Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение свойств естественного ингибирующего фактора и путей коррекции иммунопатологии, обусловленной его гиперфункцией

РГВ од

10 №003 На правах рукописи

РОДОССКАЯ Нонна Кирилловна

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЕСТЕСТВЕННОГО ИНГИБИРУЮЩЕГО ФАКТОРА И

/

ПУТЕЙ КОРРЕКЦИИ ИММУНОПАТОЛОГИИ, ОБУСЛОВЛЕННОЙ ЕГО

ГИПЕРФУНКЦИЕИ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Воронежской государственной медицинской академии имени Н.Н. Бурденко

Научный консультант: доктор медицинских наук Журавлева Нина Васильевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Романов Виталий Александрович доктор медицинских наук профессор Несвижский Юрий Владимирович доктор медицинских наук Снимщикова Ирина Анатольевна

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет

Защита состоится 15 мая 2003 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.01 при Курском государственном медицинском университете по адресу: 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Курского государственного медицинского университета

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. К настоящему времени патогенез вторичных иммунодефицитов изучен в недостаточной степени. Продолжается исследование при различных патологических состояниях иммуносу-прессивного эффекта субпопуляций Т-лимфоцитов, цитокинов (В.В. Чиркин и соавт., 1999; A.C. Симбирцев, 1999; P.M. Хаитов, 2000), подклассов иммуноглобулинов, механизмов естественной гибели клеток - апоптоза (А.Н. Чередеев, JT.B. Ковальчук, 1997; Р.И. Сепиашвили и соавт., 2000; С.Г. Аббасова и соавт., 2000).

Несомненный интерес для понимания патогенеза вторичных иммунодефицитов представляют исследования компенсаторных и адаптационных реакций, но не только внутри иммунной системы, а с учетом всех ее непосредственных межсистемных связей. При этом изменения иммунного статуса должны рассматриваться в единой взаимосвязанной реакции нервной и эндокринной систем (A.A. Зозуля, Э. Пацакова, 1986; А.Т. Гречко, 1998; A.M. Василенко, Л.А. Захарова , 2000; А.Д. Ноздрачев и соавт., 2000; Н. Imura, J. Fukata, 1994; Е. Peyron, 1999), метаболического статуса, а не как изолированный дисбаланс только одной иммунной системы (В.В. Абрамов, Т.Я. Абрамова ,1996; A.M. Земсков и соавт.,1999; R. Dantzer, 1997; Shao-Guang Fan, Gui-Feng Ding, 1999). Только при таком подходе могут быть найдены эффективные способы лечения и профилактики вторичных иммунодефицитов.

Все системы иммунного гомеостаза в нормальных условиях находятся между собой в сложных, упорядоченных взаимодействиях. Воздействие на иммунный гомеостаз повышенных функциональных нагрузок ведет к напряженной работе механизмов саморегуляции и далее - к развитию компенсации (восстановлению нарушенного равновесия) или же - к суб- и декомпенсации (Б.Б. Першин , 1994; А.П. Колесников и соавт., 2001).

В свете вышесказанного большой интерес представляет изучение механизмов подавляющего действия на образование антител естественного гуморального фактора, отличительной чертой которого является ингибирование активности циркулирующих в крови макромоле-кулярных (Ig М) антител различной специфичности (Г.М. Фаустова, 1973; М.В. Земсков, Н.В. Журавлева, 1977; М.В. Земсков и соавт., 1977; А.Н. Горяйнова, Н.В. Журавлева, 1982).

Естественный ингибирующий фактор занимает совершенно особое положение в системе регулирующих и супрессорных механизмов. Активность естественного ингибирующего фактора (ЕИФ) связана с увеличением в крови концентрации аминокислоты цистеина, активных сульфгидрильных групп (Н.В. Журавлева, Н.В. Лобеева, 1978; Н.К. Родосская, 1986). При этом ингибирующей активностью по отношению

к макромолекулярным антителам обладает как цельная сыворотка, та] и альбуминовая фракция сывороточных белков (Н.В. Журавлева, 1979). Установлено, также, что выработка ЕИФ в организме экспери ментальных животных стимулируется как антигенными, так и неанти генными воздействиями. Функционирование ЕИФ в организме в фи зиологических условиях продолжается 10-14 дней и несет гомеостати ческую функцию, регулируя уровень макроглобулинов. Однако, про должающееся циркулирование ЕИФ ведет к развитию иммунологиче ской недостаточности, снижая интенсивность образования антите] (Н.К. Родосская, 1982, 1986). Было высказано предположение об уча стии определенных этапов тиол-дисульфидного обмена в регуляцш иммунного гомеостаза (Н.К. Родосская, 1986; Н.В. Журавлева, Н.К Родосская, 1988;).

Исследованиями различных авторов показана широкая распро страненность естественного ингибирующего фактора у больных с раз нообразной патологией и значение его определения для прогнозирова ния течения заболевания. Так, ингибирующая активность сыворотю крови выявляется у больных с хроническими нагноительными заболе ваниями бронхо-легочной системы в 91,8% случаев (П.И. Кошелев i соавт., 1982; В.М. Провоторов, Е.Ю. Солодовникова, 1985; В.А. Орло ва, Г.А. Трубников, 1993); у детей с хроническим пиелонефритои (В.П. Ситникова и соавт., 1982); у больных с рожистым воспаление» (часто рецидивирующее течение) (В.М. Фролов и соавт., 1985); остры» инфарктом миокарда (A.A. Ступницкий и соавт., 1985), тяжелым па родонтитом (JI.A. Малиновская и соавт., 1987), у больных сифилисов (Т.М. Бахметьева, 1987, 1989) , у женщин с осложненным течением бе ременности (О.Б. Мамнев, 1993); при механической травме и анаэроб ной газовой инфекции в эксперименте (A.A. Шепелев, 1995).

Таким образом, результаты клинических исследований свиде тельствуют о частом выявлении ЕИФ у пациентов с различными забо леваниями, что сопровождается развитием вторичного иммунодефи цитного состояния.

В доступной нам литературе не содержатся сведения о механизм! супрессивного действия естественного ингибирующего фактора на об разование антител; нет также сведений о способах, с помощью кото рых можно инактивировать ЕИФ.

Однако, решение этих вопросов имеет большое практическое зна чение для разработки методов коррекции вторичного иммунодефицит ного состояния, вызываемого ЕИФ, у больных с различной патологией В теоретическом плане полученные результаты будут способствоват расширению наших представлений о межсистемных механизмах регу ляции иммунологического гомеостаза.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательски работ Воронежской государственной медицинской академиии им. Н.Е

Бурденко в рамках проблемной комиссии "Физиологические механизмы резистентности организма" НИИЭМ АМН СССР (№ гос. регистрации 01.850077577; дата регистрации 23.10.85 г.).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель исследования состояла в том, чтобы на экспериментальных моделях in vivo и in vitro установить патогенетические механизмы развития иммуносупрессии, обусловленной функционированием в организме естественного фактора, подавляющего активность циркулирующих макромолекулярных (Ig М) антител, а также разработать способы коррекции иммуносупрессии данного гене-за.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Исследовать патогенетические механизмы иммуносупрессив-ного эффекта естественного ингибирующего фактора:

- его влияние на мобильность мембранных иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов;

- влияние ЕИФ на клеточные механизмы регуляции иммуногенеза.

2. Изучить влияние веществ, индуцирующих ингибирующую активность сыворотки крови (цистеина и унитиола), на мобильность мембранных рецепторов В-лимфоцитов, клеточные механизмы регуляции иммуногенеза.

3. Исследовать взаимосвязь гормона кортизола и ингибирующей активности сыворотки крови.

4. Экспериментально разработать методы коррекции иммуносупрессии, обусловленной функционированием ЕИФ:

- обосновать использование гипербарической оксигенации в качестве средства, инактивирующего ЕИФ;

- обосновать применение сывороточного альбумина с целью инактивации ЕИФ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые удалось установить механизм развития иммуносупрессии, обусловленной функционированием в организме ЕИФ. Свое супрессивное действие на антителообра-зование естественный ингибирующий фактор осуществляет путем противодействия мобильности мембранных иммуноглобулиновых рецепторов, а именно - формированию "кэпов ". Этим влиянием на рецеп-торный аппарат лимфоцитов ЕИФ предотвращает дифференцировку В-лимфоцитов в антителообразующие клетки. Этот механизм лежит в основе супрессивного действия ЕИФ на различных этапах антителогене-за (в индуктивную и продуктивную его фазах). Кроме того, при функционировании ЕИФ в организме отмечается снижение индекса иммунологической регуляции Fcp /Fey. Полученные результаты показыва-

ют, что ЕИФ является одним из факторов "позднодействующей" супрессии.

Впервые показано, что сывороточный альбумин, как участник ти-ол-дисульфидного обмена, является не только носителем, но и инакти-ватором ингибирующей активности сыворотки крови.

Впервые показано, что кислород под повышенным давлением, как оксидант, является инактиватором ингибирующей активности сыворотки крови.

Впервые показана возможность индуцирования ингибирующей активности сыворотки крови с помощью парентерального введения i организм гидрокортизона, а также - дозозависимость этого эффекта. Функционирование естественного ингибирующего фактора подчиняется регуляторным влияниям нейрогормональных механизмов стресс -реакции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Результаты исследований раскрывают механизм иммуносупрессивного действия естественного ингибирующего фактора. Это имеет большую практическую ценность, так как позволяет своевременно диагностировать данный вид вторичной иммунологической недостаточности, возникающий npi: длительном функционировании ЕИФ в организме и который, как показывают клинические исследования, широко распространен у пациентоЕ с различной патологией.

Разработана экспериментальная модель коррекции иммуносу-прессии, вызываемой ЕИФ, с помощью гипербарической оксигена-ции.

Разработана экспериментальная модель коррекции иммуносу-прессии, вызываемой ЕИФ, с помощью парентерального введения гомологичного альбумина.

Разработана экспериментальная модель воспроизведения иммуносупрессивного действия ЕИФ с помощью соединений, которые содержат активные сульфгидрильные группы - цистеина и унитиола.

Разработана экспериментальная модель индуцирования ингибирующей активности сыворотки крови с помощью парентерального введения животным гидрокортизона.

РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. Результать проведенного исследования зарегистрированы как научное открытие № А-171 (Н.В. Журавлева, Н.К. Родосская "Явление снижения интенсивности образования антител в организме млекопитающих под действием естественного ингибирующего фактора", 1998).

По материалам работы оформлены два изобретения: "Способ по вышсния резистентности организма, A.C. № 1264427, 1986г. (соавторь Н.В.Журавлева, А.Н.Леонов, С.Я.Дьячкова) и "Способ инактиваци*

естественного ингибирующего фактора", A.C. № 1802326, 1992г. (соавтор Н.В.Журавлева).

Полученные данные послужили основой для разработки методических рекомендаций МЗ РСФСР "Реакция ингибирования активности антител (РИА) в диагностике вторичного (или временного) иммунодефицита" (1989 г.).

В ходе проведения научных исследований созданы методики, признанные рационализаторскими предложениями:

1. Способ индуцирования ингибирующей активности сыворотки крови № 1114 (18.03.1988г.).

2. Способ индуцирования ингибирующей активности сыворотки крови № 1120 (25.04.1988г.).

Результаты работы по диагностике и коррекции вторичного им-мунодефицитиого состояния, вызванного ЕИФ, а также - по индуцированию ингибирующей активности сыворотки крови у больных с аутоиммунной патологией, внедрены в практическую работу иммунологической лаборатории и врача - клинического иммунолога поликлиники № 4 г. Воронежа, в практическую работу клинико-диагностической лаборатории городской клинической больницы № 10 г. Воронежа, в научную и практическую работу отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии Всеросийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии.

Теоретические положения о впервые установленных закономерностях тиол-дисульфидного обмена, его связи с иммунной и эндокринной системами внедрены в учебный процесс на кафедрах терапии № 1 факультета переподготовки и повышения квалификации специалистов (ранее факультет усовершенствования врачей), факультетской терапии, инфекционных болезней, госпитальной педиатрии Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертации доложены на YII научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1988), научной конференции "Биохимия - медицине" (Ленинград, 1988), на межрегиональных научно-практических конференциях "Актуальные проблемы инфекционной патологии, клинической иммунологии и медицинской генетики" (Москва-Луганск, 1990, 1991), Всесоюзной конференции "Реабилитация иммунной системы" (Цхалтубо, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммунной систем" (Ростов-на-Дону, 1990), Y региональной научной конференции иммунологов, инфекционистов, генетиков, аллергологов Луганской области (Москва-Луганск, 1992), Втором международном симпозиуме "Традиционные и нетрадиционные методы реабилитации больных" (Анапа, 1994), Первом и Втором

национальных конгрессах по профилактической медицине (С.Петербург, 1994, 1995), УН Международном конгрессе "Реабилитация в медицине и иммунореабилитация" (Нью-Йорк, 2001), 4-ом Конгрессе РААКИ (Москва, 2001), межкафедральной конференции Воронежской государственной медицинской академии с участием кафедр факультетской терапии, терапии №1 факультета переподготовки и повышения квалификации специалистов, патологической физиологии, инфекционных болезней, Центральной научно-исследовательской лаборатории, сотрудников отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии (Воронеж, 2002).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Механизм иммуносупрессивного действия естественного ингиби-рующего фактора заключается в его влиянии на мобильность поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов, т.е. в подавлении феномена "шляпкообразования".

2. Коррекция иммуносупрессии, вызываемой функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, возможна с помощью гипербарической оксигенации в нетоксических дозах (2 избыточные атмосферы в течение 1 часа трижды через день). Иммунокорригирую-щее действие гипербарической оксигенации связано с окислением активных сульфгидрильных групп естественного ингибирующего фактора.

3. Коррекция иммуносупрессии, вызываемой функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, возможна с помощью парентерального введения в организм гомологичного альбумина (в дозе 5% - 10% от имеющегося в сыворотке крови). Альбумин является, с одной стороны, носителем, с другой стороны- инактиватором ингиби-рующей активности сыворотки крови благодаря своему активному участию в процессах тиол - дисульфидного обмена.

4. Введение животным гидрокортизона индуцирует появление у них ингибирующей активности сыворотки крови. Этот эффект носит дозо-зависимый характер.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам исследований опубликовано 46 научных работ, включая монографию "Иммунодефицита и естественное ингибирование активности макромолекулярных антител" в соавторстве с Н.В.Журавлевой (1988).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 191 странице текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы и приложения.

Работа иллюстрирована 31 таблицей, 3 рисунками, 1 схемой. Приложение содержит 4 таблицы, 10 рисунков. Библиографический указатель включает 349 работ: из них 254 отечественных и 95 зарубежных авторов.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проведены на 308 беспородных кроликах серой и черной масти с массой тела 2,5-3,5 кг, 97 белых крысах массой тела 250-300 г и 84 крысах \Vistar-100.

2.1. Способы индуцирования и моделирования ингибирующей активности сыворотки крови

Выработку естественного ингибирующего фактора (ЕИФ) в организме экспериментальных животных и появление в сыворотке крови ингибирующей активности индуцировали двумя способами:

1) дробной иммунизацией кроликов малыми дозами брюшнотифозной вакцины (Г.М. Фаустова, 1973);

2) пятикратными физиологическими по дозам кровопусканиями

(Н.В. Журавлева, 1970).

1. Брюшнотифозную вакцину вводили кроликам ежедневно подкожно в область подколенных и залопаточных лимфатических узлов в разовой дозе 100 млн.микробных тел. Иммунизацию животных заканчивали через 2 недели после появления в крови у них естественного ингибирующего фактора. Длительность иммунизации составила 35 дней. Исследование изучаемых показателей у животных проводили еженедельно, основываясь на выделенных ранее с помощью критерия (Н.К. Родосская, 1986) периодах антителообразования. Они характеризуются титром сывороточных антител и реакцией ингибирования активности антител сыворотки крови.

2. Кровопускания кроликам и крысам проводили с интервалом в 5 дней в дозе 0,5% от массы тела животного. Естественный ингибирующий фактор в сыворотке крови в большинстве экспериментов появлялся после 3-го кровопускания. На фоне циркулирования ЕИФ у животных исследовали показатели иммунорегуляции.

Моделирование ингибирующей активности сыворотки крови осуществляли введением животным цистеина (Н.В. Журавлева, Н.В. Ло-беева, 1978; Н.К. Родосская, 1986). Солянокислый Ь-цистеин. вводили животным внутрибрюшинно из расчета 100 мг на 1 кг массы тела.

В ряде экспериментов для воспроизведения ингибирующей активности сыворотки крови использовали донатор БН-групп - унитиол. Его вводили внутримышечно из расчета 0,1 мл 5% раствора на 100 г массы тела животного. Животных иммунизировали в этих экспериментах Т-зависимым (эритроциты барана) или же Т-независимым (брюш-

нотифозная вакцина) антигенами. Животные контрольной группы получали один антиген.

2.2. Определение естественного ингибирующего фактора в сыворотке крови

Ингибирующие свойства сыворотки крови подопытных животных изучали методом Н.В.Журавлевой (1970) с помощью постановки реакции ингибирования активности антител (РИА). Метод заключается в определении изменения агглютинирующих свойств иммуноглобулинов класса М диагностических сывороток (тест-сывороток) с заранее известными титрами после их контакта с испытуемыми сыворотками крови экспериментальных животных. Результаты реакции выражали индексом ингибирования (ИИ), который определяется как отношение суммарного титра тест-сыворотки, определяемого после ее контакта с физиологическим раствором, к суммарному титру после ее контакта с испытуемой сывороткой.

Суммарный титр вычисляли по X. Фьюденбергу и соавт. (1975). Реакция ингибирования считается положительной, если индекс ингибирования (ИИ РИА) =>1,2.

В части экспериментов определяли ингибирующую активность депротеината крови, который получали с помощью метафосфорной кислоты (Х.М. Рубина, Л.А. Романчук, 1961). Перед постановкой РИА депротеинат разводили физиологическим раствором 1:2.

2.3. Используемые тесты для оценки антителообразования и регуляции иммуногенеза

Специфические антителообразующие клетки (АОК) в клеточной суспензии регионарных лимфоидных органов экспериментальных животных определяли методом локального гемолиза в геле ( N.K. Jerne, A.A. Nordin, 1963), а также модифицированным методом A.J. Canningham (1965).

Функциональную активность Т-лимфоцигов исследовали в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) регионарных лимфоидных органов по Н.Л. Самойлиной (1970) и Н.Р. Лингу (1971).

Характер расположения поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов на лимфоцитах регионарных лимфоидных органов определяли методом прямой иммунофлюоресценции по Coons в модификации О.М. Лежневой (1968). При этом использовали ослиные сыворотки против иммуноглобулинов М кролика (производства МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского). Учет реакции проводили как в нативных препаратах клеточной суспензии лимфоидных органов, так и после преинку-бации в течение 1 часа при +37° С клеточной взвеси в присутствии цистеина (0,1 мл раствора из расчета 1 мг/мл на 1 мл клеточной взвеси, содержащей 1 млн. лимфоидных клеток), а также - специфического

антигена (0,1 мл брюшнотифозного экстракта на 1 мл клеточной взвеси). Подсчитывали отдельно число лимфоцитов с дискретным свечением поверхностных рецепторов и число лимфоцитов со "шляпками", или "кэпами".

Влияние ЕИФ на регуляторные клетки селезенки крыс Wistar-100 (Fc^i- , Fey -субпопуляции) изучали с использованием гомологичных эритроцитов по Моретта в модификации Д.К. Новикова с соавт. (1985). При этом применяли сыворотки кроликов, иммунизированных эритроцитами крыс. Наличие Ig М и Ig G антител в сыворотках против эритроцитов крыс контролировали с помощью 2-меркаптоэтанола (N. Costea N. е.а., 1965). Определяли клетки, несущие на своей поверхности рецепторы к Fcji -фрагменту Ig М и к Fey -фрагменту Ig G. Рассчитывали индекс иммунологической регуляции как отношение числа Fen -клеток к числу Fey -клеток (НИР Fc^ /Fey).

Определение супрессорной активности спленоцитов крыс Wistar-100 проводили по методу Н.А.Краскиной и соавторам (1983). С этой целью оценивали способность клеток селезенки крыс вызывать инги-бицию АОК в популяции спленоцитов от сингенных, иммунизированных эритроцитами барана, животных при совместном культивировании. Затем определяли индекс ингибирования АОК (ИИ АОК) как соотношение числа АОК в контроле (иммунные спленоциты ) к числу АОК в опыте (иммунные спленоциты + испытуемые спленоциты).

2.4. Другие используемые методы исследования

Определение белковых фракций в сыворотке крови методом электрофореза на бумаге проводили по А.Е. Гурвичу (1955). У кроликов определяли содержание гидрокортизона (ГК) и 17-оксикортикостероидов (17-ОКС) в плазме крови (H.A. Юдаев, 1961; С.А. Nurgent, D.M. Maye, 1966).

Фракцию альбумина из сыворотки крови крыс и кроликов получали по методу Schneider (В.М. Русанов , Л.И. Скобелев, 1988). Содержание альбумина в полученной фракции определяли рефрактометрически (Й. Тодоров, 1963). Альбумин экспериментальным животным вводили внутримышечно. Для крыс - в дозе 5 мг чистого вещества, для кроликов - 200 мг. Это составляло увеличение общего содержания альбумина в крови экспериментальных животных соответственно на 5, 10% (И.М. Трахтенберг и соавт., 1978).

Курс гипербарической оксигенации (ГБО) кроликам проводили при 2-х избыточных атмосферах в течение 1 часа три или шесть раз с интервалом в 1 день. Курс начинали при появлении ингибирующей активности сыворотки крови.

Гидрокортизон (2,5% суспензия гидрокортизона ацетата) вводили кроликам и крысам внутримышечно.

Сульфгидрильные группы (8Н-группы) в цельной и депротеини-зированной крови определяли спектрофотометрическим методом по Х.М. Рубиной и Л.А. Романчук (1961).

При статистической обработке вариационных рядов была произведена оценка нормальности их распределения. В большинстве случаев, распределение вариационных рядов было близко к нормальному. Для анализа этих рядов мы использовали параметрические методы статистики. При вычислении достоверности различия средних мы использовали коэффициент Стьюдента для малых выборок. В некоторых случаях были использованы непараметрические коэффициенты корреляции. Достоверность различия средних определялась при Р=95%.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования посвящены изучению механизмов супрессивного действия естественного ингибирующего фактора на образование антител, а также способам коррекции иммуносупрессии, вызванной ЕИФ.

Поскольку активность ЕИФ связана с увеличением в крови аминокислоты цистеина и воспроизводится введением животным его физиологических доз (Н.К. Родосская, 1985; 1986), нами были проведены эксперименты по индуцированию ингибирующей активности сыворотки крови с помощью другого низкомолекулярного тиола с активными БН-группами - унитиола. Действительно, в опытах на крысах по введению им унитиола (трижды, с интервалом 24 часа) показано появление в сыворотке крови положительной реакции ингибирования активности макромолекулярных антител в течение 5-ти суток после окончания введения унитиола. У животных, иммунизированных эритроцитами барана на фоне положительной РИА (индуцированной введением унитиола), число иммунных АОК было значительно (в 3,2 раза) меньше (р<0,01), чем у контрольных животных с отрицательной РИА.

Поскольку цистеин и унитиол - это низкомолекулярные тиолы с активными сульфгидрильными группами, были проведены эксперименты для выявления роли БН-групп небелковых тиолов (НБТ) в функционировании ЕИФ.

В опытах по стимуляции выработки ЕИФ дробной иммунизацией кроликов малыми дозами брюшнотифозной вакцины было показано достоверное увеличение концентрации БН-групп НБТ к периоду функционирования ЕИФ; это происходило после их снижения в начальный период антителообразования (7-й день иммунизации). Та же динамика отмечалась в опыте по стимуляции выработки ЕИФ циклом дозированных кровопусканий: после снижения содержания БН-групп небелковых тиолов в крови в начале цикла кровопусканий происходило их последующее достоверное увеличение к периоду появления ингибирующей активности в сыворотке крови. При этом ингибирующая активность в

депротеинизированной крови появлялась раньше, исчезала позже и была более выражена, чем в цельной сыворотке (табл. 1).

Появление ингибирующих свойств в депротеинате крови отмечалось на фоне снижения концентрации SH-групп небелковых тиолов с последующим ее увеличением. Вероятно, снижение количества SH-групп НБТ крови происходит за счет увеличения их потребления в обменных процессах. Снижение количества SH-групп крови на высоте и в начале иммунного ответа описывается в работах ряда авторов (A.A. Архипова, 1970; Н.И. Лебедев, 1972) и объясняется тем, что в предми-тотическом состоянии в клетке происходит накопление цистеина (И.М. Воронцов, 1964), превращение его клетками в цистин, который входит в состав белковых молекул (J.A. Sturman е.а., 1980). Известно, что иммунные гамма2-глобулины содержат в 1,5-3,0 раза больше SH-групп, чем неспецифический гаммаг-глобулин (К.Х. Ходжиев и соавт., 1964).

Таблица 1

Сульфгидрильные группы в депротеинизированной крови, ингиби-рующая активность сыворотки и депротеината крови кроликов при повторных дозированных кровопусканиях (М+m), п=20

№ Номера кро- ИИ РИА ИИ РИА депро- SH-группы

пп вопускании сыворотки теината крови (мг%)

1. I 1,0-0,0 1,0*1,0 7,0-4), 7

2. II 1,0^0,0 1,040 j 3,3-4),4

3. III 1,0+0,0 3,1+0,5 2,7+0,4

4. IV 2,li0,2 2,34),2 5,9*1,2

5. V 1,04),0 2,0-4),2 5,44), 9

Примечание: для SH-групп- pi>3<0,001, р3>4<0,02

Уровень тиолов сыворотки крови рассматривается как показатель общей реактивности организма при различных патологических состояниях (С.Ф. Гуляева, В.Г. Гуляев, 1988; В.В. Кравчук и соавт., 1994; W. Zimmermann, 1979; R.W.Pero, 1999).

В наших опытах изменения в уровне SH-групп небелковых тиолов чаще не превышали исходных значений. Вероятно, в процессе иммунизации отмечается перераспределение низкомолекулярных тиолов с преобладанием цистеина и, соответственно, появлением ингибирую-щей активности, которая появляется сначала в депротеинате крови (увеличение концентрации цистеина), а затем в цельной сыворотке. Видимо, альбумин приобретает ингибирующие свойства, включаясь в тиол-дисульфидный обмен, после того, как возрастает концентрация SH-групп НБТ в сыворотке крови выше определенного для каждого

индивидуума уровня. При этом, видимо, изменяются его качественные характеристики.

Что же происходит с поверхностными иммуноглобулиновыми рецепторами лимфоцитов при функционировании в организме естественного ингибирующего фактора? Для ответа на этот вопрос мы исследовали мобильность поверхностных рецепторов B-лимфоцитов, несущих Ig М рецепторы (P.M. Хаитов и соавт., 1995; F. Loder е.а., 1999; М. Ivarson е.а., 1999; Н. White, D. Gray, 2000).

В опытах по стимуляции выработки ЕИФ дробной иммунизацией кроликов малыми дозами брюшнотифозной вакцины было отмечено значительное увеличение процента лимфоцитов с "кэпами" в начальный период антителообразования (7-й день иммунизации). Увеличение "кэппинга" обусловлено концентрацией на одном из полюсов клетки поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов. Он стимулируется антигеном или митогеном и предшествует дифференцировке лимфоцитов и их последующей пролиферации (Р.Д. Сейфулла и соавт., 1981; Б. Пернис, 1981). На пике антителообразования количество лимфоцитов с "кэпами" снижалось, что можно связать с высокой митотической активностью клеток в этот период и переходом их в специфические антителообразующие клетки. В период начала ингибирования (21-й день иммунизации) на фоне максимального количества антителообра-зующих клеток в регионарных лимфоузлах кроликов отмечалось вновь возросшее количество лимфоцитов с "кэпами" (р<0,01). И в этот период максимального антителообразования in vitro они не способны стимулироваться специфическим антигеном. В дальнейшем, при продолжении функционирования ЕИФ (28-й день иммунизации), происходило достоверное (р<0,02) снижение процента лимфоцитов со "шляпками" и увеличение числа лимфоцитов с рецепторами, расположенными дискретно (в 4,5 раза). Это совпадает с достоверным уменьшением количества специфических АОК (р<0,01). Однако, in vitro, в этот срок исследования лимфоциты реагируют "шляпкообразованием" на добавленный специфический антиген (р<0,02), что, вероятно, связано с отсутствием ЕИФ в препаратах in vitro и предполагает обратимость влияния ЕИФ на мобильность поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов. В период окончания ингибирования (на 35-й день иммунизации), когда РИА становится отрицательной, процент лимфоцитов с "кэпами" возрастает недостоверно, чему соответствует и отсутствие увеличения числа иммунных АОК.

По результатам эксперимента можно предположить, что наличие ингибирующей активности сыворотки крови оказывает временное влияние на мобильность поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов.

В этом же эксперименте по индукции выработки ЕИФ дробной иммунизацией кроликов малыми дозами брюшнотифозной вакцины ис-

следовали влияние добавленного к взвеси лимфоцитов регионарных лимфатических узлов кроликов цистеина на стимуляцию "кэн"- образования под влиянием специфического антигена. Предварительный контакт лимфоидных клеток с цистеином и антигеном в течение 1 часа снимал эффект "кэп"- образования (р<0,01), но способствовал появлению дискретного свечения (р<0,01) по сравнению с препаратом "+антиген" (7-й день исследования). На 14-й день исследования отмечалось недостоверное снижение процента "кэпов" под влиянием цистеина. Лимфоциты же, взятые в опыты у кроликов с положительной РИА (21-й, 28-й дни иммунизации), на цистеин не реагировали, очевидно, за счет насыщения SH-группами естественного ингибирующего фактора. На 35-й и 42-й дни исследования на фоне отрицательной РИА вновь отмечается подавляющее действие цистеина на "шляпкооб-разование" (р<0,05 на 42-й день исследования).

Влияние цистеина in vitro на "кэп"-образование и число специфических антителообразующих клеток подтверждается и в другом эксперименте. Кролики были иммунизированы однократно брюшнотифозной вакциной (1 млрд. микробных тел) подкожно в область залопаточных и подколенных лимфатических узлов. Исследования проводились на 3-й и 7-е сутки после введения вакцины. Число антителообразующих клеток определяли во взвеси лимфоидных клеток до и после их предварительной обработки специфическим антигеном, цистеином и антигеном в течение 1 часа.

Анализ полученных данных показывает, что у животных к 3-им суткам после иммунизации происходило достоверное увеличение процента лимфоцитов "кэп"- образующих и с дискретным свечением поверхностных рецепторов (р<0,05). Увеличивалось, также, и число специфических антителообразующих клеток. Под влиянием специфического антигена, добавленного in vitro к взвеси лимфоцитов, достоверно увеличивалось как число лимфоцитов с рецепторами, концентрирующимися в "шляпки" (на 3-й день р<0,001; на 7-й день р<0,001), так и число АОК (на 3-й день -в 2,8 раза (р<0,05), на 7-й день - в 1,8 раза). Цистеин, добавленный к взвеси лимфоцитов одновременно со специфическим антигеном, противодействует процессу "кэппинга" (на 3-й день - р<0,02; на 7-й день р<0,001) и, как результат, вызывал снижение числа специфических антителообразующих клеток (соответственно в 2,3 раза и в 3,3 раза (р<0,05).

Можно полагать, что воздействие гипербарической оксигенации в нетоксических дозах окажет влияние на ингибирующую активность сыворотки крови, т.к. известно, что гипербарический кислород вмешивается в тиол-дисульфидный обмен, способствуя окислению сульфгид-рильных групп, изменяя при этом активность ряда ферментов, снижая содержание аминокислоты цистеина в печени (Д.С. Гарингтон, 1971;

Б.В. Петровский, С.Н. Ефуни, 1976; Ю.М. Торчинский, 1977; М.А. Ласкаржевская, 1982; А.Н. Леонов, 1995).

Рис. 1. Влияние ГБО на интенсивность "нэп" -образования поверхностными иммуноглобулиновыми рецепторами лимфоцитов регионарных лимфоузлов кроликов и уровень БН-групп НБТ крови (28-ой день иммунизации малыми дозами брюшнотифозной вакцины)

1 -интенсивность "кэп"-образования , 2-уровень SH - групп НБТ крови

Действительно, наши эксперименты показали, что под воздействием гипербарической оксигенации ингибирующая активность сыворотки крови кроликов инактивируется (опыт по стимуляции выработки ЕИФ с помощью дробной иммунизации брюшнотифозной вакциной).

При этом отмечается и достоверное снижение концентрации SH-групп небелковых тиолов по сравнению с животными с положительной РИА (р<0,01) (рис. 1), а также - по сравнению с интактными животными (р<0,001).

В исследованиях по инактивации ЕИФ с помощью гипербарической оксигенации показано достоверное увеличение процента лимфоцитов с "кэпами" (в 11,4 раза, 5,2 раза на 28-й и 35-й дни исследования соответственно) (рис. 1) и достоверное увеличение процента лимфоцитов с "кэпами" при добавлении специфического антигена in vitro (в 3,5 раза и 4,2 раза соответственно), чего не отмечалось у животных с положительной РИА.

Та же закономерность прослеживается в эксперименте, в котором ингибирующую активность сыворотки крови моделировали трехкратным введением животным цистеина. Гипербарическая оксигенации снимала моделирующий эффект цистеина (РИА становилась отрицательной). При этом достоверно (р<0,02) увеличивался процент лимфоцитов с "кэпами" (на 7-й день после однократной иммунизации кроли-

ков брюшнотифозной вакциной), возрастала реакция лимфоцитов в виде "кэппинга" на добавленный in vitro специфический антиген (3-й, 7-й день от введения вакцины). Под влиянием же добавленного в препарат цистеина процент "кэп-образования" вновь снижался (р<0,01).

Между процентом лимфоцитов с "кэпами" и числом АОК выявлена хорошо выраженная положительная корреляционная связь (г =+0,85, Spearman R=+0,83, Gamma=+0,7) при отсутствии ингибирующих свойств сыворотки крови (инактивация с помощью ГБО). Функционирование в организме животных ЕИФ увеличивает число лимфоцитов с дискретным расположением поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов: между коэффициентом, характеризующим соотношение процента дискретного свечения к проценту "кэпов", и процентом "кэпов" у животных с положительной РИА выявлена хорошо выраженная обратная корреляционная связь (г =-0,79, Spearman R=-0,88, Gamma=-0,78). При этом нарушается прямая взаимосвязь между процентом лимфоцитов с "кэпами" и числом АОК.

Таким образом, опыты по стимуляции выработки или по моделированию эффекта ЕИФ, а также опыты с применением ГБО для инактивации ингибирующей активности сыворотки крови показали влияние изучаемого нами естественного ингибирующего фактора на процесс выработки антител, а именно - на мобильность поверхностных рецепторов клеток-предшественников АОК. Действие ГБО проявляется окислением активных SH-групп небелковых тиолов крови, относящихся к ЕИФ.

Связь естественного ингибирующего фактора с тиол-дисульфидным обменом предполагает зависимость ЕИФ от факторов регуляции этого обмена. К одним из основных регулирующих факторов можно отнести стресс-гормон гидрокортизон (ГК) и альбумин сыворотки крови.

Известно, что процессы обмена в печени в значительной степени стимулируются ГК (Е.А Корнева и соавт., 1978; Е.А. Корнева, В.А. Шекоян, 1982; Е.А. Мухин и соавт., 1988). В печени же синтезируется альбумин и осуществляется метаболизм цистеина. И.М. Воронцовым (1964) было показано, что под влиянием ГК происходит увеличение содержания SH-групп в сыворотке крови как за счет белковых, так и низкомолекулярных тиолов - цистеина и в меньшей степени глутатио-на и что альбумины препятствуют окислению SH-групп. Глюкокорти-коиды усиливают продукцию альбумина, участвуют в обмене аминокислот в печени (А.И. Венгеровский и соавт., 1999). Поскольку активность ЕИФ обусловлена сульфгидрильными группами, вполне вероятно, что его функционирование регулируется нейрогуморальными механизмами, в частности гидрокортизоном.

Известно, что глюкокортикоиды участвуют в нейрогуморальном обеспечении иммунного гомеостаза, причем в большей степени оказы-

вают влияние на клеточно-опосредованные процессы (Е.А. Мухин и соавт., 1988; Н.Л. Шапорова , В.И. Трофимов, 2000; D. Franchimont е.а., 2000). Глюкокортикоиды влияют на процессы пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, а также на экспрессию рецепторов к иммуномодулирующим цитокинам (Е.А. Корнева и соавт., 1998). Известно их лимфолитическое действие (M.L. Nicholson, D.A Young, 1979). Глюкокортикоиды вызывают дозозависимый апоп-тоз тимоцитов (П.В. Сергеев и соавт., 1998; Y.-R. Kim. е.а., 1999), Т- и B-лимфоцитов (F.A. Weyts е.а., 1998). При стрессе некоторые авторы отмечают снижение (Ю.В. Редькин, Т.Ф. Соколова, 1983) или исчезновение (С.Н. Кузьмин, Б.Б. Першин, 1988) из крови отдельных классов иммуноглобулинов, в том числе Ig М.

Принципиально новым этапом в развитии представлений о взаимодействии эндокринной и иммунной систем стало постулирование двусторонних отношений между глюкокортикоидами и иммунологическими факторами.

В связи с вышеизложенным несомненный интерес представляет исследование взаимосвязи ингибирующей активности сыворотки крови и уровня ГК плазмы крови у экспериментальных животных.

В опытах по стимуляции выработки ЕИФ дробной иммунизацией кроликов малыми дозами брюшнотифозной вакцины показано, что к периоду "пика сывороточных антител" (14-й день иммунизации) происходило достоверное (р<0,01) увеличение содержания I7-OKC в плазме крови с последующим его снижением в 1,8 раза (р<0,05) к периоду начала ингибирования. К этому же времени отмечалось достоверное увеличение концентрации SH-групп НБТ (с 2,9 мг%+0,8 до 4,0 мг%+0,1; р<0,01). При этом между ИИ РИА в сыворотке крови и содержанием 17-ОКС в плазме крови была выявлена обратная корреляционная связь (r=-0,61, Spearman R=-0,67, Gamma=-0,52).

Та же динамика содержания ГК в плазме крови отмечалась и в опыте с индукцией выработки ЕИФ циклом дозированных кровопусканий: в начале цикла кровопусканий происходило возрастание уровня кортизола плазмы ко дню II взятия крови, который в последующем достоверно снижался. Вслед за этим отмечалось достоверное возрастание содержания SH-групп НБТ (р<0,001). Вероятно, снижение концентрации ГК можно объяснить его потреблением в обменных процессах. Что касается динамики SH-групп небелковых тиолов, то она имеет ту же закономерность, что и в описанных выше экспериментах: после достоверного снижения уровня SH-групп небелковых тиолов в начале опыта (р<0,001) отмечается их возрастание (относительное по отношению к исходным данным) к периоду появления положительной РИА (р<0,001). В этом эксперименте также положительная реакция ингибирования активности антител в депротеинате крови появляется раньше и является более выраженной, чем в цельной крови.

Для подтверждения взаимосвязи глюкокортикоидов с ингиби-ругощей активностью сыворотки крови были проведены эксперименты по исследованию РИА сыворотки крови и ее депротеината на фоне введения ГК.

В серии экспериментов исследовали непосредственное влияние гидрокортизона на появление ингибирующей активности сыворотки крови. С этой целью кроликам вводили гидрокортизон внутримышечно в дозе 20 мг на ЗОООг массы тела однократно и затем ежедневно по 10 мг в течение 4-х дней. У экспериментальных животных изучали уровень сульфгидрильных групп и индекс ингибирования РИА сыворотки крови и ее депротеината через определенные промежутки времени, указанные на рисунке, считая от первого введения гидрокортизона. Введение гидрокортизона сопровождалось достоверным увеличением количества БН-групп НБТ крови (р<0,05). Одновременно появлялась положительная РИА сначала в депротеинате, а через 48 часов (по мере накопления БН-групп) - и в сыворотке крови. Затем содержание БН-групп небелковых тиолов постепенно снижалось. Однако, положительная РИА в сыворотке крови продолжала определяться до 4-го дня исследования (через 96 часов), а в депротеинате крови - до конечного срока исследования: 12-го дня опыта (через 288 часов) (рис. 2).

Рис. 2. Появление положительной РИА в сыворотке и депротеинате крови кроликов на фоне введения им гидрокортизона.

3,50

□ Положительная РИА е

депротеинате крови Е1 Положительная РИА е сыворотке крови

Зч. 24 ч. 48ч. 72 ч. 96 ч. 192 ч. 288 ч. Время от начала введения ГК

Таким образом, полученные результаты позволяют высказать предположение, что ингибирующая активность сыворотки крови зависит не только от уровня БН-групп НБТ, но и от их качественного состава. Вероятно, в сыворотке крови происходит накопление именно аминокислоты цистеина.

В опытах на крысах была показана прямая зависимость выраженности реакции ингибирования активности антител от дозы вводимого ГК (табл. 2).

Таблица 2

ИИ РИА сыворотки крови крыс, получавших гидрокортизон в течение четырех дней (М+т)

Доза вводимого ГК Время от начала введения ИИ РИА

п=7

1 мг Исходный ИИ РИА 1,0+0,0

1 мг Через 24 часа 1,1+0,1

1 мг Через 48 часов 1,4+0,0

1 мг Через 72 часа 1,1+0,0

4-й день после окончания введения ГК 1,0+0,0

п=7

5мг Исходный ИИ РИА 1,0+0,0

5 мг Через 24 часа 1,2+0,0

5 мг Через 48 часов 1,4+0,1

5 мг Через 72 часа 1,6+0,2

4-й день после окончания введения ГК 1,2+0,1

Полученные результаты показывают, что для увеличения числа БН-групп в депротеинате крови требуется включение ГК в обменные процессы. Можно сделать заключение, что формирование сывороточного ЕИФ обусловлено предварительным накоплением в крови ГК, затем увеличением концентрации 8Н-групп небелковых тиолов, а следующим этапом является их взаимодействие с альбумином сыворотки крови.

Таким образом, в наших экспериментах показано неизвестное ранее эффекторное действие стресс-гормона гидрокортизона, реализующееся в индуцировании им ингибирующей активности сыворотки крови.

В экспериментах на крысах Вистар-100 исследовали влияние естественного ингибирующего фактора на иммунорегуляторные показатели.

Было выявлено достоверное снижение ИИР Рсд/Рсу (р<0,02) за счет уменьшения числа Рсц-клеток, снижение функциональной активности Т-лимфоцитов (р<0,02), уменьшение числа ядросодержащих клеток (ЯСК) в селезенке (после их первоначального увеличения на 5-й день после II кровопускания на фоне отрицательной РИА, р<0,01). Выявлена хорошо выраженная обратная корреляционная связь между

ИИ РИА и числом ядросодержагцих клеток селезенки (r=-0,56, Spearman R=-0,62, Gamma=-0,59), между ИИ РИА и ИИР Fcp /Fey (r=-0,8, Spearman R=-0,67, Gamma=-0,59). Супрессорная активность спленоци-тов крыс Вистар-100 при функционировании в организме естественного ингибирующего фактора не возрастала.

Аналогичная динамика показателей иммунорегуляции была получена при моделировании ингибирующей активности сыворотки крови у крыс с помощью введения им унитиола. У животных с положительной РИА отмечалось снижение числа Fcji-клеток (р<0,05), ИИР Fcfi /Fey (р<0,001), ЯСК селезенки (р<0,05), функциональной активности Т-лимфоцитов (р<0,01).

В следующей серии экспериментов была показана зависимость ЕИФ от регулятора тиол-дисульфидного обмена - сывороточного альбумина. Гомологичный альбумин вводили животным с целью инактивации ингибирующей активности сыворотки крови. В опытах по стимуляции выработки ЕИФ дозированными кровопусканиями было показано, что трех- или четырехкратное введение альбумина животным опытной группы снимало (табл. 3), а в других случаях (в зависимости от времени введения) препятствовало появлению ингибирующей активности сыворотки крови.

У животных, иммунизированных эритроцитами барана на фоне положительной РИА, стимулированной циклом кровопусканий, число иммунных АОК селезенки было достоверно (р<0,01) меньше, чем у животных с инактивированной РИА с помощью введения альбумина.

Таблица 3

Индекс ингибирования РИА сыворотки крови крыс при кровопусканиях и введении альбумина (трижды) в дни III, IY, Y взятия крови (М±т)

№ кровопусканий /Группы животных I II III IY Y Через 4 дня после У кровопускания

Контрольная, п=7 1,0±0,0 1,1+0,1 1,2+0,0 1,8±0,3 1,3±0,1 1,9+0,5

Опытная, п=7 1,0+0,0 - 1,3+0,1 1,0±0,1 0,9+0,0 1,1+0,3

Изучение показателей иммунорегуляции у крыс Вистар-100 на фоне положительной реакции ингибирования активности антител, ин-

дуцированной циклом дозированных кровопусканий, и при инактивации РИА с помощью введения альбумина подтвердило описанную выше закономерность в изменении показателей (табл. 4).

Таблица 4

Влияние ЕИФ и альбумина на иммунологические показатели у крыс Wistar-100 в опыте с дозированными кровопусканиями (М+т)

Группы животных/ Интактные Контрольная Опытная

Показатели п=8 группа Альбумин- п=8 группа Альбумин+ п=13

1 2 3

ИИ РИА, I 1,0+0,1 1,3+0,3 1,1+0,1

Число ЯСК 421,4+81,5 299,3+49,1 500,4+48,1

(млн. ""селезенку II

Fcji-клетки (млн.* 35,1+6,6 11,2+2,9 38,3+2,7

селезенку), III

Рсу-клетки(млн. * 26,4+6,9 35,4+3,9 79,5+12,6

селезенку), IV

ИИР Тц/Ту, V 1,3+0,1 0,3+0,1 0,5+0,1

РБТЛ на ФГА, %, VI 45,7+8,0 5,0+4,4 38,0+4,4

ИИ АОК, VII 0,7+0,1 1,0+0,2 0,9+0,1

Примечание: рИ1>2<0,02; рИ2>3<0,01; рШь2<0,02; рШ2)3<0,02; р1У1-2<0,01; р1У2,'3<0,01; рУ,,'2<0,02; РУ2,3<0,02; рУ11>2'<0,001; рУ12'3<0,001

У опытных животных на фоне введения альбумина отмечалось достоверное возрастание числа Рсц-клеток (р<0,02), Рсу-клеток (р<0,01), индекса иммунорегуляции Бсц/Рсу (р<0,02), функциональной активности Т-лимфоцитов (р<0,001), количества ядросодержащих клеток селезенки (р<0,01) по сравнению с животными с положительной РИА. Супрессорная активность спленоцитов при функционировании в организме естественного ингибирующего фактора не увеличивалась.

Таким образом, наши эксперименты показали возможность инактивации ингибирующей активности сыворотки крови с помощью введения животным гомологичного альбумина. Известна роль альбумина в реакциях тиол-дисульфидного обмена (Ю.М. Торчинский, 1977; Н.Л. Шимановский, 1984). Известна, также, способность альбумина обратимо связывать метаболиты различной природы, играть существенную роль в биотрансформации как ксенобиотиков, так и веществ эндогенного происхождения, регулируя их транспорт через мембрану. Благодаря взаимному влиянию лигандов на связывание с альбумином изменяется скорость биотрансформации субстратов и контролируется кон-

центрация биологически активных веществ (A.A. Петшок и соавт., 1995). Существует гипотеза о внутрипеченочной диссоциации комплекса лиганд - альбумин (К.И. Бендер и соавт., 1989). Вероятно, этим можно объяснить наличие ингибирующей активности именно в экстрактах печени в опытах по стимуляции его выработки. Ю.М. Лопухин и соавторы (2000) рассматривают изменения вторичной и третичной структуры альбумина как новый тип реакции организма на патологический процесс, необязательно связанный с загрузкой молекулы альбумина токсическими продуктами. Авторы отмечают, что конформа-ционные изменения альбумина сопровождают многие заболевания и позволяют прогнозировать их течение.

Согласно классической теории Г.Селье (I960) разнообразные действующие на организм повреждающие факторы могут выступать в качестве стрессоров. Стресс рассматривается как неспецифическая реакция организма, проявляющаяся активацией ведущего эндокринного механизма - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) (М.М. Eijsbaits Agnes, P. Murphy Evelyn, 1999). В зависимости от характера, интенсивности стрессового фактора описаны различные реакции иммунной системы при стрессе ( Е.А. Корнева, 1999; T. Shi-mizu е.а., 2000).

До сих пор остается открытым вопрос о механизме развития и характере стрессовой иммуносупрессии. Существуют различные точки зрения относительно природы ингибиции функциональной активности Т-лимфоцитов при стрессовом воздействии: нарушение пролиферации, кооперации Т-лимфоцитов, усиление влияния Т-супрессоров. Инверсия при стрессовых воздействиях соотношения хелперы-супрессоры отмечена различными авторами (З.И. Савченко и соавт., 2001; K.M. Tornatore е.а., 1998; М. Maes е.а., 1999). В работе Caetano Dorgival е.а. (1999) подчеркивается роль иммунной системы как связующего звена между внешними воздействиями, воспринимаемыми нервной системой, и метаболизмом, регулируемым гормонально. Авторами, также, отмечается, что на фоне стрессовой реакции (увеличения концентрации в крови катехоламинов, адренокортикотропного гормона, кортизола) снижается пролиферативный ответ лимфоцитов на митогены, "соотношение Т-хелперы:Т-супрессоры/цитотоксические". При этом прослеживается взаимосвязь между стрессом и инфекциями, особенно вирусными (J. Leserman е.а., 2000). Сходные изменения в иммунной системе отмечаются при клинически выраженных депрессивных состояниях.

Снижение соотношения иммунорегуляторных Fcji- и Бсу-клеток отмечается и в наших экспериментах при функционировании ЕИФ в организме. В наших исследованиях динамика клеточного состава при функционировании ЕИФ носила определенный характер. Иммуносу-прессия, которая возникала при функционировании ЕИФ в организме, сопровождалась снижением числа Fcji-клеток.

Иммуносупрессия на фоне положительной РИА не связана с увеличением супрессорной активности спленоцитов. Она характеризуется снижением функциональной активности Т-лимфоцитов, числа ЯСК селезенки. При этом происходит нарушение мобильности поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов с нарушением их последующей дифференцировки в плазматические клетки и снижение митотической активности Т- и В- лимфоцитов, чему способствует временное ингибирование ряда метоболических процессов цистеином , который является активным началом ЕИФ.

Таким образом, в наших исследованиях впервые было показано эффекторное действие стресс-гормона гидрокортизона, реализующееся в индуцировании им ингибирующей активности сыворотки крови с последующей иммуносупрессией иммунного ответа, коррелирующей с индексом ингибирования РИА. В соответствии с уровнем проявления стресс-реакции можно говорить об эустрессе и дистрессе. В состоянии эустресса кратковременное функционирование ЕИФ в организме оказывает регулирующее влияние на уровень макроглобулинов сыворотки крови и антителообразование. В условиях дистресса длительное стимулирование образования и функционирования ЕИФ ведет к развитию патологического состояния - иммунодефицита, способствующего хро-низации и рецидивированию инфекционно-воспалительных заболеваний. Истощение механизмов адаптации, приводящее к ослаблению функции ГГНС и к снижению выработки гидрокортизона, может способствовать развитию аутоиммунных процессов, обусловленных отсутствием продукции ЕИФ. Показано, например, что у больных ревматоидным артритом отмечается снижение уровня кортизола, необходимого для формирования нормального иммунного ответа (W.M. Jefferies., 1998). Угнетение продукции кортизола, снижение уровня АКТГ, рецепторов лимфоцитов к глюкокортикоидам отмечено у детей, страдающих тяжелой формой бронхиальной астмы (И.И. Балаболкин и соавт., 2001), у больных сепсисом (J. Briegel, 2000). При этом, исследователями отмечается различие в реактивности ГГНС у различных индивидов, обусловленное возможным наличием центрального дефекта в регуляции синтеза АКТГ на генетическом уровне и, соответственно, синтеза кортизола (Е.М. Sternberg е.а., 1989; Т. Breivik е.а., 2000). Глюкокортикоидная недостаточность может наблюдаться и при патологии со стороны других органов. Например, снижение катаболизма кортизола, уменьшение его концентрации в крови отмечается при циррозе печени вирусной и аутоиммунной этиологии (О.В. Астафьева, Т.А. Логинов, 1999). Таким образом, стойкое отсутствие ЕИФ на фоне снижения эффекторного действия кортизола при наличии в организме инфекционного агента может способствовать развитию синдрома по-ликлональной стимуляции В-клеток с формированием аутоиммунных реакций (А.П. Колесников и соавт., 2001).

Известно, что гипероксия является одним из мощных адаптоге-нов, способным через систему нейрогормональной регуляции осуществлять стимулирующее или ингибирующее влияние на функциональную, метаболическую, морфологическую активность клетки-мишени (Л.Д. Мальцева, С.Я. Дьячкова, 1995, С.О. Киселев, 2002). Гиперокси-ческое состояние организма формируется в ходе развития трех последовательных стадий: адаптационной, токсической и терминальной. Начальная стадия гипероксии характеризуется мобилизацией универсальных защитных, компенсаторных процессов функционального, метаболического и структурного типов, определяющих основу положительного клинического результата ГБО. Адаптогенное действие ГБО на общую реактивность больного организма дает право рассматривать ГБО в качестве универсального саногенетического фактора (А.Н. Леонов, 1995; 2000). Гипербарический кислород способен в первые сутки бактериального эндотоксического шока повышать пролиферацию и дифференцировку B-лимфоцитов в плазматические клетки; повышать функциональную активность нейтрофилов; функциональная активность специфических рецепторов иммунокомпетентных клеток селезенки мышей под воздействием ГБО резко изменяется: происходит ускорение "кэппинга" (С.Я. Дьячкова, 1995). Терапевтические дозы гипербарического кислорода оказывают положительное влияние на динамику ряда иммунологических показателей у больных с различной патологией: неврозами (В.Г. Подсеваткин и соавт., 2000; В.Г. Подсе-ваткин, C.B. Кирюхина, 2001), рассеянным склерозом (М.В. Васильев и соавт., 1995).

В наших экспериментах мы также обнаружили стимулирующее влияние ГБО на процесс "кэп-образования" и установили, что это происходит за счет инактивации активных SH-групп естественного инги-бирующего фактора, которые способны концентрироваться на поверхности лимфоцитов (J. Ryzevvski е.а., 1977). Это действие ГБО мы рассматриваем как проявление его универсального адаптогенного эффекта, с помощью которого можно проводить коррекцию иммунологической недостаточности, обусловленной ЕИФ. С другой стороны, К.П. Воробьев (2000) отмечает, что регуляторное звено АОС является ведущим фактором адаптации организма к гипероксии. Можно полагать, что и оценка компенсаторного звена АОС, включающая в себя в качестве низкомолекулярных антиоксидантов цистеин, глутатион (A.B. Погабало и соавт., 1997; Л.Е. Бобырева, 1998; В.Д. Лукьянчук, Л.В. Савченкова, 1998; P.A. Сабирова и соавт., 2000), займет свое место в системном подходе к определению стратегии ГБО.

Таким образом, природа ЕИФ есть функция количества небелковых тиолов с активной SH-группой, а именно - цистеина, продукция и активность которого регулируется гидрокортизоном и альбумином в силу закономерностей тиол - дисульфидного обмена.

Роль естественного ингибирующего фактора в формировании иммунологической реактивности организма представлена на схеме 1.

Схема 1. Роль ЕИФ в формировании иммунологической реактивности организма

При ее разработке использовались полученные нами и другими авторами данные.

Резюмируя вышеизложенное, следует подчеркнуть, что результаты экспериментов раскрывают неизвестный ранее механизм иммуно-супрессии, возникающей при функционировании ЕИФ в организме: ЕИФ подавляет антителообразование, препятствуя мобильности мембранных иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов,вмешиваясь в этот процесс на стадии формирования "кэпов" .

Кроме того, установлено неизвестное ранее эффекторное проявление стресс-гормона гидрокортизона, заключающееся в индуцировании им ингибирующей активности сыворотки крови.

ВЫВОДЫ

1. Установлен механизм иммуносупрессивного действия естественного ингибирующего фактора, заключающийся в снижении мобильности поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов.

2. Установлено, что иммуносупрессивное действие естественного ингибирующего фактора временно и обратимо и наиболее выражено в период максимальной ингибирующей активности сыворотки крови. Снижение активности ЕИФ приводит к восстановлению мобильности иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов.

3. Иммуносупрессивное действие естественного ингибирующего фактора проявляется как в индуктивной, так и в продуктивной фазах иммунного ответа. При функционировании ЕИФ в организме происходит снижение индекса иммунологической регуляции Рсц/Тсу за счет уменьшения количества Рсц-клеток; снижение числа ядросодержащих клеток регионарных лимфоидных органов.

4. Иммуносупрессивное действие естественного ингибирующего фактора проявляется по отношению как Т-зависимого, так и Т-независимого антигенов.

5. Воспроизведение иммуносупрессивного эффекта естественного ингибирующего фактора возможно с помощью парентерального введения соединений, содержащих активные сульфгидрильные группы — цистеина и унитиола.

6. Установлено неизвестное ранее эффекторное действие гидрокортизона, реализующееся в индуцировании им ингибирующей активности сыворотки крови при его парентеральном введении в организм.

7. Коррекция иммуносупрессии, обусловленной функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, осуществляется при воздействии на организм гипербарической оксигенации.

8. Коррекция иммуносупрессии, обусловленной функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, осуществляется с помощью парентерального введения гомологичного альбумина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный в эксперименте способ моделирования ингибирую-щей активности сыворотки крови и, соответственно, иммуносупрессии, связанной с функционированием в организме естественного ингиби-рующего фактора, основанный на парентеральном введении соединений, содержащих активные сульфгидрильные группы - цистеина и унитиола, может использоваться в экспериментальной иммунологии для дальнейшего изучения иммунотропных свойств ЕИФ. Можно рекомендовать, также, клиническую апробацию этих препаратов у пациентов с аутоиммунной патологией.

2. Установленная способность гидрокортизона индуцировать появление ингибирующей активности сыворотки крови может явиться предметом дальнейших исследований как в экспериментальной, так и в клинической иммунологии.

3. С целью коррекции иммуносупрессии, связанной с функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, рекомендуется использование гипербарической оксигенации (2 избыточные атмосферы в течение 1 часа трижды через день) или же введение гомологичного альбумина (из расчета 5-10% от имеющегося в сыворотке крови три или четыре раза с интервалом 5 дней). Эти способы могут быть рекомендованы для клинической апробации.

4. Полученные результаты, свидетельствующие о значительном влиянии естественного ингибирующего фактора на иммунологическую реактивность, диктуют необходимость исследования реакции ингибиро-вания активности антител сыворотки крови при иммунологическом обследовании пациентов различного профиля для выявления иммуносупрессии, обусловленной функционированием в организме ЕИФ, что позволит более объективно оценить состояние больного, позволит прогнозировать течение заболевания, развитие осложнений, эффективность плановой вакцинации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ингибирование активности антител при иммунизации // Тез. докл. ХУ1 Всесоюзного съезда микробиологов и эпидемиологов. Ч. II.- М., 1977,- С. 167-168 (соавт. Н.В. Журавлева, М.В. Земсков).

2. Динамика реакции бласттрансформации и реакции иммунного прилипания при дробной иммунизации кроликов малыми дозами брюшнотифозной вакцины // Некоторые вопросы экспериментальной и клинической медицины: Тез. докл. 1У науч. конф. ВГМИ. - Воронеж, 1977.-С. 77-78 (соавт. Н.В. Журавлева, И.В. Буравлева).

3. Антителообразоваиие и сульфгидрилыше группы крови при дробной иммунизации кроликов малыми дозами брюшнотифозной вакцины П Некоторые вопросы экспериментальной и клинической медицины: Тез. докл. 1У науч. конф. ВГМИ.- Воронеж, 1977.- С. 78-79 (соавт. Н.В. Журавлева).

4. Сульфгидрилыше группы и антителогенез //Актуальные вопросы гигиены, эпидемиологии и инфекционной патологии: Тез. докл.IX обл. съезда гигиенистов и сан. врачей, микробиологов и бактериологов -инфекционистов Воронежской области,- Воронеж, 1977.- С. 108-109.

5. Молекулярная характеристика антител в сыворотке крови и лимфатических узлах при дробной иммунизации малыми дозами бактериальных вакцин // Журн. гигиены, эпидемиологии и иммунологии,- 1978.Т. 22, № 2,- С. 237-242 (соавт. Н.В. Журавлева, М.В. Земсков, И.М. Смирнова).

6. Образование антител при функционировании в организме ингибитора их активности и введении цистеина.- Воронеж, 1979.-10 с.Деп. во ВНИИМИ,1979, № Д-2092//МРЖ.-1979,- раздел III, № 6, публ. 1604 (соавт. Н.В. Журавлева, А.Н. Козырев).

7. Влияние неспецифического ингибирования активности антител на образование антител II Факторы естественного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. к Y науч. конф. Вып. 8-й.- Челябинск, 1982,- С. 108.

8. Показатели антителобразования при введении экспериментальным животным цистеина и антигена //Активаторы и ингибиторы биологических процессов: Сб. науч. тр. ВГМИ. - Воронеж, 1982.- С. 106-108.

9. Естественное ингибирование активности антител как фактор имму-нодепрессии у животных.- Воронеж, 1984,- 13 е.- Деп. в ВИНИТИ 31.01.84, № 606-84// РЖ.-1984,- публ. 5.53.401 (соавт. Н.В. Журавлева).

10. Иммунный ответ на введение антигена у животных с положительной РИА // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. к Y11 зональной науч. конф. Вып.9-й,- Челябинск, 1984.- С. 116-117 (соавт. Н.В. Журавлева).

11. Микрометод диагностики вторичного иммунодефицита с помощью определения естественного ингибирующего фактора /ЕИФ/ в сыворотке крови // Профилактика, диагностика и лечение аутоиммунных заболеваний и вторичных иммунодефицитов: Тез. докл. Всесоюзн .конф.-Новосибирск, 1985,- С. 69-70 (соавт. Н.В. Журавлева, С.Я. Дьячкова).

12. Влияние естественного ингибирующего фактора /ЕИФ/ на антителообразоваиие // Естественное ингибирование активности антител в эксперименте и клинике: Сб. науч. тр .ВГМИ.- Воронеж, 1985.- С. 2033.

13. Естественный ингибирующий фактор /ЕИФ/ при иммунодефицит-ных состояниях в эксперименте и клинике // Теоретические проблемы эпидемиологии и инфекционной иммунологии на современном этапе: Тез. докл. к конф,- Нальчик, 1986,- С. 140-141 (соавт. Н.В. Журавлева, С.Я. Дьячкова).

14. Значение ЕИФ в развитии иммунодефицита // Иммунодефицита и аллергия: Тез. докл. Всесоюзного симпоузима с международным участием.- М., 1986.- С. 31 (соавт. Н.В. Журавлева, С.Я. Дьячкова).

15. Значение низкомолекулярных тиолов и гидрокортизона в формиро-ваниии сывороточного ЕИФ /естественного ингибирующего фактора / в эксперименте,- Воронеж, 1987,- 11 е.- Деп. в ВИНИТИ, № 3672-В27 (соавт. Н.В. Журавлева, А.Г. Нежданов).

16. ЕИФ и регуляторные субпопуляции Т-лимфоцитов в селезенке крыс Вистар-100 // Формы и механизмы процессов адаптации в норме и патологии: Сб. науч. тр.- Воронеж, 1987. - С. 127-131 (соавт. Н.В. Журавлева).

17. К механизму иммунодепрессивного действия ЕИФ // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. УН науч. конф.- Челябинск, 1988,- С. 107-108 (соавт. Н.В. Журавлева, В.В. Сорелля).

18. Иммунодсфнциты и естественное ингибирование активности макромолекулярных антител.- Воронеж, 1988.- 96 с. (монография, соавт. Н.В.Журавлева).

19. ЕИФ - неспецифический гуморальный фактор иммунодефицитных состояний П Биохимия-медицине: Тез. докл. науч. конф.- Л., 1988.- С. 165-166 (соавт. Н.В. Журавлева).

20. Зависимость иммунных показателей у больных пародонтозом от величин ЦИК и индекса РИА 11 Влияние факторов внешней среды на реактивность организма: Матер, регион, научно - практич. конф.- Киев-Ворошиловград , 1990,- Т. 1.- С. 29-30 (соавт. Н.В. Журавлева, Л.А. Малиновская, Т.А. Журавлева).

21. ЕИФ и некоторые иммунологические показатели лимфоидной системы в эксперименте // Актуальные проблемы инфекционной патологии, клинической иммунологии и медицинской генетики.- Москва-Луганск, 1990,- С. 17-18 (соавт. Н.В. Журавлева).

22. Иммунодефицита у больных как результат функционирования ЕИФ // Там же,- С. 18-19 (соавт. Н.В.Журавлева, Л.А.Малиновская и др.).

23. Гуморальный фактор иммуносупрессии ЕИФ в оценке иммунного статуса организма // Реабилитация иммунной системы: Тез. докл. Все-союзн. конф.- Цхалтубо, 1990,- № 153 (соавт. Н.В. Журавлева).

24. ЕИФ и эндокринная регуляция иммунной реакции организма // Взаимодействие нервной и иммунной систем: Тез. докл.У Всесоюзн. симпозиума.- Ростов-на-Дону, 1990.- С. 32-33 (соавт. Н.В. Журавлева).

25. Естественный ингибирующий фактор (ЕИФ) и некоторые иммуно-регуляторные показатели в эксперименте //Актуальные проблемы экологической иммунологии, морфологии и иммунореабилитации в условиях индустриального региона Донбасса: Сб. тр. 3-й межрегион, науч,-практич. конф.- Москва-Луганск, 1991.- С. 23 (соавт. Н.В. Журавлева).

26. Естественный ингибирующий фактор (ЕИФ) у крыс при острой не-возмещенной кровопотере // Актуальные проблемы экологической иммунологии, морфологии и иммунореабилитации в условиях индустриального региона Донбасса: Сб. тр. 4-й межрегион, науч.- практич. конф. - Москва-Луганск, 1991.- С. 22 (соавт. Н.В. Журавлева, В.В. Со-релля).

27. Экспериментальное обоснование коррекции функционирования ЕИФ // Гам же,- С. 23 (соавт. Н.В. Журавлева, В.В. Сорелля).

28. Антителозависимая цитотоксичность (АЗТК), иммуноглобулины, ЕИФ и ЦИК у больных пародонтозом // Там же,- С. 24 (соавт. Н.В. Журавлева, В.В. Сорелля, Л.А. Малиновская).

29. Влияние унитиола на АОК и другие иммунокомпетентные клетки селезенки крыс // Материалы докладов У регион, науч. конф. иммунологов, инфекционистов, генетиков, аллергологов Луганской обл.- Москва-Луганск, 1992.- С. 35-36 (соавт. Н.В. Журавлева).

30. Естественный ингибирующий фактор (ЕИФ) и интенсивность образования антител у иммунизированных животных // Там же.- С. 36-37 (соавт. Н.В. Журавлева).

31. ЕИФ и иммунодефициты в эксперименте и клинике //Актуальные проблемы медицины: юбилейный сб. науч. тр.- Воронеж, 1993.-Т. 1.-С. 99-103 (соавт. Н.В. Журавлева, И.Г. Кокорева, В.И. Болотских.).

32. Альбумин как средство инактивации ЕИФ // Естественное ингиби-рование активности и подавление синтеза антител класса М: Сб. науч. тр. Саратовского мед. ин-та,- Саратов, 1993.- С. 11-16 (соавт. Н.В. Журавлева, В.В. Сорелля).

33. Влияние унитиола на активность ЕИФ в эксперименте // Там же.-С. 55-59 (соавт. Н.В. Журавлева).

34. Анализ этиологии вторичных иммунодефицитов и тактика их лечения // Традиционные и нетрадиционные методы реабилитации больных: Тез. докл.II Межд. симпозиума - Анапа, 1994. - С. 220-222 (соавт.

B.П. Захаров).

35. Клинико-лабораторные исследования экологически зависимых заболеваний (иммунитет и характер клинических проявлений) // Первый национальный конгресс по профилактической медицине: Тез. докл. -

C.-П., 1994,- Т. 2. - С. 39 (соавт. Н.В. Журавлева, Н.А .Степкина).

36. Естественный ингибирующий фактор (ЕИФ) в системе регуляции иммунного гомеостаза // Впервые в медицине: Тез. докл. Второго национального конгресса по профилактической медицине,.- С.-П., 1995.-Т.2-3.- С. 138 (соавт. В.П. Захаров).

37. Иммунологические показатели при проведении пролонгированного курса ГБО у больных рассеянным склерозом // Бюлл. гипербарической биологии и медицины,- 1995.- Т. 3, № 1-2,- С. 18-27 (соавт. М.В. Васильев, E.H. Подшивалкин, П.Н. Савилов).

38. Естественный иммуносупрессивный фактор (ЕИФ) - эффекторное звено в системе нейроиммуноэндокринной регуляции гомеостаза // 1п-ternatoinal Journal on Immunorehabilitation: Тез. YII Междунар. конгресса,- 2001.- Vol. 3, № 1,- P. 112.

39. Иммунотропные свойства альбумина // Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии: Тез. докл. 4-го Конгресса РААКИ,- М., 2001,- С. 385.

40. Методика диагностики вторичного иммунодефицитного состояния (ВИДС): Информационный листок № 136.- Воронеж: ЦНТИ, 2001.-2 с.

41. Инактивация ингибирующей активности сыворотки крови с помощью гомологичного альбумина // Аграрная наука.-2002.-№ 12.-С. 2324.

42. О способности гидрокортизона индуцировать ингибирующую активность сыворотки крови// Аграрная наука.-2003.-№ 1.-С. 21-22.

ОТКРЫТИЯ

1. Явление снижения интенсивности образования антител в организме млекопитающих под действием естественного ингибирующего фактора: Открытие № А-171. - 1998 // Научные открытия. - М., 2001,- С. 7 (соавт. Н.В. Журавлева).

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. A.c. № 1264427 РФ. Способ повышения резистентности организма // Открытия, изобретения.- 1986.- № З.-Не подлежит опубликованию (соавт. Н.В. Журавлева, А. Н.Леонов, С.Я .Дьячкова).

2. A.c. № 1802326 РФ, МКИ3 GOIN33/53.Способ инактивации естественного ингибирующего фактора. Заявл. 9.10.92 г.// Открытия, изобретения,- 1993,- № 10,- С. 152 (соавт. Н.В. Журавлева).

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Реакция ингибирования активности антител /РИА/ в диагностике вторичного /или временного / иммунодефицита: Метод, рекомендации МЗ РСФСР,- Воронеж, 1989,- 11 с. (соавт. Н.В. Журавлева, В.Е. Рыч-нев, В.М. Фролов и др.).

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. К настоящему времени патогенез вторичных иммунодефицитов изучен в недостаточной степени. Продолжается исследование при различных патологических состояниях иммуносупрессивного эффекта субпопуляций Т-лимфоцитов, цитокинов [201, 233, 234, 246], подклассов иммуноглобулинов, механизмов естественной гибели клеток - апоптоза [10, 226, 242].

Несомненный интерес для понимания этой проблемы представляют исследования компенсаторных и адаптационных реакций, но не только внутри иммунной системы, а с учетом всех ее непосредственных межсистемных связей. При этом изменения иммунного статуса должны рассматриваться в единой взаимосвязанной реакции нервной и эндокринной систем [28, 49, 90, 150, 184, 2 13, 292, 313], метаболического статуса, а не как изолированный дисбаланс только одной иммунной системы [2, 94, 241, 281, 285]. Только при таком подходе могут быть найдены эффективные способы лечения и профилактики вторичных иммунодефицитов.

Все системы иммунного гомеостаза в нормальных условиях находятся между собой в сложных, упорядоченных взаимодействиях. Воздействие на иммунный гомеостаз повышенных функциональных нагрузок ведет к напряженной работе механизмов саморегуляции и далее - к развитию компенсации (восстановлению нарушенного равновесия) или же - к суб- и декомпенсации [104, 157].

В свете вышесказанного большой интерес представляет изучение механизмов подавляющего действия на образование антител естественного гуморального фактора, отличительной чертой которого является ингибирование активности циркулирующих в крови макромолекулярных М) антител различной специфичности

47, 69, 88, 89, 228].

Исследованиями Н.В. Журавлевой, Н.В. Лобеевой (1978), Н К. Родосской (1986) было установлено, что активность естественного ингибирующего фактора (ЕИФ) связана с увеличением концентрации в крови аминокислоты цистеина [70], активных сульфгидрильных групп [179] При этом ингибирующей активностью по отношению к макромолекулярным антителам, как показала Н В. Журавлева (1979), обладает как цельная сыворотка, так и альбуминовая фракция сывороточных белков [63]. Установлено, также, что выработка ЕИФ в организме экспериментальных животных стимулируется как антигенными, так и неантигенными воздействиями. Функционирование ЕИФ в организме в физиологических условиях продолжается 10-14 дней и несет гомеостати-ческую функцию, регулируя уровень макроглобулинов. Однако, дальнейшее циркулирование ЕИФ приводит к развитию иммунологической недостаточности, снижая интенсивность образования антител [72, 176, 179] Исследователями было высказано предположение об участии определенных этапов тиол-дисульфидного обмена в регуляции имм) нного гомеостаза [74, 179]

Широкая распространенность естественного ингибирующего фактора у больных с разнообразной патологией и значение его определения для прогнозирования течения заболевания показано в работах различных авторов. Так, ингибирующая активность сыворотки крови выявляется у больных с хроническими нагноительными заболеваниями бронхо-легочной системы [56, 149, 166], у детей с хроническим пиелонефритом [202], у больных с рожистым воспалением (часто рецидивирующее течение) [232], острым инфарктом миокарда [212], тяжелым пародонтитом [139], у больных сифилисом [17], у женщин с осложненным течением беременности [141], при механической травме и анаэробной газовой инфекции в эксперименте [249]

В доступной нам литературе не содержатся сведения о механизме супрессивного эффекта естественного ингибирующего фактора на образование антител, отсутствуют сведения о способах, с помощью которых можно инактивировать ЕИФ Между тем, решение этих вопросов имеет большое значение для разработки методов коррекции вторичного иммунодефицитного состояния, вызванного ЕИФ, у больных с различной патологией, а также - для расширения наших представлений о межсистемных механизмах регуляции иммунологического гомеостаза

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования состояла в том, чтобы на экспериментальных моделях in vivo и in vitro установить патогенетические механизмы развития иммуносупрессии, обусловленной функционированием в организме естественного фактора, подавляющего активность циркулирующих макромолекулярных (Ig М) антител, а также разработать способы коррекции иммуносупрессии данного генеза

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать патогенетические механизмы иммуносупрес-сивного эффекта естественного ингибирующего фактора:

- его влияние на мобильность мембранных иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов;

- влияние ЕИФ на клеточные механизмы регуляции иммуногенеза.

2. Изучить влияние веществ, индуцирующих ингибирующую активность сыворотки крови (цистеина и унитиола), на мобильность мембранных рецепторов В-лимфоцитов, клеточные механизмы регуляции иммуногенеза

3. Исследовать взаимосвязь гормона кортизола и ингиби-рующей активности сыворотки крови

4. Экспериментально разработать методы коррекции иммуно-супрессии, обусловленной функционированием ЕИФ:

- обосновать использование гипербарической оксигенации в качестве средства, инактивирующего ЕИФ;

- обосновать применение сывороточного альбумина с целью инактивации ЕИФ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые удалось установить механизм развития иммуносу-прессии, обусловленной функционированием в организме ЕИФ. Свое супрессивное действие на антителообразование естественный ингибирующий фактор осуществляет путем противодействия мобильности мембранных иммуноглобулиновых рецепторов, а именно - формированию "кэпов " Этим влиянием на рецепторный аппарат лимфоцитов ЕИФ предотвращает дифференцировку Влимфоцитов в антителообразующие клетки. Этот механизм лежит в основе супрессивного действия ЕИФ на различных этапах анти-телогенеза (в индуктивную и продуктивную его фазах). Кроме того, при функционировании ЕИФ в организме отмечается снижение индекса иммунологической регуляции Бсц /Fey. Полученные результаты показывают, что ЕИФ является одним из факторов "позднодействующей" супрессии

Впервые показано, что сывороточный альбумин, как участник тиол-дисульфидного обмена, является не только носителем, но и инактиватором ингибирующей активности сыворотки крови.

Впервые показано, что кислород под повышенным давлением, как оксидант, является инактиватором ингибирующей активности сыворотки крови

Впервые показана возможность индуцирования ингибирующей активности сыворотки крови с помощью парентерального введения в организм гидрокортизона, а также - дозозависимость этого эффекта Функционирование естественного ингибирующего фактора подчиняется регуляторным влияни ,м нейрогормональных механизмов стресс - реакции

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Результаты исследований раскрывают механизм иммуносу-прессивного действия естественного ингибирующего фактора. Это имеет большую практическую ценность, так как позволяет своевременно диагностировать данный вид вторичной иммунологической недостаточности, возникающий при длительном функционировании ЕИФ в организме и который, как показывают клинические исследования, широко распространен у пациентов с различной патологией.

Разработана экспериментальная модель коррекции иммуно-супрессии, вызываемой ЕИФ, с помощью гипербарической окси-генации.

Разработана экспериментальная модель коррекции иммуно-супрессии, вызываемой ЕИФ, с помощью парентерального введения гомологичного альбумина.

Разработана экспериментальная модель воспроизведения им-муносупрессивного действия ЕИФ с помощью соединений, которые содержат активные сульфгидрнльные группы - цистеина и унитиола.

Разработана экспериментальная модель индуцирования инги-бирующей активности сыворотки крови с помощью парентерального введения животным гидрокортизона

РЕАЛИЗАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты проведенного исследования зарегистрированы как научное открытие № А-171 (Н В Журавлева, Н.К. Родосская "Явление снижения интенсивности образования антител в организме млекопитающих под действием естественного ингибирую-щего фактора", 1998)

По материалам работы оформлены два изобретения: "Способ повышения резистентности организма, А С. № 1264427, 1986г. (соавторы Н.В.Журавлева, А.Н Леонов, С Я.Дьячкова) и "Способ инактивации естественного ингибирующего фактора", A.C. № 1802326, 1992г. (соавтор Н.В.Журавлева).

В ходе проведения научных исследований созданы методики, признанные рационализаторскими предложениями:

1. Способ индуцирования ингибирующей активности сыворотки крови № 1 1 14 (18.03.1988г.).

2. Способ индуцирования ингибирующей активности сыворотки крови № 1 120 (25.04.1988г ).

По материалам исследований опубликована 43 научные работы, включая монографию "Иммунодефициты и естественное инги-бирование активности макромолекулярных антител" в соавторстве с Н.В.Журавлевой (1988) и методические рекомендации "Реакция ингибирования активности антител (РИА) в диагностике вторичного (или временного) иммунодефицита" (1989) (и соавторстве).

Результаты исследования внедрены в практическую работу иммунологической лаборатории и врача - клинического иммунолога поликлиники № 4 г Воронежа, в практическую работу клинико-диагностической лаборатории городской клинической больницы № 10 г Воронежа, в учебный процесс на кафедрах терапии № 1 факультета усовершенствования врачей, факультетской терапии, инфекционных болезней, госпитальной педиатрии Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко, в научную и практическую работу отд ла микробиологии, вирусологии и иммунологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии.

Основные результаты диссертации доложены на YII научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета

12 при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1988), научной конференции "Биохимия - медицине" (Ленинград, 1988), на межрегиональных научно-практических конференциях "Актуальные проблемы инфекционной патологии, клинической иммунологии и медицинской генетики" (Москва-Луганск, 1990, 1991), Всесоюзной конференции "Реабилитация иммунной системы" (Цхалтубо, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммунной систем" (Ростов-на-Дону, 1990), У региональной научной конференции иммунологов, инфекционистов, генетиков, аллергологов Луганской области (Москва-Луганск, 1992), Втором международном симпозиуме "Традиционные и нетрадиционные методы реабилитации больных"(Анапа, 1994), Первом и Втором национальных конгрессах по профилактической медицине (С -Петербург, 1994, 1995), УП Международном конгрессе "Реабилитация в медицине и иммунореабилитация" (Нью-Йорк, 2001), 4-ом Конгрессе РААКИ (Москва, 2001), межкафедральной конференции Воронежской государственной медицинской академии с участием кафедр факультетской терапии, терапии № 1 факультета усовершенствования врачей, патологической физиологии, инфекционных болезней, центральной научно-исследовательской лаборатории, сотрудников отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии (Воронеж, 2002)

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Механизм иммуносупрессивного действия естественного инги-бирующего фактора заключается в его влиянии на мобильность поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов, т.е. в подавлении феномена "шляпкообразования".

2. Коррекция иммуносупрессии, вызываемой функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, возможна с помощью гипербарической оксигенации в нетоксических дозах (2 избыточные атмосферы в течение 1 часа трижды через день). Им-мунокорригирующее действие гипербарической оксигенации связано с окислением активных сульфгидрильных групп естественного ингибирующего фактора

3. Коррекция иммуносупрессии, вызываемой функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, возможна с помощью парентерального введения в ор1анизм гомологичного альбумина (в дозе 5% - 10% от имеющегося в сыворотке крови) Альбумин является, с одной стороны, носителем, с другой стороны- инактиватором ингибирующей активности сыворотки крови благодаря своему активному участию в процессах тиол - дисуль-фидного обмена.

4 Введение животным гидрокортизона индуцирует появление у них ингибирующей активности сыворотки крови. Этот эффект носит дозозависимый характер

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОК - антителообразующие клетки

АОС - антиоксидантная система

АСГ - антистрептогиалуронидаза

АСК - антистрептокиназа

ACJ1-0 - антистрептолидаза-0

ГБО - гипербарическая оксигенация

ГК - гидрокортизон

ГГНС - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ЕИФ - естественный ингибирующий фактор

ИИ РИА - индекс ингибирования реакции ингибирования активности антител

ИИР Fc^i - индекс иммунологической регуляции Fc^i /Fey /Fey

ИИ АОК - индекс ингибирования антителообразующих клеток

ИДС - иммунодефицитное состояние

ОИМ - острый инфаркт миокарда

РБТЛ - реакция бластной трансформации лимфоцитов

РИА - реакция ингибирования активности антител

17-ОКС - 1 7-оксикортикостероиды

НБТ - небелковые тиолы

SH- -сульфгидрильные группы группы

ФГА - фитогемагглютинин

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЯСК - ядросодержащие клетки

- иммуноглобулины

- десятичный логарифм

В диссертации, в ряде случаев, при цитировании литературных источников приводились термины, характеризующие субпопуляции лимфоцитов, определение которых было основано на методах розеткообразования и которые использовали авторы цитируемых работ.

126 ВЫВОДЫ

1. Установлен механизм иммуносупрессивного действия естественного ингибирующего фактора, заключающийся в снижении мобильности поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов.

2 Установлено, что иммуносупрессивное действие естественного ингибирующего фактора временно и обратимо и наиболее выражено в период максимальной ингибирующей активности сыворотки крови Снижение активности ЕИФ приводит к восстановлению мобильности иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов

3 Иммуносупрессивное действие естественного ингибирующего фактора проявляется как в индуктивной, так и в продуктивной фазах иммунного ответа При функционировании ЕИФ в организме происходит снижение индекса иммунологической регуляции Рсц/Рсу за счет уменьшения количества Рсц-клеток, снижение числа ядросо-держащих клеток регионарных лимфоидных органов

4 Иммуносупрессивное действие естественного ингибирующего фактора проявляется по отношению как Т-зависимого, так и Т-независимого антигенов

5 Воспроизведение иммуносупрессивного эффекта естественного ингибирующего фактора возможно с помощью парентерального введения соединений, содержащих активные сульфгид-рильные группы - цистеина и унитиола

6 Установлено неизвестное ранее эффекторное действие гидрокортизона, реализующееся в индуцировании им ингибирующей активности сыворотки крови при его парентеральном введении в организм.

7. Коррекция иммуносупрессии, обусловленной функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, осуществляется при воздействии на организм гипербарической оксигенации.

8. Коррекция иммуносупрессии, обусловленной функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, осуществляется с помощью парентерального введения гомологичного альбумина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный в эксперименте способ моделирования инги-бирующей активности сыворотки крови и, соответственно, иммуносупрессии, связанной с функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, основанный на парентеральном введении соединений, содержащих активные сульфгидрильные группы - цистеина и унитиола, может использоваться в экспериментальной иммунологии для дальнейшего изучения иммунотропных свойств ЕИФ. Можно рекомендовать, также, клиническую апробацию этих препаратов у пациентов с аутоиммунной патологией

2. Установленная способность гидрокортизона индуцировать появление ингибирующей активности сыворотки крови может явиться предметом дальнейших исследований как в экспериментальной, так и в клинической иммунологии.

3. С целью коррекции иммуносупрессии, связанной с функционированием в организме естественного ингибирующего фактора, рекомендуется использование гипербарической оксигенации (2 избыточные атмосферы в течение 1 часа трижды через день) или же введение гомологичного альбумина (из расчета 5-10% от имеющегося в сыворотке крови три или четыре раза с интервалом 5 дней). Эти способы могут быть рекомендованы для клинической апробации

4 Полученные результаты, свидетельствующие о значительном влиянии естественного ингибирующего фактора на иммунологическую реактивность, диктуют необходимость исследования реакции ингибирования активности антител сыворотки крови при иммунологическом обследовании пациентов различного профиля для выявления иммуносупрессии, обусловленной функционированием в организме ЕИФ, что позволит более объективно оценить состояние больного, позволит прогнозировать течение заболевания, развитие осложнений, эффективность плановой вакцинации