Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное исследование церебропротекторных свойств феруловой кислоты в условиях ишемии мозга

003057598

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

ДЬЯКОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНЪТХ СВОЙСТВ ФЕРУЛОВОЙ КИСЛОТЫ В УСЛОВИЯХ ИШЕМИИ МОЗГА

14.00.25 - ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРА1

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НА. ТС

ПЯТИГОРСК-2007

003057598

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическ академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук, доце Назарова Любовь Ефимовна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Тюренков Иван Николаевич

Кандидат фармацевтических наук, доце Кулешова Светлана Анатольевна

Ведущая организация;

Курский государственный медицине университет

Защита состоится & ¿Ььс/ьСе^ьк- 2007 года в /(Р часов на заседай Диссертационного совета Д 208.069.01 при ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздра. (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорская ГФ Росздрава».

Автореферат разослан « ^ У » ¿3—_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Инсульты и сердечно-сосудистые заболевания - в настоящее время основные причины смертности населения во всем мире. Ежегодно регистрируется около 20 миллионов случаев инсульта, каждый четвертый из них - смертельный. К 2020 году прогнозируется рост смертности от инсульта до 7,6 миллиона человек в год. Наибольшая частота инсультов отмечена в Китае, в Восточной Европе и в России. В России регистрируется более 450000 инсультов ежегодно. В Москве количество больных с инсультом в течение уже длительного времени (почти 20 лет) достигает 36000 пациентов в год. Летальность после состоявшегося ишемического инсульта составляет 20% в течение первого месяца и около 25% в течение первого года. Через 6 месяцев после инсульта инвалидизация наступает у 40% выживших больных. Следует подчеркнуть катастрофические последствия ишемического инсульта - в течение первых 5 лет до 85% больных умирают или остаются инвалидами и только 15% пациентов полностью выздоравливают. Преобладают ишемические поражения головного мозга. По данным международных мультицентровых исследований соотношение ишемического и геморрагического инсультов составляет 85% и 15% соответственно. Несмотря на распространенность и частоту этих заболеваний, все еще остается много нерешенных вопросов, особенно касающихся лечения больных. Терапию этой группы пациентов необходимо проводить, учитывая сложные этиологические и патогенетические механизмы, длительность и тяжесть заболевания. Применяемые до сих пор лечебные комплексы нередко оказываются малоэффективными, что обуславливает актуальность проблемы поиска и разработки новых фармакологических средств [Скоромец A.A. и др., 2001].

Церебропротекция рассматривается в качестве защиты функциональных регулирующих возможностей мозга даже в условиях их временного нарушения и одновременной защиты молекулярно-клеточного механизма, лежащих в основе высших психических функций человека Стратегия защиты от острой недостаточности мозгового кровообращения включает две составляющих. Первая -сохранение и поддержание необходимого уровня поступления в мозг кислорода и глюкозы, достаточного для синтеза АТФ выше критического уровня, и удаления из

мозга продуктов метаболизма. Вторая составляющая - защита и сохранен функциональной целостности нейронов [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001].

Первоначально феруловая кислота изучалась как активный антиоксидан Благодаря своей структуре, она является ловушкой свободных радикалов. Ферулов кислота проявляет способность увеличивать активность супероксиддисмутаз каталазы, глутатионпероксидазы, повышать экспрессию гена гемоксигеназы-шоковых температурных белков. Она ингибирует цикл арахидоновой кислоты и, т самым, уменьшает образование провоспалительных и проагрегантных факторо проявляя противовоспалительные свойства и уменьшая агрегацию тромбоцит Выявлена способность феруловой кислоты уменьшать нарушения развития головно мозга, возникающие у потомства при введении глутамата натрия в пренатапьн периоде у крыс. Феруловая кислота уменьшает активацию микроглии, астроцитов реакции воспаления в ткани мозга при бетаамилоидпептидиндуцированн повреждении мозга, моделирующем болезнь Альцгеймера. Доказана способно феруловой кислоты подавлять экспрессию генов апоптоза (Р53 и Р21) и сохраня глиальные клетки от гибели в условиях ишемии. Совпадение механизм ишемического повреждения и выявленных видов активности феруловой кислоты других моделях поврежения нервной ткани позволяет предположить, что она окаж церебропротекторный эффект при ишемическом повреждении мозга.

Цель и задачи работы

Целью исследования является изучение церебропротекторного действ феруловой кислоты при глобальной и фокальной ишемии мозга. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• изучить влияние феруловой кислоты на выживаемость крыс при ишем вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий в дозах 10, 30 и мг/кг;

• изучить антигипоксическое действие феруловой кислоты на модел гиперкапнической и гемической гипоксий;

• изучить влияние феруловой кислоты на мозговой кровоток и сопротивление сосудов мозга крыс в дозе, оказывающей наиболее выраженное церебропротекторное действие;

• изучить влияние феруловой кислоты на процесс свертывания крови;

• изучить влияние феруловой кислоты на функциональное состояние мозга при постоянной ишемии мозга и в постишемическом периоде;

• изучить влияние феруловой кислоты на развитие постишемического отека мозга, перекисное окисление липидов и активность антиоксидантной системы при ишемии мозга;

• изучить влияние феруловой кислоты на метаболизм глюкозы в ткани мозга при ишемии и в норме;

• изучить влияние феруловой кислоты на размер зоны некроза при фокальной ишемии.

Научная новизна полученных результатов

Впервые изучено церебропротекторное действие феруловой кислоты на моделях тотальной и фокальной ишемий мозга.

Проанализирована зависимость доза - церебропротекторный эффект на модели выживаемости крыс при ишемии мозга, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий. Определена оптимальная доза для проявления церебропротекторной активности феруловой кислоты. Показано выраженное защитное действие феруловой кислоты, превосходящее кавинтон и циннаризин при постоянной ишемии мозга

На моделях гиперкапнической и гемической гипоксий впервые показано антигипоксическое действие феруловой кислоты, определены оптимальные дозы, увеличивающие продолжительность жизни мышей.

Изучено влияние феруловой кислоты на объемный мозговой кровоток и сопротивление сосудов мозга. Феруловая кислота не изменяет объемный мозговой кровоток и сопротивление сосудов мозга.

Показана способность феруловой кислоты ускорять восстановление функционального состояния мозга на двух моделях ишемий мозга, вызванных

билатеральной окклюзией общих сонных артерий и гравитационными перегрузкам кранио-каудальном направлении.

Впервые показано, что феруловая кислота уменьшает отёк, перекисное окислен липидов и активирует каталазу в ткани мозга при реперфузионном повреждении.

Феруловая кислота увеличивает потребление глюкозы мозгом, активируя п этом окисление молочной кислоты на модели фокальной ишемии мозга.

Доказана способность феруловой кислоты уменьшать зону некроза п фокальной ишемии, вызванной окклюзией средней мозговой артерии.

Практическая значимость

Полученные результаты указывают на высокую эффективность ферулов кислоты как церебропротектора и свидетельствуют о перспективности её дальнейше доклинического углубленного изучения. Запланировано дальнейшее изучен церебропротекторных свойств феруловой кислоты на кафедре фармакологии ГО ВПО «Волгоградского государственного медицинского университета» и на кафед фармакологии ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава».

Уровень внедрения

По результатам фармакологических исследований, полученным пр выполнении данной работы, составлено и утверждено в ГОУ ВПО «Пятигорская ГФ Росздрава» информационное письмо «Об изучении церебропротекторных свойс феруловой кислоты». Материалы этого письма будут использоваться на кафедр фармакологии ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» и на кафедре фармакологи ГОУ ВПО «Волгоградского государственного медицинского университета» пр прочтении лекций и при проведении практических занятий по темам «Антиоксидан и антигипоксанты» и «Ишемия головного мозга», а также в научных исследования проводимых в лабораториях кафедр фармакологии.

Связь с планом НИР ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава»

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно исследовательских работ ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» (К

6

государственной регистрации 01.2001.02926).

Апробация полученных результатов

Основные результаты диссертационной работы доложены на 1-м съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005 г.); на 61-й и 62-й региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров Пятигорской государственной фармацевтической академии (Пятигорск, 2006,2007 гг.).

Положения, выдвигаемые на защиту:

• феруловая кислота увеличивает выживаемость крыс при ишемии мозга, вызванной постоянной окклюзией общих сонных артерий и превышает по активности препараты сравнения кавинтон и циннаризин;

• феруловая киелсла обладает антигипоксической активностью, увеличивая продолжительность жизни мышей при гиперкапнической и гемической гипоксиях;

• феруловая кислота уменьшает интенсивность неврологических нарушений, возникающих при постоянной ишемии мозга и в постишемическом периоде.

• феруловая кислота в дозе 30 мг/кг не изменяет мозговой кровоток и не влияет на сопротивление сосудов мозга;

• феруловая кислота снижает скорость свертывания крови in vitro;

• феруловая кислота в дозе 30 мг/кг уменьшает отёк, перекисное окисление липидов и увеличивает активность каталазы в ткани мозга в условиях реперфузионного повреждения;

• феруловая кислота увеличивает потребление глюкозы тканью мозга, интенсифицируя второй этап её окисления — окисление молочной кислоты;

• феруловая кислота в 3 раза уменьшает зону некроза при фокальной ишемии мозга.

Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, шест взаимосвязанных глав, содержащих результаты собственных исследований заключение, общие выводы, список литературы. Библиографический список включа ■ 218 литературных источников, в том числе — 167 на иностранном языке. Рабо изложена на 125 страницах текста компьютерного набора, содержит 11 таблиц и 3 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования: Феруловая кислота (3-метокси 4-гидрок фенилпропеновая кислота), синтезированная на кафедре органической химии ГО ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» под руководством доктора фармацевтическ наук, профессора Э.Т. Оганесяна, за что выражаем ему искреннюю благодарность.

Препаратами сравнения служили кавинтон (винпоцетин) (производство Гедео Рихтер, Будапешт, Венгрия, ампульный раствор) в дозе 3,2 мг/кг и циннаризи (производство Балканфарма-Дупница, Болгария. Использовали таблетк предварительно растирая, растворяли в дистиллированной воде, фильтровал Учитывали содержание действующего вещества в каждой таблетке) в дозе 5,2 мг/к Дозы препаратов сравнения выбраны как наиболее эффективные по данны литературы [Благодырь М.Н., 1992; Никитина O.A., 1991].

Методы исследования: Исследования выполнены на 114 беспородных бел крысах, 328 крысах линии Wistar, 48 беспородных мышах. Животные содержались стандартных условиях вивария.

Изучение церебропротекторной активности феруловой кислоты проведено соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучен фармакологических веществ» [Под ред. Хабриева Р.У., 2005].

Раствор феруловой кислоты для внутрибрюшинных инъекций готовили tempore. Феруловую кислоту растворяли в дистиллированной воде с добавлени гидрокарбоната натрия в эквивалентных количествах, при нагревании раствора 40°С. После растворения феруловой кислоты контролировали pH раствора, котор равнялся 7,4-7,8.

Изучали влияние феруловой кислоты на выживаемость животных при ишемии мозга, вызванной постоянной билатеральной окклюзией общих сонных артерий у крыс и продолжительность жизни мышей при гиперкапнической и гемической гипоксиях.

Для определения объемного мозгового кровотока использовали метод водородного клиренса и метод доплерографии. Метод водородного клиренса основан на скорости вымывания предварительно введенного водорода из ткани мозга и позволяет определить объемную скорость мозгового кровотока [Демченко И.Т., 1981]. Для определения использовали платиновый электрод, который фиксировали на поверхности сагиттального синуса в области стока синусов. Одновременно определяли системное артериальное давление. Сопротивление сосудов мозга рассчитывали как отношение давления в периферическом конце общей сонной артерии к объемному мозговому кровотоку.

В доплерографических исследованиях использовали доплерограф «Минимакс-Допплер-К», разработанный фирмой ООО «СП Минимакс». Для измерений применяли датчик 25 МГц, позволяющий регистрировать объёмный мозговой кровоток микроциркуляторного русла. Датчик фиксировали в области проекции дистального отдела средней мозговой артерии. Измерения проводили в обеих сериях до введения феруловой кислоты и через 5, 15, 30, 45 и 60 минут после её введения. Сравнивали с показателями контрольных животных, получавших физиологический раствор.

Время свертывания крови in vitro определяли с помощью коагулографа Н334. В кювету с кровью крыс добавляли 0,02 мл 0,6% раствора феруловой кислоты, что соответствует её распределению в объеме крови in vivo. В контрольных измерениях использовали физиологический раствор.

Влияние феруловой кислоты на функциональное состояние мозга ишемизированных крыс изучали на моделях постоянной ишемии мозга и в постреперфузионном периоде. Для создания постоянной ишемии использовали метод билатеральной окклюзии общих сонных артерий. Ишемию с реперфузией создавали путем гравитационных перегрузок в кранио-каудальном направлении [Гаевый М.Д., 1986] при g=13.52 в течение 12 минут. Показатели неврологического статуса

9

определяли в тестах «открытое поле», «экстраполяционное избавление», «УРПИ» «вращающийся стержень».

Влияние феруловой кислоты на активность перекисного окисления липидов антиоксидантную ферментную систему, а также отек мозга определяли у животных ишемией, вызванной гравитационными перегрузками в кранио-каудально направлении.

Фокальную ишемию мозга создавали путем постоянной окклюзии средне мозговой артерии у крыс. На модели фокальной ишемии мозга исследовали влияни феруловой кислоты на метаболизм глюкозы в ткани мозга и размер зоны некроза.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Церебропротекторное действие оценивалось по выживаемости крыс линии Wist массой 170-220 г при билатеральной окклюзии общих сонных артерий пр применении феруловой кислоты в дозах 10, 30 и 60 мг/кг. Феруловая кислот кавинтон и цикнаризин сводились через час после окклюзии общих сонный артери. В ранее проведенных исследованиях кардиог.ротекторной активности ферулов„ кислоты [Дьяков A.A., 2002] доза 30 мг/кг проявила наиболее выраженный эффе Феруловая кислота в дозе 30 мг/кг вводилась двум группам животных: в перво случае после ишемии, во втором случае - за час до ишемии. Наиболее выраженнь церебропротекторный эффект феруловая кислота оказала в дозе 30 мг/кг при перво её введении через час после окклюзии общих сонных артерий (выжило 70% животнь против 20% в контроле). Препараты сравнения увеличили число выживших животнь - до 50% кавинтон и до 60% циннаризин (таблица 1).

При гиперкапнической гипоксии больший эффект наблюдался при введен феруловой кислоты в дозе 90 мг/кг. При гемической гипоксии больший эффе наблюдался при введении 60 мг/кг (таблица 2).

Далее проводили исследования активности феруловой кислоты на крысах п применении дозы 30 мг/кг.

Исследование влияния феруловой кислоты на функциональное состоян ишсмизированного мозга проводили в тестах «открытое поле», «экстраполяционн избавление», «УРПИ» и «вращающийся стержень».

10

Таблица 1 — Влияние феруловой кислоты на выживаемость животных при циркуляторной гипоксии, вызванной двусторонней окклюзией общих сонных

артерий

Группы животных Число Число выживших животных и проценты

животных в относительно исходного числа

группе Через Через 3 Через 5 Через 7

сутки суток суток суток

1 группа (п=10) 10 2 2 2 2

Контрольная 100% 20% 20% 20% 20%

физ. раствор

2 группа (п=9) 9 5 5 5 4

ФК 10 мг/кг 100% 55,56% 55,56% 55,56% 44,44%

3 группа (п= 10) 10 7 7 7 7

ФК 30 мг/кг (через 1 100% 70% 70% 70% 70%

час после окклюзии)

4 группа (п=10) 10 9 6 6 6

ФК 30 мг/кг (за 1 час 100% 90% 60% 60% 60%

до окклюзии)

5 группа (п=10) 10 5 5 5 4

ФК 60 мг/кг 100% 50% 50% 50% 40%

6 группа (п=10) 10 6 5 5 5

кавинтон (3,2 мг/кг) 100% 60% 50% 50% 50%

7 группа (п=10) 10 7 7 6 6

циннаризин (5,2 100% 70% 70% 60% 60%

мг/кг)

Таблица 2- Влияние феруловой кислоты на длительность жизни мышей при гиперкапнической и гемической гипоксиях

Группы животных Время до гибели при гиперкапнической гипоксии (мин) Время до гибели при гемической гипоксии (мин)

Контрольная группа (физ. раствор) 90,83±11,92 27,4±1,28

Группа ФК (30 мг/кг) 102±8,56 31,6±1,79

Группа ФК (60 мг/кг) 95,67±9,98 36,3±3,22*

Группа ФК (90 мг/кг) 130±12,23* 29,2± 1,66

Примечание - * - достоверно относительно контроля

В результате ишемии мозга у животных развиваются расстройства ег деятельности: снижается двигательная и исследовательская активность, нарушаете память, координация движений, процессы обучения и воспроизведения навыков, первой серии экспериментов животных подвергали двусторонней окклюзии общ -сонных артерий. Это - модель постоянной ишемии головного мозга. Он характеризуется более тяжелой патогенетической картиной, но в ней отсутствуе звено, связанное с реперфузионным повреждением.

Во второй серии крыс подвергали гравитационным перегрузкам на центрифуг радиусом 1 м в кранио-каудальном направлении со скоростью вращения 110 оборото в минуту (§=13.52) в течение 12 минут. Это - модель преходящей ишемии с мене выраженным ишемическим повреждением, однако, в данной модели присутству • фактор реперфузионного повреждения, но отсутствует посттравматический фактор Первый раз проводили тесты за час до создания ишемии (1-й день). Затем н следующий день (2-й день), и далее на 4-й, 6-й, 8-й дни.

Изменение показателей выражали в процентах от исходного значения.

В каждой серии крысы были разделены на 5 групп по 12 животных. Перв группа - контрольная. Животные этой группы получали физиологический раство внутрибрюшинно в объеме 1 мл за 1 час до окклюзии общих сонных артерий и течение последующих 3 дней утром и вечером. Животным второй группы вводил феруловую кислоту первый раз через час после окклюзии общих сонных артерий и течение последующих 3 дней утром и вечером. Животным третьей группы вводил феруловую кислоту за 1 час до окклюзии общих сонных артерий и в течени последующих 3 дней утром и вечером. Четвертая группа животных получала раство кавинтона за 1 час до операции и в течение последующих 3 дней утром и вечеро Пятая группа животных получала раствор циннаризина в те же сроки, что и кавинтон.

В первой серии учитывали показатели только выживших крыс.

Двигательная активность у крыс с ишемией мозга, вызванной билатерально окклюзией общих сонных артерий, в контрольной группе снижалась на 2-й ден (-73,20±6,12%) и оставалась сниженной до конца эксперимента (-63,10±5,99% на 8-день). В группе ишемизированных животных, получавших феруловую кислоту поел окклюзии общих сонных артерий, двигательная активность на 2-й день был

12

достоверно выше, чем в контрольной группе (-50,20±8,48%) и повышалась до конца периода наблюдений (-28,20±14,77% на 8-й день). В группе ишемизированных животных, получавших феруловую кислоту первый раз за час до ишемии, двигательная активность не снизилась относительно исхода на 2-й день (-1,48±13,3%) и повысилась к концу эксперимента (108,69±15,34% на 8-й день). В группе ишемизированных животных, получавших кавинтон, двигательная активность не отличалась от показателей контрольной группы на 2-й день (- 62,51 ±5,80%), но была достоверно выше к концу эксперимента (-26,40±12,49%). В группе ишемизированных животных, получавших циннаризин, показатель двигательной активности на 2-й день не отличался от показателя контрольной группы, но повысился к концу эксперимента (-35,20±10,81%). Таким образом, при ишемии, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий, введение феруловой кислоты препятствует падению двигательной активности как при первом введении за час до ишемии, так и ири введении после окклюзии общих сонных артерий. Действие это, однако, более выражено при первом профилактическом введении и превосходит действие препаратов сравнения.

В контрольной группе животных, подвергнутых гравитационным перегружай, двигательная активность восстанавливалась к 4-му дню наблюдений, снижаясь только на 2-й день (-62,92±9,13%). В группе ишемизированных животных, получавших феруловую кислоту после ишемии, этот показатель на 2-й день повысился (42,13± 13,99%) относительно исхода, а в группе животных, получавших феруловую кислоту в первый раз профилактически - не отличался от показателя контрольной группы (-52, 81±5,35%). В группе животных, получавших кавинтон, он также не имел отличий от показателя контрольной группы (-52,95± 8,77%); в группе ишемизированных животных, получавших циннаризин, двигательная активность увеличилась на 18,75±8,49%. При ишемии, вызванной гравитационными перегрузками, феруловая кислота при первом профилактическом введении не оказывает влияния на двигательную активность, но при введении после ишемии повышает двигательную активность крыс, превышая по действию препараты сравнения.

Исследовательская активность в контрольных группах животных с ишемие мозга, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий, снижалась на 2-день (-87,88±2,79%) и оставалась к 8-му дню ниже исхода (-56,06±2,79%). В групп ишемизированных животных, получавших феруловую кислоту после окклюзии исследовательская активность на 2-й день снизилась (-51,21 ±4,14%) меньше, чем контрольной группе, но не отличалась от показателей контрольной группы на 8-й ден исследований (-60,14±7,07%). В группах ишемизированных животных, получавши феруловую кислоту первый раз за час до ишемии, исследовательская активность н второй день была выше, чем в контрольной группе (-47,80±7,00%), а к 8-му Д1 вернулась к исходному значению (2,20±8,20%). В группе ишемизированнь животных, получавших кавинтон, на 2-й день этот показатель составил -74,58±5,43У а к концу эксперимента - -41,46±8,96% от исхода. В группах ишемизированны животных, получавших цшшаризин, исследовательская активность понизилась на 2-день (-64,13±2, 45%) и на 8-й день оставалась на том же уровне (-64,13±9,08%). Таки образом, при введении феруловой кислоты животным с ишемией мозга, вызванно билатеральной окклюзией общих сонных артерий, после окклюзии отмечается боле высокая исследовательская активность, чем у животных, получавших препара сравнения кавинтон и циннаризин.

При ишемии мозга, вызванной гравитационными перегрузкамг исследовательская активность снижалась на 2-й день (-65,36±7,13%) и к 8-му дн восстанавливалась (-14,85±12,89%). При введении феруловой кислоты после ишеми исследовательская активность не изменялась (на 2-й день 4.0±16,5% и на 8-й 1,42±6,75%). В группе ишемизированных животных, получавших феруловую кисло первый раз за час до ишемии, исследовательская активность снижалась меньше, чем контрольной группе (-41,59±7,72% на 2-й день и -16,82±7,90% на 8-й день). В групп ишемизированных животных, получавших кавинтон, исследовательская активност снизилась на 2-й день (-65,92±6,92%) и на 8-й день (-27,49±11,21%). В групп ишемизированных животных, получавших циннаризин, исследовательская активност не изменялась относительно исхода. Таким образом, введение феруловой кислот животным с ишемией мозга, вызванной гравитационными перегрузками

препятствует снижению исследовательской активности, превосходя по действию кавинтон и не уступая циннаризину.

Тест «экстраполяционное избавление» позволяет оценить способность к обучению. При билатеральной окклюзии общих сонных артерий в контрольной группе время экстраполяционного избавления увеличилось на 2-й день (345,66±55,03%) и к 8-му дню уменьшилось (62,64±48,50%). В группе ишемизированных животных, получавших феруловую кислоту после окклюзии, показатель снижался на 2-й день (-67,66±6,09%), и на 8-й день он составил -84,28±1,99% против исходного значения. В группе ишемизированных животных, получавших феруловую кислоту в первый раз за час до ишемии, этот показатель на 2-й день составил -74,58±4,26% от исхода, а на 8-й день - -77,21±5,11%. В группе ишемизированных животных, получавших кавинтон, на 2-й день показатель не отличался от исходного значения, а на 8-й день был -5б,96±9,85%. В группе ишемизированных животных, получавших циннаризин, показатель снизился на 2-й день (-90,02±2,36), на 8-й день оставался на том же уровне (-92,80±1,06%), превышая показатели остальных групп. Таким образом, введение феруловой кислоты животным с ишемией мозга, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий, восстанавливает способность ишемизированного мозга к обучению, уступая, однако, циннаризину.

В тесте «УРПИ» регистрировали количество животных, заходящих в темный отсек экспериментальной установки, т.е. имеющих нарушения воспроизведения условного рефлекса, выработанного до ишемии. После гравитационных перегрузок животные не имели нарушений. В контрольной группе животных с ишемией мозга, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий, нарушения имело 41,67% животных на протяжении всего эксперимента. В группе ишемизированных животных, получавших* феруловую кислоту после окклюзии, нарушений имело 16,67% только на 2-й день. В группе ишемизированных животных, получавших феруловую кислоту первый раз за час до ишемии, нарушения имело 16,67% на 2-й и 4-й дни. В группе ишемизированных животных, получавших кавинтон, нарушения имело 40% животных на 2-й и 4-й дни. В группе ишемизированных животных, получавших циннаризин, нарушения имело 30% животных на 2-й и 4-й дни, 60% - на

15

6-й день и на 8-й день - 30% животных. Таким образом, введение феруловой кисло оказывает выраженный церебропротекторный эффект, уменьшая нарушени воспроизведения условного рефлекса, превосходя по действию препараты сравнения.

В тесте «вращающийся стержень» регистрировали количество животных н способных удержаться на вращающемся стержне 2 минуты. Оценивали способное феруловой кислоты, кавинтона и циннаризина уменьшать нарушения координаци движений и равновесия, возникающих в результате ишемии мозга, вызванно билатеральной окклюзией общих сонных артерий. В группе животных, получавши физиологический раствор, на второй день нарушение имело 41,67% животных, на 46-й и 8-й дни - 25% животных. В группе животных, получавших феруловую кисло после окклюзии, нарушения наблюдались только на 2-й день у 25% животных, группе ишемизированных животных, получавших феруловую кислоту первый раз час до ишемии, нарушения наблюдались только на второй день у 16,67% животных, группе ишемизированных животных, получавших кавинтон, нарушения наблюдали на 2-й и 4-й дни у 20% животных. В группе ишемизированных животных, получавш циннаризин, нарушения наблюдались на 2-й день у 10% животных, на 4-й день -20% и на 6-й день - у 10%. Таким образом, введение феруловой кислоты препятству нарушению координации движений и равновесия, возникающих в результате ишем! мозга, превосходя по действию препараты сравнения.

Изучение влияния феруловой кислоты на мозговой кровоток и сопротивлен сосудов мозга проводили на неишемизированных крысах, чтобы исключить инь механизмы влияния феруловой кислоты на эти показатели в условиях ишемии моз Не было выявлено влияния феруловой кислоты на объемный мозговой кровоток сопротивление сосудов мозга.

Изучение влияния феруловой кислоты на время свертывания крови проводи для подтверждения литературных данных о способности феруловой кислоты снижа образование проагрегантных факторов путем ингибирования цикла арахидонов кислоты в тромбоцитах [Xu L.N. et al., 1990]. Активация агрегации тромбоцит является пусковым механизмом в микротромбообразовании в условиях ишемии, ч приводит к нарушению микроциркуляции в ткани мозга [Гусев Е.И., Скворцова В. 2001]. Однако, при ишемии нарушение микроциркуляции связано с реакци

16

воспаления, активацией лейкоцитов и многими другими. Чтобы исключить влияние противовоспалительного и антиоксидантного эффектов феруловой кислоты изучали её влияние на процесс свертывания крови здоровых крыс in vitro.

Феруловая кислота уменьшает скорость свертывания крови. Выявлено, что при добавлении феруловой кислоты в кювету с кровью конец свертывания крови отодвигается на 21,33% в сравнении с экспериментами, проведенными в тех. же условиях, но с добавлением физиологического раствора.

Имеющиеся литературные данные свидетельствуют об антиоксидантном действии феруловой кислоты, что, возможно, обусловливает её церебропротекторное действие. Для подтверждения этого предположения изучали её влияние на перекисное окисление липидов, активность каталазы и развитие постишемического отека на модели ишемии, вызванной гравитационными перегрузками в кранио-каудапъном направлении. Эта модель воспроизводит ишемическую реперфузию с активацией процессов свободнорадикального окисления. Животных декапитировали через 36 часов после гравитации. Достоверное уменьшение отека мозга наблюдалось только при профилактическом применении феруловой кислоты. Достоверных отличий по данному показателю не наблюдалось в группах животных, получавших феруловую кислоту через час после ишемии и группах, получавших препараты сравнения и физиологический раствор.

В группах животных, получавших феруловую кислоту, активность каталазы была выше, чем в контрольных группах и группах, получавших препараты сравнения. Наиболее выраженный эффект наблюдался при введении феруловой кислоты через час после ишемии. В группах животных, получавших препараты сравнения кавинтон и циннаризин, активность каталазы не отличалась от показателей контрольных групп.

Содержание малонового диальдегида в ткани мозга достоверно понижалось в группах животных, получавших феруловую кислоту и препараты сравнения относительно контроля (таблица 3).

Таким образом, только профилактическое введение (за час до ишемии) феруловой кислоты уменьшает отек мозга в постишемическом периоде. Введение феруловой кислоты защищает ишемизированную ткань мозга от перекисного окисления липидов,

снижая содержание малонового диальдегида и повышая активность каталазы, ч более выражено при её лечебном введении (через час после ишемии). Таблица 3. Влияние феруловой кислоты, кавинтона и циннаризина содержание воды, активность каталазы и содержание малонового диальдегида

ткани мозга в постишемическом периоде

Группы животных Содержание воды в процентах относительно массы навески Активность каталазы (мкат/г белка) Содержание малонового диальдегида (нмоль/г белка)

1 2 3 4

1. Контроль (физ р-р за 1 час до ишемии) 78,01±0,21 Р2 <0,001 0,138± ±0,021 Р2<0,02 2,284± ±0,148 Р2<0,001 Р3 <0,02 Р4<0,01

2 Контроль (физ. р-р через 1 час после ишемии) 3 ФК(30 мг/кг за 1 час до ишемии) 78,04±0,13 Р2 <0,001 0,12б± ±0,006 Р2<0,001 Рз<0,05 2,330± ±0,141 Р2<0,001 Рз <0,01 Р4<0,01

77,17±0,26 Р,<0 05 Р,.<0,05 Рз<0.05 Р4<0 01 0,223± ±0,022 Р,<0,05 Р,.<0,01 Р2<0,001 Р4<0 05 1,603± ±0,139 Р,<0,02 Р!-<0,02 Р2<0,02

4 ФК (30 мг/кг через 1 час после ишемии) 77,80±0,22 Р2<0.01 Р4<0.05 0,433± ±0,071 Р!<0,01 Ри<0,001 Р2<0,01 Рз<0,02 Р4<0,01 1,417± ±0,287 Р|<0,05 Р,.<0,05

5 Кавинтон (3.2 М1/К1 за 1 час до ишемии) 78,07±0,17 Р2<0 001 0,169± ±0,017 Р,.<0,05 Р2<0,01 1,636± ±0,770 Р1<0,02 Р,.<0,01 Р2<0,01

6 Циннаризин (5,2 мг/кг за 1 час до ишемии) 78,43±0,15 Р2<0 001 0,147± ±0,020 Р2<0,01 1,628± ±0,568 Р1<0,01 Р,.<0,01 Р2<0,01

7. Биологический контроль (физ р-р без ишемии) 76,66±0,13 Р,<0.001 Рз<0.001 Р4<0 001 0,062± ±0,008 Р,<0,01 Р1.<0,001 Рз<0,01 Р4<0,01 0,983± ±0,110 Р,<0,001 Р,.<0,001 Рз <0,01 .Р4<0,01

Примечания

1 Р| - достоверно относительно контроля 1

2 Р] •. достоверно относительно контроля 2

3 Р2 - достоверно относительно биологического контроля

4 Р3 - достоверно относительно кавинтона 5. Г4 - достоверно относительно циннаризина

Ишемизированная ткань мозга испытывает энергодефицит, более того, в результате снижения аэробного окисления глюкозы в ней развивается лактат-ацидоз, что приводит к дальнейшему каскаду нарушений клеточного метаболизма Вещества, увеличивающие потребление глюкозы мозгом и снижающие накопление молочной кислоты, уменьшают повреждение ишемизированной нервной ткани. Проведено исследование влияния феруловой кислоты и препаратов сравнения кавинтона и циннаризина на метаболизм глюкозы в ткани мозга при фокальной ишемии. Сравнение проводили с контрольными животными, получавшими физиологический раствор, и животными без ишемии, получавшими феруловую кислоту. Исследуемые вещества вводили через час после окклюзии правой средней мозговой артерии, затем вечером того же дня и утром следующего. Исследования проводили через сутки после окклюзии средней мозговой артерии. Определяли гематокрит, объемный мозговой кровоток, содержание глюкозы в плазме артериальной крови, взятой из сонных артерий и венозной — из венозного синуса мозга. Показатели пересчитывали на ммоль/100 г/ мин.

Было установлено, что введение феруловой кислоты и кавинтона достоверно увеличивают потребление глюкозы мозгом. Введение феруловой кислоты здоровым животным также увеличивает потребление глюкозы мозгом как в сравнении с контрольными животными, так и здоровыми.

Введение феруловой кислоты, кавинтона и циннаризина уменьшает накопление в ткани мозга молочной кислоты. Причем, введение циннаризина в условиях ишемии увеличивает не только образующийся в ткани мозга лактат, но и притекающий с артериальной кровью. Введение феруловой кислоты здоровым животным вызывает такой же эффект (рисунок 1).

Таким образом, введение феруловой кислоты увеличивает потребление глюкозы мозгом, при этом активируя окисление молочной кислоты.

глюкоза

1. Контрольная(фнз.р-р)

■ ЕЗ 2. <Е>ср¥ловая кислота (30 мг/кг)

□ 3. Кавн нтон(3.2 мг/кг)

Ними:1 рн (И 1Г| г>,2 мг/кг)

-, □ 5. БнАлогнявский (СОНТрОЛь(фн £.р-| без ишемии)

3 6, Ферул о пая кииМт« (30 пи /кл бел ишемии)

Рисунок ! - Влияние феруловоЙ кислоты, кавинтона и циннариЗнна на потребление глюкозы мозгом и накопление молочной кислоты

Определение зоны некроза мозга проводили трифенилтетразолиевым методе Трифен и лтетразо л и я хлорид в живых тканях восстанавливается в красный формазаь окрашивает ткань в красный цвет. Некротизированные ткани не окрашивают Количественное извлечение красного форм азана позволяет колориметр и чес определить зону некроза в процентах к обшей массе полушарий. В контрольна группе зона некроза составила 24,24^1,71%. Введение кавинтона уменьшило зо; некроза до !5,56±2,13% (Р<0,02 относительно контроля). Введение Циннаризи уменьшило зону некроза до 12,48^2,34% (Р<0г01 относительно конгрол; Применение феруловой кислоты в дозе 30 мг/кг уменьшило зону некроза 1 8,12±1,48% (Р<0,01 относительно контроля) (рисунок 2).

I КОНТ РОЛЬ (фнз.р-р)

С! ФЕГУЛОВЛЯ

КИСЛОГЛ ОО мг/кг) И КЛОП НЛО Н (3,2 МГ/КГ)

и щшн.ичгаищ;,!

мг/кг)

Рисунок 2 - Влияние ферул о в ой кислоты, кавинтока и циннаризина на размер зоны некроза при фокальной ишемии мозга, вызванной постоянной окклюзией правой средней мозговой артерии

Таким образом, установлена церебропротекторная активность феруловой кислоты, повышающей выживаемость крыс при ишемии мозга, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий. Выявлена её антигипоксическая активность на моделях гиперкапнической и гемической гипоксий. Выявлена способность феруловой кислоты уменьшать функциональные нарушения мозга в условиях ишемии в тестах «открытое поле», «экстраполяционное избавление», «УРПИ», «вращающийся стержень». Для выявления механизмов церебропротекторной активности проведено исследование влияния феруловой кислоты на мозговой кровоток и сопротивление сосудов мозга, скорость свертывания крови, влияние на развитие отёка, свободнорадикальное окисление и активность антиоксидантной системы, метаболизм глюкозы в ткани мозга. Феруловая кислота не изменяет мозговой кровоток и сопротивление сосудов, но увеличивает время свертывания крови, что имеет значение для сохранения микроциркуляции при ишемии. В условиях реперфузионного повреждения введение феруловой кислоты уменьшает развитие отека мозга, повышает активность катал азы и уменьшает образование малонового диальдегида в ткани мозга. Это свидетельствует об уменьшении разрушения клеточных мембран и защите других структур клеток от свободнорадикального повреждения. Феруловая кислота увеличивает потребление глюкозы мозгом, активируя окисление молочной кислоты, тем самым уменьшая энергодефицит ишемизированной ткани и развитие лактат-ацидоза.

Церебропротекторная активность феруловой кислоты проявляется и при фокальной ишемии, которая служит экспериментальной моделью инсульта. Феруловая кислота уменьшает зону некроза мозга при фокальной ишемии в 3 раза.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1. Феруловая кислота увеличивает выживаемость крыс при ишемии мозга, вызванной окклюзией общих сонных артерий, превосходя по этому показателю кавинтон и циннаризин. Наиболее выраженный церебропротекторный эффект феруловой кислоты наблюдается в дозе 30 мг/кг.

2. Феруловая кислота обладает антигипоксической активностью, увеличив продолжительность жизни мышей при гиперкапнической и гемической гипоксия

3. Феруловая кислота проявляет церебропротекторный эффект, уменып функциональные нарушения, возникающие при ишемии мозга. По показател проведенных исследований феруловая кислота в большинстве тестов превосход препараты сравнения.

4. Феруловая кислота не изменяет объемный мозговой кровоток и сопротивлен сосудов мозга.

5. Феруловая кислота увеличивает время свертывания крови in vitro.

6. Феруловая кислота уменьшает степень цитотоксического отека, тормозит разви свободнорадикального окисления и активирует антиоксидантную защиту постишемическом периоде. По этим показателям феруловая кислота превосход препараты сравнения кавинтон и циннаризин.

7. Феруловая кислота увеличивает потребление мозгом глюкозы и уменьша накопление лактата при фокальной ишемии мозга и в норме. По влиянию активность окисления глюкозы феруловая кислота уступает кавинтону, превосходит циннаризин. По влиянию на окисление молочной кислоты эффе феруловой кислоты сопоставим с кавинтоном, но уступает циннаризину.

8. Феруловая кислота уменьшает зону некроза при фокальной ишемии мозга в 3 р по сравнению с контролем.

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ:

1. Влияние феруловой кислоты на выживаемость крыс при циркуляторно гипоксии// Человек и лекарство: тез. докл. 12 Рос. нац. конгресса 18-22 апр 2005 г. - М., 2005. - С. 660. (Соавт. Назарова Л.Е.).

2. Влияние феруловой кислоты на скорость мозгового кровотока и сопротивлени сосудов мозга крыс// Современные проблемы фармакологии и фармации материалы Всерос. науч.-практ. конф. 18-19 мая 2005 г. - Новосибирск: НГМА 2005. - С. 284-286. (Соавт. Назарова Л.Е.).

3. Цитопротекторное действие феруловой кислоты//Физиология и здоровь человека: науч. тр. I съезда физиологов СНГ 19-23 сент. 2005г. Сочи

22

Дагомыс- М.:Медицина-Здоровье, 2005. - Т.2. - С.4. (Соавт. Назарова JI.E., Огурцов Ю.А., Абисалова ИЛ., Дьяков A.A.).

4. Перспектива поиска нейропротекгоров среди производных коричных кислот// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2005. - Вып. 60. - С. 319-320. (Соавт. Гаевый М.Д., Назарова JI.E., Гаевая М.Н., Благодырь М.Н., Купко E.H., Никитина O.A.).

5. Влияние кислоты феруловой на поведение крыс в тесте «открытое поле» в условиях ишемии мозга, вызванной билатеральной перевязкой общих сонных артерий// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2006. - Вып. 61.- С.351-353. (Соавт. Назарова Л.Е.).

6. Влияние кислоты феруловой на неврологический статус крыс в норме и при ишемии, вызванной билатеральной перевязкой общих сонных артерий// Известия высших учебных заведений. Сев.-Кавк. регион. Естественные науки. Фармакология. - 2006 (Спецвыпуск).- С.70-72. (Соавт. Назарова Л.Е.).

7. Влияние кислоты феруловой на развитие ишемического отека, активность каталазы и содержание малонового диапьдегида в мозге крыс// Известия высших учебных заведений. Сев.-Кавк. регион. Естественные науки. Фармакология. - 2006 (Спецвыпуск). - С. 74-76. (Соавт. Назарова Л.Е.).

8. Влияние феруловой кислоты на продолжительность жизни мышей при гиперкапнической и гемической гипоксии// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2007,- Вып. 62. - С. 533-534.

9. Влияние кислоты феруловой на поведение крыс в тесте «открытое поле» в норме и при ишемии мозга, возникающей в результате гравитационных перегрузок// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2007.- Вып. 62. - С. 590-593. (Соавт. Назарова Л.Е.).

ДЬЯКОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ ФЕРУЛОВОЙ КИСЛОТЫ В УСЛОВИЯХ ИШЕМИИ МОЗГА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Подписано к печати 6*3- 2007. Формат бумаги 60x84 1/16.

Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная Усл. печ. л. %_0_. Тираж Заказ № т

Государственное образовательное учреждение высшего профессиональн образования «Пятигорская государственная фармацевтическая акадек Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Актуальность проблемы

Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе инсульты - в настоящее время основные причины смертности населения во всем мире. До сих пор ученые были единодушны: по прогнозам, в течение ближайших 20-30 лет количество этих заболеваний будет существенно расти. Ежегодно регистрируется около 20 миллионов случаев инсульта, каждый четвертый из них — смертельный. К 2020 году прогнозируется рост смертности от инсульта до 7,6 миллиона человек в год. Наибольшая частота инсультов отмечена в Китае, в Восточной Европе и в России [21]. В России регистрируется более 450000 инсультов ежегодно. В Москве количество больных с инсультом в течение уже длительного времени (почти 20 лет) достигает 36000 пациентов в год. Летальность после состоявшегося ишемического инсульта составляет 20% в течение первого месяца и около 25% в течение первого года. Через 6 месяцев после инсульта инвалидизация наступает у 40% выживших больных. Следует подчеркнуть катастрофические последствия ишемического инсульта - в течение первых 5 лет до 85% больных умирают или остаются инвалидами и только 15% пациентов полностью выздоравливают. Преобладают ишемические поражения головного мозга. По данным международных мультицентровых исследований соотношение ишемического и геморрагического инсультов составляет 85% и 15% соответственно. Несмотря на распространенность и частоту этих заболеваний, все еще остается много нерешенных вопросов, особенно касающихся лечения больных.

Терапию этой группы пациентов необходимо проводить, учитывая сложные этиологические и патогенетические механизмы, длительность и тяжесть заболевания. Применяемые до сих пор лечебные комплексы нередко оказываются малоэффективными, что обуславливает актуальность проблемы поиска и разработки новых фармакологических средств [19].

К числу наиболее значимых факторов риска были отнесены артериальная гипертензия, заболевания сердца, наличие в семье заболеваний сердечно-сосудистой системы, курение, злоупотребление алкоголем, сахарный диабет, гиперлипидемия.

Регулярное лечение ишемической болезни головного мозга до инсульта (прием антигипертензивных препаратов, антиагрегантов, метаболических, ноотропных средств) достоверно снижало тяжесть ишемического инсульта. При обследовании больных в динамике установлено, что прирост показателей количественных шкал был большим у больных с ишемическим инсультом, получавших в дополнение к антигипертензивной и антиагрегантной терапии метаболические и ноотропные препараты [40].

Цель и задачи исследования

Целью исследования является изучение церебропротекторного действия феруловой кислоты при глобальной и фокальной ишемии мозга.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• изучить влияние феруловой кислоты на выживаемость крыс при ишемии, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий в дозах 10, 30 и 60 мг/кг;

• изучить антигипоксическое действие феруловой кислоты на моделях гиперкапнической и гемической гипоксий;

• изучить влияние феруловой кислоты на мозговой кровоток и сопротивление сосудов мозга крыс в дозе, оказывающей наиболее выраженное церебропротекторное действие;

• изучить способность феруловой кислоты влиять на процесс свертывания крови;

• изучить влияние феруловой кислоты на функциональное состояние мозга при постоянной ишемии мозга и в постишемическом периоде;

• изучить влияние феруловой кислоты на развитие постишемического отека мозга, перекисное окисление липидов и активность антиоксидантной системы при ишемии мозга;

• изучить влияние феруловой кислоты на метаболизм глюкозы в ткани мозга при ишемии и в норме;

• изучить влияние феруловой кислоты на размер зоны некроза при фокальной ишемии.

Научная новизна

Впервые изучено церебропротекторное действие феруловой кислоты на моделях тотальной и фокальной ишемий мозга.

Проанализирована зависимость доза - церебропротекторный эффект на модели выживаемости крыс при ишемии мозга, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий. Определена оптимальная доза для проявления церебропротекторной активности феруловой кислоты. Показано выраженное защитное действие феруловой кислоты, превосходящее кавинтон и циннаризин при постоянной ишемии мозга.

На моделях гиперкапнической и гемической гипоксий впервые показано антигипоксическое действие феруловой кислоты, определены оптимальные дозы, увеличивающие продолжительность жизни мышей.

Изучено влияние феруловой кислоты на объемный мозговой кровоток и сопротивление сосудов мозга. Феруловая кислота не изменяет объемный мозговой кровоток и сопротивление сосудов мозга.

Показана способность феруловой кислоты ускорять восстановление функционального состояния мозга на двух моделях ишемий мозга, вызванных билатеральной окклюзией общих сонных артерий и гравитационными перегрузками в кранио-каудальном направлении.

Впервые показано, что феруловая кислота уменьшает отёк, перекисное окисление липидов и активирует каталазу в ткани мозга при реперфузионном повреждении.

Феруловая кислота увеличивает потребление глюкозы мозгом, активируя при этом окисление молочной кислоты на модели фокальной ишемии мозга.

Доказана способность феруловой кислоты уменьшать зону некроза при фокальной ишемии, вызванной окклюзией средней мозговой артерии.

Практическая значимость работы и выход в практику

Полученные результаты указывают на высокую эффективность феруловой кислоты как церебропротектора и свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического углубленного её изучения. Запланировано дальнейшее изучение церебропротекторных свойств феруловой кислоты на кафедре фармакологии ГОУ ВПО «Волгоградского государственного медицинского университета» и на кафедре фармакологии ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава».

Уровень внедрения По результатам фармакологических исследований, полученным при выполнении данной работы, составлено и утверждено в ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» информационное письмо «Об изучении церебропротекторных свойств феруловой кислоты». Материалы этого письма будут использоваться на кафедре фармакологии ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» и на кафедре фармакологии ГОУ ВПО «Волгоградского государственного медицинского университета» при прочтении лекций и при проведении практических занятий по темам «Антиоксиданты и антигипоксанты» и «Ишемия головного мозга», а также в научных исследованиях, проводимых в лабораториях кафедр фармакологии.

Положения, выдвигаемые на защиту

• Феруловая кислота увеличивает выживаемость крыс при ишемии мозга, вызванной постоянной окклюзией общих сонных артерий и превышает по активности препараты сравнения кавинтон и циннаризин.

• Феруловая кислота обладает антигипоксической активностью, увеличивая продолжительность жизни мышей при гиперкапнической и гемической гипоксиях.

• Феруловая кислота уменьшает интенсивность неврологических нарушений, возникающих при постоянной ишемии мозга и в постишемическом периоде.

• Феруловая кислота в дозе 30 мг/кг не изменяет мозговой кровоток и не влияет на сопротивление сосудов мозга.

• Феруловая кислота снижает скорость свертывания крови in vitro.

• Феруловая кислота в дозе 30 мг/кг уменьшает отёк, перекисное окисление липидов и увеличивает активность каталазы в ткани мозга в условиях реперфузионного повреждения. J

• Феруловая кислота увеличивает потребление глюкозы тканью мозга, интенсифицируя второй этап её окисления - окисление молочной кислоты.

• Феруловая кислота в 3 раза уменьшает зону некроза при фокальной ишемии мозга.

Связь с планом НИР ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава»

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» (№ государственной регистрации 01.2001.02926).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Апробация полученных результатов

Основные результаты диссертационной работы доложены на 1-м съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005 г.); на 61-й и 62-й региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров Пятигорской государственной фармацевтической академии (Пятигорск, 2006, 2007 гг.).

Объем и структура диссертации

Общие выводы:

1. Феруловая кислота увеличивает выживаемость крыс при ишемии мозга, вызванной окклюзией общих сонных артерий, превосходя по этому показателю кавинтон и циннаризин. Наиболее выраженный церебропротекторный эффект феруловой кислоты наблюдается в дозе 30 мг/кг.

2. Феруловая кислота обладает антигипоксической активностью, увеличивая продолжительность жизни мышей при гиперкапнической и гемической гипоксиях.

3. Феруловая кислота проявляет церебропротекторный эффект, уменьшая функциональные нарушения, возникающие при ишемии мозга. По показателям проведенных исследований феруловая кислота в большинстве тестов превосходит препараты сравнения.

4. Феруловая кислота не изменяет объемный мозговой кровоток и сопротивление сосудов мозга.

5. Феруловая кислота увеличивает время свертывания крови in vitro.

6. Феруловая кислота уменьшает степень цитотоксического отека, тормозит развитие свободнорадикального окисления и активирует антиоксидантную защиту в постишемическом периоде. По этим показателям феруловая кислота превосходит препараты сравнения кавинтон и циннаризин.

7. Феруловая кислота увеличивает потребление мозгом глюкозы и уменьшает накопление лактата при фокальной ишемии мозга и в норме. По влиянию на активность окисления глюкозы феруловая кислота уступает кавинтону, но превосходит циннаризин. По влиянию на окисление молочной кислоты эффект феруловой кислоты сопоставим с кавинтоном, но уступает циннаризину.

8. Феруловая кислота уменьшает зону некроза при фокальной ишемии мозга в 3 раза по сравнению с контролем.

Заключение

При анализе литературы, посвященной биологическим свойствам феруловой кислоты, следует отметить следующие факты. Феруловая кислота изучалась в первую очередь как вещество, проявляющее антиоксидантные свойства [116]. Её химическая структура определяет способность выступать в качестве ловушки свободных радикалов. Однако этим не ограничивается активность феруловой кислоты, как антиоксиданта [33, 34, 35, 36, 60, 100].,Она препятствует снижению активности антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы) [185] Феруловая кислота способна индуцировать активность генов системы шоковых температурных белков, гемоксигеназы-1, что проявляется в протекции от перекисного окисления липидов, белков, нуклеиновых кислот [106, 128].

Для феруловой кислоты был показан выраженный протекторный эффект по отношению к №+/К+-АТФазной активности в микросомах мозга крысы. Инкубация микросом мозга в присутствии Н202 приводила к ингибированию №+/К+-АТФазы. Введение феруловой кислоты в инкубационную смесь приводило к сохранению Na+/K+-АТФазной активности [94].

На модели бетаамилоидиндуцированной модели изучено её влияние на патогенетические процессы, протекающие в ткани мозга. Введение бетаамилоидпептида в четвертый желудочек мозга приводит к развитию процессов, модулирующих болезнь Альцгеймера. Развивается воспалительная реакция в ткани мозга, а также активируются процессы свободнорадикального окисления. На данной модели феруловая кислота проявила способность снижать реакцию воспаления и препятствовать усилению свободнорадикального окисления [64, 139, 157, 179].

Противовоспалительное действие феруловой кислоты объясняется ее способностью снижать образование свободных радикалов, которые активируют миграцию нейтрофилов в зону воспаления. Но влияние феруловой кислоты не ограничивается её антиоксидантной активностью. Она способна снижать образование провоспалительного фактора MIP-2 (макрофагальный белок воспаления - 2) [44, 138]. Показана способность феруловой кислоты уменьшать адгезию лейкоцитов к эндотелию сосудов [99]. Она блокирует цикл арахидоновой кислоты, тем самым, уменьшая образование проагрегантных факторов. Имеются доказательства способности феруловой кислоты подавлять синтез проагрегантных простагландинов и агрегацию тромбоцитов [97, 96], что является пусковым механизмом реакций свертывания крови, микротромбообразования и нарушения микроциркуляции в ишемизированной ткани.

Большой интерес представляет работа, предполагающая способность феруловой кислоты конкурировать с глутаматными рецепторами мозга. Было проведено исследование влияния феруловой кислоты на последствия введения глутамата натрия самкам мышей на последней стадии беременности. Использовали радиоизотопный глутамат, помеченный по третьему атому водорода. Распределение глутамата в мозге эмбрионов определяли через 30, 60, 90 и 120 минут после внутрижелудочкового его введения самкам. Одновременное введение феруловой кислоты ингибировало поступление глутамата в мозг эмбрионов. Потомство животных, получавших феруловую кислоту, впоследствии имело менее выраженные нарушения поведения. Уменьшались отклонения развития мозга, выявленные гистопатологическими методами, явления генетической токсичности увеличивающей экспрессию генов апоптоза (метод «вестерн-блот»). Таким образом, можно предполагать, что феруловая кислота является конкурентным антагонистом NMDA-рецепторов [175]. В зоне пенумбры нейроны и нейроглиальные клетки погибают не столько по типу некроза, сколько по типу апоптоза. Имеются работы доказывающие способность феруловой кислоты ингибировать экспрессию генов Р21 и Р53 (генов апоптоза), а также снижать активность каспазы-3, повышать активность флипазы [142, 157]. Феруловая кислота значительно предотвращала образование кислого глиального фибриллярного белка, увеличение интерлейкина-1, а также изменение уровня экспрессии ферментов ERK и РКВ. Такое же влияние феруловой кислоты на активность ERK показано на модели окклюзии средней мозговой артерии мозга крыс с реперфузией [95, 99, 200]. Феруловая кислота проявила способность активировать митоз и синтез ДНК в культуре клеток сетчатки глаза 7месячного эмбриона человека, неонатального теленка и 4-месячных мышей [93], что, возможно, будет ускорять неовазогенез в постишемическом периоде.

Это позволяет предполагать, что феруловая кислота, проявляя перечисленные свойства, будет проявлять церебропротекторный эффект in vivo, т.е. на целом организме в условиях ишемии мозга. Для подтверждения этого предположения мы провели данное исследование.

В собственных исследованиях была подтверждена церебропротекторная активность феруловой кислоты на модели по выживаемости крыс при билатеральной окклюзии общих сонных артерий. Для этой модели используются молодые крысы линии Wistar с весом 170-220 г; в контроле выживают до 20% животных. Феруловая кислота в дозе 30 мг/кг увеличила выживаемость животных до 70%. При фокальной ишемии мозга введение феруловой кислоты в дозе 30 мг/кг уменьшило зону некроза в 3 раза по сравнению с контролем. Таким образом, феруловая кислота защищает ишемизированную ткань от гибели в условиях ишемии, как при фокальной ишемии, так и при ишемии всего головного мозга. Но при ишемии целого мозга структуры гиппокампальной области и клетки коры мозга страдают в первую очередь и погибают раньше, чем нейроны других отделов. Для исследования влияния феруловой кислоты на отделы мозга, которые при ишемии страдают в первую очередь, была проведена серия экспериментов по определению функционального состояния мозга, и в первую очередь, коры головного мозга в тестах «открытое поле», «экстраполяционное избавление», «УРПИ» и «вращающийся стержень». Введение феруловой кислоты заметно уменьшало расстройства, регистрируемые данными тестами.

Антигипоксическая активность феруловой кислоты была выявлена на моделях гиперкапнической и гемической гипоксий. Этот вид активности, можно объяснить мембраностабилизирующей активностью феруловой кислоты, что непосредственно связано с её антиоксидантными свойствами.

Было проведено исследование феруловой кислоты как возможного вазодилататора. Для этого исследовали влияние феруловой кислоты на объемный мозговой кровоток неишемизированных крыс. Этот вид активности у феруловой кислоты отсутствует. Однако феруловая кислота проявила способность уменьшать скорость свертывания крови. Для исключения противовоспалительного влияния феруловой кислоты на процесс свертывания исследование проводили in vitro на крови здоровых крыс.

Подтверждена способность феруловой кислоты ингибировать процессы свободнорадикального окисления и увеличивать активность антиоксидантной защиты в ишемизированной ткани мозга. Для этого использовали модель с максимальной активацией свободнорадикального окисления в постреперфузионном периоде - временной глобальной ишемии, вызванной гравитационными перегрузками в кранио-каудальном направлении. Феруловая кислота уменьшала образование малонового диальдегида и увеличивала активность каталазы. На этой же модели подтверждена способность феруловой кислоты уменьшать цитотоксический отек мозга.

Исследовали способность феруловой кислоты влиять на энергодефицит ишемизированной зоны мозга. Для этого использовали модель фокальной ишемии — окклюзию средней мозговой артерии. Феруловая кислота увеличивает окисление глюкозы с усилением второго этапа - окислением молочной кислоты. Уменьшение зоны некроза служит косвенным доказательством того, что синдром обкрадывания ишемизированной зоны при этом уменьшается.

Таким образом, феруловая кислота может рассматриваться как перспективный церебропротектор.