экстракта сухого.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

- результаты фармакогностического исследования цельной и измельченной травы зюзника европейского;

5

- результаты фитохимического изучения травы зюзника европейского и сухого экстракта из неё;

- результаты разработки технологии получения зюзника европейского экстракта сухого;

- результаты разработки методов стандартизации травы и сухого экстракта.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на симпозиуме по фенольным соединениям - 2009, г. Москва.

Связь задач исследований с проблемным планом НИР

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГНУ ВИЛАР по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской федерации на 2006-2010 гг», задание 04, шифр 13.05 «Создать лекарственные, профилактические средства и биологически активные добавки».

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, из них 3 - в печатных изданиях, рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава I), пяти глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 167 источников, в том числе 81 иностранных. Работа содержит 51 рисунок и 18 таблиц. Объём приложения - 22 страницы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Материалами для исследования служили образцы опытных партий травы зюзника европейского - Ьусори5 еигорает Ь., собранные во время цветения летом 2007-2010 гг. в Московской области (Луховицкий район, пос. Матыра, долина реки Матырки). Для изучения динамики накопления о-дифенолов в траве зюзника были дополнительно собраны образцы:

б

2 июня 2010 года, 14 июля 2010 года и 02 сентября 2010 года в фазу вегетации, цветения и плодоношения соответственно, также был собран образец сырья с побуревшими листьями (2 сентября 2010 г). Сушка травы проводилась с принудительной вентиляцией при температуре ~ 25°С. В опытах использовалось как цельное, так и измельченное сырье.

Отбор проб и анализ лекарственного растительного сырья проводили по методикам ГФ XI и разработанным нами методами качественного и количественного определения фенольных соединений.

Микроскопический анализ цельного и измельчённого сырья проводили согласно статье «Техника микроскопического анализа» ГФ XI изд., вып.1., с. 277-285 с помощью микроскопа Биолам С 11 с окуляром 15х, с объективами 40х, 20х, 10х. Фотосъёмку проводили фотокамерой Olympus Digital Camera С-310 Zoom.

Для экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «хч». Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы осуществляли согласно ГФ XI вып.1 и 2.

Тонкослойная хроматография. Для хроматографического контроля на этапах предварительной оценки элюатов, экстрактивных веществ, чистоты и сравнения с аутентичными образцами применяли метод хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Silufol UV 254» и «Sorbfil ПТСХ-ПА» размером 7x15 см. Хроматографирование выполняли при температуре (19-23) °С в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах.

Для тонкослойной хроматографии использовали систему растворителей: хлороформ-метанол (8:2), хлороформ-метанол-вода (61:32:6), толуол-этилацетат-муравьиная кислота (5:3:1). Проявление зон адсорбции проводили обработкой 1% спиртовым раствором хлорида железа (FeCl3) и 5% раствором фосфорно-молибденовой кислоты с последующим нагреванием при 100°С + 2°С в течение 2-3 минут.

Спектры ЯМР регистрировали на приборе Gemini 200 (Varían) с рабочей частотой 200 МГц (согласно ГФ XI вып. 1 с. 50), растворитель CD3OD-D20, (CD3)2SO, внутренний стандарт - тетраметилсилан.

Спектры 13С ЯМР регистрировали на приборе Gemini 200 (Varían) с рабочей частотой 100 МГц, растворитель CDC13, внутренний стандарт CDC13).

УФ спектр снимали на спектрофотометре Specord согласно ГФ XI вып.1 с.ЗЗ, в качестве сравнения использовали 40%, 98% этанол.

Исследование морфологических признаков сырья

В результате изучения внешних признаков сырья выявили следующие диагностические признаки.

Цельное сырьё. Стебель четырёхгранный, слегка ветвистый, опушённый. Расположение листьев супротивное. Листья простые, продолговато-яйцевидные, остроконечные, лишь в основании перистонадрезанные, без прилистников. Край листа крупнозубчатый. Черешок длиной 2-3 см, переходит в главную жилку листа. Цветки мелкие, образуют густые соцветия в пазухах верхних листьев, почти сидячие, вместе с листьями образуют неравные по величине подобия ложных мутовок. Чашечка колокольчатая, венчик двугубый, верхняя губа трехлопастная, белая, с размытыми красными точками, нижняя чисто белая, изнутри опушенная. Измельчённое сырьё. Кусочки стеблей, листьев, цветков, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет серовато-зеленый. Запах сильный, ароматный. Вкус горьковатый.

Микроскопическое изучение травы зюзника европейского

Стебель. Для зюзника европейского характерно типичное строение стебля семейства губоцветные. Стебель имеет четырёхгранную форму. В ходе микроскопического анализа выделены следующие диагностические признаки: эпидерма представлена клетками прямоугольной формы немного вытянутыми по длине стебля (длина - 39 мкм, ширина -13,8 мкм), покрыта мощным слоем складчатой кутикулы (рис. 1а). На поверхности расположены простые волоски крупные, многоклеточные и одноклеточные, покрытые бородавчатой кутикулой, а также головчатые волоски с 1-2 клеточной головкой и одноклеточной ножкой и желёзки (рис. 1а). Устьичный комплекс диацитного типа (рис. 16). На поперечном срезе под эпидермисом в рёбрышках видна пластинчатая колленхима с тангентально утолщенными стенками, хлоренхима с крупными межклетниками, в сырье часто образует полость под тканями ребра, эндодерма не выражена. На поперечном срезе рёбра имеют полукруглую форму. Участки перициклической склеренхимы с плотно сомкнутыми равномерно утолщенными волокнами хорошо выражены. Более мощные участки перициклической склеренхимы часто располагаются по бокам от линии оси ребра с плотно сомкнутыми волокнами. Открытые коллатеральные сосудисто-волокнистые пучки располагаются по кругу.

Крупные весенние и ранние летние сосуды кольчатые и спиральные располагаются вертикальными рядами по 4-5. Хорошо выражены трахеиды (рис. 1в).

Древесная паренхима имеет утолщенные стенки. Первичные сердцевинные лучи однорядные живые. Межпучковые сердцевинные лучи имеют утолщенные клеточные стенки. Сердцевина имеет хорошо выраженную перемедулярную зону.

• И.-.. ■

а б в

Рис. 1. Строение стебля: а - желёзка; б - диацитный устьичный комплекс; в - кольчатые сосуды и трахеиды.

Лист. У зюзника европейского лист гипостоматический, устьица располагаются с нижней стороны листа. При рассмотрении листа с поверхности клетки верхней эпидермы сильно извилистостенные, изодиаметрические (рис. 2а). Много простых волосков. Волоски толстостенные 1-3 клеточные с бородавчатой кутикулой, клетки длинные, наблюдается лёгкая суставчатость (рис. 26); эфиромасличные желёзки круглые. В головке желёзки выделяются 4-6 клеток. Головчатые волоски с одноклеточной ножкой и двухклеточной головкой.

Эпидерма нижней стороны листа мелкоклетная, устьица мелкие, слегка погруженные, имеют овальную форму, устьичный комплекс диацитного типа, клетки его сопоставимы с шириной замыкающих клеток устьица, часто соединяются с устьицем не по прямой линии. Головчатые волоски с 1-2 клеточной головкой, слегка овальной, и одноклеточной маленькой ножкой. Мощные простые 3-5 клеточные волоски, покрытые бородавчатой кутикулой имеют суставчатое сочленение клеток. Наибольшее скопление волосков отмечено вдоль жилок. Железки 4-6 клеточные. На верхушке зубчика листовой пластинки, имеющего форму клювика расположены гидатоды (рис. 2в).

Лист зюзника имеет дорзовентральное строение. Губчатую паренхиму образуют 3-4 ряда клеток округлой формы с крупными межклетниками.

9

Мезофилл состоит из 1 ряда палисадной паренхимы, занимающей 1/3 толщины листа. Жилка представлена коллатеральным сосудисто-волокнистым пучком. Сосуды жилки имеют кольчатое и спиральное утолщение. В пространстве под жилкой, до нижней эпидермы расположена уголковая колленхима с хлоропластами со слабо утолщенными стенками.

КОД л»' - 1 I '

> !!

а б в

Рис. 2. Строение листа: а - клетки верхней эпидермы; б - простой волосок верхней эпидермы; в - гидатоды нижней эпидермы.

Цветок. Наружная эпидерма лепестка имеет мелкие клетки эпидермы, покрытые складчатой кутикулой с большим количеством волосков (рис. За), диацитный устьичный комплекс. Простые волоски 2-3 клеточные, покрытые бородавчатой кутикулой. Желёзки 4-6 клеточные. Головчатые волоски с одноклеточной ножкой и двухклеточной головкой (рис. 36).

Внутренняя эпидерма лепестка часто имеет участки с сосочковидными выростами (рис. Зв). Простые волоски одноклеточные и многоклеточные, желёзки в большом количестве, расположены по всей поверхности.

Наружная эпидерма чашелистика имеет простые волоски 2-3 клеточные на многоклеточном основании, покрытые бородавчатой кутикулой, головчатые волоски, желёзки 4-6 клеточные, устьица диацитного типа.

Внутренняя эпидерма чашелистика отличается отсутствием устьиц, клетки эпидермы сильно извилистостенные. Головчатые волоски с одноклеточной ножкой и двухклеточной головкой, простые: одноклеточные и многоклеточные. У многоклеточных волосков более выражена суставчатость, чем у таких же волосков листа. Желёзки с 4-6 клеточной головкой.

а б в

Рис. 3. Строение лепестка: а - простые волоски наружной эпидермы; б - головчатые волоски наружной эпидермы; в - сосочковидные выросты внутренней эпидермы.

Измельченное сырьё. При рассмотрении измельчённого сырья, выявлены следующие диагностические признаки: кусочки эпидермы, обломки простых и головчатых волосков, железки, спиральные и кольчатые сосуды, трахеиды, клетки мезофилла, обрывки пластинчатой и уголковой колленхимы, хлоренхимы, перициклической склеренхимы.

Изучение метаболома травы зюзника европейского

Измельчённое сырьё (2.526 кг) трёхкратно экстрагировалось 40% спиртом при комнатной температуре. Объединённые водно-спиртовые извлечения упаривали до полного удаления спирта. Водную фазу экстракта (700 мл) обрабатывали последовательно хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом по 3 раза. Растворители из каждой фракции упарили.

Изучение химического состава этилацетатной фракции

Упаренную этилацетатную фракцию 2 г, хроматографировали на колонке с силикагелем 40/100 ¡i, промытым 5% водным раствором соляной кислоты для удаления следов железа. Элюент - смесь хлороформа и метанола 8:2, для рехроматографирования применяли ту же смесь с ростом градиента метанола.

Выделенные соединения принадлежат к двум группам фенольных соединений - фенилпропаноидам I, II, VI, VIII (розмариновая кислота (рис. 46), метиловый эфир розмариновой кислоты, кофейная кислота (рис. 4а), этиловый эфир кофейной кислоты) и флавоноидам IV, V, VII

(5,3\4'-тригидрокси-6,7-диметоксифлавон, апигенин, лютеолин), а также протокатеховый альдегид (УФ спектр: 232, 280, 314 нм; 251, 289 нм). Данные 'Н-ЯМР спектров и их интерпретации приведены табл.1 и 2.

Рис.4. 'Н ЯМР спектр(С03(Ж, 0-ТМС, 200 МГц): а - кофейной кислоты (VI); б - розмариновой кислоты (I).

Вещества IV, V, и VII — производные флавона идентифицированы с 5,3\4л-тригидрокси-6,7-диметоксифлавоном, апигенином и лютеолином

(УФ спектр VII: ?чпах 256, 268, 354 нм; ).т]П 237, 299 нм). Для определения положения метокси-групп в IV проведено сопоставление данных 'Н-ЯМР спектров с изомерными веществами (табл. 2) и Т пл. IV совпадает только с Т пл. идентичного по строению цирзилиола.

Изучение химического состава н-бутанольной фракции

Упаренную н-бутанольную фракцию хроматографировали на колонке с силикагелем 40/100ц, промытым 5% водным раствором соляной кислоты для удаления следов железа. Элюирование проводилось смесью хлороформ - метанол в градиентном и изократическом режимах смесью хлороформ - метанол - вода 61:32:6 и 47:47:6 до 66 фракции.

В результате многократного рехроматографирования выделены вещества IX-XII. Вещество IX идентифицировано, по данным 'Н ЯМР, 13С ЯМР спектров и Т плавления = 222-224 °С, с мезоинозитом.

*Н ЯМР спектр: 4,00 м.д., триплет, Ju = J1-6 = 2,7 Гц, 1Н (Н-1); 3,62 м.д., триплет, J3 2 = 1з,4= J4,5= Js,6 = 9,2 Гц, 2Н (Н-3 и Н-5); 3,45 м.д. дублет дублетов, J2ji = J6,i = 2,7 Гц, 12,з= 1б,5= 9,2 Гц, 2Н (Н-2 и Н-6); 3,22 м.д., триплет, J4i3 = J4i5 = 9,2 Гц, 1Н (Н-4). В соответствии со структурой мезоинозита в спектре Н, Н COSY присутствуют кросс-пики 4,00/3,45 м.д. и 3,62/3,22 м.д., а в спектре 13С ЯМР сигналы 76,45 м.д.

(С-1),74,43 м.д. (С-2 и С-6), 74,22 м.д. (С-4), 73,31 м.д. (С-3 и С-5).

Вещества X, XI и XII по данным 'Н ЯМР, УФ спектров и молекулярных пиков в масс спектрах (табл. 3) идентифицированы с метиловым эфиром лютеолин-7-глюкуронида, этиловым эфиром лютеин-7-глюкуронида и этиловым эфиром апигенин-7-глюкуронида.

Изучение химического состава водной фракции

Из упаренной водной фракции колоночным хроматографированием на полиамиде выделена глюкоза, идентифицированная по данным 'Н ЯМР спектра.

Водно-спиртовые фракции содержали сложную смесь веществ. Характерной особенностью 'Н ЯМР спектра глюкозы является наличие двух сигналов аномерных протонов: А5 5.15 и 4.65 м.д. (аир изомерные конфигурации).

Согласно литературным данным наличие глюкозы является характеристическим признаком экстрактов из надземной части растения.

Изучение динамики накопления о-дифенолов в траве зюзника

При получении из травы зюзника европейского лекарственного препарата антитиреоидного действия - сухого водно-спиртового экстракта - представляется необходимым определение времени сбора сырья, когда содержание в нём орто-дифенольных производных достигает максимального значения.

Данные 'Н ЯМР спектров фенилпропаноидных соединений и протокатехового альдегида травы зюзника европейского.

Соединения

Параметры и отнесения сигналов: 8 м.д.; ] Гц II этиловый эфир кофейной кислоты VI кофейная кислота I розмариновая кислота VIII метиловый эфир розмариновой кислоты III протокатеховый альдегид

1 2 3 4 5 6

Формулы V 1 н & у он он н с=1р—соон 1 н & ^г^ он он н <^оон он он н сросн, он он н 1 с=о б. он он

Н-2 7.05,д, 2.3 Гц 7.03,д, 2 Гц 7.05,д, 1.9 Гц 7.06, д, 2 Гц 7.29,д, 2.3 Гц

Н-5 6.85,д, 8.6 Гц 6.77,д, 8.2 Гц 6.78,д, 8.3 Гц 6.78,д, 8.2 Гц 6.90, д, 8.6 Гц

Н-б 6.95, дд, 8.6 Гц, 2.3 Гц 6.93, дд, 8.2 Гц, 2 Гц 6.96, дд, 8.3 Гц, 1.9 Гц 6.96, дд, 8.2 Гц, 2 Гц 7.31,дд, 8.6 Гц, 2.3Гц

а 6.23, д, 16 Гц 6.22, д, 16 Гц 6.28, д, 15.9 Гц 6.27, д, 15.9 Гц ----------

Р 7.55, д, 16 Гц 7.53,д, 16 Гц 7.55, д, 15.9 Гц 7.56. д, 15.9 Гц -------

Н-2' 6.76, д, 1.9 Гц 6.72, д, 2 Гц .........

Н-5- -------- 6.69, д, 8.1 Гц 6.70, д, 8.2 Гц

Н-б' --------- --------- 6.62, дд, 8.1 Гц, 1.9 Гц 6.57,дд, 8.2 Гц, 2 Гц ----------

а' -------- -------- 5.19, дд, 7.9 Гц, 4.6 Гц 5.2, м ---------

Р- 3.10, дд, 14.2 Гц, 4.6 Гц; 2.99, дд, 14.2 Гц, 7.9 Гц 3.05,д -------

СООСНз ------- --------- 3.71, с --------

соос,н3 4.25, к, 7 Гц, 1.32, т, 7 Гц ---------- -------- ----------

сн=о ---------- ------- ------ ------ 9.69, с

Данные 'Н -ЯМР и УФ спектров производных флавона из травы зюзника европейского и литературные (5-8).

Соединение

Параметры и отнесения сигналов: б м.д.; J Гц. IV (DMCO-d6) 5,3',4'-тригидрокси-6,7-диметоксифлавон V (CD3-OD) апигенин VII (DMCO-d6) лютеолин 5,7,3'-тригидрокси-6,4'-диметокси-флавон (DMCO-d6) 5,7,4'-тригидрокси-6,3'-диметокси-флавон (DMCO-d6) 5,6,3'-тригидрокси-7,4'-диметокси-флавон (DMCO-d6) 5,6,4'-тригидрокси-7,3'-диметокси-флавон**

1 2 3 4 5 6 7 8

Формулы он "VrV©- »YY ш о ¿и ° он но. л о /тК кТ.лГ^"0"' ОН 0 ОН МвО. ^о^ /тт\ 01 он ° МїО -y^V i ^ ю JI он °

Н-6 ------- 6.21, д, 2.1 Гц 6.21, д, 2.1 Гц .. ----

Н-8 6.91,с 6.46,д, 2.1 Гц 6.47,д, 2.1 Гц 6.73,с 7.25,с 6.9,с 6.78,с

Н-3 6.77,с 6.61,0 6.70,с 6.58,с 6.58,с 6.7,0 6.56,с

Н-2' 7.46,д, 2.4 Гц 7.86, а* 7.42,д, 2.1 Гц 7.41,д, 2 Гц 7.45,д 7.5,д 7.3,д, 2 Гц

Н-5' 6.92,д, 8.2 Гц 6.93,д*. (Н-З+Н-5) 6.91 ,д, 8.4 Гц 7.09,д, 8.2 Гц 7.12,д, 8.0 Гц 7.1, д, 9 Гц 6.94,д, 8 Гц

Н-6' 7.48,дд, 8.2 Гц, 2.4 Гц 7.86,д* 7.45,дд, 8.4 Гц, 2.1 Гц 7.52, дд, 8.2 Гц, 2 Гц 7.45,дд 7.5, дд 7.48, дд, 8 Гц, 2 Гц

ОСИ, 3.95, с, 3.75,с (по 3 Н) 3.90,с (6Н) 3.88,0 (6Н) 4.00, с (6Н)

5 ОН 12.45,с -------- 13.7 ----- -------

УФ спектр, Хтах,нм ЕЮН Хтах: 257,273, 350 ЕЮН Хтах: 256,268, 354 Хтах: 273, 342 ------ МеОН Хтах: 232, 253, 285, 340 ЕЮН Хтах: 284, 344

Т пл., °С 274-277 --------- --------- 269-270 227-228,219-221 245-247 248-250

* - Сложный мультиплет, вырожденный до дублета, ** - '[І-ЯМР спектр приведён для 6-глюкозида, УФ и Т пл. - для агликона.

Таблица 3.

Данные 'Н ЯМР спектров, масс спектров и УФ спектров глюкуронидов флавоноидов зюзника.

Соединение

Параметры и отнесения сигналов: 8 м.д.; J Гц. X метиловый эфир лютеолин-7-глюкуронида XI этиловый эфир лютеолин-7-глюкуронида XII этиловый эфир апигенин-7-глкжуронида

1 2 3 4

Формулы QH _.он Vv^ снп--1«.- ОН ° <зн /0н Iii ILaj ^ с,н,о-Ц, он 0 QH ноЗУ уцг^ C;!LO А>0 ОН О

Н-б 6,49 д, 2,1 Гц 6,49 д, 2,0 Гц 6,49 д, 2,1 Гц

Н-8 6,77 д, 2,1 Гц 6,79 д, 2,0 Гц 6,81 д, 2,1 Гц

Н-3 6,62 с 6,63 с 6,69 с

Н-2' 7,42 д, 2,2 Гц 7,42 д, 2,2 Гц 7,91 д*

Н-3' -------- 6,94 д*

Н-5' 6,90 д, 8,2 Гц 6,92 д, 8,0 Гц 6,94 д*

Н-б' 7,43 дд,8,2 Гц, 2,2 Гц 7,43 дд, 8,0 Гц, 2,2 Гц 7,91 д*

Н-Г' 5,18 д, 6,9 Гц 5,2 д, 6,3 Гц 5,2 д, 6,8 Гц

Н-2" 3,52 м 3,5 м 3,55 м

Н-4" 3,61 м 3,6 м 3,65 м

Н-5" 4,17 д, 9,2 Гц 4,17 д, 9,3 Гц 4,18 д, 9,3 Гц

СООСНз 3,8 с --------

СООС2Н5 --------- 1,30 т, 7,8 Гц; 4,26 к, 7,8 Гц 1,30 т, 7,7 Гц; 4,25 к, 7,7 Гц

Масс спектр: m/z пика молекулярного иона 476,09 490,1 474,11

УФ спектр, 1шах,нм 251,4; 270,0; 287,0; 341,1 251,4; 270,0; 287,0;341,1 264,5; 333,8

* - система АА'ВВ'

Образцы травы зюзника европейского собраны 2 июня 2010 года, 14 июля 2010 года и 02 сентября 2010 года в фазу вегетации, цветения и плодоношения соответственно. Дополнительно был собран образец сырья с побуревшими листьями (2 сентября 2010 г).

Спектры 'Н ЯМР получены в растворе С0300-020 с концентрацией раствора экстрактов - 6 %, спектры записаны в одинаковых условиях.

Основным фенольным соединением водно-спиртового экстракта травы зюзника является розмариновая кислота, о чём свидетельствует наличие в 'Н ЯМР спектре суммарного экстракта интенсивных характеристических сигналов фрагмента - СН=СН- с трансконфигурацией протонов (дублеты при 6,3 м.д. и 7,5 м.д., 1=16 Гц).

Данные 'Н ЯМР спектров также свидетельствуют о максимальном содержании основного фенольного компонента, розмариновой кислоты в экстракте, полученном из сырья, собранного в фазу цветения (рис. 56) и минимальным - в фазу вегетации (рис. 5а).

Рис. 5. 'Н ЯМР спектры сухих экстрактов из травы зюзника европейского:

а - сбор травы 09. 06. 2010, б - 14. 07. 2010, в - 02. 09. 2010, г - 02. 09. 2010, побуревшая трава (200 МГц, СБзОЭ, 0-тетраметилсилан).

В фазу плодоношения (начало сентября) в траве зюзника наблюдается снижение содержания фенольных компонентов по сравнению с фазой цветения, но это значение не достигает уровня содержания в фазу вегетации. В фазу плодоношения наблюдается побурение старых листьев. Содержание суммы фенолов в бурых образцах почти наполовину меньше, чем в зелёных.

Данные 'Н ЯМР спектра свидетельствуют о наличии в образце артефактов в результате процессов окисления. Следовательно, следует нормировать содержание побуревших частей растений в сырье.

Количественное соотношение розмариновой кислоты для июньского, июльского и сентябрьского образцов и сентябрьского образца с побуревшими листьями составляет 1:6,6:2,6:2. Следовательно, оптимальный сбор сырья - фаза цветения (июль).

Анализ приведённых 'Н ЯМР спектров показывает также, что в фазу вегетации в сырье минимально не только содержание розмариновой кислоты, но и глюкозы (дублеты 5.2 м.д. - а форма, и 4.6 м.д. р форма).

Данные дифференциальных УФ спектров растворов сухих экстрактов травы зюзника одинаковой концентрации с добавлением хлорида алюминия подтверждают вывод об оптимальном сроке сбора растительного сырья. Значения процентного содержания располагаются в порядке увеличения в зависимости от сроков сбора растительного сырья следующим образом: июнь, сентябрь, июль (2,39%; 3,43%; 4,8%). Эти данные легли в основу написания инструкции по сбору и сушке травы зюзника.

Разработка показателей подлинности и контроля качества

сырья - травы зюзника европейского

Метод ТСХ. Путём сопоставления хроматографического поведения со стандартным образцом (СО) в траве зюзника европейского идентифицировали розмариновую кислоту.

Для обнаружения розмариновой кислоты нами были использованы пластинки силуфола и сорбфила, в качестве подвижной фазы использованы 2 системы: хлороформ-метанол (8:2), хлороформ-метанол-вода (61:32:6). Проявление зон адсорбции проводили 5% спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты с последующим нагреванием до 100°С ± 2°С и 1 % спиртовым раствором хлорида железа (III). Зоны адсорбции на хроматограммах испытуемых образцов

оценивали в сравнении со стандартным образцом розмариновой кислоты (Sigma-Aldrich № 536954-5G).

Метод количественного определения

фенольных соединений в зюзника европейского травы

На основании результатов изучения химического состава травы зюзника европейского был разработан метод количественного определения суммы фенолов в пересчёте на розмариновую кислоту с помощью дифференциальной спектрофотометрии с использованием комплексообразования о-дифенолов с хлоридом алюминия.

Содержание суммы фенольных соединений в пересчёте на розмариновую кислоту (X) и абсолютно сухое сырьё в процентах вычисляют по формуле:

A-10-25-S0-100 100 _ А-1250 100 а-1-26М000 '(100-Ж)" 261-а "(100-00

Где А - оптическая плотность комплекса о-дифенолов испытуемого раствора с А1С13 (X 368 нм), 261 - удельная оптическая плотность комплекса PCO розмариновой кислоты с А1С13 (X 368 нм) а - масса навески травы зюзника, г W - потеря в массе при высушивании, %

Сравнение накопления о-дифенолов в листьях и стеблях зюзника

Проведен сравнительный анализ накопления о-дифенолов отдельно в листьях и стеблях зюзника европейского, собранного в июле 2007 г. в Московской области, изложенным выше методом дифференциальной спектрофотометрии.

Установлено, что содержание фенольных соединений в листьях в 2,09 раз превышает содержание в стеблях, следовательно, при заготовке сырья травы зюзника европейского, следует нормировать количество стеблей.

Обоснование номенклатуры и норм числовых показателей

Выбор номенклатуры числовых показателей и установление их норм произведены в соответствии с требованиями ГФ XI к оформлению НД на лекарственное растительное сырьё на основании результатов анализа 5 опытных партий зюзника европейского травы.

19

Установлены следующие нормы числовых показателей для цельного сырья: суммы фенольных соединений в пересчёте на розмариновую кислоту не менее 0,5 %; потеря в массе при высушивании не более 12%; содержание золы общей не более 11 %; содержание золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной не более 2 %; содержание побуревших частей растения не более 0,5 %; кусочков стеблей, в том числе отделённых при анализе, не более 35%; содержание органической примеси не более 0,5 %, минеральной не более 0,5%.

Для измельчённого сырья также регламентируется содержание: частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм, не более 10 %; частиц проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм, не более 10%.

Рекомендуемый срок хранения травы зюзника европейского -2,5 года.

На основании проведённых исследований разработан проект ФСП на лекарственное сырьё «Зюзника европейского трава».

Разработка способа получения сухого экстракта из травы зюзника европейского

Для проведения эксперимента по определению оптимальных условий экстракции была составлена матрица, учитывающая действия нескольких факторов: 1) время I экстракции шах 18 часов; min 3 часа; 2) время II экстракции шах 3 часа; min 2 часа; 3) время III экстракции шах 3 часа; min 2 часа; 4) соотношение объёма растворителя и массы сырья: 8:1; 10:1; 5) степень измельчения сырья (размер частиц): до 1-2 мм; до 3 мм; 6) способ экстракции: настаивание; перемешивание; 7) кратность экстракции: 1; 2; 3.

Температура процесса и растворитель не варьировались, т.к. эти параметры фиксированы при выборе фармакологами объекта антитире оидного действия - зюзника европейского травы экстракта сухого, полученного экстракцией 40° спиртом при комнатной температуре. В качестве параметра оптимизации было взято процентное соотношение содержания фенольных компонентов в экстрактах и содержания в сырье.

Значимыми параметрами экстракции являются кратность экстракции, время первой экстракции, соотношение объёма растворителя и массы сырья и степень измельчённости сырья.

Суммируя полученные данные, мы избрали следующие параметры экстракции: 1) экстрагент 40° этиловый спирт; 2) экстракция трёхкратная; 3) соотношение массы сырья и объёма экстрагента 1:10; 4) время первой экстракции 4 часа; 5) время второй экстракции 3 часа; 6) время третьей экстракции 2 часа; 7) температура комнатная; 8) экстракция с перемешиванием; 9) размер частиц до 3 мм.

При непрерывном процессе третий экстракт подаётся на свежую порцию сырья. Объединённые первый и второй экстракты упариваются при температуре (50±2) °С до ~ 4% исходного объёма. Для получения экстракта сухого использовали сырьё с содержанием экстрактивных веществ 15%, фенольных соединений в пересчёте на розмариновую кислоту 0,94%, влажности 8,57 %, собранные в Московской области. Выход готового продукта 15,71% от массы сырья с содержанием фенольных компонентов в пересчёте на розмариновую кислоту 5,31 %■ Выход суммы фенольных соединений от их содержания в сырье 89,9%. Проведено 3 балансовых загрузки.

Изложение технологического процесса получения сухого экстракта зюзника европейского

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА.

Спирт этиловый

ТП 2.3

ТП 2.4

Вода дистиллированная

ТП Приготовление 40 0 Измельчение

2.1. спирта и экстракция —і 1 растительного

сырья сырья

Ш

2.2.

Слив и фильтрация экстракта

Упаривание экстракта

Сушка экстракта

ТИ

2.5

Измельчение сухого экстр акта

ТП. Получение

2 готового

продукта

УМО Фасовка, упаковка,

маркировка зюзника

европейского травы

экстракта сухого

21

Потери

Шрот

в сборник на выброс

Отгон спирта

Отфильтрованные частицы сырья с ТП 2.2

в сборник но выброс

Потери

і сборки*

Разработка показателей качества

зюзника европейского экстракта сухого

Для установления подлинности сухого экстракта предусмотрено проведение качественных реакций на наличие основной группы биологически активных веществ: фенольных соединений. В колбу вместимостью 50 мл помещают навеску 0,025 г сухого экстракта, прибавляют 25 мл спирта этилового 40% и растворяют при периодическом помешивании. К полученному раствору добавляют 0,2 мл 1% спиртового раствора FeCl3, появляется серо-зелёное окрашивание раствора.

Тонкослойная хроматография со стандартным образцом позволяет установить присутствие основного представителя фенольных соединений

- розмариновой кислоты в зюзника европейского экстракте сухом.

Для обнаружения розмариновой кислоты нами были использованы пластинки «Сорбфил» ПТСХ-ПА (силикагель СТХ-1А; зернение 5-17; толщина слоя 110 мкм) размером 10x15 см, в качестве подвижной фазы использована система: толуол - этилацетат - муравьиная кислота (5:3:1). Проявление зон адсорбции проводили 5% спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты при нагревании до 100°С ± 2°С и 1% спиртовым раствором хлорида железа (III) в 95% этиловом спирте с последующим нагреванием при 110°С в течение 15 минут. На пластинке проявляется зона испытуемого экстракта тёмного цвета с Rf ~ 0,23 (Rs=l) и зона адсорбции раствора стандартного образца розмариновой кислоты тёмного цвета с таким же Rf (~ 0,23). На хроматограмме сухого экстракта травы зюзника допускается наличие других пятен. Rs - рассчитано относительно зоны адсорбции розмариновой кислоты Rf (~ 0,23).

На хроматограмме зона адсорбции раствора стандартного образца розмариновой кислоты должно иметь Rf=R_L=0,23±0,03 (не менее 0,20 и не более 0,26). R2

1II ЯМР спектр 5% раствора сухого экстракта в смеси растворителей CD3OD и D20 2:1 (0- сигнал тетраметилсилана, 200 МГц) должен содержать:

- дублеты 6.3 м.д. и 7.5 м.д. (розмариновая кислота),

- группа мульти етов в области 3.4 - 4.2 м.д. (углеводы),

- дублеты 5.2 м.д. и 4,6 м.д. (глюкоза, а и (3-формы) (рис. 56).

УФ спектр 0,005% раствора сухого экстракта в области длин волн от 220 до 350 нм имеет максимумы поглощения 283(±2 нм) и 321 (±2 нм).

22

Потеря в массе при высушивании. Не более 5% (ГФ XI, вып.2, с. 161). Сульфатная зола. Не более 0,1% (ГФ XII, ч.1, с. 115). Тяжелые металлы. Не более 0,01% (ГФ XII, ч.1, с.121). Микробиологическая чистота. Испытания проводят в соответствии с требованиями ГФ XII, ч.1, с.92 (категория 3.2).

Разработка метода количественного определения фенольных соединений

Используя свойство фенольных соединений с ортодигидроксигруппами образовывать комплексы с солями алюминия, мы разработали спектрофотометрический метод количественного определения общей суммы фенольных соединений в суммарном сухом экстракте травы зюзника в пересчёте на розмариновую кислоту. В методе используется дифференциальная УФ спектроскопия. Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на розмариновую кислоту (X) и абсолютно сухое вещество в процентах вычисляют по формуле:

Х= А-10-100-25-100 Ю0 _ А-500 100

O-261-5-I000 '(100-W) ~ 261-я '(100-W)

Где А - оптическая плотность комплекса о- дифенолов испытуемого раствора с А1С13 (X 368 нм); 261 - удельная оптическая плотность комплекса PCO розмариновой кислоты А1С13 (X 368 нм); а - масса навески сухого экстракта, г; W - потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на розмариновую кислоту и абсолютно сухой экстракт должно быть не менее 3,5%.

ВЫВОДЫ

1. Установлены морфолого-анатомические диагностические признаки зюзника европейского.

2. Изучен метаболом зюзника европейского. Выделено и идентифицировано 14 индивидуальных соединений с использованием физико-химических методов анализа.

3. Разработана методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчёте на розмариновую кислоту с

23

использованием метода дифференциальной спектофотометрии в траве зюзника европейского. Установлена норма содержания фенольных соединений в пересчёте на розмариновую кислоту не менее 0,5 %.

4. На основании проведённых исследований разработан проект ФСП на лекарственное сырьё «Зюзника европейского трава».

5. Установлены основные параметры экстракции фенольных соединений, позволяющие получить готовый продукт со стабильными показателями качества. Разработан и утверждён JIP 04868244-03-2010 на производство зюзника европейского травы экстракта сухого.

6. Определены показатели качества и критерии подлинности зюзника европейского травы экстракта сухого. Разработана валидированная методика количественного определения содержания фенольных соединений в пересчёте на розмариновую кислоту в сухом экстракте с использованием метода дифференциальной спектрофотометрии. Установлена норма содержания фенольных соединений в пересчёте на розмариновую кислоту не менее 3,5 %.

7. На основании проведённых исследований составлен проект ФСП «Зюзника европейского травы экстракт сухой».

8. Разработан проект инструкции по сбору и сушке сырья - трава зюзника европейского.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. H.A. Монастырева, A.A. Савина, В.А. Шейченко и др. Фенольные соединения зюзника европейского // Материалы симпозиума по фенольным соединениям.-М., 2009. - С. 177-179.

2. H.A. Шелухина, A.A. Савина, В.А. Шейченко, Т.А. Сокольская, В.А. Быков. Изучение химического состава зюзника европейского (Lycopus europaeus L) // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - Москва, 2010. - Вып.11. - С.7-11.

3. H.A. Шелухина, A.A. Савина, В.А. Шейченко, В.И. Осипов, Т.А. Сокольская, В.А. Быков, О.Ф. Лаская. Изучение химического состава травы зюзника европейского (Lycopus europaeus L) II // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - Москва, 2011. - Вып.З. - С.6-9.

4. И. А. Кирьянова, Н. А. Шелухина, Л. Н. Зайко, А. А. Савина, В. И. Шейченко, Т. А. Сокольская, В. А. Быков, О. Ф. Ласская. Изучение динамики накопления о-дифенолов в траве зюзника европейского (ЬусориБ еигораеиэ Ь.), семейство губоцветные -ЬаЫа1ае // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - Москва, 2012. - Вып. 1. - С. 144-147.

Подписано в печать: 20.02.2012 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 52 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, д. 6, стр. 1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru