Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение радиопротекторного действия феруловой кислоты

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

АБИСАЛОВА ИРИНА ЛЕОНИДОВНА

ИЗУЧЕНИЕ РАДИОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ФЕРУЛОВОЙ КИСЛОТЫ

14.00.25 - ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

ПЯТИГОРСК-2004

Работа выполнена в Пятигорской государственной фармацевтической академии

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - кандидат биологических наук,

доцент Назарова Любовь Ефимовна ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Гринзайд Юрий Михайлович кандидат фармацевтических наук Лысенко Татьяна Александровна ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия

ЗАСЕДАНИИ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д 208.069.01 ПО ЗАЩИТАМ ДИССЕРТАЦИЙ ПРИ ПЯТИГОРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ АКАДЕМИИ (357533, ПЯТИГОРСК, ПР.КАЛИНИНА, 11)

С ДИССЕРТАЦИЕЙ МОЖНО ОЗНАКОМИТЬСЯ В БИБЛИОТЕКЕ ПЯТИГОРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ АКАДЕМИИ

АВТОРЕФЕРАТ РАЗОСЛАН

ЗАЩИТА СОСТОИТСЯ ^в 2004 г. В_ЧАСОВ НА

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА

КОМПАНЦЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время значительно возросла радиационная нагрузка на население земного шара. Кроме природного радиационного фона, который представлен космической радиацией (протоны, альфа-частицы, гамма-лучи), и излучения естественных радиоактивных веществ, присутствующих в почве, воздухе, воде и пище, на организм человека оказывают влияние техногенные системы радиационного излучения. Остальную часть популяционной дозы человек получает при медицинских диагностических процедурах: рентгеновских снимках, флюорографии, просвечивании и т.д., при пребывании в современных зданиях. Но все это очень малые величины, практически не оказывающие вредного влияния на здоровье человека. Причинами, вызывающими острое или хроническое лучевое поражение, чаще всего могут стать как аварийные ситуации, так и тотальное облучение организма с лечебной целью. В связи с этим, сегодня вопросы фармакологической защиты населения от радиационного поражения остаются актуальными.

составленные на их основе рецептуры, которые при введении в организм перед его облучением оказывают защитное действие. Несмотря на то, что высокие радиозащитные свойства обнаружены у многих химических веществ и лекарственных средств, для практического использования рекомендованы лишь некоторые из них. Это связано с тем, что имеющиеся в арсенале медицинской науки радиопротекторы обладают рядом существенных недостатков - низкой эффективностью и узкой широтой терапевтического действия, высокой токсичностью и малой по времени продолжительностью радиопротекторного эффекта. В литературе по радиобиологии в основном представлены работы, посвященные изучению фармакологических свойств и роли механизмов противолучевой защиты лекарственных препаратов, относящихся к серосодержащим соединениям, индолилалкиламинам, арилалкиламинам, производным имидазола, и мало уделяется внштагпи-фаюльным соедиаени-ям, обладающим антиоксидантными свойств; ми. Вместе.с-тем доказана и

Радиопротекторами называются лекарственные препараты или

достаточно хорошо изучена роль свободно-радикальных механизмов повреждения в патогенезе развития лучевого поражения.

Цель: выявить наиболее активное соединение в ряду производных 3-фенилпропеновой (коричной) кислоты с различными заместителями в ароматическом ядре и оценить его радиопротекторную активность.

Для достижения поставленной цели нами решались следующие задачи:

1. Изучить радиопротекторное действие синтетических производных 3-фенилпропеновой кислоты in vitro с использованием эритроцитар-ной радиомиметической методики и УФ-индуцированного гемолиза эритроцитов.

2. Выбрать наиболее активное соединение в ряду производных 3-фенилпропеновой кислоты.

3. Определить острую токсичность, оптимальную концентрацию и время введения выбранного соединения.

4. Провести оценку радиопротекторной активности выбранного соединения по клиническим показателям лучевого поражения.

5. Оценить антимутагенную активность изучаемого соединения с помощью микроядерного теста в облученном организме.

6. Определить биохимические показатели в облученном организме и влияние на них изучаемого соединения и препарата сравнения циста-мина.

7. Изучить влияние исследуемого соединения и цистамина на морфологические изменения в критических органах при облучении.

Научная новизна работы. В результате проведённых исследований впервые выявлена закономерность между структурой и радио протекторной активностью в ряду 27 синтетических производных 3-фенилпропеновой кислоты. Установлено, что феруловая кислота (З-метокси-4-гидрокси фенил-пропеновая кислота) задерживает УФ-индуцированный гемолиз эритроцитов,

оказывает выраженный мембраностабилизирующий эффект при тестировании на эритроцитарной радиомиметической методике с использованием модельных радиотоксинов; повышает выживаемость животных при однократном общем у-облучении в летальных и сублетальных дозах; нормализует клинические, биохимические и некоторые цитологические показатели радиационного поражения; усиливает компенсаторно-приспособительные реакции клеток организма облучённых животных.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования позволяют определить влияние феруловой кислоты в сравнении с цистамином на течение острой лучевой болезни по клиническим, цитологическим, биохимическим и морфологическим показателям. Полученные результаты указывают на высокую эффективность и низкую токсичность феруловой кислоты, что создает предпосылки для дальнейшего более углубленного ее изучения в качестве радиопротектора.

Внедрение результатов исследования в практику. По результатам фармакологических исследований, полученным при выполнении данной работы, составлен и утвержден в ПятГФА отчет о биологической активности феруловой кислоты, материалы которого будут использоваться на кафедре фармакологии ПятГФА для дальнейшего изучения ее церебропротекторной активности в условиях радиационного воздействия; разработаны методические указания для студентов по патологии по теме: «Облучение - физический повреждающий фактор» содержащие информацию к проведению лабораторного занятия с использованием в качестве изучаемого объекта феруловой кислоты. Методические указания будут использоваться в курсе общей патологии ПятГФА и Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии.

Положения, выносимые на защиту: 1. В результате сравнительной оценки антиоксидантной активности в ряду 27 синтетических производных коричной кислоты с их антигемолитическим действием при ультрафиолетовом повреждении эритроцитов установлена тесная корреляционная зависимость между этими двумя видами

фармакологических эффектов.

2. Наибольший антиоксидантный и антигемолитический эффект среди изученных производных коричной кислоты проявила феруловая кислота. На липидной радиомиметической модели подтверждено радиопротекторное действие феруловой кислоты.

3. Феруловая кислота относится к практически нетоксичным веществам.

4. В сравнении с цистамином показано влияние феруловой кислоты на степень выраженности острой лучевой болезни, вызванной гамма-облучением у разных видов животных на организменном, органном, тканевом и клеточном уровнях. Феруловая кислота улучшает клинические, цитогенетические, биохимические и морфологические показатели при остром радиационном поражении.

5. Экспериментально установлены некоторые механизмы радиопротекторного действия феруловой кислоты, показаны преимущества феруловой кислоты по сравнению с цистамином.

Апробация работы: Основные результаты диссертационной работы доложены на 56-й, 58-й, 59-й региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров Пятигорской государственной фармацевтической академии (Пятигорск, 2001, 2003; 2004 гг), на ежегодной конференции молодых ученых «Аспирантские чтения» (Самара, 2002).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (№ государственной регистрации 01.2001.02926).

Объём и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 125 страницах текста компьютерного набора (без приложений), содержит 20 таблиц и 29 рисунков. Диссертационная работа состоит из введения, пяти взаимосвязанных глав, выводов, списка литературы и приложений. Библиографический указатель включает 167 литературных источников, в том числе -

41 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования: производные 3-фенилпропеновой (коричной) кислоты с различными заместителями в ароматическом ядре, синтезированные на кафедре органической химии ГТятГФА (зав. кафедрой - профессор Э.Т. Оганесян).

Методы исследования: Радиопротекторные свойства феруловой кислоты изучались в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ» [Фисенко,2000].

Опыты выполнены на белых мышах-самцах массой 20-25 г, крысах-самцах линии Вистар и беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. Животные содержались в стандартных условиях (22±2°С, 12-часовая смена светового периода с включением света в 8-00) и получали стандартный корм и воду ad libitum.

Раствор феруловой кислоты для внутрибрюшинных инъекций готовили ex tempore. Феруловую кислоту растворяли в дистиллированной воде с добавлением гидрокарбоната натрия в эквивалентных количествах и при нагревании раствора до 40°С. После растворения феруловой кислоты контролировали рН раствора, который равнялся 1,4-1,8.

Для воспроизведения острой лучевой болезни общее равномерное облучение экспериментальных животных проводили на стандартной у-терапевтической установке типа «АГАТ-С» (мощность 0,0111, поле 20x20, РИП 15 мм, источник Со60). Дозы радиации в различных сериях экспериментов составляли от 2,0 до 9,0 Грей.

Острую токсичность феруловой кислоты определяли по методу Литчфилда и Уилкоксона.

Эффективные дозы феруловой кислоты и цистамина для лечения облученных животных определяли при помощи теста на выживаемость. Время введения феруловой кислоты устанавливали методом газожидкостной хроматографии на приборе «Кристалл 2000».

Для изучения гематологических показателей лучевого поражения проводили подсчет количества лейкоцитов и эритроцитов периферической крови, подсчет количества миелокариоцитов в красном костном мозге в камере Горяева; построение эритрограмм.

Цитогенетические показатели радиационного поражения оценивали микроядерным тестом [Сычева, 2001].

Биохимические изменения острой лучевой болезни и влияние на них исследуемого вещества определяли по изменению уровня белковых фракций, по концентрации молекул средней массы и ТБК-активных продуктов в сыворотке крови.

Для определения степени проницаемости капилляров кожи у облученных животных использовали вакуум- и ксилол- индуцированное повреждение капилляров.

Морфологические исследования критических органов (тонкий кишечник, селезенка, семенники) проводили по методике Меркулова [1962].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведен скрининг 27 синтетических производных 3 - фенилпропе-новой (коричной) кислоты с различными заместителями в ароматическом ядре на предмет наличия у этих соединений антиоксидантных свойств. В качестве модельной системы использовали аскорбатзависимое перекисное окисление липидов в составе Твина-80, окислителем служил кислород воздуха. В следующей серии экспериментов нами проведено изучение влияния тех же производных коричной кислоты на течение гемолиза эритроцитов, вызванного облучением клеток ультрафиолетовыми лучами.

В результате было установлено, что антиоксидантная и антигемолитическая активности производных коричной кислоты зависят от характера, местоположения и взаимного влияния заместителей в ароматич еском ядре. Кроме того, прослеживается взаимосвязь между антиоксидантными свойствами и протективным действием при УФ - индуцированном гемолизе.

Наиболее выраженные антиоксидантные и антигемолитические свой-

ства проявила феруловая кислота (3-метокси 4-гидрокси фенилпропеновая кислота):

Благодаря наличию в структуре молекулы феруловой кислоты (ФК) углеродной цепи, содержащей двойную связь (остаток пропеновой кислоты) и гидроксильной группы в фенильном ядре, она легко вступает в свободно-радикальные реакции с образованием стабильного слабо реакционноспособ-ного феноксильного радикала. Таким образом, ФК, способствуя терминации цепных свободно-радикальных реакций, является высокоэффективной ловушкой свободных радикалов.

С учетом результатов скрининга провели оценку влияния ФК на гемолиз эритроцитов, вызванный модельными липидными радиотоксинами в сравнении с известным антиоксидантом эмоксипином. Опыты показали, что ФК снижала степень гемолиза эритроцитов в 4 раза относительно контроля и в 2 раза относительно эмоксипина.

Учитывая, что ФК проявила наиболее выраженные антиоксидантные и антигемолитические свойства, она была выбрана в качестве объекта для дальнейших исследований.

Острую токсичность ФК определяли по методу Литчфилда и Уил-коксона. Исследования показали, что LD50 для ФК составила 1520 мг/ кг, что позволило по классификации Сидорова К.К. отнести ее к практически нетоксичным веществам.

Было установлено, что радиации в условиях нашего

эксперимента для мышей составляет

Для определения оптимальной дозы ФК как радиопротектора проводили тест на выживаемость на белых мышах-самцах. ФК вводили внутри-брюшинно в виде раствора, приготовленного ex tempore на воде для иньек-

сн3о

1ТТТИ с добавлением эквивалентных количеств гидрокарбоната натрия. ФК вводилась в концентрациях от 50 мг/кг до 500 мг/кг с шагом 50 мг/кг. Параллельно проводился опыт с использованием в качестве радиопротектора цис-тамина. Доза радиации составляла 5,5 Гр. За животными наблюдали в течение 30 дней с ежедневной регистрацией погибших. Опыты показали, что оптимальная доза цистамина составляет 100 мг/кг массы животного, что совпадает с данными, имеющимися в литературе, а доза ФК -200 мг/кг (выживает 100% экспериментальных животных).

Время достижения максимальной концентрации ФК в крови после ее внутрибрюшинного введения устанавливали методом газожидкостной хроматографии. Животным внутрибрюшинно вводили 200 мк/кг ФК и через 15, 30, 45 и 60 минут с момента введения определяли концентрацию исследуемого вещества в плазме крови. Полученные данные свидетельствуют о том, что плато концентрации ФК при внутрибрюшинном введении наступает через 30 минут.

Для оценки радиопротекторного действия ФК при постановке каждой методики использовалось 4 группы животных по 10 особей в каждой: 1-я -биологический контроль; 2-я - облученный контроль; 3-я - получала за 30 минут до облучения цистамин в дозе 100 мг/кг; 4-я - получала ФК в дозе 200 мг/кг по той же временной схеме.

Учитывая, что одним из объективных и постоянных признаков лучевого поражения является прогрессивное падение массы тела, мы изучали изменение массы крыс после поражения у-лучами в дозе 5,5 Гр на фоне применения ФК. К 28 дню исследования наблюдалось достоверное увеличение прироста массы животных в группе, получавшей ФК (180,1±2,34-облученный контроль; 188,9±2,37-опытсФК).

Острая лучевая болезнь характеризуется заметной патологией со стороны капиллярного русла. По степени выраженности капиллярной проницаемости и ломкости можно судить об эффективности применяемых радиопротекторов. Животных облучали в дозе 3 Гр, так как более высокие дозы

приводили в ряде случаев к глубокому повреждению кожи. Опыты показали, что ФК проявляла наиболее выраженное капилляропротекторное действие. Она достоверно снижала количество петехий в первой серии при вакуум-индуцированном повреждении капилляров и время их появления и полного прокрашивания во второй серии при ксилол-индуцированном повреждении. Результаты достоверны по отношению к контролю и препарату сравнения цистамину.

Среди биологических тканей наиболее чувствительной к радиационному поражению является система кроветворения. Наиболее реактивной среди клеток периферической крови является лейкоцитарная фракция.

Анализ лейкоцитарного состава периферической крови проводили у животных, облученных в дозе 2 и 5,5 Гр. Установлено, что профилактическое введение ФК и цистамина перед облучением достоверно препятствовало интенсивному снижению лейкоцитов по сравнению с контролем. Протекторное действие ФК выше при дозе радиационного поражения 2 Гр (табл. 1), оно достоверно превосходило антилейкопеническое действие цистамина. При дозе радиации 5,5 Гр радиопротекторные эффекты цистамина и ФК выравниваются и достоверных различий в эффектах не наблюдается.

Таблица 1 — Влияние феруловой кислоты и цистамина на изменение общего количества лейкоцитов у крыс, подвергшихся у-облучению в дозе

Группа животных Количество лейкоцитов (*109/л) после облучения

на 7 день на 14 день на 21 день на 28 день

Облучённый контроль 5,62±0,34 3,93±0,23 4,52±0,27 5,94±0,36

Цистами», 100 мг/кг 7,58±0,51 Р< 0,01 6,65+0,46 Р<0,001 7,43±0,58 Р<0,01 8,25±0,66 Р< 0,01

Феруловая кислота, 200 мг/кг 8,86±0,72 Р|>0,05 8,23±0,52 Р,<0,05 9,11 ±0,41 Р]<0,05 9,86±0,42 Р,<0,05

*Примечание: количество лейкоцитов у интактных животных 12,62±0,83х109/Л;

Р - по отношению к контролю; Р1 - по отношению к цистамину.

Параллельно проводили подсчет количества эритроцитов в периферической крови у крыс, облученных в дозе 5,5 Гр. Результаты показали, что существенных изменений в количестве эритроцитов после облучения не наблюдается. Это объясняется тем, что их средняя продолжительность жизни составляет 120 дней.

Более информативным в отношении эритроцитарной составляющей крови является метод построения эритрограмм. Эритрограммы отражают нарушения в соотношении между кроветворной и кроверазрушающей системами в облученном организме. Критерием служит время наступления гемолиза эритроцитов, вызванного соляной кислотой. Нормой считается наступление 80-ти % гемолиза на четвертой минуте с момента введения гемолизирующего фактора, что соответствует среднеустойчивым эритроцитам в возрасте от 30 до 90 дней. Продление гемолиза до 5-7 минут соответствует повышенной устойчивости, свойственной молодым эритроцитам. В норме их должно быть 15-20%.

Построение эритрограммы животных, подвергнутых у-облучению в дозе 5,5 Гр, показало, что профилактическое введение ФК способствует сохранению в крови молодых и зрелых эритроцитов в соотношениях, практически приближенных к норме (рис.1).

Рисунок 1 - Влияние цистамина (ЮОмг/кг) и ферулоеой кислоты (200мг/кг) на динамику эритрограммы облучённых(5,5Гр) крыс

Оценку мутагенного действия радиации на клетки красного костного мозга проводили методом подсчета миелокариоцитов в костном мозге крыс, облученных в дозе 5,5 Гр на 4 день. ФК в дозе 200 мг/кг оказывала протекторный эффект при защите клеток костного мозга от действия у-излучения, достоверно превышая эффект цистамина (табл.2).

Таблица 2 — Влияние феруловой кислоты и цистамина па количество миелокариоцитов костного мозга крыс*

Серия опытов Количество животных Миелокариоциты (х 104/л)

Интактные 6 268±16

Облучённый контроль 6 32±3 Р<0,001

Цистам ин, 100 мг/кг 6 98±9 Р<0,01

Феруловая кислота, 200 мг/кг 6 166±11 Р<0,001; Р1<0,01

" • Примечание: Р - по отношению к контролю; Pi - по отношению к цистам ину.

Для оценки цитогенетических изменений под влиянием радиационного поражения использовали микроядерный тест. Микроядра являются продуктами, появляющимися в клетке при деструктивных изменениях в генетическом аппарате. Микроядерный тест проводили на эритроцитах красного костного мозга. Анализировали показатели поли- и нормохроматофильных эритроцитов с микроядрами у животных, пораженных у-излучением в дозе 2 Гр. Опыты показали, что облучение в указанной дозе приводит к значительному повышению в костном мозге эритроцитов с микроядрами. Введение за 30 минут до облучения ФК и цистамина достоверно улучшает эти показатели. Кроме того, наибольшую активность проявляет ФК, ее эффект достоверно превосходит препарат сравнения цистамин (табл. 3).

Таблица 3 — Показатели микроядерного теста в эритроцитах костного мозга облученных крыс (на 1000 клеток, в %)*

Группа животных Дни Количество полихроматофилов с микроядрами Количество нормохроматофилов с микроядрами

Интактные 1,27±0,37 0,35±0,05

Облученный контроль 7 14 21 7,12±0,35 9,83±0,43 11,12±0,36 0,75±0,03 0,86±0,03 1,21 ±0,03

Цистамин, 100 мг/кг 7 14 21 5,43±0,38 Р<0,05 7,25±0,41 Р<0,05 7,87±0,33 Р<0,05 0,58±0,01 Р<0,05 0,63±0,03 Р<0,05 0,72±0,03 Р<0,05

Феруловая кислота, 200 мг/кг 7 14 21 4,26±0,36 Р,<0,05 5,88±0,42 Р!<0,05 6,64±0,37 Р[<0,05 0,52±0,02 Р)<0,05 0,54±0,02 Р!<0,05 0,62±0,03 Р,<0,05

*Примечание: Р - по отношению к контролю; Pi - по отношению к цистамину.

Определение изменения уровня белковых фракций в плазме крови проводили на 14 день после облучения дозой 5,5 Гр. Рассчитывали альбу-мин-глобулиновый коэффициент. Опыты показали выраженный протекторный эффект цистамина и ФК по сравнению с контролем.

Степень эндогенной интоксикации оценивали по уровню молекул средней массы в плазме крови животных, облученных в дозе 5,5 Гр. Анализ плазмы проводили на спектрофотометре СФ-26, при длине волны 254 нм на 7, 14 и 21 день после облучения. Было установлено, что ФК проявила статистически достоверную большую активность, чем препарат сравнения циста-мин в снижении уровня эндогенной интоксикации (табл. 4).

Таблица 4— Влияние феруловой кислоты и цистамипа на содержание молекул средней массы в плазме крови крыс*

Группа животных Дни исследования Ед. оптической плотности Достоверность различий

Интактные 0,222±0,018

Облучённый контроль 7 14 21 0,321 ±0,021 0,380±0,018 0,344+0,016 Р<0,05 Р<0,01 Р<0,01

Цистамин, 100 мг/кг 7 14 21 0,283±0,016 0,28810,018 0,268±0,012 Р,>0,05- Р,<0,01 Р,<0,01

Феруловая кислота, 200 мг/кг 7 14 21 0,23810,015 0,24110,012 0,23410,010 Р,<0,05 Р2<0,05 Р,<0,05 Р2<0,05 Р1<0,01 Р2<0,05

""Примечание: Р — по отношению к интактным; Pi - по отношению к контролю; Р2 - по отношению к цистамину.

Учитывая, что одним из наиболее важных патогенетических механизмов развития лучевой болезни является активация процессов перекисно-го окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран, проводили изучение динамики изменения содержания продуктов ПОЛ в сыворотке крови животных, облученных дозами 2, 4 и 6 Гр. Облучение приводило к достоверному дозозависимому повышению ТБК-активных продуктов в контрольной группе. ФК проявляла более выраженное по сравнению с цистамином радиопротекторное действие в диапазоне низких доз радиации. По мере повышения дозы облучения способность ФК и цистамина снижать уровень ТБК- активных продуктов в сыворотке крови нивелируется (рис 2).

Интактные -№ 1

Облученные дозой 2 Гр -№2 (контроль, цистамин, ФК);

Облученные дозой 4 Гр -№3 (контроль, цистамин, ФК);

Облученные дозой 6 Гр -№4 (контроль, цистамин, ФК).

Для изучения патоморфологических изменений под влиянием радиационного поражения при вскрытии животных отбирали наиболее радиочувствительные органы: тонкий кишечник, селезенку и семенники.

Анализ срезов показал, что облучение приводит к значительным изменениям в архитектонике тонкого кишечника: происходит истончение или расширение клеточных ворсинок; центральные зоны сохранившихся ворсинок представляют бесструктурную массу, всасывающие цилиндрические эпи-телиоциты утрачивают четкое очертание, наблюдается кариолизис, обнаруживаются множественные петехиальные и сливные кровоизлияния. Тонкий кишечник крыс, леченных ФК, значительно отличается от облученного контроля. Кишечные ворсинки несколько расширены, но сохранены по всей поверхности. Признаки кариолизиса наблюдаются в единичных случаях. В группе животных, получавших цистамин, количество эпителиальных энтеро-цитов с признаками кариолизиса и петехиальных кровоизлияний значительно больше, чем в группе, получавшей ФК.

Морфологическая картина срезов семенников, которые отбирали на 60 день от облучения, показала, что облучение животных в дозе 5,5 Гр приводит к истончению стенки семенных канальцев, базофилия клеток исчезает, что свидетельствует о разрушении хромосомного аппарата ядер, зрелые сперматозоиды полностью отсутствуют. На гистологических срезах семенников крыс, леченных ФК, сперматогенный слой сохранен, также сохранена ба-зофильная окраска сперматогоний, количество сперматогенных клеток несколько меньше, чем в интактной группе. В центральной зоне среза семенного канальца содержатся зрелые сперматозоиды. На фоне применения циста-мина сперматогенный слой истончен по всему периметру, частично сохранена базофильная окраска сперматогоний, количество сперматогенных клеток меньше, чем в группе, получавшей ФК.

Морфологическая картина срезов селезенки показала, что под влиянием у-облучения в дозе 5,5 Гр наблюдается уменьшение среднего размера фолликулов белой пульпы (4,03±0,17 отн.Ед -биологический контроль; 2,53±0,15 отн.Ед -облученный контроль). В группе животных, получавших ФК и цистамин, значительных изменений размеров фолликулов белой пульпы не наблюдалось, однако их размер у животных, леченных цистамином, составлял 3,12±0,16 отн.Ед, что достоверно меньше, чем в группе, получавшей ФК(3,82±0,14 отн.Ед).

Таким образом, нами впервые установлено, что феруловая кислота оказывает выраженное радиопротекторное действие и по многим показателям превосходит препарат сравнения цистамин.

18

ВЫВОДЫ:

1. Установлены антиоксидантная и антигемолитическая активности 27 синтетических производных 3-фенилпропеновой (коричной) кислоты in vitro. Определена взаимосвязь между антиоксидантной, антигемолитической активностью и характером заместителей в ароматическом ядре коричной кислоты, их местоположением и взаимным влиянием.

2. Установлено, что наиболее активным соединением в ряду исследуемых производных коричной кислоты является 3-метокси 4-гидрокси фенилпропеновая (феруловая) кислота.

3. Изучена острая токсичность ферул овой кислоты и установлено, что она относится к практически нетоксичным веществам. Феруловая кислота оказывает наиболее выраженный радиопротекторный эффект в дозе 200 мг/кг (среднелетальная доза у-излучения 5,5 Гр). Плато концентрации феруловой кислоты в плазме крови после внутрибрюшинного введения наступает через 30 минут.

4. Установлено, что феруловая кислота улучшает клинические показатели лучевой болезни: способствует приросту массы, оказывает капил-ляропротекторное действие, препятствует снижению количества лейкоцитов, проявляет протекторный эффект при защите клеток костного мозга, превосходя эффекты препарата сравнения цистамина.

5. На эритроцитах красного костного мозга у облученных животных показано, что феруловая кислота обладает антимутагенным действием по результатам микроядерного теста.

6. Экспериментально подтверждено, что феруловая кислота снижает степень эндогенной интоксикации по показателям уровня молекул средней массы и ТБК-активных продуктов в плазме крови облученных крыс.

7. Установлено, что феруловая кислота предотвращает выраженные деструктивные изменения в критических органах (тонкий кишечник, семенники, селезенка) при облучении животных в дозе 5,5 Гр.

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ

РАБОТЫ:

1. Протекторный эффект феруловой кислоты при действии на клетки модельных липидных радиотоксинов // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (56; 2001; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА, 2001. - С. 203. (Соавт. Назарова Л.Е., Огурцов Ю.А.).

2. Анализ зависимости антиоксидантных свойств производных 3-фенилпропеновой (коричной) кислоты от характера заместителей в ее ароматическом ядре и алифатической цепи // Пятигорск: ПятГФА, 2002. - 13 с. Деп. В ВИНИТИ РАН 19.02.02. № 334 - В 2002. Анн.: Библ. указ.: Деп. науч. работы (Естественные и точные науки, техника) — 2002. - № 4 (362) - С. 6-7. (реф 62). (Соавт. Огурцов Ю.А., Назарова Л.Е., Дьяков А.А.).

3. Феруловая кислота как потенциальный радиопротектор // Аспирантские чтения-2002: Сб. тез. докл. межрегион, коиф. мол. исследователей. 25 сент. 2002г. - Самара: СамГМУ, 2002. - С. 13-14.

4. Радиопротекторные свойства феруловой кислоты // Пятигорск: ПятГФА, 2003. - 14 с. Деп. В ВИНИТИ РАН 07.08.03. № 1537 - В 2003. Анн.: Библ. указ.: Деп. науч. работы (Естественные и точные науки, техника)- 2003. - № 10 (380) - С. 9 (реф. 74). (Соавт. Назарова Л.Е., Огурцов Ю.А.).

5. Радиопротекторнос действие 3-окси 4-метокси фенилпропено-вой кислоты // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Материалы межрегион, конф. по фармации и фармакологии (58; 2003; Пягигорск) - Пятигорск: ПятГФА, 2003. - С. 264-267. (Соавт. Назарова Л.ЕМ Огурцов Ю.А.).

6. Влияние феруловой кислоты и цистамина на степень эндогенной интоксикации у крыс, пораженных у-излучением // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Материалы межрегион, конф. по фармации и фармакологии (59; 2004; Пятигорск) - Пятигорск: ПятГФА, 2004. - С. 238. (Соавт. Назарова Л.Е., Огурцов Ю.А.)

»212 7 5 4

ИЗУЧЕНИЕ РАДИОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ФЕРУЛОВОЙ КИСЛОТЫ

АБИСАЛОВА ИРИНА ЛЕОНИДОВНА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать Л & 2004. Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтарная Усл. печ. л. // &. Тираж экз. Заказ № Пятигорская государственная фармацевтическая академия 357533, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11

Актуальность исследований. В настоящее время значительно возросла радиационная нагрузка на население земного шара [2]. Кроме природного радиационного фона, который представлен космической радиацией (протоны, альфа-частицы, гамма-лучи), и излучения естественных радиоактивных веществ, присутствующих в почве, воде, воздухе и пище, на организм человека оказывают влияние техногенные системы радиационного излучения [25]. Так, суммарная доза, создаваемая естественным излучением в Европейской части России колеблется от 70 до 200 мбэр/год, что составляет одну треть так называемой популяционной дозы общего фона. Ещё треть человек получает при медицинских диагностических процедурах - рентгеновских снимках, флюорографии. Остальную часть популяционной дозы даёт пребывание человека в современных зданиях. Вклад в усиление радиационного фона вносят и тепловые электростанции, работающие на угле, поскольку уголь содержит рассеянные радиоактивные элементы. При полётах на самолетах человек также получает небольшую дозу ионизирующего облучения[32]. Но всё это очень малые величины, практически не оказывающие вредного влияния на здоровье человека. Причинами, вызывающими острое или хроническое лучевое поражение чаще всего могут стать как аварийные ситуации [15,23], так и тотальное облучение организма с лечебной целью - при трансплантации костного мозга, при лечении множественных опухолей с облучением в дозах, превышающих 50 бэр [95]. Тяжесть радиоактивного поражения в основном определяется внешним гамма-облучением [97]. При этом изменения на молекулярном уровне и образование химически активных соединений в тканях и жидких средах организма ведут к появлению в крови продуктов патологического обмена - первичных и вторичных радиотоксинов, приводящих к гибели клеток [60,61,64]. Завершающим этапом в цепи процессов, развивающихся в результате воздействия больших доз ионизирующего излучения на ткани, клетки и жидкие среды организма является развитие лучевой болезни [80].

По этим причинам сегодня вопросы защиты населения от радиационного поражения (в том числе и фармакологической) приобретают особую актуальность. Вместе с тем остается нерешённым вопрос о внедрении высокоэффективных, безопасных и удобных в применении веществ для лечения и профилактики радиационных поражений [104]. Имеющиеся в арсенале медицинской науки радиопротекторы обладают рядом существенных недостатков - низкой эффективностью и узкой широтой терапевтического действия (индолилалкиламины, серосодержащие соединения), высокой токсичностью (цианистые соединения и производные аминопро-пио- и бензофенонов), малой по времени продолжительностью радиопротекторного эффекта (арилалкиламины и производные ацетилхолина) [115]. Радиопротекторное действие указанных веществ проявляется, как правило, в дозах, приближающихся к максимально переносимым. В литературе по радиобиологии в основном представлены работы, посвященные изучению фармакологических свойств и роли механизмов противолучевой защиты препаратов, относящихся к серосодержащим соединениям, индоли-лалкиламинам, арилалкиламинам, производным имидазола [28,46,115], и мало уделяется внимания фенольным соединениям, обладающим антиок-сидантными свойствами. Вместе с тем доказана и достаточно хорошо изучена роль свободно-радикальных механизмов повреждения в патогенезе развития лучевого поражения [13,60,61,64,69].

Целью диссертационной работы является выявление наиболее активного соединения в ряду производных 3-фенилпропеновой (коричной) кислоты с различными заместителями в ароматическом ядре и оценка его радиопротекторной активности.

Для достижения поставленной нами цели были выделены следующие задачи, которые последовательно решались:

У Изучить радиопротекторное действие синтетических производных 3-фенилпропеновой кислоты in vitro с использованием эритроцитар-ной радиомиметической методики и УФ-индуцированного гемолиза эритроцитов.

У Выбрать наиболее активное соединение в ряду производных 3-фенилпропеновой кислоты.

Определить острую токсичность, оптимальную концентрацию и время введения выбранного соединения.

Провести оценку радиопротекторной активности выбранного соединения по клиническим показателям лучевого поражения.

Оценить антимутагенную активность изучаемого соединения с помощью микроядерного теста в облученном организме.

Определить биохимические показатели в облученном организме и влияние на них изучаемого соединения и препарата сравнения циста-мина.

Изучить влияние исследуемого соединения и цистамина на морфологические изменения в критических органах при облучении.

Объектами исследования явились производные 3-фенилпропеновой (коричной) кислоты с различными заместителями в ароматическом ядре, синтезированные на кафедре органической химии ПятГФА (зав. кафедрой - профессор Э.Т. Оганесян).

В процессе исследования использовались методы: системного анализа, группировки, метод сравнения, наблюдения. Обработка информации проводилась на персональном компьютере.

Научная новизна. В результате проведённых исследований впервые выявлена закономерность между структурой и радиопротекторной активностью в ряду 27 синтетических производных 3-фенилпропеновой кислоты. Установлено, что феруловая кислота (З-метокси-4-гидрокси фе-нилпропеновая кислота) задерживает УФ-индуцированный гемолиз эритроцитов, оказывает выраженный мембраностабилизирующий эффект при тестировании на эритроцитарной радиомиметической методике с использованием модельных радиотоксинов; повышает выживаемость животных при однократном общем у-облучении в летальных и сублетальных дозах; нормализует клинические, биохимические и некоторые цитологические показатели радиационного поражения; усиливает компенсаторно-приспособительные реакции клеток организма облучённых животных.

Практическая значимость результатов исследования. Проведенные исследования позволяют определить влияние феруловой кислоты в сравнении с цистамином на течение острой лучевой болезни по клиническим, цитологическим, биохимическим и морфологическим показателям. Полученные результаты указывают на высокую эффективность и низкую токсичность феруловой кислоты, что создает предпосылки для дальнейшего более углубленного ее изучения в качестве радиопротектора.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

В результате сравнительной оценки антиоксидантной активности в ряду 27 синтетических производных коричной кислоты с их антигемолитическим действием при ультрафиолетовом повреждении эритроцитов установлена тесная корреляционная зависимость между этими двумя видами фармакологических эффектов.

Наибольший антиоксидантный и антигемолитический эффект среди изученных производных коричной кислоты проявила феруловая кислота. На липидной радиомиметической модели подтверждено радиопротекторное действие феруловой кислоты.

Феруловая кислота относится к практически нетоксичным веществам.

В сравнении с цистамином показано влияние феруловой кислоты на степень выраженности острой лучевой болезни, вызванной гамма-облучением у разных видов животных на организменном, органном, тканевом и клеточном уровнях. Феруловая кислота улучшает клинические, цитогенетические, биохимические и морфологические показатели при остром радиационном поражении.

Экспериментально установлены некоторые механизмы радиопротекторного действия феруловой кислоты, показаны преимущества феруловой кислоты по сравнению с цистамином.

Внедрение результатов исследования. По результатам фармакологических исследований, полученным при выполнении данной работы, составлен и утвержден в ПятГФА отчет о биологической активности феруловой кислоты; разработаны методические указания для студентов к лабораторным занятиям по патологии по теме: «Облучение - физический повреждающий фактор».

Апробация полученных результатов. Основные результаты диссертационной работы доложены на 56-й, 58-й, 59-й региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров Пятигорской государственной фармацевтической академии (Пятигорск, 2001, 2003; 2004 гг.), на ежегодной конференции молодых ученых «Аспирантские чтения» (Самара, 2002).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (№ госрегистрации 01200102926) в рамках проблемы «Фармация» научного совета МНС № 38 МЗ РФ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, пяти взаимосвязанных глав, выводов, списка литературы и приложений. Библиографический указатель включает 167 литературных источников, в том числе - 41 на иностранных языках.

Работа изложена на 125 страницах текста компьютерного набора (без приложений), содержит 20 таблиц и 29 рисунков.

Во введении обоснованы актуальность темы диссертации; изложены основная цель и задачи исследования; определен круг исследуемых вопросов, объекты и методы анализа, показана научная новизна и практическая значимость работы.

Первая глава представляет собой аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по вопросу патогенеза, клиники и фармакологии острой лучевой болезни, а также биологической и фармакологической активности производных коричной кислоты.

Во второй главе описаны метериалы и методы использованные при проведении экспериментов.

В третьей главе обоснованы результаты скрининга в ряду синтетических производных коричной кислоты.

Четвёртая глава посвящена изучению некоторых аспектов фармако-кинетики феруловой кислоты.

Пятая глава отражает сущность проведенных исследований по изучению радиопротекторного действия феруловой кислоты.

Общие выводы

1. Проведен анализ антиоксидантной и антигемолитической активности 27 синтетических производных 3-фенилпропеновой (коричной) кислоты in vitro. Установлена взаимосвязь между антиоксидантной, антигемолитической активностью и характером заместителей в ароматическом ядре коричной кислоты, их местоположением и взаимным влиянием.

2. Установлено, что наиболее активным антиоксидантом в ряду исследуемых производных коричной кислоты является 3-метокси 4-гидрокси фенилпропеновая (феруловая) кислота.

3. Изучена острая токсичность феруловой кислоты и установлено, что она относится к практически нетоксичным веществам. Феруловая кислота оказывает наиболее выраженный радиопротекторный эффект в дозе 200 мг/кг (среднелетальная доза у-излучения 5,5 Гр). Плато концентрации феруловой кислоты в плазме крови после внутрибрюшинного введения наступает через 30 минут.

4. Установлено, что феруловая кислота улучшает: клинические показатели острой лучевой болезни: способствует приросту массы, оказывает капилляропротекторное действие, препятствует снижению количества лейкоцитов, оказывает протекторный эффект при защите клеток красного костного мозга у облученных животных.

5. Феруловая кислота обладает антимутагенным действием по показателям микроядерного теста на эритроцитах красного костного мозга у облученных животных.

6. Феруловая кислота снижает степень эндогенной интоксикации по показателям уровня молекул средней массы и ТБК-активных продуктов в плазме крови облученных крыс.

7. Феруловая кислота предотвращает выраженные деструктивные изменения в критических органах (тонкий кишечник, семенники, селезенка) при облучении животных в дозе 5,5 Гр.

НАУЧНО - ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Изучение взаимосвязи «структура - активность» в ряду синтетических производных коричной кислоты показало, что этот класс соединений является перспективным для дельнейшего поиска веществ, обладающих одновременно антиоксидантным и радиопротекторным действием.

2. Установленная в данной работе радиопротекторная активность феруловой кислоты указывает на перспективность дельнейшего ее фармакологического и доклинического исследования. Феруловая кислота является практически нетоксичным веществом и проявляет выраженное радиопротекторное действие, что позволяет рассматривать ее как потенциальный препарат для лечения острой лучевой болезни.