Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение роли Д1, Д2 и Д4 подтипов дофаминовых рецепторов в механизмах действия психомоторных стимуляторов

На правах рукописи

НОВОСЕЛОВ Илья Александрович

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ Д1, Д2 и Д4 ПОДТИПОВ ДОФАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В МЕХАНИЗМАХ ДЕЙСТВИЯ ПСИХОМОТОРНЫХ СТИМУЛЯТОРОВ

14. 00.25 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I 1

Москва- 2003

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова Российской Академия медицинских наук

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, профессор К.С. Раевский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Т. А. Воронина

доктор биологических наук, профессор H.A. Тушмалова

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится " "_2003 г. в_часов

на заседании Диссертационного Совета Д.001.024.01 в ГУ НИИ фармакологии РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части ГУ НИИ фармакологии РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

Автореферат разослан "_"_2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е.А.Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Психомоторные стимуляторы находят применение в медицине для лечения ряда психоневротических расстройств (адинамические, энергические и апатические состояния, нарколепсия, синдром гиперактивности с нарушением внимания у детей), а также дня повышения умственной и физической работоспособности. Вещества, близкие по структуре к фенилалкиламинам используются для коррекции избыточного веса (Машковский, 1993; Арушанян, 2003; Holmes, 1995; Poulin, 2001).

Вместе с тем, использование психостимуляторов в значительной степени ограничено наличием серьезных побочных эффектов (периферические симпатомиметические эффекты, гипертермия, моторная гиперактивность, психотические шизофреноподобные состояния, нарушения сна, нейротоксическое действие).

Характерной особенностью фармакологического спектра веществ данной группы является эйфоризирующий эффект, с которым связан высокий риск развития физической и психической зависимости. Указанное свойство является причиной широкого немедицинского использования психостимуляторов, что влечет за собой' развитие наркомании.

Наиболее распространенными психостимуляторами являются представители группы фенилэтиламина (амфетамин, метамфетамин, метилфенидат и их аналоги). Близким по действию к фенилэтиламинам является растительный алкалоид кокаин.

Медицинское, а особенно немедицинское применение психостимуляторов в последние годы постоянно растет, представляя собой серьезную социальную проблему. Так, по данным зарубежной статистики, немедицинское потребление амфетаминов среди подростков в США и Канаде в период 80-90х гг. прошлого века выросло в 1,5-2 раза (Poulin, 2001). Не меньшее рапространение имеет кокаиновая наркомания.

Таким образом, одной из актуальных задач современной психофармакологии является изучение тонких механизмов, лежащих в основе психостимулирующего и нейротоксического действия соединений данной группы. Не менее важной задачей представляется создание нетоксичных заменителей амфетаминов с одной стороны, и веществ эффективных для профилактики и лечения патологических состояний, связанных с хроническим приемом психостимуляторов.

Многочисленные исследования, проведенные в последнее время, подтвердили высказанное ранее предположение, согласно которому нейрохимической основой механизма действия амфетаминов является их способность вызывать «обращение» или ингибирование функции дофаминового транспортера (ДАТ) - специфического мембранного бежа, обеспечивающего обратный захват (re-uptake) нейротансмиттера в нервные окончания

дофаминергических нейронов. Результатом этого является значительное возрастание внеклеточной концентрации ДА и усиление функциональной активности дофаминергической нейропередачи (Seiden et al., 1993; Cho and Segal, 1994; Jones et al., 1998).

По мере высвобождения во внеклеточное пространство, ДА взаимодействует со специфическими дофаминовыми рецепторами, инициируя процессы внутриклеточной сигнализации (запуск каскадов вторичных мессенджеров, изменение проницаемости Na+-, K+-, Са2+ - каналов, индукцию генов раннего ответа), что опосредует клеточный ответ (Missaleetal., 1998).

Дофаминовые рецепторы подразделяют на 2 основных семейства: Д2-подобные (включает Д2-, ДЗ- и Д4-рецепторы) и Д1-подобные (Д1- и Д5-рецепторы, соответственно). Отличительной особенностью Д2/ДЗ дофаминовых рецепторов считается их локализация на дофаминергических нейронах, что подразумевает ауторецепторную функцию.

Исследования последнего времени, в том числе с использованием генетических манипуляций позволило выявить наличие сложной регуляторной взаимосвязи между ДАТ и До-подтипом дофаминовых рецепторов. Было показано, что Д2-антагонист раклоприд значительно удлиняет время клиренса ДА в структурах мозга крыс, оказывая тем самым непосредственное модулирующее влияние со стороны Д2-подтипа дофаминовых рецепторов на функциональную активность ДАТ (Cass et al., 1994). С другой стороны, стимуляция Д2-рецепторов опосредует активацию работы ДАТ и обратного захвата ДА (Malenka et al., 2000).

Тем не менее, истинная роль пре- и постсинаптического рецепторных компонентов в механизме действия психостимуляторов изучены явно недостаточно. В связи с этим, детальный анализ возможного вклада отдельных подтипов дофаминовых рецепторов в формирование нейрохимических и фармакологических эффектов психостимуляторов, с использованием селективных антагонистов этих рецепторов представляется своевременным и целесообразным.

Наряду с хорошо известным психостимулятором амфетамином, в представленной работе использовался оригинальный отечественный препарат сиднокарб (3-(ß-фенилизопропил)-М-фенилкарбамоилсиднонимин). Сиднокарб обладает сходным с амфетамином спектром фармакологической активности при умеренном побочном действии.

Важным шагом вперед в изучении механизма действия пихостимуляторов явилось применение метода внутримозгового микродиализа (Андяржанова и соавт., 1999, 2002; Sharp et al., 1983; Gainetdinov et al., 1997; Afanas'ev et al., 2001). Было показано, что сиднокарб по своему нейрохимическому профилю существенно отличается от амфетамина (Gainetdinov et

al., 1997; Anderzhanova et al., 2000; Afanas'ev et al., 2001), что указывает на необходимость более подробного изучения последнего.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение функциональной роли рецепторного звена дофаминергической нейропередачи мозга, в том числе участие отдельных подтипов дофаминовых рецепторов, в механизме действия психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние d-амфетамина и сиднокарба на динамику изменения внеклеточной концентрации ДА и его метаболитов ДОФУК и ГВК) в дорзальном стриатуме свободноподвижных крыс in vivo.

2. Оценить влияние антагонистов Д1-, Д2- и Д4-подтипов дофаминовых рецепторов на изменение внеклеточного уровня ДА и его метаболитов, обусловленное воздействием d-амфетамина и сиднокарба.

3. Исследовать эффекты антагонистов различных подтипов дофаминовых рецепторов на динамику стереотипного поведения крыс, вызванного психостимуляторами.

4. Оценить вклад отдельных подтипов дофаминовых рецепторов (Д1, Д2 и Д4) в механизмы формирования локомоторной гиперактивности, обусловленной воздействием d-амфетамина и сиднокарба.

5. Изучить эффекты психостимушггоров на локомоторную активность и паттерн экспрессии белка c-Fos (продукта «раннего гена» c-fos) в мозге мышей инбредных линий С57В1 и BALB/c Научная новизна исследования. Впервые продемонстрировано различное влияние Д1, Д2 и Д4-подтипов дофаминовых рецепторов на изменение дофаминергической нейропередачи в стриатуме крыс линии Вистар (in vivo), обусловленное введением оригинального психостимулятора сиднокарба. Впервые проведен сравнительный анализ участия отдельных подтипов (Д1, Д2 и Д4) дофаминовых рецепторов в механизме развития стереотипного поведения, вызванного d-амфетамином и сиднокарбом. При регистрации индивидуальной двигательной активности животных (установка "Opto-Varimex"), выявлено неодинаковое вовлечение Д1, Д2 и Д4 дофаминовых рецепторов в механизмы развития локомоторного возбуждения, вызванного воздействием d-амфетамина и сиднокарба. В работе впервые продемонстрирована экспрессия белка Fos (продукта гена «раннего ответа» c-Fos) в мозге мышей инбредных линий С57В1 и BALB/c, вызванная однократным введением сиднокарба. Научно-практическое значение. Был проведен сравнительный анализ изменения нейрохимических и поведенческих характеристик животных в условиях воздействия d-амфетамином и сиднокарбом. Обнаружена значительная гетерогенность участия дофаминовых рецепторов Д1-, Д2- и Д4-подгапов в механизмах формирования психостимулирующего

эффекта. Учитывая более низкую вероятность возникновения лекарственной зависимости, а также менее выраженные побочные эффекты отечественного психостимулятора по сравнению с d-амфетамином, выяснение тонких механизмов действия этих соединений вносит существенный вклад в определение стратегии направленного поиска веществ обладающих оптимальным спектром психостимулирующего действия, при минимальном риске возникновения побочных эффектов.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на 5th ECNP Regional Meeting, С.-Петербург, 2000, на VIII Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии», Казань, 2001, на ХХШ конгрессе CINP, Montreal, 2002, Международном симпозиуме «Neuron differentiation and plasticity - regulation by intercellular signals», Москва, 2003, Ежегодной Всероссийской конференции «Человек и лекарство», Москва, 2003, на лабораторных и межлабораторных семинарах НИИ фармакологии РАМН.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 335 отечественных и зарубежных источников. Диссертация содержит 1 таблицу и 27 рисунков.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 публикациях (8 тезисов и 3 статьи).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы 169 самцов крыс линии Вистар, весом 200-260 г; 320 самцов мышей линии С57В1 и 25 самцов мышей линии BALB/c, весом 20-25 г.

В работе использовали следующие вещества: d-амфетамин (Sigma), сиднокарб (ЦХЛС ВНИХФИ), SCH23390, раклоприд и клозапин (все - RBI). Для приготовления буферных растворов, перфузирующих растворов, подвижных фаз для хроматоргафического разделения веществ использовались реактивы фирм Биохром, ICN, Merk. 1. Методика внутримозгового микродиализа

Крыс линии Вистар анестезировали хлоралгидратом (400 мг/кг внутрибрюшинно) и фиксировали в стереотаксическом приборе. Микродиализный зонд имплантировали в дорзальный стриатум по координатам: АР +0,5 мм; L -3,0 мм; DV -7,0 мм [Paxinos and Watson, 1986]. Зонд фиксировали на черепе. В работе использовали концентрические микродиализные зонды (Di Chiara et al., 1985; Gainetdinov et al., 1994) с диализной мембраной проницаемостью до 15000 ДА ("Hospal AN-69", Italy).

Перфузию мозга проводили через 24-48 часов после операции, используя искусственную цереброспинальную жидкость, содержащую 150 мМ Na+, 1,4 мМ Са2+, 30 мМ К1", 0,8 MM Mg2+, 31,0 мМ РО4", 155 мМ СГ, pH 7,4. Для подачи жидкости использовали шприцевый насос (Braun perfusor VI, TUV Rheinland, Германия), скорость тока составляла 2 мкл\мин. Диализаты собирали каждые 20 минут в течение 4-5 часов. Для определения базального уровня содержания ДА, ДОФУК и ГВК использовали 3-4 начальных образца.

Образцы диализата без дополнительной очистки анализировали на содержание ДАа и его метаболитов с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД), на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette,

США), снабженным инжектором Rheodyne 7125 с петлей на 20 мкл для нанесения образцов. ДА, ДОФУК и ГВК разделяли на колонке с обращенной фазой (3x150 мм, С18, 5 мкм, МНПП "Элсико", Москва). В качестве подвижной фазы использовали 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0,3 мМ октансульфата натрия, 0,1 мМ ЭДГА и 9% ацетонитрила (рН 3,6).

Среднее содержание ДА, ДОФУК и ГВК в базальных образцах принимали за 100% , по отношению к которому рассчитывали эффекты веществ. По окончании эксперимента животных декапитировали и проводили морфологический контроль для определения положения зонда.

Антагонисты Д1 (SCH23390), Д2 (раклоприд) и Д4 (клозапин) подтипа дофаминовых рецепторов вводили внутрибрюшинно в дозах 0,1 мг/кг, 1,2 м/кг и 10 мг/кг, соответственно. D-амфетамин в дозе 5 мг/кг и сиднокарб в дозе 50 мг/кг вводили подкожно через 20 мин после инъекции SCH23390 и раклоприда, и через 40 мин после введения клозапина.

2. Методика стереотипного поведения крыс

Оценку стереотипного поведения животных проводили параллельно с экспериментами по микродиализу (см. выше), используя 6-балльную шкалу (Havamann et al, 1986).

3. Регистрация спонтанной двигательной активности мышей

Регистрацию двигательной активности мышей линии С57В1 проводили с помощью установки "Opto-Varimex" (США) индивидуально для каждого животного. В предварительной серии экспериментов было проведено определение доз исследуемых веществ, которые не вызывали значимого угнетения спонтанной двигательной активности Тестирование состояло из трех последовательных сессий по 10 мин каждая с перерывом между сессиями 20 мин. Рецепторные антагонисты или 0,85% раствор NaCl вводили внутрибрюшинно сразу после первой сессии, d-амфетамин и сиднокарб, в дозах 2 и 10 мг/кг, соответственно (равноэффективных по величине локомоторной активности животных) как и 0,85% раствор NaCl, непосредственно после второй тестовой сессии.

Эффект антагонистов на локомоторную активность мышей представлен как отношение показателей двигательной активности при 2-ом и 1-ом тестировании, выраженное в процентах. Влияние тех же веществ на локомоторную гиперактивность, вызванную психостимуляторами оценивалось как процентное отношение показателей двигательной активности при 3-ем и 1-ом тестировании.

4. Оценка активности гена c-Fos.

Оценка двигательной активности мышей линий С57В1 и BALB/c. Индивидуально содержащиеся животные, в домашних клетках, помещались накануне проведения исследования в экспериментальную комнату под видеокамеру. Регистрацию поведения проводили с _ помощью установки VideoMnt-2 Videotracking System (TSE, Германия) в звукоизолированном помещении. Одновременно регистрировали поведение 3-х животных разных экспериментальных групп. Регистрация проводилась в 2 этапа. На первом этапе в течение 30 мин оценивали фоновую локомоторную активность животных в домашних клетках, после чего первой группе вводили d-амфетамин (5мг/кг), второй - сиднокарб (50 мг/кг) и третьей - 0,85% раствор NaCl. На втором этапе двигательную активность регистрировали в течение 30 мин.

Через 90 мин после инъекций препаратов животных декапитировали, мозг извлекали и замораживали при -70°С.

Иммуногистохимическое выявление c-Fos белка. Коронарные срезы толщиной 20 мкм готовили на криостате, помещали на стекла и фиксировали в холодном 4% параформальдегиде, после чего трижды промывали в фосфатном буфере и преинкубировали с нормальной козьей сывороткой (2-5% раствор) в течение 30 мин для снижения неспецифического окрашивания.

Далее, срезы инкубировали с поликлональными кроличьими антителами (разведение 1:2000) к Fos-белку (Ab-5, Oncogene Research Product, Cambridge, UK) в течение 12-14 часов при температуре +22°С. После инкубации со вторичными биотинилированными антителами

(разведение 1:300) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) в течение 90 минут, использовали стандартную ABC-методику (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories) с последующим окрашиванием 0,6% раствором диаминобензидина (Vector Laboratories).

Приготовленные таким образом препараты проводили по спиртам возрастающей концентрации, окончательно обезвоживали в ксилоле и заключали под покровные стекла. Изображение окрашенных срезов оцифровывалось с помощью микроскопа Olympus ВХ50 и высокоразрешающей камеры Nikon DMX1200. Подсчет количества Fos-положительных клеток проводили с помощью программы AnalySiS (Soft Imaging System GmbH) в следующих структурах мозга: вторичная моторная кора, полосатое тело, перегородка, центральная часть прилежащего ядра, оболочка прилежащего ядра. Идентификацию структур мозга проводили согласно атласу Franklin and Paxinos, 1996.

Данные обрабатывали статистически по U-критерию Манна-Уитни. Результаты представлены в виде M±SEM (среднее ± стандартная ошибка среднего) или M±SD (среднее ± стандартное отклонение).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение эффектов веществ, модулирующих дофаминергическую нейропередачу, на динамику изменения содержания ДА, ДОФУК и ГВК в дорзальном стриатуме крыс in vivo.

Влияние психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба на параметры дофаминергической нейропередачи в дорзальном стриатуме крыс.

Однократное введение d-амфетамина в дозе 5 мг/кг в/б вызывало быстроразвивающееся, выраженное повышение уровня внеклеточного ДАа, составлявшее через 20 минут после введения психостимулятора 835±231% относительно базального уровня. В дальнейшем, наблюдалось постепенное снижение внеклеточного содержания нейротрансмиттера практически до исходных значений (Рис. 1).

Внеклеточное содержание ДОФУК, на фоне введения d-амфетамина в указанной дозе, достоверно снижалось до 37±12% (к 80 мин), сохраняясь в дальнейшем практически неизменным. Динамика изменения внеклеточной концентрации ГВК была в целом сходной.

Сиднокарб (50 мг/кг в/б) вызывал более умеренное, по сравнению с d-амфетамином, повышение внеклеточного уровня ДА, через 40 мин после введения составлявшее около 300% относительно базальных значений. В дальнейшем, содержание ДА постепенно снижалось, оставаясь, однако, несколько повышенным до конца наблюдения (Рис. 1).

Уровень ДОФУК в течение первого часа достоверно не изменялся, однако, затем отмечалась тенденция к некоторому повышению этого показателя. Значимых изменений концентрации ГВК отмечено не было.

Наблюдаемые нами различия в эффектах d-амфетамина и сиднокарба на внеклеточное содержания ДА, ДОФУК и ГВК, по-видимому, определяются неидентичностью тонких механизмов действия двух психостимуляторов (Альтшулер и соавт., 1973; Альтшулер и соавт., 1977; Gainetdinov et al., 1997).

1100-, 1000 900 Н 800 700-I 600 5004003002001000

0,85% NaCI d-амфетамин сиднокарб

~г

X

~г

1 I I I I I I i г

■40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Время в мин

Рис. 1. Эффект d-амфетамина (5 мг/кг) и сиднокарба (50 мг/кг) на изменение уровня внеклеточного дофамина в дорзальном стриатуме свободно-подвижных крыс. M±SEM (п=6-8). * - р < 0.05 по сравнению с контролем (0,85 % раствор NaCl).

В то время как «пикообразный» выброс ДА на фоне введения d-амфетамина, по-видимому, обусловлен способностью последнего вызывать «обращение» функции ДАТ (Seiden et al., 1993; Cho and Segal, 1994; Gainetdinov et al., 2002), механизм действия сиднокарба на дофаминергическую нейропередачу представляется иным (Альтшулер и соавт., 1976; Анохина и соавт., 1979; Gainetdinov et al., 1997).

В частности, сиднокарб ингибирует «обратный захват» ДА (Erdo et al., 1981), преимущественно влияя на его внутриклеточное везикулярное «депо».

Дополнительным свидетельством различий нейрохимических механизмов действия d-амфетамина и сиднокарба, является динамика изменения содержания основных метаболитов ДА. Выраженное снижение внеклеточного уровня ДОФУК и ГВК, обусловленое, по-видимому, способностью d-амфетамина ингибировать активность МАО - ключевого

фермента метаболизма, не наблюдается в случае сиднокарба, что согласуется с тем, что последний не влияет на активность МАО (Rudenko and Altshuler, 1979). Сиднокарб, согласно исследованиям нашей лаборатории вызывает некоторое повышение их содержания (Anderzhanova et al„ 2000; Afanas'ev et al., 2001).

Таким образом, полученные результаты подтверждают высказанное ранее предположение о различии эффектов сиднокарба и d-амфетамина на дофаминергическую нейропередачу в мозге.

Влияние селективного антагониста Д2-рецепторов раклоприда на изменение внеклеточного содержания дофамина, ДОФУК и ГВК в дорзапъном стриатуме крыс

Однократное введение раклоприда в дозе 1,2 мг/кг (п/к) обеспечивает эффективную блокаду Д2-рецепторов (Magnusson et al., 1986). В этой дозе раклоприд вызывает достоверное повышениеДА, ДОФУК и ГВК в диализатах стриатума.

Данный эффект рассматривается как следствие функциональной блокады Д2-подтипа ауторецепторов, локализованных на ДА-содержащих нейронах и регулирующих процессы нейрональной электрической активности, биосинтеза и высвобождения ДА, и, в физиологических условиях, находящихся под ингибиторным контролем внеклеточного «пула» нейротрансмитгера (See et al., 1991; Gainetdinov et al., 1994).

При системном введении, раклоприд в указанной дозе вызывал достоверный потенциирующий эффект на уровень высвобождения внеклеточного ДА, обусловленного введением d-амфетамина (5мг/кг). Максимальный эффект при комбинированном действии раклоприда и d-амфетамина (как и в случае одного психостимулятора) наблюдался через 20 минут после введения d-амфетамина, составляя по отношению к исходному уровню 1300% и 835%, соответственно (Рис. 2).

На протяжении последующего часа в диализатах мозга крыс, получавших раклоприд и d-амфетамин, отмечалось выраженное снижение внеклеточного уровня дофамина, однако, абсолютные значения содержания нейротрансмиттера были значимо выше, чем при введении одного d-амфетамина. При последовательном введении раклоприда и d-амфетамина наблюдалось выраженное снижение внеклеточной концентрации ДОФУК, содержание ГВК снижалось в меньшей степени.

Раклоприд в дозе 1,2 мг/кг не оказывал значимого эффекта на повышение внеклеточного уровня ДА, обусловленное сиднокарбом (50мг/кг) (Рис. 2). Максимальное увеличение содержания нейротрансмиттера в диализатах крыс опытной группы, наблюдалось через 40 минут после инъекции сиднокарба и составляло 345±83% по сравнению с контролем. В дальнейшем, уровень внеклеточной концентрации ДА снижался, оставаясь, однако, несколько повышенным до конца наблюдения (135±15% к 220 минуте).

-d-амфетамин,

-раклоприд + d-амфетамин,

-раклоприд

1500 1400 g 1300 g 1200 ft 1100 ^ 1000 | 900

5 800

£ 700 3 600 "3 500

j» 400 SB 300' 200 100 0

*—Ф—o-

"I-1-Г

-40 -20 0

20 40 60

~I-1-1-1-1-1-1-1—

80 100 120 140 160 180 200 220

Время в мин

-сиднокарб,

-раклоприд + сиднокарб, —-А— раклоприд

450

S а а

I "0

>>

>>

S о

■ 250

400

300 -

я ю к

г? й

200

150 -

100-

50

и 5 * : » s

-1

i

-40 -20

20

—Г-40

—Г" 60

80

—I-1-1-1-1-1-1—

100 120 140 160 180 200 220

Время в мин

Рис. 2. Влияние раклоприда, в дозе 1,2 мг/кг (п/к), на вызванное введением d-амфетамина (5мг/кг) и сиднокарба (50мг/кг) изменение внеклеточного содержания дофамина в дорзальном стриатуме свободно-подвижных крыс. M±SEM (п=б-8). Стрелками показан момент инъекции. * - р < 0.05 по сравнению с контролем (0,85 %раствор NaC!). # - достоверные различия при р < 0.05 между группами «d-амфетамин» и «раклопрщгН1-амфетамин».

Последовательное введение раклоприда и сиднокарба оказывало умеренный стимулирующий эффект на внеклеточное накопление ДОФУК и ГВК в диализатах крыс экспериментальной группы.

Наиболее вероятное объяснение возможного механизма взаимодействия эффектов Д2-антагониста и d-амфетамина предполагает, что последний вызывает «обращение» функции ДАТ, что проявляется в интенсивном уменьшении внутринейрональных запасов ДА. Высвобождаемый во внеклеточное пространство нейротрансмитгер, способен с высокой аффинностью связываться с дофаминовыми ауторецепторами Д2-подтипа, вызывая их активацию. Последнее, в свою очередь, опосредует торможение процессов синтеза/высвобождения ДА по механизму «отрицательной» обратной связи (Santiago and Westerink, 1991; Pehek et al., 1999; Schmitz et al., 2001).

С другой стороны, селективный антагонист Д2-рецепторов раклоприд в дозе, обеспечивающей эффективную блокаду Д2-подтипа рецепторов, способно предотвращать их последующую активацию ДА, высвобождающимся во внеклеточное пространство, по d-амфетамин-опосредованному механизму (Pehek, 1999; Schmitz et al., 2001). Результатом этого может явиться «нивелирование» ингибирующего влияния психостимулятора на Д2-рецепторы, что выражается в «растормаживании» процессов синтеза/высвобождения ДА.

Учитывая, что, введение раклоприда, само по себе, опосредованно стимулирует процессы синтеза, метаболизма и высвобождения ДА (Gainetdinov et al., 1994; Salvatore et al., 2000), наблюдаемый в нашей работе синергистический эффект раклоприда и d-амфетамина на внеклеточное содержание нейротрансмитгера получает логичное обоснование.

Неспособность раклоприда вызывать дальнейшее повышение внеклеточной концентрации ДА, на фоне стимулирующего действия сиднокарба может объясняться тем, что последний, в отличие от d-амфетамина не вызывает перераспределения внутриклеточного ДА между везикулами и цитоплазмой (Jones et al., 1998; Gainetdinov and Caron, 2002). В действии сиднокарба, очевидно, преобладает его ингибирующее влияние на ДА «re-uptake» (Erdo, 1981).

Таким образом, динамика изменения параметров дофаминергической нейропередачи в стриатуме крыс при последовательном введении d-амфетамина или сиднокарба на фоне раклоприда значительно различается, что позволяет предположить наличие неодинаковой роли Д2-подгипа дофаминовых рецепторов в механизме действия двух психостимуляторов. Влияние селективного антагониста Щ-рецепторов SCH23390 на изменение внеклеточного содержания дофамина, ДОФУК и ГВК в дорзальном стриатуме крыс

Селективный Д1-антагонист SCH23390 (ОД мг/кг в/б) не вызывал достоверных изменений уровня содержания ДА в диализатах стриатума. Внеклеточное содержание

и

ДОФУК несколько повышалось, достигая значимых отличий от базальных значений на 60-й и 100-й минутах после введения Д1 -антагониста. Изменения уровня ГВК были в общем аналогичными, хотя в этом случае значимых отличий от базального уровня контрольной группы животных отмечено не было.

Влияние SCH23390 на нейрохимические параметры дофаминергической нейропередачи в мозге представляется неоднозначным. В частности, наблюдаемое в нашей работе отсутствие заметных изменений внеклеточного уровня ДА на фоне этого соединения, согласуется с данными ряда авторов (Zetterstrom et al., 1986; Watanabe et al., 1989; Inoue et al., 1995). Хотя другие авторы (Imperato et al., 1988; See et al., 1991; Zackheim and Abercrombie, 2001), наблюдали повышение внеклеточного уровня ДА и его метаболитов.

Согласно некоторым данным, SCH23390 может стимулировать высвобождение ДА во внеклеточное пространство путем блокады Д1 -подтипа рецепторов, локализованных в стриатуме, преимущественно постсинаптически, на проекционных ГАМКергических нейронах, участвующих в регуляции механизма «отрицательной» обратной связи «стриатум - черная субстанция» и/или блокады рецепторов Д1-подтипа, опосредующих тормозный контроль интернейронов, модулирующих выброс ДА через вовлечение длинных или локальных нейрональных «петель» (Abercrombie and DeBoer, 1997; Shi et al., 2000).

Введение SCH23390 в дозе 0,01 мг/кг оказывало позитивный модулирующий эффект на накопление внеклеточного ДА, обусловленное d-амфетамином в дозе 5 мг/кг. Максимальное повышение внеклеточной концентрации нейротрансмиттера на фоне последовательного введения Д1-антагониста и психостимулятора отмечался через 40 мин после инъекции d-амфетамина, составляя 1304±613% относительно контроля (отличие от эффекта одного психостимулятора незначимо).

Комбинация SCH23390 и сиднокарба в указанных дозах вызывала достоверное повышение внеклеточного содержания ДА в дорзальном стриатуме крыс, максимум которого достигал 582±264% на 60-й мин после введения сиднокарба. В дальнейшем, внеклеточная концентрация ДА несколько снижалась, составляя к концу наблюдения 250%.

Объяснение возможного механизма взаимного усиления эффектов Д1-антагониста и психомоторных стимуляторов представляется достаточно сложным. Учитывая постсинаптическую локализацию Д1-рецепторов, логично предположить, что наблюдаемые эффекты SCH23390 на дофаминергические нейроны, вероятнее всего, опосредованы вовлечением других нейромедиаторных систем мозга (Imperato and Di Chiara, 1988; Shi et al., 2000).

Результаты данного раздела работы позволяют заключить, что селективная блокада Д1-подтипа рецепторов оказывает позитивный модулирующий эффект, на обусловленное

действием d-амфетамина и сиднокарба, повышение внеклеточного содержания ДА в стриатуме.

Влияние антагониста Д4-подтипа petfenmopoe клозапина на изменение внеклеточного содержания дофамина, ДОФУКиГВКв дорзалъном стриатуме крыс

Клозапин в дозе 10 мг/кг (в/б) вызывал градуальное увеличение уровня ДА в диализатах крыс опытной группы. К концу второго часа с момента введения Д4-антагониста внеклеточный уровень ДА достигал своего максимума, составляя 161 ±27% по отношению к исходным значениям.

Внеклеточный уровень ДОФУК значимо увеличивался на протяжении первых 2-х часов с момента инъекции Д4-антагониста. Максимальное повышение содержания метаболита наблюдалось через 100 мин, составляя 170±11%. Эти данные согласуются с результатами более ранних работ нашей лаборатории (Rayevsky et al., 1995).

Клозапин оказывал позитивный модулирующий эффект на повышение внеклеточной концентрации ДА, обусловленное действием d-амфетамина. Максимальное повышение внеклеточного уровня ДА отмечалось на 40 мин после введения психостимулятора (957±300% по сравнению с исходным фоном). В дальнейшем, внеклеточный уровень ДА постепенно снижался до базальных значений.

Изменение внеклеточной концентрации ДОФУК и ГВК на фоне последовательного введения клозапина и d-амфетамина в большой степени соответствовало динамике этих показателей, характерной для действия одного психостимулятора.

Последовательное введение клозапина и сиднокарба, в указанных выше дозах, вызывало более интенсивное накопление внеклеточного ДА, чем при действии одного психостимулятора. Через 20 мин после введения сиднокарба на фоне Д4-антагониста, повышение уровня ДА составляло 318±64% по отношению к исходному, причем максимальный эффект (376±70%) наблюдался на 100-й мин после введения.

Динамика содержания ДОФУК и ГВК, в диализатах при последовательном введении клозапина и сиднокарба не претерпевала существенных изменений.

Функциональная роль Д4-рецепторов ДА в регуляции дофаминергической нейропередачи мозга до настоящего времени практически не изучена (Missale et al., 1998; Waddington et al., 2001). Одной из основных причин этого является недостаточная селективность доступных фармакологических лигандов.

Исходя из того, что экспериментальные данные, в целом, не подтверждают локализацию Д4 рецепторов непосредственно на ДА-содержащих нигростратных нейронах (Surmeier et al., 1996; Tarazi et al., 1998; Rivera et al., 2002), результаты, представленные в этой части работы, позволяют предположить, что позитивный модулирующий эффект

клозапина на повышение уровня внеклеточного ДА в дорзальном стриатуме крыс,

t

обусловленное введением d-амфетамина или сиднокарба, подобно влиянию SCH23390, может опосредоваться вовлечением иных нейротрансмиттерных систем мозга. rj Альтернативное объяснение эффекта комбинации клозапина + психостимулятор

' основывается на известном факте достаточно высокой аффинности этого ли ганда к ряду

других рецепторов: Д1, Д2 и 5-НТ2 (Seeman and Van Toi, 1994; Meitzer et al., 1999). Изучение эффектов веществ, модулирующих дофаминергическую нейропередачу, на динамику развития стереотипного поведения

Влияние психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба на развитие стереотипного поведения.

d-Амфетамин (10 мг/кг, в/б) как и сиднокарб (50 мг/кг, в/б) вызывали у крыс развитие I характерного двигательного расстройства в виде стереотипного поведения уже через 20 мин

после инъекции. Через 80 мин после введения d-амфетамина, интенсивность стереотипии достигала среднем 4,8 балла по шкале Havemann'a, сохраняясь приблизительно на этом уровне до конца наблюдения. Эффект сиднокарба выходил на «плато» через'100 мин с момента инъекции психостимулятора, составляя 4,8±0,3 балла. В дальнейшем, значимых изменений в степени выраженности поведенческого ответа отмечено не было. При этом, интенсивность и динамика развития стереотипного поведения для d-амфетамина и сиднокарба были в большой степени сходными, что позволяет предположить эквиэффективность выбранных нами доз психостимуляторов.

Влияние SCH23390 на динамику развития стереотипного поведения, вызванного введением психостимуляторов

Д1-рецепторный лиганд SCH23390, введенный в дозе 0,1 мг/кг за 20 мин до d-амфетамина, полностью предотвращал развитие стереотипного поведения. Аналогичный эффект наблюдался при последовательном введении SCH23390 в той же дозе и сиднокарба (50 мг/кг). Инъекция Д1-антагониста полностью подавляла стимулирующее действие сиднокарба.

' Влияние ракпоприда на динамику развития стереотипного поведения

Предварительное введение Д2-рецепторного антагониста раклоприда (1,2 мг/кг) за 20 ' мин до инъекции d-амфетамина (5 мг/кг) полностью предупреждало развитие характерного

стереотипного ответа. В той же дозе, раклоприд предотвращал развитие стереотипного поведения крыс, обусловленного сиднокарбом. Влияние клозапина на динамику развития стереотипного поведения

Д4-рецепторный антагонист клозапин, в дозе 10 мг/кг, введенный за 40 мин до d-амфетамина (5 мг/кг), незначимо подавлял стереотипное поведение крыс. Клозапин также не

оказывал влияния на динамику развития поведенческого ответа, вызванного сиднокарбом (50 мг/кг).

Известно, что селективная блокада дофаминовых рецепторов Д1 и Д2 подтипов способна предотвращать развитие стереотипного поведения, обусловленного различными психостимуляторами (амфетамин и его аналоги, кокаин) (Cabib et al., 1991; Petry et al., 1993; Witkin et al., 1999). Таким образом, полученные нами результаты согласуются с этими данными и позволяют заключить, что Д1- и Д2-подтипы дофаминовых рецепторов играют принципиальную роль в механизмах формирования стереотипного поведения, обусловленного как d-амфетамином, так и сиднокарбом.

Неэффективность клозапина в предупреждении стереотипии, индуцированной психостимуляторами, может быть обусловлена предпочтительной направленностью эффектов этого препарата на мезолимбическую и мезокортикальную, но не нигростриатную дофаминергические системы мозга (Fitton and Heel, 1990; Moghaddam et al., 1990).

Принципиально важным, в этом случае, является, по-видимому, именно высокий аффинитет клозапина к Д4-рецепторов ДА (Seeman and Van Toi, 1994), что согласуется с недавними сообщенями неэффективности высокоселективных Д4-антагонистов в отношении стереотипии, вызванной дофаминомиметиками (Bristow et al., 1997; Millan et al., 1998).

Обнаруженное нами неодинаковое участие Д1, Д2 и Д4 дофаминовых рецепторов в нейрохимических механизмах действия d-амфетамина и сиднокарба, послужило основанием для дальнейшего анализа индивидуальной роли отдельных подтипов дофаминовых рецепторов в формировании психостимулирующих эффектов данных препаратов. Влияние веществ, модулирующих дофаминергическую передачу в мозге, на локомоторную активность мышей линии С57В1

Эффект d-амфетамина и сиднокарба на спонтанную локомоторную активность

Введение d-амфетамина в дозе 2 мг/кг (в/б) или сиднокарба в дозе 50 мг/кг (в/б) через 30 мин после инъекции 0,85% раствора NaCl вызывало отчетливое повышение спонтанной двигательной активности. Суммарный уровень локомоторной активности у животных, получавших психостимуляторы, приблизительно в 3 раза превышал показатели контрольной группы (0,85% раствор NaCl).

Влияние селективного антагониста Д1-подтипа рецепторов SCH23390 на локомоторную активность мышей.

Введение SCH23390 (0,01 мг/кг) сразу после первой тестовой сессии не оказывало заметного влияния на уровень спонтанной активности мышей С57В1 при втором и третьем тестировании по сравнению с контрольной группой животных, получавших после первой сессии 0,85% NaCl. Представленные данные позволили заключить, что Д1 -антагонист

I

БСН23390 (0,01 мг/кг) не оказывает влияния на измеряемые параметры спонтанной * активности мышей этой линии.

' В той же дозе, ЭСШЗЗЭО полностью предупреждал локомоторную гиперактивность

животных, обусловленную введением (1-амфетамина (2 мг/кг) (Рис. За). Суммарный уровень двигательной активности в третьем тестовом периоде был практически идентичным у этих животных и мышей контрольной группы, составляя 60% по отношению к исходному значению. В то же время, 8СН23390 не влиял на уровень активации, вызванной однократным введением сиднокарба в дозе 10 мг/кг (Рис. За). Последний составлял приблизительно 180% по отношению к базальному значению.

Влияние селективного антагониста Д2-подтипа рецепторов раклоприда на локомоторную активность мышей С57В1.

Селективный антагонист Д2-рецепторов ДА раклоприд, введенный после первого тестирования в дозе 0,125 мг/кг, не оказывал значимого влияния на параметры локомоторной активности мышей С57В1 при втором и третьем тестировании, по сравнению с контрольной группой. Это позволяет заключить, что селективная блокада Д2-рецепторов раклопридом, в указанной дозе, не влияет на уровень двигательной активности мышей С57В1. | Эффекты раклоприда, на обусловленное введением ё-амфетамина или сиднокарба

I повышение двигательной активности мышей С57В1, сходны с таковыми для 8СН23390 (Рис.

36). Так, предварительное введение раклоприда (0,125 мг/кг) полностью предупреждало развитие локомоторной гиперактивности, индуцированное (¡-амфетамином. В то же время, раклоприд не оказывал значимого влияния на стимуляцию двигательной активности, ' вызванную инъекцией сиднокарба в эквиэффективной дозе.

Влияние антагониста Д4-подтипа рецепторов клозапина на локомоторную активность мышей С57В1.

Введение клозапина в дозе 1,25 мг/кг не оказывало значимого влияния на уровень спонтанной локомоции животных.

Эффекты <1-амфетамина и сиднокарба на горизонтальную двигательную активность на фоне клозапина в дозе 1,25 мг/кг оказались различными. Так, на фоне Д4-антагониста, стимулирующий эффект сиднокарба оказался значительно сниженным (до 79,08±5,83% по а сравнению с базальным уровнем), хотя локомоторная активность оставалась достоверно

более высокой, чем в контрольной группе (клозапин + 0,85% раствор №С1) (Рис. Зв).

В то же время, эффект с!-амфетамина, на фоне клозапина, не претерпевал существенных изменений: уровень двигательной активности для мышей, получавших 0,85% №С1 + психостимулятор, составлял 190,6±55,9%, достоверно не отличаясь от такового для

г т 8 £

Я Р в V

о о а. X в

» 5

Групп» 1 Группа 2 Группа 5 Группа б Группа 7 Группа «

В

N чР Я в4

5 А а в

- § ё г

я ж

Е €

Группа! Группа 4 Группа 5 Группа 6 Группа 11 Группа 1:

Группа I Группа Э Группа 5 Группа б Группа 9 Группа 10

Рис. 3. Изменение уровня горизонтальной двигательной активности мышей линии С57В1 при введении антагонистов дофаминовых рецепторов: Д1 -8СН23390 (а), Д2 - раклоприда (б) и Д4 - клозапина (в) на фоне (1-амфетамина и сиднокарба. Группа 1 - 0,85% ЫаС1 + 0,85% КаС1; Группа 2 - 8СН23390 (0,01мг/кг) + 0,85% ЫаС1; Группа 3 - раклоприд (0,125 мг/кг) + 0,85% 1МаС1; Группа 4 - клозапин (1,25 мг/кг) + 0,85% КаС1; Группа 5 - 0,85% ЫаС1 + ^амфетамин (2 мг/кг); Группа 6 -0,85% ЫаС1 + сиднокарб (10 мг/кг); Группа 7 - 8СН23390 + ё-амфетамин; Группа 8 - 8СН23390 + сиднокарб. Группа 9 -раклоприд + ё-амфетамин; Группа 10 - раклоприд + сиднокарб; Группа 11 - клозапин + ¿-амфетамин; Группа 12 -клозапин + сиднокарб. (* - р < .05 по сравнению с контрольной группой 1. # - р < .05 при сравнении групп 5 и 7 (а), групп 5 и 9 (б), групп 11 и 12 по отношению к группе 4 (в). $ - р < .05 при сравнении групп 2 и 8 (а), групп 3 и 10 (б), групп 6 и 12 (в).

f t

животных, получавших клозапин и d-амфетамин - 225,88±3 8,78%, по отношению к исходным значениям (Рис. Зв).

Данные литературы свидетельствуют о состоянии функциональной блокады Д1-, Д2-и Д4-подтипов дофаминовых рецепторов, при использовании селективных антагонистов SCH23390, раклоприда и клозапина в тех же дозах, что использовались в нашей работе (Andersen et al, 1988; Lapin and Rogawski, 1995; Bristow et al., 1997).

Таким образом, блокада SCH23390 и раклопридом (в дозах не влияющих на спонтанную локомоцию) двигательной гиперактивности мышей С57В1, на фоне действия d-амфетамина, позволяет подтвердить тот факт, что Д1- и Д2-подтипы дофаминовых рецепторов специфическим образом вовлечены в механизм действия психостимулятора.

Способность клозапина ингишбировать стимулирующий эффект сиднокарба помимо возможной роли блокады Д4-рецепторов ДА, может объясняться избирательностью I эффектов клозапина на мезолимбокортикальном уровне, а также его уникальным

рецепторным «профилем» (Hand et al., 1987; Fitton and Heel, 1990). Кроме того, одним из возможных объяснений является наличие серотонин- и норадренергического компонента в механизме действия сиднокарба (Анохина и соавт., 1979; Арушанян и Батурин, 1981).

Суммируя полученные нами данные, можно заключить, что обнаруженные различия в эффектах d-амфетамина и сиднокарба, могут объясняться с одной стороны неодинаковым вовлечением отдельных подтипов дофаминовых рецепторов, а с другой - возможным вкладом других нейромедиаторных систем мозга.

Сравнительный анализ влияния d-амфетамина и сиднокарба на локомоторную

I

активность и паттерны экспрессии белка c-Fos в мозге мышей инбредных линий С57В1 | и BALB/c

Изучение эффектов d-амфетамина и сиднокарба на локомоторную активность мышей 1 С57В1 и BALB/c

Введение 0,85% раствора NaCl вызывало незначительное повышение локомоторной активности мышей обеих линий (Рис. 4). d-Амфетамин (5 мг/кг) и сиднокарб (50 мг/кг) оказывали выраженное стимулирующее влияние на двигательную активность, причем по реакции на введение психостимуляторов животные обеих линий значимо отличались от контрольной группы (0,85% NaCl) (Рис. 4). Суммарная пройденная дистанция для мышей C57BL, получавших d-амфетамин, по абсолютному значению была выше, чем для животных той же линии, получавших сиднокарб (75,8±б,2м и 44,6±12м, соответственно), однако,

/

достоверных различий между группами отмечено не было (р = 0.15). Сиднокарб вызывал скорее противоположный эффект, но, и в этом случае, межгрупповые различия не достигали уровня значимости (р = 0.39).

110 1

1008

КАС КАС КАС КАС до введения после введения до введения после введения

12 3 4

Рис. 4. Суммарная двигательная активность мышей линий С57В1 (1,2) и ВАЬВ/С (3,4) при введении 0,85% раствора №С1 (К), ё-амфетамина (5 мг/кг в/б) (А) и сиднокарба (50 мг/кг в/б) (С) (регистрация в течение 30 минут до и после введения веществ)

* - Статистически достоверное отличие групп "с!-амфетамин" и "сиднокарб" от контроля в обеих линиях мышей при р<0,05.

# - Статистически достоверное отличие между группами "с!-амфетамин" и "сиднокарб" у мышей С57В1 при р<0,05.

' (1-Амфетамин вызывал достоверно более выраженный подъем двигательной

активности у мышей линии С57ВЬ по сравнению с мышами линии ВАЬВ/с (р = 0.043); вместе с тем, межлинейных отличий в эффектах сиднокарба отмечено не было. Эффект однократного введения (¡-амфетамина и сиднокарба на уровень экспресии белка с-

I

Лм в структурах мозга мышей

Введение 0,85% раствора №С1 вызывало умеренную активацию РоБ-белка у контрольной группы животных обеих линий (Рис. 5). Однократная инъекция сиднокарба в указанной дозе приводило к достоверному увеличению количества Ров-позитивных клеток во всех исследованных структурах мозга мышей ВАЬВ/с по сравнению с контрольной группой. У мышей той же линии ё-амфетамин (5 мг/кг) вызывал подобный эффект в стриатуме, вторичной моторной коре и перегородке (Рис. 5).

Введение ё-амфетамина, в указанной выше дозе, сопровождалось достоверным повышением числа Роб-позитивных клеток у мышей С57В1 во вторичной моторной коре и перегородке по сравнению с контрольной группой. Сиднокарб (50 мг/кг) вызывал выраженный стимулирующий эффект на активность белка с-Роэ у животных той же линии в стриатуме, вторичной моторной коре и центральной части прилежащего ядра (Рис. 5). В последней структуре у мышей С57В1 инъекция (1-амфетамина сопровождалась более интенсивной экспрессией белка по сравнению с группой получавшей сиднокарб.

При проведении сравнения мышей линий С57В1 и ВАЬВ/с между собой было I обнаружено, что в контрольной группе мышей С57В1 количество Ров-позитивных клеток в

перегородке и вторичной моторной коре достоверно выше, чем у аналогичной группы животных линии ВАЬВ/с. (1-Амфетамин вызывал более выраженную экспрессию белка с-Ров во вторичной моторной коре мышей С57В1, чем у животных ВАЬВ/с (Рис. 5).

Полученные данные позволяют придти к заключению, что индукция гена раннего ответа о Ки в стриатуме, прилежащем ядре, перегородке, вторичной моторной коре, наблюдаемая на фоне действия ё-амфетамина и сиднокарба, указывает на вовлечение в механизм психостимулирующего действия дофаминзависимых структур мозга, тесно связанных с различными проявлениями психомоторных функций. Результаты данного раздела работы подтверждают предположение о том, что различия в эффектах двух психомоторных стимуляторов, как на клеточном, так и системном уровне, могут в значительной мере определяться исходным генотипом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленном исследовании проведено сравнительное изучение возможной роли отдельных подтипов дофаминовых рецепторов мозга в нейрохимических и фармакологических эффектах двух различных по своей структуре психостимуляторов, <1' амфетамина и сиднокарба (оригинального отечественного препарата, обладающего сходным

I

I !

КАС КАС КАС КАС

12 12

Вторичная моторная Стриатум кора

КАС КАС 1 2 Перегородка

АС КАС

1 2 центральная часть прилежащего ядра

КАС 1

КАС 2

оболочка прилежащего ядра

Рис. 5. Количество Ров-позитивных клеток в структурах мозга мышей линий С57В1 (1) и ВАЬВ/с (2) при введении 0,85% раствора ИаС1 (К), с!-амфетамина (А), 5 мг/кг и сиднокарба (С), 50 мг/кг. * - р<05 по сравнению с контролем. # - р<.05 при сравнении между контрольными группами мышей С57В1 и ВАЬВ/с. $ - р<.05 для группы "ё-амфетамин" при сравнении между мышами С57В1 и ВАЬВ/с. + - р<.05 при сравнении между группами "с!-амфетамин" и "сиднокарб" у мышей С57В1.

с амфетамином спектром фармакологической активности, при меньшей выраженности * побочного действия).

? Использование методики внутримозгового микродиализа позволило

продемонстрировать, что однократное введение (¡-амфетамина сопровождается мощным | пикообразным повышением внеклеточного уровня ДА и достоверным снижением

внеклеточной концентрации его метаболитов ДОФУК и ГВК. В то же время, повышение уровня ДА в диализатах стриатума, .обусловленное введением сиднокарба носило значительно более умеренный и пролонгированный характер. Подобное различие в эффектах двух психостимуляторов можно объяснить тем, что в отличие от (1-амфетамина, сиднокарб не вызывает «обращения» дофаминового транспортера, но ингибирует «обратный захват» ДА.

Селективный антагонист Д2-подтипа дофаминовых рецепторов раклоприд оказывал достоверное потенциирующее влияние на повышение внеклеточной концентрации ДА, обусловленное (1-амфетамином, и не влиял на эффект сиднокарба. В то же время селективный антагонист Д1-подтипа рецепторов БСН23390 и антагонист Д4-рецепторов клозапин оказывали позитивное модулирующее влияние на накопление внеклеточного ДА в диализатах, обусловленное введением как ё-амфетамина, так и сиднокарба.

Наблюдаемое в представленной работе, неодинаковое влияние дофаминовых рецепторов различных подтипов, на вызванное психостимуляторами повышение внеклеточного уровня ДА послужило поводом для дальнейшего анализа специфичности участия индивидуальных рецепторных подтипов в механизмах стимулирующего действия (3-амфетамина и сиднокарба.

Антагонист Д2-рецепторов раклоприд и антагонист Д1-рецепторов 8СН23390, в дозах, не влияющих на спонтанную локомоцию, эффективно предотвращали двигательную гиперактивность мышей С57В1, обусловленную с!-амфетамином и не влияли на эффект сиднокарба. В то же время Д4-антагонист клозапин не оказывал значимого влияния на действие (1-амфетамина, и достоверно подавлял эффект сиднокарба.

Последнее, как предполагается, может быть обусловлено наличием в фармакологическом спектре этого психостимулятора серотонин- и норадренергического нейромедиаторного компонентов (Анохина и соавт., 1974; Альтшулер и соавт., 1977; Арушанян и Батурин, 1981).

При проведении сравнительного анализа эффектов сиднокарба и <1-амфетамина на локомоторную активность и паттерн экспрессии белка с-Роэ (продукта активности «раннего гена» с-йк) в мозге мышей двух инбредных линий С57В1 и ВАЬВ/с было показано, что оба психостимулятора вызывают значительное повышение локомоторной активности и

I (

I

I

выраженную индукцию Ров-белка в структурах мозга тесно связанных с различными проявлениями психомоторных функций. Эффект ё-амфетамина в отношении двигательной активности оказался более выраженным у мышей С57В1, что коррелировало со степенью индукции с-Ров в области вторичной моторной коры мозга.

Наблюдающаяся на фоне действия обоих психостимуляторов, сложная комплексная картина паттерна экспрессии гена с-Ров в мозге, позволяет заключить, что различия в эффектах (1-амфегамина и сиднокарба, как на клеточном, так и системном уровне, могут в значительной мере определяться исходным генотипом животных. Сопутствующее усилению активности гена «раннего ответа» с-Бов в дофаминзависимых структурах мозга, выраженное повышение спонтанной локомоторной активности животных, предполагает вовлечение данных областей в психостимулирующие эффекты ё-амфетамина и сиднокарба, что подтверждает высказанное ранее предположение о наличии выраженного дофаминергического компонента в механизме действия последнего.

В целом, представленные в данной работе результаты свидетельствуют о значительной нейрохимической гетерогенности механизмов, лежащих в основе психостимулирующего действия амфегаминоподобных соединений.

ВЫВОДЫ

1. При сравнительном изучении психостимуляторов ё-амфетамина и сиднокарба показано, что оба препарата в эквиэффективных дозах вызывают значительные изменения в дофаминергической нейропередаче в неостриатуме свободноподвижных крыс Вистар, проявляющиеся в выраженном увеличении внеклеточного уровня дофамина

2. Селективный антагонист Д2-подтипа дофаминовых рецепторов раклоприд потенциирует вызванное ё-амфетамином повышение внеклеточного уровня дофамина и не влияет на стимулирующий эффект сиднокарба

3. Селективный антагонист Д1 -подтипа рецепторов 8СН23390 и антагонист Д4-подттша рецепторов клозапин проявляют позитивное модулирующее влияние на повышение внеклеточного уровня дофамина, вызванное как ё-амфетамином так и сиднокарбом

4. 8СН23390 и раклоприд в дозах, не влияющих на спонтанную локомоторную активность мышей линии С57В1, предотвращают развитие двигательной гиперактивности, обусловленное ё-амфетамином, не оказывая заметного влияния на эффект сиднокарба

5. Клозапин в дозе, не вызывающей снижения локомоторной активности, не оказывает существенного влияния на стимулирующее действие ё-амфетамина, но вместе с тем значительно ослабляет эффект сиднокарба

i 23

I

^ 6. Введение d-амфетамина и сиднокарба, наряду с повышением локомоторной

активности, сопровождается выраженной индукцией Fos-белка в структурах мозга мышей двух инбредных линий, С57В1 и BALB/c. При этом, поведенческий ответ

*

мышей С57В1 на d-амфетамин оказывается значительно более выраженным по сравнению с реакцией мышей BALB/c, что коррелирует с выраженностью экспрессии Fos-белка во вторичной моторной коре.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДА - дофамин, ДОФУК - 3,4-дифенилуксусная кислота, ГВК - гомованилиновая кислота, МАО - моноаминооксидаза.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Новоселов И.А., Афанасьев И.И., Андяржанова Э.А., Кудрин B.C., Раевский К.С. Различия в механизме действия d-амфетамина и сиднокарба в стриатуме крыс in vivo. //Физиология нейротрансмиттеров: VIII Всероссийская конференция. Тезисы докладов. - Москва. РАН, 2000. с.45.

2. I.A. Novoselov, I.I. Afanas'ev, E.A.Anderzhanova, V.S.Kudrin, K.S.Rayevsky. Sydnocarb differs from D-Amphetamine by its effect on the dopaminergic neurotransmission in rat striatum in vivo. //Abstract of the 5th ECNP Regional Meeting, 2000, vol.10, suppl.2.

3. Новоселов И.А., Сорокин А.Я., Афанасьев И.И., Кудрин B.C., Раевский К.С. Возможная роль Д1-подгипа дофаминовых рецепторов в механизме психостимулирующего действия сиднокарба и d-амфетамина (микродиализное

I изучение in vivo). //Актуальные проблемы нейробиологии: Тезисы VIII Всеросс.

школы молодых ученых. - Казань: КГМУ, 2001. с. 128.

4. Сорокин А.Я., Новоселов И.А., Афанасьев И.И., Кудрин B.C., Раевский К.С. Нейрохимические аспекты участия Д1-подтипа дофаминовых рецепторов в механизме психостимулирующего действия Д-амфетамина и Сиднокарба. //Материалы II Российской конференции молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины". Москва: РАМН, 2001, -т.2, с.268-269.

5. Cherepov A., Lukashev A., Novosyolov I., Rayevsky К., Anokhin К. Relationship between novelty versus d-amphetamine-induced behavior and brain c-fos expression in two inbred mouse strains: a functional system analysis. //Abstr. of 4th Intern. Confer, on methods and

T

and t in behavioral research, 2002, Amsterdam, -p.58.

6. I. Novosyoloff, A. Cherepov, K. Anokhin, K. Rayevsky. Patterns of locomotor activity and ^ brain c-Fos expression in C57B1 and BALB/c mice: the effects of D-amphetamine,

sydnocarb and novelty. //Abstr. of the ХХШ CINP Congr., Montreal, 2002. -s.157.

7. M. Dvorkina, I. Novosyoloff, A. Sorokin, I. Afanas'ev., K. Rayevsky. Dl-dopamine receptor antagonist SCH23390 attenuates stereotyped behavior but fails to modulate psychostimulant-induced increase in extracellular dopamine in rat neostriatum. //Abstr. of the ХХ1П CINP Congr., Montreal, 2002. -s.157.

8. Новоселов И.А., Черепов А.Б., Раевский K.C., Анохин К.В. Локомоторная активность и экспресс и белка c-Fos в мозге мышей С57В1 и BALB/c: эффекты D-амфетамина и сиднокарба.// Экспер. и клин, фармакол., 2002, т. 65, № 5, с. 18-21.

9. I. Novosyoloff, A. Cherepov, К. Rayevsky, К. Anokhin. Neuronal plasticity in mice with different genetic background under treatment of amphetamine, sydnocarb and novelty: correlation with behavior. //Abstr. of International symposium Neuronal differentiation and plasticity regulation by intercellular signals, Moscow. 2003.

10. Афанасьев И.И., Дворкина М.Л., Новоселов И.А., Раевский К.С. Совместное влияние амфетамина и мидантана на дофаминергическую передачу в стриатуме свободно-подвижных крыс. //Экспер. и клин, фармакол., 2003, т. 66, № 1, с. 3-7.

П.Новоселов И.А., Раевский К.С. Влияние антагонистов различных подтипов дофаминовых рецепторов на локомоторную активность мышей линии С57В1, обусловленную введением психостимуляторов. //Экспер. и клин, фармакол., 2003, т. 66, №6, с. 11-15.

184^? «1849 4

Отпечатано ЗАО «Оперативное тиражирование» ИНН - 7710243829

т. 100 экз., заказ №111/6-1, от 6.11.2003

(/

Психомоторные стимуляторы до настоящего времени находят применение в клинической практике при лечении ряда психоневротических расстройств, таких как адинамические, анергические и апатические состояния, нарколепсия, а также синдрома гиперактивности с нарушением внимания у детей. Вещества, близкие по структуре к фенилалкиламинам применяются для коррекции избыточного веса [Машковский, 1993; Арушанян, 2003; Holmes, 1995; Poulin, 2001].

Вместе с тем, использование психостимуляторов в значительной степени ограничено наличием серьезных побочных эффектов (периферическое симпатомиметическое действие, возможность развития моторной гиперактивности, агрессивных реакций, психотических шизофреноподобных состояний с бредом и галлюцинациями, нарушения аппетита и сна, нейротоксический потенциал).

Существенной особенностью фармакологического спектра психомоторных стимуляторов является характерный эйфоризирующий эффект, с которым связан высокий риск развития физической и психической зависимости. Указанное обстоятельство является причиной широкого немедицинского использования психостимуляторов, что влечет за собой развитие наркомании.

Наиболее распространенными психостимуляторами являются представители группы фенилэтиламина (d-амфетамин, метамфетамин, катинон, метилфенидат и их многочисленные структурные производные). Близким по действию к фенилэтиламинам является растительный алкалоид кокаин.

Медицинское, а особенно немедицинское применение психостимуляторов в последние годы постоянно растет, представляя собой серьезную социальную проблему. Так, по данным зарубежной статистики, немедицинское потребление амфетаминов среди подростков в США и Канаде в период 80-90х годов прошлого века выросло в 1,5-2 раза [Poulin, 2001]; в то же время число людей, официально зарегистрированных в качестве потребителей кокаина в США оценивается приблизительно в 25 млн человек [Lange and Hillis, 2001].

Таким образом, одной из актуальных задач современной психофармакологии является изучение тонких механизмов, лежащих в основе психостимулирующего и нейротоксического действия соединений данной группы. Не менее важной задачей психофармакологии представляется создание нетоксичных заменителей амфетаминов с одной стороны, и веществ эффективных для профилактики и лечения патологических состояний, связанных с хроническим приемом психостимуляторов.

Механизм действия наиболее популярных психомоторных стимуляторов (кокаин, амфетамины) тесным образом увязывается с их способностью влиять на состояние катехоламинергической нейропередачи мозга [Seiden et al., 1993; Cho and Segal, 1994; Berke et al., 1998; Jones et al., 1998]. В частности, принято считать, что развитие психостимулирующего эффекта амфетамина и его аналогов, в значительной степени, обусловлено воздействием на процесс «обратного захвата» пресинаптическими нервными окончаниями. Другими вероятными «мишенями» действия психостимуляторов являются стимуляция перераспределения внутриклеточного нейротрансмиттера из везикулярного «депо» в цитоплазму, а также прямое ингибирование активности моноаминооксидазы (ключевого фермента метаболизма дофамина) [Cho and Segal, 1994; Jones et al., 1998].

Многочисленные исследования, проведенные в последнее время, подтвердили высказанное ранее предположение, согласно которому нейрохимической основой механизма действия амфетаминов является их способность избирательно связываться со специфическим мембранным белком -дофаминовым транспортером (ДАТ), обеспечивающим процесс обратного захвата (re-uptake) нейротансмиттера из синаптической щели в нервные окончания дофаминергических нейронов соответствующих структур мозга.

Результатом этого является значительное возрастание внеклеточной концентрации дофамина и усиление функциональной активности дофаминергической нейропередачи [Seiden et al., 1993; Cho and Segal, 1994; Jones et al., 1998].

Недавние исследования, выполненные на мышах с делецией гена ДАТ (так называемые ДАТ-нокаутированные мыши) показали, что эти животные характеризуются повышенной локомоторной активностью, значительно более высоким уровнем внеклеточного дофамина и состоянием длительной гиперактивации дофаминовых рецепторов. Обнаружено также, что ДАТ-нокаутированные мыши неадекватно реагируют на амфетамин: введение психостимулятора этим животным не сопровождается накоплением внеклеточного дофамина, а изменения на поведенческом уровне характеризуются парадоксальным успокаивающим ответом, который предположительно связан с ингибиторным влиянием психостимулятора на серотониновый мембранный транспортер [Jones et al., 1998; Gainetdinov et al., 1999].

В клинической практике получены доказательства генетического полиморфизма ДАТ, ассоциированные с той или иной патологией мозга.

Все вышеизложенное позволяет заключить, что именно механизм регуляции функциональной активности дофаминового транспортера является ведущей «мишенью» фармакологических воздействий, модулирующих эффективность нейропередачи, в частности - действия амфетаминоподобных стимуляторов.

По мере высвобождения во внеклеточное пространство, дофамин способен взаимодействовать со специфическими дофаминовыми рецепторами, инициируя активацию таких процессов, как запуск каскадов вторичных мессенджеров, изменение проницаемости Na+-, К+-, Са2+ - каналов, индукцию генов раннего ответа и т. д., что опосредует клеточный ответ [Missale et al., 1998].

Традиционно дофаминовые рецепторы подразделяют на 2 основных семейства: Д2-подобные (включает Д2-, ДЗ- и Д4-рецепторы) и Д1-подобные (содержит Д1- и Д5-рецепторы, соответственно). Отличительной особенностью Д2/ДЗ дофаминовых рецепторов считается их локализация на самих дофаминергических нейронах, что, очевидно, подразумевает ауторецепторную функцию.

В последнее время, применение различных фармакологических и генетических манипуляций позволило выявить наличие сложной регуляторной взаимосвязи между дофаминовым транспортером и Д2-подтипом дофаминовых рецепторов. В частности было показано, что введение Д2-антагониста раклоприда значительно удлиняет время клиренса дофамина в структурах мозга крыс, обнаруживая тем самым непосредственное модулирующего влияние со стороны Д2-подтипа дофаминовых рецепторов на функциональную активность дофаминового транспортера. [Cass et al., 1994]. С другой стороны, стимуляция Д2-рецепторов опосредует повышение скорости работы ДАТ и обратного захвата дофамина (по-видимому, через К+-опосредованную гиперполяризацию нейрональной мембраны) [Lacey et al., 1987; Malenka et al., 2000].

Использование методики внутримозгового микродиализа на свободно-подвижных животных, позволяющей оценить in vivo изменения нейрохимических параметров (внеклеточного содержания нейротрансмиттеров и их основных метаболитов) в условиях комбинированного введения Д2-антагонистов и соединений, вызывающих функциональную блокаду «обратного захвата» дофамина дало противоречивые результаты [Sharp et al., 1986; Pehek, 1999; Rahman et al., 2001а]. Принципиальную роль, как предполагается, в этом случае может играть механизм «отрицательной обратной связи», опосредованный участием Д2-ауторецепторов [Iravani and Kruk, 1995; Schmitz et al., 2001].

Тем не менее, истинная роль как пре-, так и постсинаптического рецепторного компонента в механизме действия психостимуляторов изучена явно недостаточно.

Планируемое в данной работе детальное изучение возможной роли отдельных подтипов дофаминовых рецепторов в нейрохимических и фармакологических эффектах соединений психостимулирующего типа, открывает принципиально новый подход к изучению данной проблемы.

Наряду с хорошо известным психостимулятором d-амфетамином, в представленной работе использовался оригинальный отечественный препарат сиднокарб (З-(р-фенилизопропил)-Ы-фенилкарбамоилсиднонимин). Сиднокарб обладает сходным с амфетамином спектром фармакологической активности, при умеренном побочном действии. Известно также, что в отличие от амфетамина сиднокарб не угнетает активность МАО. Важным шагом вперед в изучении механизма действия пихостимуляторов явилось применение метода внутримозгового микродиализа [Андяржанова и соавт., 1999; Zetterstrom et al., 1983; Gainetdinov et al, 1997; Afanas'ev et al., 2001]. Эти исследования показали, что сиднокарб по ряду показателей существенно отличается от амфетамина [Gainetdinov et al., 1997; Anderzhanova et al., 2000; Afanas'ev et al., 2001]. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение функциональной роли рецепторного звена дофаминергической нейропередачи мозга, в том числе участие отдельных подтипов дофаминовых рецепторов, в механизме действия психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба. Для достижения этой цели в исследовании были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба на динамику изменения внеклеточной концентрации дофамина и его метаболитов (ДОФУК и ГВК) в дорзальном стриатуме свободноподвижных крыс in vivo.

2. Оценить влияние антагонистов Д1-, Д2- и Д4-подтипов дофаминовых рецепторов на изменение внеклеточного уровня дофамина и его метаболитов (ДОФУК и ГВК), обусловленное введением психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба.

3. Оценить эффекты антагонистов различных подтипов дофаминовых рецепторов на динамику стереотипного поведения крыс, вызванного психостимуляторами.

4. Оценить вклад отдельных подтипов дофаминовых рецепторов (Д1, Д2 и Д4) в механизмы формирования локомоторной гиперактивности, обусловленной воздействием d-амфетамина и сиднокарба.

5. Изучить эффекты психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба на локомоторную активность и паттерн экспрессии белка c-Fos (продукта «раннего гена» c-fos) в мозге мышей инбредных линий С57В1 и BALB/c

Научная новизна.

В данной работе впервые продемонстрировано различное влияние Д1, Д2 и Д4-подтипов дофаминовых рецепторов на изменение дофаминергической нейропередачи в стриатуме крыс линии Вистар (in vivo), обусловленное введением оригинального психостимулятора сиднокарба. Впервые проведен сравнительный анализ участия отдельных подтипов (Д1, Д2 и Д4) дофаминовых рецепторов в механизме развития стереотипного поведения, вызванного введением d-амфетамина и сиднокарба. С помощью методики регистрации двигательной активности животных в установке "Opto-Varimex", впервые продемонстрировано неодинаковое вовлечение Д1, Д2 и Д4 дофаминовых рецепторов в механизм локомоторной гиперактивности, вызванной введением d-амфетамина и сиднокарба. В представленной работе впервые продемонстрирована экспрессия белка Fos (продукта гена «раннего ответа» c-Fos) в мозге мышей инбредных линий, вызванная острым введением психостимулятора сиднокарба. Теоретическая и практическая значимость.

Был проведен сравнительный анализ изменения нейрохимических и поведенческих параметров в условиях воздействия психостимуляторами d-амфетамином и сиднокарбом. Продемонстрированы значительные отличия в участии дофаминовых рецепторов Д1-, Д2- и Д4-подтипов в механизме психостимулирующего действия. Учитывая сниженный риск возникновения лекарственной зависимости, а также менее выраженные побочные эффекты отечественного психостимулятора по сравнению с d-амфетамином, выяснение тонких механизмов действия этих соединений вносит существенный вклад в определение стратегии направленного поиска агентов обладающих необходимым психостимулирующим спектром действия, при сниженном риске возникновения побочных эффектов.

Апробация работы.

Результаты исследований были доложены и обсуждены на 5th ECNP Regional Meeting, С.-Петербург, Россия, 2000, на VIII Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии», Россия, Казань, 2001, на XXIII Congress of Neuropharmacology, Montreal, 2002, Международном симпозиуме «Neuron differentiation and plasticity - regulation by intercellular signals», Москва, Россия, 2003, Ежегодной Всероссийской конференции «Человек и лекарство», Москва, Россия, 2003, на лабораторных и межлабораторных семинарах НИИ Фармакологии РАМН. Публикации.

Основное содержание работы отражено в 11 публикациях (8 тезизов и 3 статьи).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

При сравнительном изучении психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба показано, что оба препарата в эквиэффективных дозах вызывают значительные изменения в дофаминергической нейропередаче в неостриатуме свободноподвижных крыс Вистар, проявляющиеся в выраженном увеличении внеклеточного уровня дофамина Селективный антагонист Д2-подтипа дофаминовых рецепторов раклоприд потенциирует вызванное d-амфетамином повышение внеклеточного уровня дофамина и не влияет на стимулирующий эффект сиднокарба Селективный антагонист Д1-подтипа рецепторов SCH23390 и антагонист Д4-подтипа рецепторов клозапин проявляют позитивное модулирующее влияние на повышение внеклеточного уровня дофамина, вызванное как d-амфетамином так и сиднокарбом

SCH23390 и раклоприд (антагонисты Д1 и Д2 дофаминовых рецепторов, соответственно) в дозах, не влияющих на спонтанную активность мышей линии С57В1, предотвращают развитие двигательной гиперактивности, обусловленное d-амфетамином, не оказывая заметного влияния на эффект сиднокарба

Клозапин в дозе, не вызывающей снижения локомоторной активности, не оказывает заметного влияния на стимулирующее действие d-амфетамина, но вместе с тем значительно ослабляет эффект сиднокарба Введение d-амфетамина и сиднокарба, наряду с повышением локомоторной активности, сопровождается выраженной индукцией Fos-белка в структурах мозга мышей двух инбредных линий, С57В1 и BALB/c. При этом, поведенческий ответ мышей С57В1 на d-амфетамин оказывается значительно более выраженным по сравнению с реакцией мышей BALB/c, что коррелирует с выраженностью экспрессии Fos-белка во вторичной моторной коре.

5. Заключение

Наиболее популярные психомоторные стимуляторы (амфетамин и его аналоги, кокаин) обладают выраженным эйфоригенным действием и способны вызывать формирование лекарственной зависимости. Указанное обстоятельство является причиной их постоянно повышающегося немедицинского использования. В связи с этим, актуальной проблемой психофармакологии остается поиск препаратов, обладающих сниженным риском формирования лекарственной зависимости, а также менее выраженными побочными эффектами по сравнению с традиционными психостимуляторами.

Изучение соединений, проявляющих подобный спектр фармакологической активности, представляется не менее значимым и для решения задач, направленных на эффективную профилактику и лечение патологических состояний, вызываемых стимуляторами. В литературе последнего времени активно дискутируется вопрос о возможности использования в клинической практике подобных соединений, для лечения лекарственной зависимости, развивающейся на фоне хронического приема амфетаминов или кокаина [Witkin, 1994; Deutsch et al., 1996; Villemagne et al., 1999].

С этих позиций представлялось интересным проведение сравнительного анализа нейрохимических и поведенческих эффектов d-амфетамина и оригинального отечественного психостимулятора сиднокарба, выгодно отличающегося от первого по целому ряду признаков: низкая токсичность, умеренное стимулирующее действие, слабый периферический и эйфоригенный эффект, предрасположенность к формированию лекарственной зависимости) [Машковский и соавт., 1971; Rudenko and Altshuler, 1979].

Широкий спектр психостимулирующих эффектов, вызываемых амфетаминами, кокаином и их аналогами, тесным образом увязывается с их способностью модулировать дофаминергическую нейропередачу в соответствующих структурах мозга [Seiden et al., 1993; Cho and Segal, Jones et al., 1998].

По всей видимости, принципиальной «мишенью» действия амфетаминов является специфический мембранный белок - дофаминовый транспортер, осуществляющий поддержание нейронального гомеостаза, путем эффективного закачивания дофамина из внеклеточной среды обратно внутрь нервной терминали [Jones et al., 1998; Gainetdinov and Caron, 2001]. Процесс «обращения» функционирования ДАТ, вызываемый данными психостимуляторами опосредует значительное повышение уровня содержания внеклеточного дофамина и ассоциирующийся с ним стимулирующий эффект [Cho and Segal., 1994; Berke et al., 1998; Jones et al., 1998].

В то же время другие психомоторные стимуляторы, такие как кокаин, метилфенидат, а также селективные блокаторы ДАТ, не являющиеся его субстратами (GBR12909 и его аналоги) вызывают повышение внеклеточного уровня содержания дофамина, непосредственно ингибируя «обратный захват» нейротрансмиттера нервными терминалями [Zetterstrom et al., 1988; Hurd and Ungerstedt, 1989; Baumann et al., 1994]. Важно отметить, что многие из них активно изучаются на предмет их использования в клинической практике. В частности, метилфенидат (наряду с амфетаминами) применяется в Северной Америке для лечения синдрома гиперактивности с нарушением внимания у детей, и некоторых других психоневротических заболеваний. Соединения группы GBR и ряд других блокаторов «обратного захвата» моноаминов в мозге, в настоящее время рассматриваются как потенциальные средства для лечения лекарственной зависимости и нейротоксических эффектов, вызываемых амфетаминами [Witkin, 1994; Witkin etal., 1999]

С этой точки зрения, представляется интересным, что нейрохимические особенности механизма действия сиднокарба, нашедшего применение в отечественной клинической психиатрии (в частности, для лечения детей с синдромом гиперактивности) [Машковский и соавт., 1971; Авруцкий, 1973; Красов, 1988], изучены явно недостаточно. В более ранних исследованиях было продемонстрировано наличие норадрен- и серотонинергического компонентов в фармакологическом спектре действия психостимулятора [Анохина и соавт. 1974; Арушанян и Батурин, 1981]. Примерно в то же время Erdo и соавт. обнаружили, что сиднокарб эффективно угнетает процесс «обратного захвата» дофамина синаптосомами мозга крыс [Erdo et al., 1981].

Исследования, проводившиеся в нашей лаборатории, на протяжении ряда последних лет выявили выраженное изменять состояние дофаминергической нейропередачи в ряде дофаминзависимых структур мозга [Андяржанова и соавт., 1999; Gainetdinov et al., 1997; Afanas'ev et al., 2001; Anderzhanova et al., 2001]. При этом по целому ряду параметров (выраженность и динамика развития эффекта, влияние на метаболиты) действие амфетамина и сиднокарба значительно отличается. Кроме того, выявлены значительные расхождения во влиянии двух психостимуляторов на другие нейромедиаторные системы мозга (глутамат-, аспартат-, пептидергические) [Anderzhanova et al., 2000; Bashkatova et al., 2002].

Одним из наиболее актуальных вопросов в области дофаминергической нейропередачи остается выяснение истинной роли различных рецепторов дофамина (Д1-Д5) в механизме действия психотропных препаратов. В частности, во многом остаются неизученными тонкие нейрохимические эффекты, лежащие в основе подобного взаимодействия. Исходя из этого, основной целью данной работы явился сравнительный анализ возможного участия дофамин-рецепторного звена в психостимулирующих эффектах d-амфетамина и сиднокарба. В первой части было продемонстрировано, что однократное введение d-амфетамина вызывает мощное и быстрое повышение уровня внеклеточного содержания дофамина, сопровождающееся достоверным падением внеклеточной концентрации его метаболитов, ДОФУК и ГВК. В то же время, повышение уровня содержания дофамина в диализатах мозга носило значительно более умеренный и пролонгированный характер, сопровождаясь незначительным повышением внеклеточной концентрации ДОФУК и ГВК.

Подобное расхождение в эффектах двух психостимуляторов можно объяснить тем, что в отличие от d-амфетамина, сиднокарб не вызывает «обращения» дофаминового транспортера, а ингибирует процесс «обратного захвата» дофамина, высвобождающегося, как предполагают, из везикулярного внутриклеточного «депо».

Исследования последнего времени позволили выявить наличие сложной комплексной связи между различными компонентами механизма дофаминергической нейротрансмисси, такими как высвобождение (release) и обратный захват (uptake) нейротрансмитттера, поддержание нейронального гомеостаза, опосредующиеся функциональной активностью дофаминового транспортера с одной стороны, и дофаминовыми рецепторами (в частности Д2-подтипа) с другой [Jones et al., 1998, 1999; Gainetdinov and Caron, 2002]. В связи с этим, представлялось интересным оценить вклад дофаминовых рецепторов различных подтипов в механизм повышения внеклеточного уровня дофамина, вызванного введением психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба, учитывая обнаруженные ранее различия в их влиянии на нейрохимические параметры дофаминергической нейропередачи.

Селективный антагонист Д2-подтипа дофаминовых рецепторов раклоприд, в дозе вызывающей их эффективную блокаду, по-разному влиял на повышение внеклеточного содержания дофамина, обусловленное введением двух психостимуляторов. В частности, раклоприд оказывал достоверный стимулирующий эффект на повышение уровня внеклеточной концентрации дофамина, обусловленное d-амфетамином, тогда как влияния Д2-антагониста, в тех же условиях, на фоне сиднокарба отмечено не было.

Потенциирующее действие антагонистов Д2-подтипа рецепторов на повышение внеклеточной концентрации дофамина, вызванное d-амфетамином или другими соединениями, эффективно блокирующими обратный захват дофамина, но не являющимися специфическими субстратами ДАТ (амфонелиевая кислота, номифензин), хорошо известно из литературных источников [Sharp et al., 1986; Watanabe et al., 1989; Tyler and Galloway, 1992; Pehek, 1999; Rahman and McBride, 2000]. По-видимому, нейрохимической основой их взаимодействия является повышение внеклеточного уровня дофамина (путем блокады «обратного захвата» дофамина или обращения ДАТ) на фоне блокады «отрицательной обратной связи», опосредуемой ауторецепторами Д2-подтипа.

Механизм взаимовлияния эффектов раклоприда и сиднокарба неясен. Неспособность раклоприда вызывать дальнейшее повышение внеклеточной концентрации дофамина, на фоне стимулирующего действия сиднокарба может объясняться тем, что последний, в отличие от d-амфетамина не вызывает перераспределения внутриклеточного дофамина из везикул в цитоплазму и последующий выброс содержимого во внеклеточное пространство, опосредуемый обращением функции ДАТ [Jones et al., 1998; Gainetdinov and Caron, 2002]. Действие сиднокарба, скорее, проявляется в ингибировании процесса «re-uptake» дофамина из внеклеточного пространства [Erdo et al., 1981], на фоне повышенного высвобождения нейротрансмиттера из везикулярного Са2+зависимого «депо», обусловленного введением Д2-антагониста раклоприда. Таким образом, полученные данные подтверждают высказанное ранее предположение о том, что механизм, опосредующий эффекты сиднокарба на дофаминергическую нейропередачу мозга, отличается от такового для d-амфетамина.

Селективный антагонист Д1-подтипа рецепторов SCH23390 и антагонист Д4-рецепторов клозапин вызывали положительный модулирующий эффект на накопление внеклеточного дофамина в диализатах, обусловленное введением обоих психостимуляторов, принципиально не меняя динамику высвобождения дофамина и его метаболитов (ДОФУК и ГВК). Учитывая, что Д1 и Д4 рецепторные подтипы локализуются в стриатуме преимущественно постсинаптически на проекционных среднешипиковых нейронах, интернейронах и терминалях корковых волокон, их позитивный модулирующий эффект на высвобождение дофамина, обусловленное психостимуляторами, очевидно, определяется вовлечением иных нейромедиаторных систем мозга (ГАМК-, глутамат-, ацетилхолинергической) [Starr, 1987; Abercrombie and DeBoer, 1997; Price and Pittman, 2001; Wang et al., 2002]

Наблюдаемое в представленной работе, неодинаковое влияние дофаминовых рецепторов различных подтипов, на обусловленное введением психостимуляторов повышение уровня содержания внеклеточного дофамина и динамику развития стереотипного поведения животных, позволило нам произвести оценку специфичности участия индивидуальных рецепторных подтипов в механизме стимулирующего действия d-амфетамина и сиднокарба. С этой целью, было проведено изучение роли Д1, Д2 и Д4 подтипов дофаминовых рецепторов в механизме локомоторной гиперактивности, вызванной d-амфетамином и сиднокарбом, у мышей линии С57В1. Путем предварительных экспериментов были установлены дозы психостимуляторов, вызывающие эквиэффективный поведенческий ответ животных. Использование низких доз дофамин-рецепторных антагонистов (SCH2390, раклоприда и клозапина), не влияющих самих по себе на двигательную активность животных, позволило выявить специфический вклад индивидуальных рецепторов.

В частности, было показано, что антагонист Д2-рецепторов раклоприд и антагонист Д1-рецепторов SCH23390 эффективно предотвращают локомоторную гиперактивность мышей С57В1, индуцированную d-амфетамином, не влияя в этих же условиях на эффект сиднокарба. В то же время, Д4-антагонист клозапин не оказывает значимого влияния на действие d-амфетамина, и достоверно (хотя и не полностью) подавляет эффект сиднокарба. Последнее, как предполагается, может быть обусловлено наличием в фармакологическом спектре психостимулятора, серотонин- и норадренергического нейромедиаторного компоненнтов [Анохина и соавт., 1974; Альтшулер и соавт., 1977; Арушанян и Батурин, 1981].

Полученные данные подтверждают обнаруженные ранее в исследованиях нашей лаборатории различия в тонких механизмах действия двух психостимуляторов [Андяржанова и соавт.,1999; Gainetdinov et al., 1997; Anderzhanova et al., 2000; Afanas'ev et al., 2001]. Учитывая, что экспрессия поведенческой гиперактивности и формирование лекарственной зависимости в значительной степени ассоциируются с мезолимбической дофаминергической системой (а развитие стереотипного поведения и проявление психотических симптомов при отравлении психостимуляторами с нигростриатной дофаминовой системой) [Арушанян, 2003], представленные в данной работе результаты дают основание предположить наличие неодинаковой индивидуальной роли дофаминовых рецепторов различных подтипов (Д1, Д2 и Д4), в психостимулирующих эффектах d-амфетамина и сиднокарба.

Исследования последнего времени позволяют предполагать, что подобные эффекты психостимуляторов, на фоне их острого или хронического применения, проявляются не только в изменении поведения животных, но и в индукции экспрессии т.н. «ранних генов» в корковых, стриатных и лимбических структурах мозга, что, по-видимому, определяет вовлеченность данных структур в механизм действия двух психостимуляторов и служит одним из ключевых этапов в развитии процессов сенситизации и формирования лекарственной зависимости [Badiani et al., 1998; Berke et al., 1998; Nestler and Landsman, 2001]. В связи с этим нами был проведен сравнительный анализ эффектов сиднокарба и d-амфетамина на локомоторную активность и паттерн экспрессии белка c-Fos (продукта активности «раннего гена» c-fos) в мозге мышей двух инбредных линий С57В1 и BALB/c, различающихся по характеру поведенческого фенотипа [Середенин, Ведерников, 1979; Машковский и соавт., 1980; Moisset and Welch, 1973].

Показано, что оба психостимулятора вызывают значительное повышение локомоторной активности и выраженную индукцию Fos-белка в стриатуме, прилежащем ядре, перегородке, и ряде областей коры мозга мышей, тесно связанных с различными проявлениями психомоторных функций. Эффект d-амфетамина в отношении двигательной активности оказался более выраженным у мышей С57В1, что коррелирует со степенью индукции c-Fos в области вторичной моторной коры мозга. Сиднокарб вызывает более сильную по сравнению с d-амфетамином экспрессию Fos-белка в центральной части прилежащего ядра мозга мышей С57В1. Сложная комплексная картина паттерна экспрессии гена c-Fos в мозге, наблюдающаяся на фоне действия обоих психостимуляторов, позволяет заключить, что различия в эффектах d-амфетамина и сиднокарба, как на клеточном, так и системном уровне, могут в значительной мере определяться исходным генотипом животных.

Кроме того, выраженная индукция активности гена раннего ответа c-Fos в дофаминзависимых структурах мозга, обусловленная введением d-амфетамина и сиднокарба, на фоне выраженного повышения спонтанной локомоторной активности мышей обеих линий, свидетельствует о вовлечении данных областей в психостимулирующие эффекты обоих психостимуляторов. Таким образом, получено дополнительное подтверждение наличия выраженного дофаминергического компонента в механизме действия оригинального психостимулятора сиднокарба. В целом, представленные в данной работе результаты свидетельствуют о значительной нейрохимической гетерогенности механизмов, лежащих в основе психостимулирующего действия амфетаминоподобных соединений.