Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование цитопротекторной активности кислоты феруловой

На правах рукописи

005011П *

НАЗАРОВА ЛЮБОВЬ ЕФИМОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИТОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ КИСЛОТЫ ФЕРУЛОВОЙ

14.03.06 - ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

- 1 МДР ш

Пятигорск 2012

005011112

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант: засл. деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

Официальные оппоненты:

1. Доктор фармацевтических наук, профессор Бунятян Наталья Дмитриевна

2. Доктор медицинских наук, профессор Болиева Лаура Зелимхановна

3. Доктор биологических наук, профессор Сергиенко Аэлита Валерьевна

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «28» марта 2012 г. в 9-00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.069.01 ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан «2» февраля 2012 г.

профессор Гаевый Михаил Дмитриевич

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Актуальность проблемы

Одной из наиболее важных проблем современной биологии и медицины является защита организма от повреждающих факторов различного происхождения. Природа повреждающих факторов, оказывающих цитотоксическое воздействие, многообразна: ионизирующая радиация, воздействие химиотерапевтических лекарственных средств, интоксикация продуктами химических производств, ишемия и др.

В связи с этим, важнейшей задачей является поиск универсальных механизмов протекции, позволяющих защитить клетку от гибели с целью сохранения ее структурной целостности и функциональной активности (Барабой В.А., 1996; Гусев Е.И., СкворцоваВ.И., 2001; Микуляк Н.И., 2011).

Клетки организма характеризуются индивидуальной реакцией на повреждающие агенты. Так, при облучении и воздействии цитостатиков быстрее всего поражаются лабильные клетки с высокой скоростью регенерации - клетки «критических» систем (красный костный мозг, кишечник, лимфоидные органы, гонады). Стабильные клетки, например гепатоциты, подвергаются поражению при значительных химических интоксикациях. Клетки головного мозга (статические) наиболее устойчивы к повреждающим факторам, но могут поражаться при нарушении целостности гематоэнцефалического барьера и различных видах ишемии.

Одним из механизмов повреждения клеток является процесс образования активных форм кислорода, индуцирующих свободнорадикальное перекисное окисление липидов мембран с развитием оксидантного стресса.

Антиоксидантная система клетки, ткани и организма в целом обеспечивает связывание и модификацию свободных радикалов, предупреждение разрушения биомолекул. Дефект в любом из звеньев системы антиоксидантной защиты приводит к активации перекисного окисления. Увеличение мощности антиоксидантной защиты, обусловленное введением естественных или синтетических антиоксидантов, создает определённую гарантию против активации перекисного окисления.

в арсенале медицинской практики недостаточно лекарственных средст проявляющих антиоксидантные и цитопротееторные свойства i предохраняющих клетки организма от воздействия агрессивных факторов. I связи с этим поиск новых антиоксидантов, обладающих высоко.' цитопротекторной активностью и низкой токсичностью, и создание на и. основе высокоэффективных полифункционгщьных лекарственных препарате является одной из актуальных проблем современной медицины и фармации.

В настоящее время большое внимание исследователей привлекаю синтетические производные коричной кислоты, многие из которых обладаю антиоксидантной активностью и низкой токсичностью (Симонян A.B., 1995).

Несмотря на это, до настоящего времени не была изучена зависимост между антиоксидантной и цитопротекторной активностью синтетически производных коричной кислоты, не исследовано антиоксидантное цитопротекторное действие наиболее активных соединений по отношению клеткам с различной скоростью регенерации. Решение данной проблемь позволит расширить базу общетеоретических знаний в области изучени антиоксидантов и предложить наиболее активные производные коричное кислоты в качестве потенциальных лекарственных средств.

Цель работы

Выявление в ряду синтетических производных коричной кислоть соединения с наиболее выраженной антиоксидантной аетивностью и оценка ег цитопротекторных свойств на различных моделях повреждения.

Задачи исследования

1. Проведение первичного скрининга 27 синтетических производных

коричной кислоты для выявления наиболее активного антиоксиданта; оценка

цитопротекторной активности выбранного соединения на разных моделях (in vitro).

2. Изучение острой и хронической токсичности выбранного соединения и некоторых параметров фармакокинетики.

3. Изучение влияния выбранного соединения на цитостатическую активность циклофосфамида и 5-фторурацила (in vitro).

4. Определение выбора эффективных доз соединения по оценке выживаемости животных на четырех моделях повреждения: у-облучении, введении цитостатиков и тетрахлорметана, ишемии головного мозга;

5. Исследование радиопротекторной активности выбранного соединения на клетки «критических» систем организма (костный мозг, кровь, тонкий кишечник, селезенка, семенники) при воздействии ионизирующей радиацией.

6. Исследование цитопротекторных свойств выбранного соединения на клетки «критических» систем организма (костный мозг, кровь, тонкий кишечник, селезенка, тимус, семенники) для снижения побочных токсических эффектов цитостатиков.

7. Изучение гепатопротекторной активности выбранного соединения при экспериментальном токсическом поражении печени тетрахлорметаном.

8. Изучение нейропротекторной активности выбранного соединения при различных видах ишемии головного мозга.

Научная новизна. В работе сформулировано положение о том, что при различных поражениях организма (облучение, интоксикация химическими веществами, ишемия) в составе комбинированной терапии должны применяться антиоксидантные соединения, обладающие цитопротекторным и мембраностабилизирующим действием, защищающие генетический аппарат клеток и улучшающие внутриклеточный метаболизм.

В работе впервые:

- проведено сравнительное изучение 27 синтетических производных коричной кислоты и выявлена корреляционная взаимосвязь между их структурой, антиоксидантной и цитопротекторной активностью;

- установлено, что наиболее выраженные антиоксидантные и цитопротекторные свойства проявило соединение, имеющее в положении 4 бензольного ядра группу НО", а в положении 3 группу СН3СГ: транс - 4'-гидрокси-З'-метоксифенилпропеновая кислота - кислота феруловая;

- установлено, что кислота феруловая относится к практически нетоксичным веществам;

- определена зависимость «доза-эффект» кислоты феруловой на четырех моделях повреждения: у-облучении, введении цитостатиков и тетрахлорметана, ишемии головного мозга;

- изучена хроническая токсичность кислоты феруловой и установлено, что по большинству изучаемых клинических и функциональных показателей отклонений от физиологической нормы не зарегистрировано, однако в токсической дозе наблюдаются биохимические признаки гепатотоксичности;

- выявлено, что кислота феруловая не снижает цитостатическую активность циклофосфамида и 5-фторурацила по отношению к культуре опухолевых клеток линий лимфосаркомы Плисса и карциномы шейки матки, сублинии Hela (in vitro);

- установлено, что кислота феруловая при однократном общем у-облучении и воздействии цитостатиками (циклофосфамидом и 5-фторурацилом) защищает клетки тканей «критических» систем и усиливает компенсаторно-приспособительные реакции организма;

- экспериментально установлено, что при облучении и поражении цитостатиками кислота феруловая способствует регенерации клеток красного костного мозга, тимуса, селезенки, тонкого кишечника, семенников, нормализации гематологических, биохимических и цитогенетических показателей;

- установлено, что кислота феруловая в условиях экспериментального тетрахлорметанового поражения нормализует гистологическую картину и функциональное состояние печени;

- доказана способность кислоты феруловой ускорять восстановление функционального состояния мозга на моделях ишемии, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий и гравитационными перегрузками в кранио-каудальном направлении;

- установлено, что кислота феруловая уменьшает отек, подавляет интенсивность перекисного окисления и активирует каталазу в ткани мозга при реперфузионном повреждении, вызванном гравитационными перегрузками в кранио-каудальном направлении;

- экспериментально доказано, что в условиях фокальной ишемии мозга кислота феруловая увеличивает потребление глюкозы мозгом, активируя окисление молочной кислоты, и уменьшает размер зоны некроза нервной ткани.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенные исследования позволили систематизировать знания о наличии зависимости между антиоксидантной и антигемолитической активностью в ряду производных коричной кислоты с различными заместителями в ароматическом ядре. Установлена зависимость антиоксидантного и цитопротекторного действия от дозы кислоты феруловой и степени моделируемого повреждения. Методологически обосновано использование кислоты феруловой в качестве цитопротекторного средства на органы-мишени и образующие их клетки. Единство механизмов развития цитотоксического повреждения, связанного с индукцией свободнорадикального перекисного окисления, определяет универсальность защитного действия кислоты феруловой.

Экспериментальные исследования подтвердили перспективность дальнейшего углубленного доклинического изучения кислоты феруловой.

По совокупности полученных экспериментальных данных кислота феруловая может быть рекомендована в качестве радиопротекторного средства, при химических поражениях печени, для снижения побочных токсических эффектов при химиотерапии цитостатическими лекарственными препаратами, а также в качестве нейропротекторного средства при ишемических повреждениях головного мозга.

В результате проведенных исследований теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность создания различных лекарственных форм на основе кислоты феруловой и их более глубокое доклиническое и клиническое тестирование.

Уровень внедрения результатов исследования

По результатам фармакологических исследований составлены и утверждены в ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России информационные письма: «Исследование цитопротекторной активности кислоты феруловой при радиационном поражении», «Фармакологическая коррекция побочных токсических эффектов циклофосфамида и 5-фторурацила с помощью кислоты феруловой», «Исследование церебропротекторной активности кислоты феруловой в условиях ишемии мозга».

На основании информационных писем ГБОУ ВПО ВолГМУ Минздравсоцразвития России и НИИ фармакологии при ГБОУ ВПО ВолГМУ Минздравсоцразвития России дали заключение о большой теоретической и практической ценности представленного материала и необходимости создания лекарственных препаратов на основе кислоты феруловой на базе российских фармацевтических предприятий с целью расширения ассортимента отечественных оригинальных лекарственных средств.

На основании материалов информационного письма «Фармакологическая коррекция побочных токсических эффектов циклофосфамида и 5-фторурацила с помощью кислоты феруловой» в лаборатории биологических испытаний филиала ИБХ РАН г. Пущино проводятся доклинические исследования при изучении влияния кислоты феруловой на развитие токсических эффектов противоопухолевых лекарственных препаратов на животных с моделированными опухолями.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс (лекции и практические занятия) ряда кафедр Московского медико-стоматологического университета, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии, Ижевской медицинской академии, Северного

государственного медицинского университета (г. Архангельск), Оренбургской государственной медицинской академии.

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведены планирование исследований, анализ и статистическая обработка, обобщение полученных результатов, принято участие в экспериментальных исследованиях. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования: от постановки задач и их реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и их внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.03.06-фармакология, клиническая фармакология, конкретно пунктам 1, 2 и 3 паспорта специальности.

Апробация полученных результатов

Основные результаты работы доложены на 56-66 региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров Пятигорской ГФА (Пятигорск, 2001-2011 гг.), XIX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (М„ 2004 г.), 1-м съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005 г.), международной научной конференции, посвященной 75-летию Ереванского гос. мед. ун-та (Ереван, Армения, 2005 г.).

Положения, выдвигаемые на защиту

1. Сравнительная оценка 27 синтетических производных коричной кислоты выявила корреляционную зависимость между антиоксидантной активностью и цитопротекторным действием.

2. Анализ взаимосвязи «структура-активность» показал, что антиоксидантная и цитопротекгорная активность изучаемых веществ зависит от характера и местоположения заместителей в ароматическом ядре.

3. Наиболее выраженные антиоксидантные и цитопротекгорные свойства проявила кислота феруловая: 4'-гидРокс„-3'-метоксифенилпропеновая кислота.

4. Кислота феруловая снижает выраженность токсических эффектов цитостатиков, не изменяя их цитосташческой активности в отношении опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса и карциномы шейки матки, сублинии HeLa (in vitro).

5. Кислота феруловая проявляет радиопротекгорное действие по отношению к «критическим» системам в условиях поражения у-лучами.

6. Кислота феруловая проявляет цитспротекторное действие по отношению к «критическим» системам, снижая побочные токсические эффекты циклофосфамида и 5-фторурацила.

7. Кислота феруловая оказывает гепатопротекторное действие в условиях экспериментального поражения гепатоцитов тетрахлорметаном.

8. Кислота феруловая обладает нейропротекторной арностью на моделях глобальной (постоянной и преходящей) и фокальной ишемий мозга.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 79 научных работ; из них монография - 1, статей в журналах, рекомендованных ВАК, 15. Общий объем научных работ - 12,415 п.л. (авторских - 9,335 п.л.). Структура и объём диссертации

Диссертационная работа изложена на 288 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы (1-2 главы), описания материалов и методов исследования (3 глава), результатов собственных исследований (4-9 главы), заключения, общих выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 85 рисунками. Библиографический список включает 389 источников, из которых 215 отечественных и 174 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явились 27 производных коричной кислоты, синтезированных на кафедре органической химии Пятигорской ГФА (зав. кафедрой, доктор фармацевтических наук, профессор Э.Т.Оганесян); кислота

феруловая (ФК), синтезированная профессором Э.Т.Оганесяном, а также полученная от Sigma-Aldrich Chemie GmbH - 99%.

Раствор ФК для внутрибрюшинных инъекций готовили ex tempore. ФК растворяли в воде очищенной с добавлением натрия гидрокарбоната в эквивалентных количествах и при нагревании раствора до 40°С. После её растворения контролировали pH раствора, который равнялся 7,4-7,8.

Эксперименты выполнены на 528 мышах, 442 беспородных крысах-самцах и 1206 крысах обоего пола линии Wistar.

Экспериментальные модели поврездсния

1. Воспроизведение острой лучевой болезни проводили общим облучением мышей и крыс на стандартной у-тералевтической установке типа «АГАТ-С» (мощность 0,0171, поле 20x20, РИП 75 мм, источник Со60) на базе Пятигорского онкологического центра. Дозы радиации в различных сериях экспериментов составляли от 2,0 до 9,0 Гр. Летальные дозы радиации (LDI6, LD50, LDg4 и LDioo) исследовали по методу Литчфилда и Уилкоксона (Сернов Л.Н., Гацура В.В, 2000). Рассчитанные значения составили LD16= 3.4 Гр; LD50=5,5 Гр; LD84=7,7 Гр; LD100=8,8 Гр.

2. Токсическое повреждение «критических» органов животных вызывали противоопухолевыми лекарственными препаратами: циклофосфамидом (ЦФ) в дозе 200 мг/кг и 5-фторурацилом (5-ФУ) в дозе 125 мг/кг. Цитостатики вводили в дозах, обеспечивающих оптимальную выживаемость животных. Выбор препаратов обоснован их широким применением во многих схемах полихимиотерапии, принадлежностью к двум основным группам (ЦФ - к алкилирующим средствам, 5-ФУ - к антиметаболитам) и ярко выраженными побочными токсическими эффектами (Машковский М.Д., 2002).

3. На модели тетрахлорметанового (СС14) поражения печени определяли гепатопротекторную активность ФК (рук-во /под ред. Р.У. Хабриева, 2005). Токсическое поражение печени вызывали путем введения per os с помощью зонда 50% масляного раствора CCi4 в дозе 0,20 мл/100 г массы тела животного 1 раз в сутки в течение четырех дней.

4. Изучение нейропротекторной активности ФК проводили на трех моделях ишемии мозга: билатеральной окклюзии общих сонных артерий (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000); гравитационных перегрузок с помощью специальной центрифуги (g=13.52 в течение 12 минут) (Гаевый М.Д., 1986); окклюзии правой средней мозговой артерии (Bederso J.M.D. [et ah], 1986; рук-во /под ред. Р.У. Хабриева, 2005).

Антиоксидантную активность синтетических производных коричной кислоты изучали на модели железоаскорбатзависимого перекисного окисления липидов (Благородов С.Г. [и др.], 1987); цитопротекторную активность - на модели УФ-индуцированного гемолиза (Баджинян С. А., 1995) и эритроцитарной радиомиметической модели (Гончаренко E.H., Кудряшов Ю.Б., 1985). Острую токсичность ФК определяли классическим методом (Измеров И.И., Соноцкий И.В., Сидоров К.К., 1997). Определение максимальной концентрации ФК в крови устанавливали методом газожидкостной хроматографии.

Для изучения цитотоксичности ЦФ и 5-ФУ в присутствии ФК использовали культуры опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса (ЛСП) (г. Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект 4) и опухолевой клеточной линии HeLa (коллекция НИИ вирусологии РАМН, г. Москва). Исследования проводили на базе лаборатории биологических испытаний филиала ИБХ РАН г. Пущино в соответствии с общими лабораторными правилами и правилами работы в клеточном боксе, регламентирующими обращение с тестируемым и контрольными веществами (рук-во /под ред. Р.У. Хабриева, 2005).

Для оценки состояния костного мозга при лучевом и цитостатическом поражении проводили подсчет миелокариоцитов (Кост Е.А., 1975) и микроядер (Суворов H.H., Шашков B.C., 1975). В периферической крови подсчитывали общее количество лейкоцитов и определяли кислотную резистентность эритроцитов (Меньшиков В.В., 1987, Кост Е.А., 1975). Биохимическими тестами определяли концентрацию молекул средней массы (МСМ) (Габриэлян Н.И. [и др.], 1985), малонового диальдегида (МДА) (Стальная И.Д., Гаришвили

Т.Г., 1977), активность щелочной фосфатазы (ЩФ) (Данилова JI.A., 2003), аминотрансфераз (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982), каталазы (Королюк М.А. [и др.], 1988). Гистоморфологические исследования печени, тонкого кишечника, селезенки, тимуса, семенников проводили по методике Меркулова Н.В. (1962). Зону некроза оценивали трифенилтетразолиевым методом (Сернов JI.H., Гацура В.В., 2000). Влияние ФК на функциональное состояние мозга ишемизированных крыс изучали на моделях постоянной ишемии мозга и в постреперфузионном периоде. Показатели неврологического статуса определяли в тестах «открытое поле», «экстраполяционное избавление», «УРПИ», «вращающийся стержень» (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д., 1991; Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000). Регистрацию объемной скорости мозгового кровотока проводили методами водородного клиренса (Демченко И.Т., 1981) и доплерографии (доплерограф «Минимакс-Допплер-К»),

Препараты сравнения: 1) при скрининге - эмоксипин - 1%, обладает антиоксидантным, антигипоксическим и ангиопротекторным действием; 2) при лучевом поражении - цистамин (100 мг/кг), применяется в клинике как радиопротектор; 3) при поражении цитостатиками - мексидол (50 мг/кг), сходный с ФК механизмом действия (антиоксидант, ловушка свободных радикалов); 4) при токсическом поражении печени - силибор (30 мг/кг), как аналог ФК по действию; 5) при ишемиях - кавинтон (3,2 мг/кг), как аналог по действию и циннаризин (5,2 мг/кг), содержащий в структуре виниленовый фрагмент, аналогичный ФК.

Статистическая обработка результатов. Результаты опытов обрабатывались методом вариационной статистики (Урбах В.Ю., 1975; Стентон Гланц, 1999). Методом дисперсионного анализа проводили проверку нулевой гипотезы о равенстве средних для нескольких групп животных в каждой серии экспериментов. Для проверки достоверности различия средних применяли критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Наблюдаемое значение критерия Стьюдента сравнивали с критическим значением. Критическое значение определяли по таблице критерия Стьюдента при уровне значимости

0,05. Обработку данных проводили с применением пакета Анализ данных MS Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Первичный скрининг синтетических производных коричной кислоты для выявления наиболее активного антиоксиданта и цитопротектора (in vitro)

В первой серии экспериментов проведён скрининг 27 производных

коричной (3-фенилпропеновой) кислоты с различными заместителями в ароматическом ядре на наличие у этих соединений антиоксидантных свойств. В качестве модельной системы использовали железоаскорбатзависимое перекисное окисление липидов в составе Твина-80, окислителем служил кислород воздуха.

Во второй серии экспериментов проведено изучение влияния тех же производных коричной кислоты на интенсивность гемолиза эритроцитов, вызванного облучением клеток УФ-лучами (таблица 1).

В результате исследований было выявлено, что механизм протекторного

действия производных коричной кислоты при ультрафиолетовом повреждении

клеток связан с их антиоксидантными свойствами. Расчётный коэффициент

корреляции составляет 0,796, что указывает на вероятность безошибочного прогноза (99%).

Анализ взаимосвязи «структура-активность» показал, что в ряду производных коричной кислоты антиоксидантная и антигемолитическая активность веществ зависят от характера и местоположения заместителей в ароматическом ядре. Введение в положение 4 бензольного ядра диметиламиногруппы (№ 21), а в положении 2, 3 или 4 бензольного ядра групп: НО", NaO~, СН3СОО-, СН2ОСОО' (№№ 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16,18, 19, 22, 23, 24, 25,27) придаёт соединениям антиоксидантные и антигемолитические свойства.

Наиболее выраженные антиоксидантные и антигемолитические свойства проявило соединение №7, имеющее в положении 4 бензольного ядра группу НО", а в положении 3 группу СНаО": транс - 4'-гидрокси-3'-метокси фенилпропеновая кислота - кислота феруловая (ФК).

Таблица 1 - Антиоксидантная и антигемолитичсская активность синтетических производных коричной кислоты ивностъ

/>-сн=сн-соон

_//

R,

№ веще ства R. R2 Из Концентрация, снижающая лииоперокси-дацию и а 50% (вМ-КГ4) 1 серия опытов ---------- % гемолизированиых эритроцитов относит, контроля (100%) при УФ - индуцированном гемолизе

_1 Н~ Н" Н" >10 106

2 сн,0 Н" Н" +- >10 96

3 СН30" СНзО" Н" >10 111

4 Н" Н" СНзО" >10 102

5 НО' Н" Н" _6,51±0,06 59

6 NaO" Н" ITf 6,10±0,09 63

7 НО" СНзО" Н" 0,63±0,02 6

8 9 NaO- СНзО" Н" 1,54±0,06 22

СН30 НО"_ Н" 2,83±0,07 19

10 СН3О' NaO" Н" 2,64±0,09 21

11 Н" Н" сг >10 116

12 Н" сг Н" >10 97

13 02N" Н" Н" >10 96

14 Н" -no2 Н >10 114

15 СН3СОО" Н" 7,66±0,10 53

16 СН30" СНзСОО" Тг 3,41±0,08 41

¡17 н СНзО" СНзО" >10 89

18 НО" НО" Н" 0,95±0,01 22

19 20 21 НО" -COONa Н" 7,70±0,09 1 63

-0-СН2-0" -0-СН2-О" Н" >10 12

-n(ch3)2 Н" Н" 0,92±0.01 62

22 och3coo' СОО" Н" 3,54±0,05 39

23 ch30" ОСН.СОО" Н" 3,41 ±0,05 46

24 0СН2С00- Н" Н" 3,82±0,06 40

25 СН30" ОСН2СОО" Н" 3,81±0,08 38

26 Н -nh2 Н" 5,01±0,09 53

27 ОСН2СОО" ОСН2СОО" Н" 8,91±0,07 1 71

С учетом результатов скрининга провели оценку влияния ФК на гемолиз эритроцитов, вызванный модельными липидными радиотоксинами (in vitro). В качестве модельного радиотоксина использовали окисленную олеиновую кислоту (ООК). Показателем устойчивости эритроцитов к действию гемолизина служило время разрушения 50% эритроцитов в пробе (рисунок 1).

—♦"Контроль ~®"Эмоксшшн ФК

- Н 1р Ф р 19 3! -ДЗ .:i5 время,мин

Рисунок 1 - Влияние кислоты феруловой и эмоксипииа на течение гемолиза эритроцитов, вызванного ООК (п=6)

Установлено, что ФК снижала степень гемолиза эритроцитов в 4 раза относительно контроля и в 2 раза относительно эмоксипииа, проявив более выраженный цитопротекторный эффект. Для дальнейших исследований в качестве цитопротектора на различных моделях повреждений была выбрана

ФК.

2. Изучение общетоксического действия и некоторых аспектов фармакокинетики кислоты феруловой

Изучение острой токсичности показало, что Ц>50 для ФК составила 1520 мг/кг, что позволило отнести ее к практически нетоксичным веществам (по классификации Сидорова К.К.). Исследование хронической токсичности выявило, что 30-дневное применение ФК в дозах 30 мг/кг и 100 мг/кг не вызывает отклонений параметров клинического анализа крови, мочи, ЭКГ, гемостаза относительно физиологической нормы. Однако, в дозе 100 мг/кг ФК проявила гепатотоксическое действие, что выражалось в сдвиге таких

биохимических показателей крови, как активность АлАт, ЩФ, содержание холестерина, Р-липопротеидов, билирубина

Экспериментально установлено, что максимальная концентрация ФК в крови после ее внутрибрюшинного введения наступает через 30 минут.

При коррекции побочных токсических эффектов ЦФ и 5-ФУ с помощью ФК возник вопрос о взаимодействии исследуемого соединения и цитостатиков. Изучая собственную противоопухолевую активность ФК, установили, что исследуемое соединение в концентрации 0,1 мг/мл (1С95) на выживаемость опухолевых клеток фактически не влияет. Результаты показали, что ФК в дозе 0,1 мг/мл при совместном присутствии не снижает лечебный эффект ЦФ и 5-ФУ (in vitro). Значения 1С50 ЦФ и 5-ФУ в присутствии ФК достоверно не изменяются в эксперименте на культурах опухолевых линий лимфосаркомы Плисса и карциномы шейки матки, сублинии HeLa.

3. Выбор эффективных доз кислоты феруловой при поражении у-лучами, цитостатиками, тетрахлорметаном и при ишемии головного мозга

Для выявления эффективных доз ФК и препаратов сравнения были проведены скрининговые исследования, основанные на оценке выживаемости животных (таблица 2).

Таблица 2 - Выбор эффективных доз кислоты феруловой и препаратов сравнения при различных способах повреждения

Клетки тканей Способ повреждения Доза кислоты феруловой Препарат сравнения н его доза

лабильные у-лучи 200 мг/кг цистамин 100 мг/кг

лабильные циклофосфамид 5-фторурацил 100 мг/кг 100 мг/кг мексидол 50 мг/кг мексидол 50 мг/кг

стабильные тетрахлорметан 30 мг/кг силибор 30 мг/кг

статические ишемия головного мозга 30 мг/кг кавинтон 3,2 мг/кг циннаризин 5,2 мг/кг

При облучении и введении цитостатиков ФК проявляет цитопротекторные свойства в дозах 50-200 мг/кг, но наиболее эффективной при облучении оказалась доза 200 мг/кг, при поражении цитостатиками - 100 мг/кг.

При остром поражении печени СС14 и ишемии, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий, ФК проявляет активность в дозах 10-60 мг/кг, но наибольшая эффективность наблюдается в дозе 30 мг/кг.

4. Изучение цитонрогекторной активности кислоты феруловой на клетки «критических» систем организма при воздействии ионизирующей радиацией и цитостатиками

При облучении и воздействии цитостатиками в первую очередь повреждаются клетки тканей с высокой скоростью пролиферации - клетки «критических» систем организма (костный мозг, кровь, тонкий кишечник, половые железы), а также лимфоидные органы (селезенка и тимус).

Динамика изменения массы тела животных. При цитотоксических поражениях, вызванных физическими и химическими факторами, происходит резкое падение массы тела животных. На фоне облучения и действия цитостатиков ФК способствовала достоверному приросту массы тела животных относительно контрольных значений в течение всего периода наблюдения. К 28-му дню эти показатели достоверно превышали контрольные значения: на фоне облучения - на 5,17%, ЦФ - на 30,8%, 5-ФУ - на 28,1% (рисунки 2, 3 и 4).

20.00!

15,00

10,00

7-й день 14-й день

21-й день 28-й день Ш Биологический контроль ■ Контроль й ФК 200 мг/кг й Цисташи 100 мг/кг

Примечание.

Достоверно относительно: # - биологического контроля, * - контроля

Рисунок 2 - Динамика изменения массы тела при облучении (5,5 Гр) на фоне действия кислоты феруловой (п=12)

* Биологический контроль ■ Контроль ®ФК МОмгкг *Мексндол50мг/кг

Примечание.

Достоверно относительно: #-биологического контроля, *-контроля, @ -мексидола

Рисунок 3 - Динамика изменения массы тела животных при введении циклофосфамида (200 мг/кг) на фоне кислоты феруловой (п=6)

Ы Биологический контроль * Контроль в ФК 100 мг/гг *Ыввзовя[50 мг/кг

Примечание.

Достоверно относительно: # - биологического контроля, * - контроля

Рисунок 4 - Динамика изменения массы тела животных при введении 5-фторурацила (125 мг/кг) на фоне кислоты феруловой (п=6)

Полученные результаты позволяют предположить, что ФК обладает

выраженным цитопротекторным действием в отношении эпителия тонкого

А Б

Рисунок 5 - Цитопротекторная активность кислоты феруловой в отношении слизистой тонкого кишечника на примере лучевого поражения 1 р): А - облучение, Б - ФК на фоне облучения

Наблюдаются многочисленные разрушения ворсинок, которые часто сливаются в общую бесструктурную массу. В клетках наблюдается кариолизис.

Профилактическое введение ФК препятствует деструктивным процессам в кишечнике. Кишечные ворсинки несколько расширены, но сохранены по всей поверхности. Признаки кариолизиса единичны.

Универсальными

маркерами эндогенной интоксикации при массированной гибели клеток под влиянием цитотоксических агентов являются молекулы средней массы (МСМ). В группе облученного контроля на 21-й день содержание МСМ достоверно увеличилось относительно группы биологического контроля на 55%. На фоне действия ФК количество МСМ снизилось на 32%, что достоверно по отношению к значениям группы облученного контроля и группы, получавшей цистамин. Уровень МСМ в контрольной группе, получавшей ЦФ, на 7-й день

кишечника при лучевом поражении и действии цитостатиков, что подтверждается гистоморфологическими исследованиями.

Облучение и цитостатики приводят к деструкции эпителиальной выстилки тонкого кишечника (рисунок 5).

достоверно увеличился относительно группы биологического контроля на

21,4%. В группе, получавшей ФК, содержание МСМ было достоверно ниже

контрольных значений на 24%. Уровень МСМ в группе, получавшей мексидол,

не имел достоверных отличий от контрольных значений (таблица 3).

Таблица 3- Содержание молекул средней массы в плазме крови крыс, облучённых дозой 5,5 Гр и при введении циклофосфамида (п=6)

Группа животных Е/л Группа животных Е/л

Биологический контроль 0,222±0,018 Биологический контроль 0,280±0,020

Облучённый контроль 0,344±0,016# Циклофосфамид, 200 мг/кг 0,340±0,016#

ФК, 200 мг/кг 0,234±0,010 * @ ФК, 100 мг/кг 0,280±0,020 *

Цистамин, 100 мг/кг 0,268+0,012 * Мексидол, 50 мг/кг 0,300±0,015

Примечание.

Достоверно относительно: # - биологического контроля, * - контроля, @ - цистамин

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ФК эффективно

предотвращает развитие синдрома эндогенной интоксикации, снижая

интенсивность протеолиза белков и накопления среднемолекулярных пептидов.

Состояние процессов перекисного окисления липидов можно оценить по

уровню МДА (таблица 4).

Таблица 4- Содержание в сыворотке крови малонового диальдегида у крыс, пораженных у-нзлучением и при введении циклофосфамида (п=6)

Группа Содержание МДА, мкмоль/л Группа Содержание МДА, мкмоль/л

Биологический контроль 3,22±0Д4 Биологический контроль 2,80±0,14

Облучённый контроль (2,0 Гр) 6,25±0,16# Циклофосфамид, 200 мг/кг 4,20±0,16#

ФК, 200 мг/кг 4,66±0,28# * @ ФК, 100 мг/кг 3,20±0,21 *

Цистамин, 100 мг/кг 5,43±0,21# * Мексидол, 50 мг/кг 3,40±0,16# *

Примечание.

Достоверно относительно: # - биологического контроля, * - контроля, @ - цистомина

Результаты экспериментов показали, что облучение животных у-лучами даже в малых дозах приводит к достоверному повышению МДА. ФК достоверно относительно контроля и цистамина снижает содержание МДА, препятствуя развитию процессов ПОЛ у облучённых животных.

Максимальное накопление МДА при введении ЦФ наблюдается на 10-й день после введения цитостатика. Содержание МДА в контрольной группе в данный экспериментальный период повысилось на 50% по сравнению с биологическим контролем. В группе, получавшей ФК, содержание МДА было снижено на 23,8% но сравнению с контролем, что свидетельствует о стимуляции антиоксидантной защиты клеток. По данному показателю действие ФК превосходило активность препаратов сравнения как при облучении, так и при воздействии ЦФ.

Изучение влияния кислоты феруловой на гематолог,™™«. „ Штогещгтеские показатели. Оценку состояния красного костного мозга при облучении и введении цитостатиков проводили методом подсчета общего количества миелокариоцитов и полихроматофилов с микроядрами.

Цитотоксическое повреждение приводит к значительному повышению в костном мозге количества полихроматофилов с микроядрами. При применении ФК на фоне ЦФ и облучения (2,0 Гр) содержание полихроматофилов с микроядрами в костном мозге снизилось до 68,5% и 59,7% относительно контроля соответственно, что свидетельствует о выраженной антимутагенной активности, позволяющей предотвратить нарушение хода клеточного деления и накопление клеток с патологическими митозами.

При облучении и введении цитостатиков значительно уменьшается количество миелокариоцитов в костном мозге (рисунок 6).

ФК способствовала регенерации клеток костного мозга, что выражалось повышением содержания миелокариоцитов как при облучении, так и воздействии цитостатиками.

Критерием оценки влияния ФК на лейкоцитарное и эритроцитарное звенья гемопоэза служило изменение картины периферической крови.

22

в"™ 11300

| 800 ?

2 600 2

| 400 а

I -00 )'

5

| 0 1

ш Биологический контроль ■ КонтрольЦФ

» Мексндол 50 мг/кг я Контроль облучение Цнстамш 100 мг/кг

аийюшЯг

2 ФК 1.00 мг/кг (ЦФ) ЯФК 200 мг/кг (облучение)

Примечание.

Достоверно относительно: # - биологического контроля, * - контроля, @ - цистамина Рисунок 6 - Влияние кислоты феруловой на содержание миелокариоцитов при воздействии циклофосфамида (200 мг/кг) и облучении (5,5 Гр) (п=6)

Наиболее реактивной среди клеток периферической крови является

лейкоцитарная фракция. На фоне действия ФК общее количество лейкоцитов

достоверно превышало контрольные значения при воздействии радиации и

цитостатиков (рисунок 7).

щои

100,00

80,00

«КИ-

ЛОЙ- «Ж

20,00 ООО ||р|

7-й день

14-й день

Я Биологический контроль йФК 100 мг/кг

* *

21-В день

■ Контроль з Цветами ЮОшткг

28-й девь

Примечание.

Достоверно относительно: # - биологического контроля, * - контроля

Рисунок 7 - Антилейкопеническое действие кислоты феруловой на примере анализа изменения содержания лейкоцитов периферической крови при облучении (2,0 Гр) (п=6)

Активность ФК при облучении (2,0 Гр) достоверно превосходила антилейкопеническое действие цистамина. ФК способствовала увеличению общего количества лейкоцитов при поражении ЦФ на 20,8% и 5-ФУ на 27,0% по сравнению с контролем за счет повышения количества нейтрофилов и моноцитов периферической крови. По степени коррекции лейкопенического действия ФК превосходила мексидол.

Воздействие облучения и цитостатиков приводит к подавлению эритропоэза и снижению общей резистентности за счёт уменьшения процента высокоустойчивых эритроцитов, поэтому в контрольной группе животных пик эритрограммы значительно смещен влево (рисунок 8).

"♦—Биологический контроль

*'%Г'КОЕГГрегЛЬ

-ЯС-ФК 100

-Х-Мексцдол 50

время, мин

Рисунок 8 - Влияние кислоты феруловой на кислотную резистентность эритроцитов на примере токсического повреждения ииклофосфамидом (п=6)

На фоне действия ФК наблюдается сдвиг пика эритрограммы вправо, что является показателем активации процессов регенерации эритроидного ростка гемопоэза, сопровождающейся повышением содержания в крови эритроцитов с высокой резистентностью.

Объективным показателем интенсивности регенерации эритроидного ростка костного мозга является изменение количества ретикулоцитов периферической крови. Наблюдение за динамикой изменения содержания ретикулоцитов проводили при введении цитостатиков.

В контрольных группах, получавших ЦФ и 5-ФУ, на 7-й день эксперимента количество ретикулоцитов снизилось до 7,6% и 8,3% от исходного уровня соответственно. В группе, получавшей ФК, количество ретикулоцитов на фоне ЦФ возросло на 56,8%, а на фоне 5-ФУ - на 62,0% относительно контроля. Динамика восстановления эритроидного ростка кроветворения под влиянием мексидола не отличалась от таковой в контроле.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ФК оказывает выраженное стимулирующее действие на процесс регенерации как эритроцитарного, так и лейкоцитарного звеньев гемопоэза, превосходя по данному показателю активность препаратов сравнения. Предполагаемый механизм цитопротекторного действия связан как с непосредственным блокированием перекисных процессов мембран в условиях массированной свободнорадикальной атаки при облучении, так и с более долгосрочными эффектами, направленными на стимуляцию регенерации за счет сохранения стволовых структур обновления.

Влияние кислоты феруловой на гистоморфологическую структуру тимуса и селезенки. При облучении и поражении цитостатиками наблюдается падение масса лимфоидных органов. В тимусе наблюдается значительное клеточное опустошение, корковое и мозговое вещество слабо дифференцированы. Лимфоциты немногочисленны и расположены отдельными очаговыми скоплениями.

В селезенке значительно снижается клеточность красной пульпы. Размер фолликулов белой пульпы уменьшается, Т- и В-зоны в ней не дифференцируются. При облучении размер белой пульпы уменьшается на 62,8% относительно биологического контроля.

ФК способствовала ускорению регенерации селезенки и тимуса, сохранению их массы и морфологической структуры. Применение ФК на фоне лучевого поражения достоверно относительно контроля увеличивало размер белой пульпы селезенки на 32%. Цитопротекторный эффект ФК по данному показателю не уступал препаратам сравнения.

Полученные результаты гистоморфологических исследований подтверждают высокую степень цитопротекторной активности ФК по отношению к лимфоидным органам.

Влияние кислоты феруловой на гистоморфологическую структуру семенников. Весьма чувствительны к воздействию цитотоксических агентов половые железы. Облучение животных в дозе 5,5 Гр или введение цитостатиков приводит к истончению стенок семенных канальцев, исчезновению базофилии клеток, что свидетельствует о разрушении хромосомного аппарата ядер. Уменьшается клеточная плотность сперматогенного эпителия, зрелые сперматозоиды отсутствуют полностью (рисунок 9).

г' * ' ' *'

А * 1 "Б

Рисунок 9 - Цитопротекторная активность кислоты феруловой в отношении сперматогенного эпителия на примере поражения циклофосфамидом: А - ЦФ, Б - ФК на фоне ЦФ

Анализ гистоморфологической структуры семенников крыс, ^получавших ФК на фоне облучения и поражения цитостатиками, показал, что в семенниках сохранен сперматогенный слой. В нем различимы клетки на всех стадиях дифференцировки: сперматогонии, сперматоциты, сперматиды. В центральной зоне среза семенного канальца содержатся зрелые сперматозоиды (рисунок 9).

Таким образом, ФК препятствует деструктивным изменениям в семенниках, способствует сохранению их гистологической структуры, и, как следствие, репродуктивной функции животных.

5. Изучение гепатопротекгориой активности кислоты феруловой при экспериментальном токсическом поражении печени тетрахлорметаиом

Объективными показателями, отражающими фунциональное состояние печени являются: активность трансаминаз (преимущественно АлАт), а также активность щелочной фосфатазы, содержание билирубина, холестерина глюкозы, При СС^-поражении печени в контрольной группе наблюдалось повышение активности АлАт по сравнению со значениями биологического контроля в 5 раз, что свидетельствует о развитии цитолитического синдрома. Развитие холестаза подтверждается значительным повышением активности ЩФ (в 8,32 раза) и содержанием в крови билирубина (в 1,43 раза). Наблюдалось также повышение общего холестерина (в 3 раза) и снижение содержания глюкозы (в 1,27 раза).

Профилактическое применение ФК на 21-день привело к достоверному

по сравнению с контролем снижению активности АлАт в сыворотке крови в 5,7

раза, ЩФ - в 1,6 раза, содержания холестерина - в 1,95 раза, повышению уровня глюкозы - в 1,4 раза.

Таким образом, применение ФК на фоне воспроизведения модели острого поражения печени СС14 способствует нормализации биохимических показателей, что позволяет предполагать наличие гепатопротекторных свойств у изучаемого соединения.

Для подтверждения антиоксидантных свойств ФК определяли ее влияние на процессы ПОЛ в тканях печени. Под действием СС14 содержание МДА увеличилось на 73,3% от биологического контроля. Содержание МДА в гомогенате печени крыс, получавших силибор, достоверно снизилось по сравнению с контролем на 8,5%. В группе, получавшей ФК, содержание МДА снизилось на 29,3%, что достоверно как относительно контроля, так и группы, получавшей препарат сравнения.

Снижение содержания МДА в группе животных с ФК свидетельствует о торможении перекисных процессов в гепатоцитах, индуцированных введением

СС14, И подтверждает, что в механизме защитного действия ФК имеют место антирадикальные процессы.

Цитопротекторная активность ФК по отношению к гепатоцитам отражается на морфологической картине печени. В группе животных, отравленных СС14, наблюдается крупнокапельная жировая дистрофия гепатоцитов с образованием жировых кист. Ядра клеток смещены на периферию и находятся в фазе кариорексиса и кариолизиса. Часть гепатоцитов некротизирована. Признаков развития цирротических изменений на данном этапе токсического поражения не наблюдается.

На гистологических срезах печени крыс, получающих лечение ФК, крупнокапельная жировая дистрофия и жировые кисты отсутствуют. Ядра в гепатоцитах округлой формы (рисунок 10).

А Б

Рисунок 10 - Гистологическая картина печени: А - на фоне СС14, Б - ФК на фоне СС14

Подсчет некротизированных гепатоцитов показал, что профилактическое применение ФК и силибора значительно снижает процесс разрушения гепатоцитов. В группе животных, отравленных СС14, на фоне ФК количество некротизированных гепатоцитов снизилось на 27,4%. Данные достоверны относительно контрольных значений (таблица 5).

28

— - ф- «СТ.,,»

Группы % некротизированных гепатоцитов

CCI 4 (контроль) 37,6 ±3,21

ССЦ+ силибор (30 мг/кг) 16,8 ±2,93*

ССЦ+ФК (30 мг/кг) тшечание. 10,2±1,54*

Достоверно относительно: * - контроля

Приведенные данные свидетельствуют о том, что ФК оказывает цитопротекторньш эффект в условиях токсического повреждения печени CCI,

6. Изучение нсйропротекторной активности кислоты феруловой „ условиях ишемического повреждения головного мозга

сосудов. С целью изучения одного из механизмов нейропротекторного действия ФК было проведено исследование влияния данного соединения на мозговой кровоток и сопротивление сосудов методами водородного клиренса и доплерографии.

В ходе эксперимента установлено, что средняя объемная скорость мозгового кровотока и сопротивление сосудов мозга на фоне действия ФК не имеют статистически достоверных отличий от значений контрольной группы.

Активация

агрегации тромбоцитов является пусковым механизмом в микротромбообразовании в условиях ишемии, что приводит к нарушению микроциркуляцни в ткани мозга (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). ФК обладает способностью снижать образование проагрегантных факторов путем подавления цикла арахидоновой кислоты в тромбоцитах (L.N. Xu [et al.], 1990), поэтому можно предположить, что ФК может оказывать ингибир'ующее влияние на процессы свертывания крови. Скорость свертывания под влиянием ФК изучали с использованием крови крыс in vitro.

Установлено, что ФК отодвигает начало свертывания крови на 21,67 сек и увеличивает время свертывания крови на 26,59%, что достоверно относительно контроля и значений группы, получавшей кавинтон.

Таким образом можно предположить, что установленный характер влияния ФК на реологические свойства крови будет способствовать снижению риска тромбообразования при ишемии головного мозга

Развитие постишемического отека мозга и активность антиоксидаитной системы при ишемии мозга. Одним из механизмов реперфузионного повреждения ткани мозга в постишемическом периоде является развитие цитотоксического отека, связанного с накоплением осмотически активных веществ и лактатацидозом. Феномен «невосстановленного кровотока» поддерживается за счет изменения реологических свойств крови, накопления провоспалительных факторов, развития оксидантного стресса, сдавления капилляров отечными астроцитами, формирования отечности эндотелия сосудов.

Для оценки влияния изучаемого соединения на процессы свободнорадикального окисления и развития воспаления в ткани мозга использовали модель ишемии, вызванной гравитационными перегрузками в кранио-каудальном направлении, которая характеризуется наличием этапа реперфузионного повреждения.

Экспериментальное исследование показало, что введение ФК за час до глобальной преходящей ишемии мозга достоверно относительно контроля и препаратов сравнения препятствует развитию отека в ткани мозга (рисунок 11).

При ишемических повреждениях мозга резко возрастает интенсивность свободнорадикального окисления, что отражается на активности антиоксидантных ферментов, в частности, каталазы (рисунок 12).

При лечебном (более чем в 3 раза) и профилактическом применении ФК наблюдалось достоверное повышение активности каталазы относительно контроля и препаратов сравнения, что является свидетельством

интенсификации внутриклеточной антиоксидантной защиты в условиях реперфузионного повреждения головного мозга.

¡5 Биологический контроль 9 Кштрсшь

2 4*: (врофкщтяесгаг) ¿0 «ш .V ФК (лечебно) 30 мг.'кг » Кипто 3,2 мг/кг « Ямвчяши » и»

Примечание.

Достоверно относительно: # - биологического контроля, * - @ -твинтона

& - циннаризина

Рисунок 11 - Влияние кислоты феруловой на степень выраженности

отека головного мозга при ишемии (п=6)

*

@

.......-............................................................&.........-........—-------------------------------------

Биологический контроль В Контроль

ё ФК (профилактически) 30 мг/кг г: ФК (лечебно) 30 мг/кг * Кавинтон 3.2 мг/кг а Днннг^изнн 5,2 мг/кг

Примечание.

Достоверно относительно: *-контроля, @ -кавинтона, &- циннаризина

Рисунок 12 - Влияние кислоты феруловой на активность каталазы в мозге ишемнзированных крыс (п=6)

Содержание МДА в контрольной группе повысилось на 132% относительно биологического контроля. При лечебном применении ФК этот показатель достоверно снизился на 88%, но не имел достоверных отличий от групп, получавших ФК профилактически и препараты сравнения - кавинтон и циннаризин (рисунок 13).

■Биологический контроль ВКонгроль й ФК (профилактически) 30 мг/кг ?? ФК (лечебно) 30 мг/кг « Кавинтон 3,2 мг/кг Ш Цшшаризнн 5,2 ыг/кг

Примечание.

Достоверно относительно: * - контроля

Рисунок 13 - Влияние кислоты феруловой на содержание малонового диальдегида в мозге ишемизированных крыс (п=6)

Из проведенных исследований следует, что при ишемии, созданной гравитационными перегрузками, введение ФК подавляет перекисное окисление, что подтверждено уменьшением содержания МДА, повышением уровня каталазы и уменьшением отека мозга.

Метаболизм глюкозы в ткани мозга при фокальной ишемии и в норме Ишемия головного мозга приводит к угнетению кислородного этапа окисления глюкозы и развитию энергодефицита нервной ткани. В результате

происходит накопление лактата, что является причиной лактатацидоза и одним из механизмов повреждения ишемизированной ткани.

При фокальной ишемии мозга через сутки после окклюзии средней мозговой артерии наблюдается повышение потребления глюкозы тканью мозга и увеличение образования молочной кислоты. Результаты исследования влияния ФК на обмен глюкозы и молочной кислоты в мозге крыс в условиях фокальной ишемии мозга представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Влияние кислоты феруловой на метаболизм глюкозы и молочной кислоты в ткани мозга крыс при фокальной ишемии мозга и в

иппша /п—АI

Группы Потребление глюкозы ммоль/100г в мин (х10 3) Образование лактата ммоль/ЮОг в мин(х103)

Биологический контроль (физ. раствор) 2,17±0,06 0,18±0,05

Контроль (ишемия) 3,26±0,22# 7,45±0,52#

ФК, 30 мг/кг 7,54±0,84* @ & 1,5б±1,81* &

Кавинтон 3,2 мг/кг 11,43±1,01* 1,24±2,26*

Циннаризин 5,2 мг/кг Примечание. 1,83±0,89* -15,01±3,30*

Достоверно относительно: # - биологического контроля, & - цгтнаризина

- контроля, @ -кавинтона,

Введение ФК животным на модели фокальной ишемии увеличивало потребление мозгом глюкозы относительно контроля в 2,3 раза, уступая кавинтону и превосходя циннарнзин. ФК уменьшала образование молочной кислоты достоверно по отношению к контрольной группе в 4,8 раза. По влиянию на окисление молочной кислоты эффект ФК сопоставим с кавинтоном, но уступал циннаризину.

Таким образом, введение ФК и кавинтона увеличивает потребление глюкозы и уменьшает образование лактата. Введение циннаризина не приводит к достоверному изменению потребления глюкозы, однако интенсифицирует окисление лактата, образовавшегося в мозге и поступающего с артериальной кровью.

Влияние кислоты феруловой на объем зоны некроза при фокальной ишемии мозга. Антиоксидантные и цитопротекторные свойства ФК дают основание предполагать, что в условиях ишемии, моделированной методом постоянной окклюзии средней мозговой артерии, ее введение будет способствовать уменьшению зоны некроза нервной ткани (рисунок 14).

Примечание.

Достоверно относительно: * - контроля, кавинтона Рисунок 14 - Влияние кислоты феруловой, кавинтона и циннаризина на объем зоны некроза мозга (п=6)

Полученные экспериментальные данные доказывают

церебропротекторную активность изучаемого соединения, так как лечебное введение ФК уменьшало зону некроза в 3 раза относительно контрольных значений и значений группы, получавшей кавинтон. Циннаризин способствовал достоверному уменьшению зоны некроза по сравнению с контрольной группой в 2 раза, а кавинтон в 1,5 раза.

Влияние кислоты феруловой на функциональное состояние мозга при ишемии. Проявления неврологического дефицита при ишемии мозга у животных выражаются в изменении поведения, нарушении памяти, координации движений, процессов обучения и воспроизведения навыков.

Результаты изучения влияния ФК на неврологический статус в условиях ишемии мозга показали, что при билатеральной окклюзии общих сонных артерий профилактическое введение ФК повышало двигательную и исследовательскую активность достоверно по отношению к циннаризину. При ишемии мозга, вызванной гравитационными перегрузками, ФК оказала более выраженную коррекцию неврологического дефицита при лечебном применении, что может быть связано с развитием реперфузионного повреждения. Введение ФК при моделировании ишемии путем билатеральной окклюзии общих сонных артерий способствовало снижению времени экстраполяционного избавления, повышало способность животных удерживать в памяти и воспроизводить условный рефлекс в тесте УРПИ, а также скорость восстановления координации движений и равновесия в тесте «Вращающийся стержень». В тестах «УРПИ» и «вращающийся стержень» активность ФК была достоверно выше препаратов сравнения.

В целом, как лечебное, так и профилактическое применение ФК способствовало нормализации показателей неврологического статуса животных. Однако, при билатеральной окклюзии сонных артерий профилактическое применение ФК наиболее эффективно способствует восстановлению показателей неврологического статуса. При гравитационных перегрузках, в связи с эффектом реперфузионного повреждения, лечебное применение ФК по ряду показателей проявило более выраженный эффект.

Заключение

Опыт широкого применения антиоксидантов в медицинской практике ставит новые вопросы о механизмах действия и адекватности их применения для профилактики и лечения.

Анализ патогенеза различных заболеваний однозначно свидетельствует о наличии единого механизма цитотоксического повреждения, который заключается в инициации свободнорадикального перекисного окисления липидов мембран, приводящего к гибели клеток.

Производные коричной кислоты обладают широким спектром биологической активности, в том числе антиоксидантной.

Экспериментально установлено, что цитопротекторная активность производных коричной кислоты находится в прямой пропорциональной зависимости от степени их антиоксидантной активности, а антиоксидантная -зависит от структуры молекулы. При этом наиболее выраженную антиоксидантную и цитопротекторную активность проявила кислота феруловая. Структурная формула кислоты феруловой определяет ее способность выступать в качестве ловушки свободных радикалов и ингибировать свободнорадикальное перекисное окисление.

Вследствие этого большой интерес представляло комплексное изучение степени протекторной активности данного соединения по отношению к тканям с различной способностью к регенерации и его системном выражении (лабильные, стабильные, статические).

Выбор тканей, основанный на их способности к регенерации, позволяет оценить степень и характер протекции изучаемого соединения не только с учетом их физиологических особенностей, но и масштаба деструктивных процессов, вызванных экспериментальным моделированием повреждения.

В собственных исследованиях была подтверждена способность кислоты феруловой повышать выживаемость животных при однократном общем облучении в дозе 5,5 Гр, введении циклофосфамида (200 мг/кт) и 5-фторурацила (125 мг/кг), поражении животных тетрахлорметаном и ишемиях мозга.

Ионизирующая радиация и противоопухолевые цитостатические лекарственные препараты в первую очередь повреждают органы, обладающие высокой скоростью регенерации: костный мозг, эпителий кишечника, органы репродуктивной системы, лимфоидные органы (тимус и селезенка).

Результаты экспериментальной работы показали, что при воздействии облучения и цитостатических лекарственных препаратов кислота феруловая проявила выраженное миелопротекторное и антимутагенное действие, что

привело к интенсификации качественного и количественного восстановления состава периферической крови. Кислота феруловая проявила способность снижать степень эндогенной интоксикации, оценку которой вели по накоплению молекул средней массы и малонового диальдегида в плазме крови.

Цитопротекторная активность кислоты феруловой в условиях цитотоксического поражения способствовала сохранению структурной и функциональной целостности клеток-мишеней, что подтверждается результатами гистоморфологических исследований «критических» органов: тимуса, селезенки, эпителия тонкого кишечника и семенников.

Кислота феруловая проявила высокую степень гепатопротекторной активности в условиях экспериментального поражения печени ССЦ. Это выразилось в достоверном уменьшении по сравнению с контролем активности АлАт, щелочной фосфатазы, содержания МДА. Гистоморфологические исследования печени показали, что количество некротизированных гепатоцитов при применении кислоты феруловой на фоне СО«-гепатита снизилось на 27,4% по сравнению с контрольной группой.

Исследуемое соединение проявило нейропротекторную активность при различных видах ишемий. Это выразилось в стабилизации неврологического статуса животных, уменьшении содержания МДА, отека мозга, зоны некроза, увеличении активности каталазы, интенсификации аэробного этапа окисления глюкозы в ткани мозга.

Экспериментально установлено, что кислота феруловая не влияет на объемный мозговой кровоток и сопротивление сосудов мозга, что доказывает цитопротекторный механизм действия, основанный на активации внутриклеточных механизмов восстановления и защиты.

Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что воздействуя на ключевой этап патогенеза, антооксиданты способны предотвращать деструкцию тканей, сохраняя структурную и функциональную активность системы, и ускорять регенерацию тканей, защищая стволовые

структуры обновления. Эти позволяет значительно корректировать сдвиги параметров тканевого гомеостаза в условиях цитотоксического повреждения.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Установлена корреляционная зависимость между структурой, антиоксидантной и антигемолитической активностью 27 синтетических производных коричной кислоты (in vitro); выявлено наиболее активное соединение, проявляющее антиоксидантные и цитопротекторные свойства - кислота феруловая: 4'-гидрокси З'-метоксифенилпропеновая кислота.

2. Кислота феруловая относится к практически нетоксичным веществам (5-й класс по классификации К.К.Сидорова, LD50 1520 мг/кг). Изучение хронической токсичности показало, что 30-дневное применение кислоты феруловой в дозах 30 мг/кг и 100 мг/кг, не вызывает отклонений по большинству изучаемых клинических и функциональных показателей относительно физиологической нормы, однако в токсической дозе (100 мг/кг) наблюдаются биохимические признаки гепатотоксичности.

3. На четырех моделях повреждения установлены эффективные дозы кислоты феруловой: при однократном общем облучении - 200 мг/кг, действии цитостатиков - 100 мг/кг, остром поражении печени СС14 - 30 мг/кг, ишемии мозга - 30 мг/ кг.

4. Кислота феруловая не снижает противоопухолевый эффект циклофосфамида и 5-фторурацила на культурах опухолевых линий лимфосаркомы Плисса и карциномы шейки матки, сублинии HeLa (in vitro).

5. Кислота феруловая способствует восстановлению количества миелокариоцитов костного мозга после апластического состояния, вызванного воздействием ионизирующей радиации и цитостатиков, стимулируя лейкоцитарное и эритроцитарное звенья гемопоэза. По степени протекторного действия на стволовые клетки кислота феруловая не уступает препаратам сравнения: цистамину и мексидолу.

6. При профилактическом применении кислоты феруловой на фоне облучения и введения циклофосфамида содержание полихроматофилов с микроядрами в костном мозге снизилось относительно контроля до 59,7% и 68,5% соответственно, что свидетельствует 0 выражений антимутагенной активности изучаемого соединения.

7. Кислота феруловая при лучевом поражении и действии цитостатиков достоверно относительно контроля и препаратов сравнения способствует снижению содержания молекул средней массы, предотвращая развитие синдрома эндогенной интоксикации, и малонового диальдегида, что свидетельствует о стимуляции антиоксидантной защиты клеток.

8. При остром токсическом поражении печени, вызванном введением тетрахлорметана, кислота феруловая способствует нормализации таких биохимических показателей крови, как: активность АлАт, ЩФ, содержание холестерина, уровень глюкозы, а также сдерживает накопление МДА в гомогенате печени крыс, превосходя показатели препарата сравнения.

9- При остром СС14 поражении печени кислота феруловая уменьшает количество некротизированных гепатоцитов на 27,4%.

10. Кислота феруловая способствует сохранению гистоморфолошческой

структуры органов, наиболее чувствительных к физическим и химическим

повреждающим факторам: тонкого кишечника, тимуса, селезенки,

семенников (при облучении и введении цитостатиков), печени (при введении CCL,).

П.Кислота феруловая (in vitro) отодвигает начало свертывания крови на 21,67 сек, увеличивает время свертывания крови на 26,59% относительно контроля, что снижает риск, связанный с тромбообразованием при острых и хронических формах ишемии.

12. На модели глобальной преходящей ишемии мозга кислота феруловая уменьшает отек мозга, снижает уровень МДА, повышает активность каталазы, тормозя свободнорадикальное окисление и активируя антиоксидантную защиту в постишемическом периоде.

13. На модели фокальной ишемии мозга, вызванной окклюзией средней мозговой артерии, кислота феруловая увеличивает потребление глюкозы мозгом, активируя окисление молочной кислоты, и уменьшает зону некроза в три раза по сравнению с контролем.

14. Кислота феруловая улучшает неврологический статус животных в тестах «открытое поле», «экстраполяционное избавление», «УРПИ», «вращающийся стержень» на моделях билатеральной окклюзии общих сонных артерий и гравитационных перегрузок в кранио-каудальном направлении.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

- монография:

1. Назарова, Л.Е. Активность кислоты феруловой в условиях цитотоксического повреждения / Л.Е.Назарова, М.А.Оганова, И.Л Абисалова Пятигорск: ООО РИА на КМВ, 2010. - 115 с. Ва'

-работы, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

2. Назарова, Л.Е. Влияние кислоты феруловой на систему крови v обл^енных крыс / Л.Е.Назарова, И.Л. Абисалова // Весгн. Воронеж, гос'ун та" серия. Химия. Биология. Фармация. - 2006. - №> 2. - С. 325-326

.3' 0га«ова> М-А- Динамика изменения общего количества лейкоцитов периферической крови при введении циклофосфамида на фоне действия кисло™ феруловой/М.А. Оганова, Л.Е. Назарова //Вестн. BopoSrocун-та серия: Химия. Биология. Фармация. - 2006. - № 2. - С. 330-331

п_ДьЯК0Ва' ИЛ- Влияние кисл°™ феруловой на неврологический статус крыс в норме и при ишемии, вызванной билатеральной перевязкой общих сонных артерий / И.Н.Дьякова, ЛЕ.Назарова // Изв вуТов Сев Кавк.регион. Естественные науки,- Фармакология. - 2006. - Спецвып - С 70-72' Назарова, Л.Е. Влияние новых производных коричной кислоты на

токГГ6 ЛК0ВЫХ ФРГИЙ В СЫВ°р0ТКе КР°ВИ КРЫС с эксперимент^^ токсическим гепатитом / Л.Е.Назарова, Ю.А. Огурцов // Изв. вузов Сев

Кавк.регион. Естественные науки,- Фармакология. - 2006. - Спецвып - С 72-74

6. Назарова, Л.Е. Влияние кислоты феруловой на развитие

ишемического отека, активность каталазы и содержание маГноош

диальдегида в мозге крыс / ЛЕ.Назарова, И.Н Дьякова // Изв. вузов Се7

Кавк.регион. Естественные науки,- Фармакология. - 2006. - Спецвып,-С. 74-76.'

токсическим гепатитом / Ю.А.Огурцов, Л.Б. Назарова // Изв. вузов Сев. Кавк.регион. Естественные науки.- Фармакология. - 2006. - Спецвып.- С. 76-77.

8. Назарова, JI.E. Динамика изменения общего количества лейкоцитов периферической крови у крыс при введении 5-фторурацила на фоне действия кислоты феруловой / Л.Е.Назарова, М.А. Оганова // Мед.науки. - 2007. - 5 -С. 21-23.

9. Оганова, М.А. Экспериментальное изучение динамики изменения содержания ретикулоцитов и гемоглобина периферической крови при введении 5-фторурацила на фоне действия кислоты феруловой / М.А.Оганова, J1.E. Назарова // Науч. обозрение. - 2007. - № 5. - С. 41-44.

10. Оганова, М.А. Экспериментальное изучение влияния кислоты феруловой на динамику изменения количества миелокариоцитов при введении циклофосфамида / М.А. Оганова, Л.Е. Назарова // Изв. вузов Сев. Кавк.регион. Естественные науки.- Фармакология. - 2007. - Спецвып. - С. 57-59.

11. Назарова, JI.E. Влияние 5-фторурацила на динамику изменения массы органов триады Селье на фоне действия феруловой кислоты / Л.Е.Назарова, М.А. Оганова // Экология и здоровье человека: материалы XII конгр. - Самара, 2007. - Т.2. - Спец.вып. - С. 66-69.

12. Оганова, М.А. Экспериментальное изучение влияния кислоты феруловой на динамику изменения количества миелокариоцитов при введении массивных доз 5-фторурацила / М.А.Оганова, Л.Е.Назарова // Вестник РУДН Серия: Медицина. - 2007. - № 6. - С. 276-278.

13. Воспроизведение геморрагического инсульта в эксперименте / М.Д.Гаевый, Л.Е.Назарова, Л.Д.Гаевая [и др.] Н Пат. физиология и эксперим терапия. - 2008. - № 2. - С. 7-8.

14. Оганова, М.А. Влияние кислоты феруловой на динамику изменения лейкоцитарной формулы при введении 5-фторурацила /М.А.Оганова, Л.Е. Назарова //Клинич. фармакология и терапия. - 2010. - № 6. - С. 74-76.

15. Назарова, Л.Е. Влияние кислоты феруловой на динамику изменения лейкоцитарной формулы при введении циклофосфамида / Л.Е.Назарова, М.А.Оганова // Изв. Самарского науч. центра РАН,- 2010. - Т 12 № 1(8) - С 2083-2087. '

16. Назарова, Л.Е. Влияние феруловой кислоты на зону некроза, возникающего в результате окклюзии правой средней мозговой артерии / Л.Е.Назарова, И.Н. Дьякова // Мед. вестн. Башкортостана. - 2011 - № 3 - С 133-135.

-основные работы, опубликованные в других изданиях:

17. Назарова, Л.Е. Протекторный эффект феруловой кислоты при действии на клетки модельных липидных радиотоксинов / Л-Е.Назарова, ИЛАбисалова, КХА.Огурцов // Регион.конф.по фармации, фармакологии и подготовке кадров (56; 2001; Пятигорск): материалы... - Пятигорск-Пятигорская ГФА, 2001. - С. 203.

18. Анализ зависимости антиоксидантных свойств производных 3-фенилпропеновой (коричной) кислоты от характера заместителей в её

бензольном ядре и алифатической цепи /Ю.А.Огурцов, Л.Е.Назарова, И.Л.Абисалова [и др.]. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2002. - 13 с. -Деп. в ВИНИТИ РАН 19.02.02, № 334-В.

19. Абисалова, И.Л. Радиопротекторные свойства феруловой кислоты /И.Л.Абисалова, Л.Е.Назарова, Ю.А.Огурцов. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2003. - 14 с. - Деп. в ВИНИТИ РАН 07.08.03, № 1537-В.

20. Назарова, Л.Е. Влияние феруловой кислоты и цистамина на степень эндогенной интоксикации у крыс, пораженных у-излучением / Л.Е.Назарова, И.Л.Абисалова, Ю.А. Огурцов; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2004. - Вып.59. - С. 238.

21. Назарова, Л.Е. Некоторые аспекты регуляции мозгового кровообращения /Л.Е.Назарова; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр. -Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2004. - Вып.59. - С. 300.

22. Методические аспекты экспериментального исследования церебропротекторной активности фармакологических средств / М.Д.Гаевый, Л.Е.Назарова, Ю.А.Огурцов [и др.] // Человек и лекарство: тез.докл. 11 Рос. нац. конгр. 19-23 апр. 2004 г. - М., 2004. - С. 776.

23. Абисалова, И.Л. К вопросу о радиопротекторном действии феруловой кислоты / И.Л.Абисалова, Л.Е. Назарова // Человек и лекарство: тез.докл. 12 Рос. нац. конгр. 18-22 апр. 2005 г. - М„ 2005. - С. 298.

24. Дьякова, И.Н. Влияние феруловой кислоты на выживаемость крыс при циркуляторной гипоксии / И.Н.Дьякова, Л.Е. Назарова // Человек и лекарство: тез.докл. 12 Рос. нац. конгр. 18-22 апр. 2005 г. - М., 2005. - С. 660.

25. Назарова, Л.Е. Мембраностабилизирующие свойства некоторых производных коричной кислоты / Л.Е.Назарова, М.Д.Гаевый // Человек и лекарство: тез.докл. 12 Рос. нац. конгр. 18-22 апр. 2005 г. - М„ 2005. - С. 687.

26. Дьякова, И.Н. Влияние феруловой кислоты на скорость мозгового кровотока и сопротивление сосудов мозга крыс / И.Н.Дьякова, Л.Е. Назарова // Современные проблемы фармакологии и фармации: материалы Всерос.науч.-практ.конф. 18-19 мая 2005 г. - Новосибирск: Новосибир. гос.мед.акад., 2005. -С. 284-286.

27. Назарова, Л.Е. Феруловая кислота в роли радиопротектора /Л.Е.Назарова, ИЛ. Абисалова // Современные проблемы фармакологии и фармации: материалы Всерос.науч.-практ.конф. 18-19 мая 2005 г. -Новосибирск: Новосибир. гос.мед.акад., 2005. - С. 320-322.

28. Назарова, Л.Е. Влияние феруловой кислоты и цистамина на содержание продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови крыс, пораженных у-излучением/Л.Е.Назарова, ИЛ.Абисалова //Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 9 Междунар.съезда Фитофарм - 2005 22-25 июня 2005 г.- СПб., 2005. - С. 121-122.

29. Назарова, Л.Е. Исследование эффективности радиопротекторного действия феруловой кислоты в сравнении с цистамином / Л.Е.Назарова, И.Л.

Абисалова // Тездокл.Междунар. науч.конф., посвящ.75-летию Ьреван.гос.мед.ун-та им. М.Гераци. - Ереван, 2005. - С. 273-274.

30. Гаевый, М.Д. Сравнительная характеристика методов воспроизводства острых нарушений мозгового кровообращения / М Д Гаевый Л.Е.Назарова, Л.Д. Гаевая // Тез.докл.Междунар. науч.конф., посвящ.75-летию Ьреван.гос.мед.ун-та им. М.Гераци. - Ереван, 2005.-С. 132.

31. Дьякова, И.Н. Влияние феруловой кислоты на поведение ишемизированных крыс в тесте «открытое поле» / И.Н.Дьякова, Л.Е. Назарова // Тез.докл.Междунар. науч.конф., посвящ.75-летию Ереван.гос.мед.ун-та им М.Гераци. - Ереван, 2005.- С. 170-171.

32. Огурцов, Ю.А. Поиск новых гепатопротекторов среди производных коричной кислоты / Ю.А.Огурцов, Л.Е. Назарова // Тез.докл.Междунар науч.конф., посвящ.75-летик> Ереван.гос.мед.ун-та им. М.Гераци - Епеван 2005-С. 290-291. ' н '

33. Цитопротек горное действие феруловой кислоты / Л.Е.Назарова (и др.) // Физиология и здоровье человека: науч.тр. 1 Съезда физиологов СНГ 1923 сент. 2005 г. Сочи, Дагомыс. - М.: Медицина; Здоровье, 2005. - Т. 2, № 6. -

34. Дьякова, И.Н. Влияние феруловой кислоты на поведение крыс в тесте «открытое поле» / И.Н.Дьякова, Л.Е. Назарова // Фармация и здоровье-материалы Междунар.науч.-практ.конф. 9-12 ноябр.2005 г. - Пермь- ПГФА

2005.-С. 174-175. Р 111

35. Назарова, Л.Е. Влияние феруловой кислоты на гистоморфологические изменения в семенниках облученных крыс / Л.Е.Назарова, И.Л.Абисалова, Ю.А. Огурцов; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции-сб.науч.тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2005. - Вып. 60. - С. 391.

36. Назарова, Л.Е. Влияние кислоты феруловой на гистологическую картину срезов тонкого кишечника облученных крыс / Л Е Назарова И.Л.Абисалова, Ю.А. Огурцов; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка! исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб науч тр -Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2006. - Вып. 61. - С. 370-372.

37. Дьякова, И.Н. Влияние кислоты феруловой на поведение крыс в тесте «открытое поле» в условиях ишемии мозга, вызванной билатеральной перевязкой общих сонных артерий / И.Н.Дьякова, Л.Е. Назарова; под ред М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА

2006.-Вып. 61.-С. 351-353.

38. Назарова, Л.Е. Влияние кислоты феруловой на гистологическую

картину селезенки облученных крыс / Л.Е.Назарова, И.Л.Абисалова, ЮА

Огурцов; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг

ГГ±ГаЦеВ™ЧеСК0Й Г[Р0ДУкции: сб.науч.тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2007.-Вып. 62.-С. 515-517.

39. Назарова, Л.Е. Влияние кислоты феруловой на поведение крыс в тесте «открытое поле» в норме и при ишемии мозга, возникающей в результате

гравитационных перегрузок / ЛЕ.Назарова, И.Н. Дьякова; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА,

2007. - Вып. 62.- С. 517-520.

40. Назарова, Л.Е. Влияние феруловой кислоты на лейкоцитарные фракции крови крыс, пораженных гамма-излучением / Л.Е.Назарова, И.Л.Абисапова // Аллергология и иммунология. - 2007. - Т. 8, № 1. - С. 156.

41. Оганова, М.А. Эффективность феруловой кислоты у животных с моделированными цитопениями / М.А.Оганова, Л.Е.Назарова // Аллергология и иммунология. - 2007. - Т. 8, № 1. - С. 11.

42. Влияние феруловой кислоты на морфологическую картину печени при гепатозе, вызванном тетрахлорметаном / Л.Е.Назарова [и др.]; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА,

2008. - Вып. 63. - С. 458-460.

43. Оганова, М.А. Влияние циклофосфамида и 5-фторурацила на изменение гистоморфологической структуры тонкого кишечника на фоне действия кислоты феруловой / М.А.Оганова, Ю.А.Огурцов, Л.Е.Назарова; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2008. - Вып. 63. - С. 468-470.

44. Назарова, Л.Е. Некоторые аспекты фармакологической активности феруловой кислоты /Л.Е.Назарова; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр. -Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2008. - Вып. 63,- С. 457-458.

45. Назарова, Л.Е. Изучение хронической токсичности кислоты феруловой по биохимическим показателям крови/Л.Е.Назарова, ИЛ.Абисалова, М.А.Оганова //Фармация из века в век: сб.науч.тр.науч.-практ.конф.- СПб., 2008. - С. 118-121.

46. Оганова, М.А. Влияние кислоты феруловой, мексидола и дерината на биохимические показатели крови при интоксикации циклофосфамидом и 5-фторурацилом / М.А.Оганова, Л.Е. Назарова // Фармация из века в век: сб.науч.тр.науч.-практ.конф,- СПб., 2008. - С. 121-124.

47. Назарова, Л.Е. Коррекция лейкопенического действия 5-фторурацила с помощью феруловой кислоты /Л.Е.Назарова // Человек и лекарство: тез.докл. 15 Рос. нац. конгр. 14-18 апр. 2008 г. - М., 2008. - С. 672.

48. Назарова, Л.Е. Изменение активности свертывающей системы крови на фоне действия феруловой кислоты /Л.Е.Назарова // Человек и лекарство: тез.докл. 15 Рос. нац. конгр. 14-18 апр. 2008 г. - М., 2008. - С. 672673.

49. Назарова, Л.Е. Влияние кислоты феруловой на динамику изменения общего количества нейтрофилов периферической крови при введении циклофосфамида / Л.Е.Назарова, М.А.Оганова // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 3. - С. 320-321.

„J1 OraH0B\MA Влияние Циклофосфамида и 5-фторурацила на изменение гистоморфологической структуры тонкого кишечника на фоне

пГГТрг110™ ФеРУТ°"/ М-АОга,,оса' Ю- А-Огурцов, Л.Е. Назарова; под

ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой

сб-научлр- -штигорск: штигорскзя ГФА'

Шзаров\ЛЛ Изучение влияния кислоты феруловой на уровень стресса при воздействии высоких доз цитостатиков / Л.Е.Назарова, М.А.Оганова, И.Л Абисалова // Науч.тр.2 Съезда физиологов СНГ 29-31 окт 2008 г Кишинэу, Молдова.-М.-Кишинэу:Медицина;Здоровье, 2008 -С 188-189 52. Оганова М.А. Влияние циклофосфамида и 5-фторурацила на

"Г ГНС;Г0Л'Т!0Д0ГИЧССК0Й ^Уктуры тимуса на фоне действия кислоты феруловой / М.А.Оганова, Ю.А.Огурцов, Л.Е.Назарова; под ред М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой

STST^c'SSr сбл,ауч-1р-"Штигорск: Пятигорская ГФА'

53 Оганова, М.А. Влияние циклофосфамида на изменение гистоморфологической структуры семенников на фоне действия кислоты феруловой в сравнении с мексидолом и деринатом / М.А Оганова, ЛЕ Назарова; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг

гг^г ^^ -штигорск: штаго^

54. Назарова, Л.Е. Влияние кислоты феруловой на биохимические показатели крови крыс, пораженных тетрахлормеганом / Л.Е.Назарова, И.Л.Абисалова, М.А. Оганова // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т l£

55. Назарова, Л.Е. Антигемолитическая активность кислоты феруловой в условиях цитотоксического поражения костного мозга / Л.Е.Назарова М А Оганова // Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов: тез.докл.Всерос.науч.-практ.конф -

omnefreP; ЦС"Тра Крови и эндокринологии им. В.А.Алмазова. - СПб

/010. - №2.-С. 150.

56. _ Оганова, М.А. Оценка антимутагенной активности кислоты феруловой методом микроядерного тестирования / М.А.Оганова, Л.Е.Назарова,

A.L. Лысенко // Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболевании сердца, крови и эндокринных органов: тез.докл.Всерос науч-практ.конф. - Бюл федер центра сердца, крови и эндокринологии им.

B.А.Алмазова. - СПб., 2010. - № 2. - С. 157-158.

57. ^ Назарова, Л.Е. Церебропротекторная активность кислоты феруловой при фокальной ишемии головного мозга / Л Е Назарова ИН

МгОЮ7-себ8В7еК И ЛеКарСТБ°: Те3-Д0КЛ' 17 Р0С' нац" К0НГР-12"16 апР- 2010 г. -

58. Оганова, М.А. Влияние кислоты феруловой на динамику изменения массы тела животных при введении циклофосфамида ••/ М.А.Оганова, Л.Е.

Назарова // Человек и лекарство: тез.докл. 17 Рос. нац. конгр. 12-16 апр. 2010 г. -М„ 2010.-С. 693.

59. Оганова, М.А. Влияние 5-фторурацила на изменение гистоморфологической структуры семенников на фоне действия кислоты феруловой / М.А.Оганова, Л.Е.Назарова; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр. -Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2010. - Вып. 65,- С. 480-482.

60. Назарова, Л.Е. Влияние кислоты феруловой на время свертывания крови in vitro / Л.Е.Назарова, И.Н.Дьякова; под ред. М.В.Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2011. - Вып. 66. - С. 543-544.

НАЗАРОВА ЛЮБОВЬ ЕФИМОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ КИСЛОТЫ ФЕРУЛОВОЙ

14.03.06 - ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Подписано в печать «Эч> января 2012 г. Формат 60x84/16. Бумага книжно-журнальная. Печать ротапрингная. Усл.печ.л. 2,0 Тираж 100 экз. Заказ №

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Токсические факторы окружающей среды оказывают повреждающее воздействие на клеточном уровне, вызывая развитие заболеваний различной этиологии (сердечно-сосудистые, онкологические и др). Природа и интенсивность цитотоксического воздействия определяет характер повреждения: локальный или глобальный, обратимый или необратимый, тип поражаемых органов и тканей, их способность к регенерации и т.д., что в дальнейшем будет определять тактику фармакотерапевтического воздействия.

Клетки организма характеризуются индивидуальной реакцией на повреждающие агенты. Так, при облучении и воздействии цитостатиками быстрее всего поражаются лабильные клетки с высокой скоростью регенерации - клетки «критических» систем (красный костный мозг, кишечник, лимфоидные органы, гонады). Стабильные клетки, например, гепатоциты, подвергаются поражению при химических интоксикациях или механических повреждениях. Клетки головного мозга (статические) наиболее устойчивы к различным негативным воздействиям, но могут поражаться при нарушении гематоэнцефалического барьера, различных видах ишемии.

Цитотоксическое повреждение на определенных этапах развития носит универсальный характер, стимулируя свободнорадикальное перекисное окисление. Поэтому одной из наиболее важных проблем современной медицины и биологии является поиск и разработка лекарственных средств, обладающих цитопротекторными свойствами, основанными на антиоксидантной активности изучаемых соединений.

Универсальность терапевтического действия антиоксидантов, основанная на способности подавлять свободнорадикальное перекисное окисление, позволяет предложить их в качестве активных радиопротекторов

2, 19, 161, 162]. В литературе по радиобиологии в основном представлены 8 работы, посвящённые изучению фармакологических свойств и роли механизмов противолучевой защиты препаратов, относящихся к серосодержащим соединениям, индолилалкиламинам, арилалкиламинам, производным имидазола [34, 38, 73, 74, 89], и мало уделяется внимания фенольным соединениям, обладающим антиоксидантными свойствами.

Высокая токсичность противоопухолевых лекарственных препаратов значительно лимитирует их применение и снижает эффективность лечения онкологических заболеваний. В связи с этим химиотерапия на сегодняшний день требует активного применения препаратов, способных в той или иной степени снизить выраженность побочных токсических эффектов и улучшить качество жизни пациентов [134]. Применяются стимуляторы кроветворения, препараты метаболического типа действия, симптоматическая терапия и др. [122,125, 134, 153, 171, 239, 251, 286, 287, 328, 355]. Системный характер действия антиоксидантов позволил создать новое направление в разработке препаратов сопровождения, поэтому в последние годы ведется активное исследование веществ с антиоксидантным типом действия, способных защитить наиболее чувствительные к химиотерапии клетки, не снижая эффективности основного лечения [10, 46,49, 139].

В последние годы актуальной является проблема терапии заболеваний печени токсической этиологии. Известно громадное количество гепатотоксических соединений, с которыми человек контактирует в течение всей жизни. В 30% случаев острых отравлений возникают клинические проявления химического повреждения печени [166]. Кроме того, поражения печени довольно часто развиваются у больных токсикоманией [150] и у лиц злоупотребляющих алкоголем [63, 101, 165].

Повреждения печени могут вызывать различные группы лекарственных препаратов: антибиотики [42, 181, 182], противоопухолевые

109, 133], противотуберкулезные [67, 195], нестероидные противовоспалительные [67] и др.

При различных заболеваниях печени используется довольно разнообразный ассортимент препаратов (эссенциале, эплир, липостабил, кальция пангамат, метионин, уридин, цитидин, оротовая кислота и др.) [35], но из них выделяется небольшая группа гепатопротекторов, обладающих избирательным терапевтическим действием на печень. К ним относятся легалон, силибор, эссенциале и некоторые другие препараты [125], при этом вышеперечисленные гепатопротекторы не всегда эффективны [21, 67, 116, 192]. Кроме того, на фармацевтическом рынке Российской Федерации доминируют зарубежные лекарственные средства (карсил, легалон, силибинин и др.) [207].

Таким образом, в связи с неблагоприятной экологией, распространением токсикоманий, бесконтрольным применением медикаментов, ростом потребления алкоголя, изыскание новых веществ, обладающих антиоксидантной и гепатопротекторной активностью и внедрение их в медицинскую практику, имеет социальное значение.

Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе инсульты, в настоящее время являются основными причинами смертности населения во всем мире. Ежегодно регистрируется около 20 миллионов случаев инсультов, каждый четвертый из них - смертельный. Летальность после состоявшегося ишемического инсульта составляет 20% в течение первого месяца и около 25% в течение первого года. Через 6 месяцев после инсульта инвалидизация наступает у 40% выживших больных. Преобладают ишемические поражения головного мозга. По данным международных мультицентровых исследований соотношение ишемического и геморрагического инсультов составляет 85% и 15% соответственно [168]. Применяемые до сих пор лечебные комплексы нередко оказывались малоэффективными, что обуславливает актуальность проблемы поиска и разработки новых фармакологических средств [86].

В патогенезе ишемического повреждения головного мозга, как и в ранее рассмотренных патологиях, ведущую роль играет интенсификация свободнорадикального перекисного окисления [117]. В связи с этим антиоксиданты, обладающие универсальным механизмом протекции, позволяют защитить клетки головного мозга от гибели с целью сохранения их структурной целостности и функциональной активности.

Одним из механизмов повреждения клеток является процесс образования активных форм кислорода (АФК), индуцирующих свободнорадикальное (СРО) перекисное окисление липидов (ПОЛ) мембран клеток с развитием оксидантного стресса. Любые внешние воздействия, приводящие к увеличению промежуточных продуктов восстановления кислорода, будут способствовать нарушению деятельности ферментных систем, контролирующих протекание окислительных свободнорадикальных реакций, их дисбалансу. Это приводит к резкому накоплению токсических продуктов и создает условия для проявления связанных с ними эффектов.

Образовавшиеся при усилении СРО продукты ПОЛ оказывают системное повреждающее действие на клетку: нарушают её деление, вызывают набухание, изменяют биохимические и физиологические процессы.

В настоящее время широко обсуждается роль избыточного количества АФК в развитии индуцированного апоптоза и снижении активности элементов антиоксидантной защиты клеток. С другой стороны клетки, имеющие дефекты антиоксидантной защиты, наиболее чувствительны к воздействиям, вызывающим апоптоз.

Антиоксидантная система клетки, ткани и организма в целом обеспечивает связывание и модификацию свободных радикалов, предупреждение разрушения биомолекул. Дефект в любом из звеньев

11 системы антиоксидантной защиты приводит к активации перекисного окисления. Увеличение мощности антиоксидантной защиты, обусловленное введением естественных или синтетических антиоксидантов, создает определённую гарантию против активации перекисного окисления.

В настоящее время большое внимание ученых привлекают синтетические производные коричной кислоты, многие из которых обладают антиоксидантной активностью, низкой токсичностью [8, 10 180, 201, 213] и представляют интерес в плане создания на их основе новых высокоэффективных полифункциональных лекарственных препаратов [117, 261,304,301].

Несмотря на это, до настоящего времени не была изучена зависимость между антиоксидантной и цитопротекторной активностью синтетических производных коричной кислоты, не исследовано антиоксидантное и цитопротекторное действие наиболее активных соединений по отношению к клеткам с различной скоростью регенерации после воздействия повреждающих агентов. В связи с этим, поиск новых антиоксидантов, обладающих высокой цитопротекторной активностью и низкой токсичностью, и создание на их основе эффективных лекарственных препаратов, является одной из актуальных проблем современной медицины и фармации.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Выявление в ряду синтетических производных коричной кислоты соединения с наиболее выраженной антиоксидантной активностью и оценка его цитопротекторных свойств на различных моделях повреждения.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Проведение первичного скрининга 27 синтетических производных коричной кислоты для выявления наиболее активного антиоксиданта; оценка цитопротекторной активности выбранного соединения на разных моделях (in vitro).

2. Изучение острой и хронической токсичности выбранного соединения и некоторых параметров фармакокинетики.

3. Изучение влияния выбранного соединения на цитостатическую активность циклофосфамида и 5-фторурацила (in vitro).

4. Определение выбора эффективных доз соединения по оценке выживаемости животных на четырех моделях повреждения: у-облучении, введении цитостатиков и тетрахлорметана, ишемии головного мозга;

5. Исследование радиопротекторной активности выбранного соединения на клетки «критических» систем организма (костный мозг, кровь, тонкий кишечник, селезенка, семенники) при воздействии ионизирующей радиацией.

6. Исследование цитопротекторных свойств выбранного соединения на клетки «критических» систем организма (костный мозг, кровь, тонкий кишечник, селезенка, тимус, семенники) для снижения побочных токсических эффектов цитостатиков.

7. Изучение гепатопротекторной активности выбранного соединения при экспериментальном токсическом поражении печени тетрахлорметаном.

8. Изучение нейропротекторной активности выбранного соединения при различных видах ишемии головного мозга.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В работе сформулировано положение о том, что при различных поражениях организма (облучение, интоксикация химическими веществами, ишемия) в составе комбинированной терапии должны применяться антиоксидантные соединения, обладающие

13 цитопротекторным и мембраностабилизирующим действием, защищающие генетический аппарат клеток и улучшающие внутриклеточный метаболизм.

В работе впервые:

- проведено сравнительное изучение 27 синтетических производных коричной кислоты и выявлена корреляционная взаимосвязь между их структурой, антиоксидантной и цитопротекторной активностью;

- установлено, что наиболее выраженные антиоксидантные и цитопротекторные свойства проявило соединение, имеющее в положении 4 бензольного ядра группу НО", а в положении 3 группу СН30~: транс - 4'-гидрокси-З'-метоксифенилпропеновая кислота - кислота феруловая;

- установлено, что кислота феруловая относится к практически нетоксичным веществам;

- определена зависимость «доза-эффект» кислоты феруловой на четырех моделях повреждения: у-облучении, введении цитостатиков и тетрахлорметана, ишемии головного мозга;

- изучена хроническая токсичность кислоты феруловой и установлено, что по большинству изучаемых клинических и функциональных показателей отклонений от физиологической нормы не зарегистрировано, однако в токсической дозе наблюдаются биохимические признаки гепатотоксичности;

- выявлено, что кислота феруловая не снижает цитостатическую активность циклофосфамида и 5-фторурацила по отношению к культуре опухолевых клеток линий лимфосаркомы Плисса и карциномы шейки матки, сублинии Hela (in vitro);

- установлено, что кислота феруловая при однократном общем у-облучении и воздействии цитостатиками (циклофосфамидом и 5-фторурацилом) защищает клетки тканей «критических» систем и усиливает компенсаторно-приспособительные реакции организма;

- экспериментально установлено, что при облучении и поражении цитостатиками кислота феруловая способствует регенерации клеток красного

14 костного мозга, тимуса, селезенки, тонкого кишечника, семенников, нормализации гематологических, биохимических и цитогенетических показателей;

- установлено, что кислота феруловая в условиях экспериментального тетрахлорметанового поражения нормализует гистологическую картину и функциональное состояние печени;

- доказана способность кислоты феруловой ускорять восстановление функционального состояния мозга на моделях ишемии, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий и гравитационными перегрузками в кранио-каудальном направлении;

- установлено, что кислота феруловая уменьшает отек, подавляет интенсивность перекисного окисления и активирует каталазу в ткани мозга при реперфузионном повреждении, вызванном гравитационными перегрузками в кранио-каудальном направлении;

- экспериментально доказано, что в условиях фокальной ишемии мозга кислота феруловая увеличивает потребление глюкозы мозгом, активируя окисление молочной кислоты, и уменьшает размер зоны некроза нервной ткани.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенные исследования позволили систематизировать знания о наличии корреляции между антиоксидантной и антигемолитической активностью в ряду производных коричной кислоты с различными заместителями в ароматическом ядре. Установлена зависимость антиоксидантного и цитопротекторного действия от дозы кислоты феруловой и степени моделируемого повреждения. Методологически обосновано использование кислоты феруловой в качестве цитопротекторного средства на органы-мишени и образующие их клетки. Единство механизмов развития цитотоксического повреждения, связанного с индукцией свободнорадикального перекисного окисления, определяет универсальность защитного действия кислоты феруловой.

Экспериментальные исследования подтвердили перспективность дальнейшего углубленного доклинического изучения кислоты феруловой.

По совокупности полученных экспериментальных данных кислота феруловая может быть рекомендована в качестве радиопротекторного средства, при химических поражениях печени, для снижения побочных токсических эффектов при химиотерапии цитостатическими лекарственными препаратами, а также в качестве нейропротекторного средства при ишемических повреждениях головного мозга.

В результате проведенных исследований теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность создания различных лекарственных форм на основе кислоты феруловой и их более глубокое доклиническое и клиническое тестирование.

Уровень внедрения результатов исследования

По результатам фармакологических исследований составлены и утверждены в ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России информационные письма: «Исследование цитопротекторной активности кислоты феруловой при радиационном поражении», «Фармакологическая коррекция побочных токсических эффектов циклофосфамида и 5-фторурацила с помощью кислоты феруловой», «Исследование церебропротекторной активности кислоты феруловой в условиях ишемии мозга».

На основании информационных писем ГБОУ ВПО ВолГМУ

Минздравсоцразвития России и НИИ фармакологии при ГБОУ ВПО

ВолГМУ Минздравсоцразвития России дали заключение о большой теоретической и практической ценности представленного материала и необходимости создания лекарственных препаратов на основе кислоты

16 феруловой на базе российских фармацевтических предприятий с целью расширения ассортимента отечественных оригинальных лекарственных средств.

На основании материалов информационного письма «Фармакологическая коррекция побочных токсических эффектов циклофосфамида и 5-фторурацила с помощью кислоты феруловой» в лаборатории биологических испытаний филиала ИБХ РАН г. Пущино проводятся доклинические исследования при изучении влияния кислоты феруловой на развитие токсических эффектов противоопухолевых лекарственных препаратов на животных с моделированными опухолями.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс (лекции и практические занятия) ряда кафедр Московского медикостоматологического университета, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии, Ижевской медицинской академии, Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск), Оренбургской государственной медицинской академии.

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведены планирование исследований, анализ и статистическая обработка, обобщение полученных результатов, принято участие в экспериментальных исследованиях. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования: от постановки задач и их реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и их внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология, конкретно пунктам 1, 2 и 3 паспорта специальности.

17

Апробация полученных результатов

Основные результаты работы доложены на 56-66 региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров Пятигорской ГФА (Пятигорск, 2001-2011 гг.), XIX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (М., 2004 г.), 1-м съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005 г.), международной научной конференции, посвященной 75-летию Ереванского гос. мед. ун-та (Ереван, Армения, 2005 г.). Положения, выдвигаемые на защиту

1. Сравнительная оценка 27 синтетических производных коричной кислоты выявила корреляционную зависимость между антиоксидантной активностью и цитопротекторным действием.

2. Анализ взаимосвязи «структура-активность» показал, что антиоксидантная и цитопротекторная активность изучаемых веществ зависит от характера и местоположения заместителей в ароматическом ядре.

3. Наиболее выраженные антиоксидантные и цитопротекторные свойства проявила кислота феруловая: 4'-гидрокси-3'-метоксифенилпропеновая кислота.

4. Кислота феруловая снижает выраженность токсических эффектов цитостатиков, не изменяя их цитостатической активности в отношении опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса и карциномы шейки матки, сублинии HeLa (in vitro).

5. Кислота феруловая проявляет радиопротекторное действие по отношению к «критическим» системам в условиях поражения у-лучами.

6. Кислота феруловая проявляет цитопротекторное действие по отношению к «критическим» системам, снижая побочные токсические эффекты циклофосфамида и 5-фторурацила.

7. Кислота феруловая оказывает гепатопротекторное действие в условиях экспериментального поражения гепатоцитов тетрахлорметаном.

8. Кислота феруловая обладает нейропротекторной активностью на моделях глобальной (постоянной и преходящей) и фокальной ишемий мозга.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 79 научных работ; из них монография - 1, статей в журналах, рекомендованных ВАК, 15. Общий объем научных работ - 12,415 п.л. (авторских - 9,335 пл.).

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа изложена на 288 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы (1-2 главы), описания материалов и методов исследования (3 глава), результатов собственных исследований (4-9 главы), заключения, общих выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 85 рисунками. Библиографический список включает 389 источников, из которых 215 отечественных и 174 зарубежных авторов.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Установлена корреляционная зависимость между структурой, антиоксидантной и антигемолитической активностью 27 синтетических производных коричной кислоты (in vitro); выявлено наиболее активное соединение, проявляющее антиоксидантные и цитопротекторные свойства - кислота феруловая: 4'-гидрокси З'-метоксифенилпропеновая кислота.

2. Кислота феруловая относится к практически нетоксичным веществам (5-й класс по классификации К.К.Сидорова, LD50 1520 мг/кг). Изучение хронической токсичности показало, что 30-дневное применение кислоты феруловой в дозах 30 мг/кг и 100 мг/кг, не вызывает отклонений по большинству изучаемых клинических и функциональных показателей относительно физиологической нормы, однако в токсической дозе (100 мг/кг) наблюдаются биохимические признаки гепатотоксичности.

3. На четырех моделях повреждения установлены эффективные дозы кислоты феруловой: при однократном общем облучении - 200 мг/кг, действии цитостатиков - 100 мг/кг, остром поражении печени CCI4 - 30 мг/кг, ишемии мозга - 30 мг/ кг.

4. Кислота феруловая не снижает противоопухолевый эффект циклофосфамида и 5-фторурацила на культурах опухолевых линий лимфосаркомы Плисса и карциномы шейки матки, сублинии HeLa (in vitro).

5. Кислота феруловая способствует восстановлению количества миелокариоцитов костного мозга после апластического состояния, вызванного воздействием ионизирующей радиации и цитостатиков, стимулируя лейкоцитарное и эритроцитарное звенья гемопоэза. По степени протекторного действия на стволовые клетки кислота феруловая не уступает препаратам сравнения: цистамину и мексидолу.

6. При профилактическом применении кислоты феруловой на фоне облучения и введения циклофосфамида содержание полихроматофилов с микроядрами в костном мозге снизилось относительно контроля до 59,7% и 68,5% соответственно, что свидетельствует о выраженной антимутагенной активности изучаемого соединения.

7. Кислота феруловая при лучевом поражении и действии цитостатиков достоверно относительно контроля и препаратов сравнения способствует снижению содержания молекул средней массы, предотвращая развитие синдрома эндогенной интоксикации, и малонового диальдегида, что свидетельствует о стимуляции антиоксидантной защиты клеток.

8. При остром токсическом поражении печени, вызванном введением тетрахлорметана, кислота феруловая способствует нормализации таких биохимических показателей крови, как: активность АлАт, ЩФ, содержание холестерина, уровень глюкозы, а также сдерживает накопление МДА в гомогенате печени крыс, превосходя показатели препарата сравнения.

9. При остром СС14 поражении печени кислота феруловая уменьшает количество некротизированных гепатоцитов на 27,4%.

Ю.Кислота феруловая способствует сохранению гистоморфологической структуры органов, наиболее чувствительных к физическим и химическим повреждающим факторам: тонкого кишечника, тимуса, селезенки, семенников (при облучении и введении цитостатиков), печени (при введении CCI4).

11.Кислота феруловая (in vitro) отодвигает начало свертывания крови на 21,67 сек, увеличивает время свертывания крови на 26,59% относительно контроля, что снижает риск, связанный с тромбообразованием при острых и хронических формах ишемии.

12. На модели глобальной преходящей ишемии мозга кислота феруловая уменьшает отек мозга, снижает уровень МДА, повышает активность

245 каталазы, тормозя свободнорадикальное окисление и активируя антиоксидантную защиту в постишемическом периоде.

13. На модели фокальной ишемии мозга, вызванной окклюзией средней мозговой артерии, кислота феруловая увеличивает потребление глюкозы мозгом, активируя окисление молочной кислоты, и уменьшает зону некроза в три раза по сравнению с контролем.

14. Кислота феруловая улучшает неврологический статус животных в тестах «открытое поле», «экстраполяционное избавление», «УРПИ», «вращающийся стержень» на моделях билатеральной окклюзии общих сонных артерий и гравитационных перегрузок в кранио-каудальном направлении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клетки организма характеризуются индивидуальной реакцией на повреждающие агенты. Так, при облучении и воздействии цитостатиков быстрее всего поражаются лабильные клетки с высокой скоростью регенерации - клетки «критических» систем (красный костный мозг, кишечник, лимфоидные органы, гонады). Стабильные клетки, например гепатоциты, подвергаются поражению при значительных химических интоксикациях. Клетки головного мозга (статические) наиболее устойчивы к повреждающим факторам, но могут поражаться при нарушении целостности гематоэнцефалического барьера и различных видах ишемии.

Одним из механизмов повреждения клеток является процесс образования активных форм кислорода, индуцирующих свободнорадикальное перекисное окисление липидов мембран с развитием оксидантного стресса.

Антиоксидантная система клетки, ткани и организма в целом обеспечивает связывание и модификацию свободных радикалов, предупреждение разрушения биомолекул. Дефект в любом из звеньев системы антиоксидантной защиты приводит к активации перекисного окисления. Увеличение мощности антиоксидантной защиты, обусловленное введением естественных или синтетических антиоксидантов, создает определённую гарантию против активации перекисного окисления.

Воздействуя на ключевой этап патогенеза, антиоксиданты способны в одних случаях предотвратить деструкцию тканей, сохраняя структурную и функциональную активность системы, а в других, способствуя ускорению последующей регенерации, защитить стволовые структуры, обеспечивающие обновление тканей. Эти свойства антиоксидантов позволяют значительно корректировать сдвиги параметров тканевого гомеостаза в условиях цитотоксического воздействия.

В настоящее время внимание ученых привлекают производные коричной кислоты, которые включены в метаболические циклы всех высших растений. Особенно высока их концентрация у видов, произрастающих в неблагоприятных условиях. Данный факт привлек внимание исследователей для рассмотрения этой группы соединений в качестве протекторов при различных видах повреждающих агентов, трансформировав их применение в медико-биологическом направлении с целью создания высокоэффективных лекарственных средств. Изучение химической структуры коричных кислот в растительных объектах позволило осуществить их рациональный синтез [180].

Установлено, что многие синтетические производные коричной кислоты обладают антиоксидантной активностью, низкой токсичностью [8, 10 180, 201, 213] и представляют интерес в плане создания на их основе новых высокоэффективных полифункциональных лекарственных препаратов [117,261,304,301].

Особый интерес представляет кислота феруловая (4'-гидрокси-3-метоксифенилпропеновая кислота), которая изучалась в первую очередь как вещество, проявляющее антиоксидантные свойства [141, 142, 143, 273, 283, 297, 357], но ее влияние не ограничивается только данным видом активности.

При моделировании болезни Альцгеймера кислота феруловая способствовала снижению реакции воспаления и препятствовала усилению свободнорадикального окисления в ткани мозга [229, 305, 349, 350].

Противовоспалительное действие кислоты феруловой объясняется ее способностью снижать образование свободных радикалов, которые активируют миграцию нейтрофилов в зону воспаления [304]. Имеются доказательства способности кислоты феруловой подавлять синтез проагрегантных простагландинов и агрегацию тромбоцитов, что является пусковым механизмом реакций свертывания крови, микротромбообразования

237 и нарушения микроциркуляции в ишемизированной ткани [260, 261]. Одновременное введение кислоты феруловой и натрия глутамата ингибировало поступление глутамата в мозг эмбрионов. Потомство животных, получавших феруловую кислоту, впоследствии имело менее выраженные нарушения поведения. Таким образом, можно предположить, что кислота феруловая является конкурентным антагонистом ЫМБА-рецепторов [346].

Кислота феруловая блокировала перекисное окисление липидов, белков, нуклеиновых кислот, что связано с ее способностью активировать гены системы шоковых температурных белков и гемоксигеназы-1 [273, 297], ингибировала экспрессию генов апоптоза Р 21 и Р 53, снижала активность каспазы-3 [308, 349]. Из литературных источников известно, что кислота феруловая обладает антиканцерогенными [301, 343, 345] и антитоксическими свойствами [263, 319, 372, 374, 375].

При токсических поражениях печени антиоксиданты рассматриваются как наиболее перспективная группа. Характерным и ведущим звеном патогенеза токсического поражения печени является повреждение мембран гепатоцитов, связанное с ПОЛ. На основании многочисленных литературных данных было выявлено, что кислота феруловая обладает гепатопротекторным и антитоксическим действиями [217, 311, 365, 375]. Для кислоты феруловой показана способность уменьшать побочные явления некоторых лекарственных препаратов [301, 319, 372, 374].

Анализ литературных данных позволяет предположить, что кислота феруловая, являясь антиоксидантом, способна проявлять цитопротекторный эффект в условиях повреждений различной природы.

Вследствие этого, большой интерес представляло комплексное изучение степени протекторной активности данного соединения по отношению к тканям с различной скоростью регенерации (лабильным, стабильным, статическим).

Выбор тканей, основанный на их способности к регенерации, позволяет оценить степень и характер протекции изучаемого соединения не только с учетом их физиологических особенностей, но и масштаба деструктивных процессов, вызванных экспериментальным моделированием повреждения.

В ходе наших исследований установлено, что цитопротекторная активность синтетических производных коричной кислоты находится в прямой пропорциональной зависимости от степени антиоксидантной активности соединений, а антиоксидантная - зависит от структуры молекулы.

Экспериментальные исследования показали, что наиболее активным антиоксидантом и цитопротектором является кислота феруловая. Структурная формула кислоты феруловой определяет ее способность выступать в качестве ловушки свободных радикалов и ингибировать свободнорадикальное перекисное окисление липидов.

В собственных исследованиях была подтверждена способность кислоты феруловой повышать выживаемость животных при однократном общем облучении в дозе 5,5 Гр, введении циклофосфамида (200 мг/кг) и 5-фторурацила (125 мг/кг), поражении животных тетрахлорметаном и ишемиях мозга.

Цитопротекторная активность кислоты феруловой была доказана при облучении животных гамма-лучами и введении цитостатических лекарственных препаратов: циклофосфамида и 5-фторурацила. Ионизирующая радиация и противоопухолевые цитостатические лекарственные препараты в первую очередь повреждают органы, характеризующиеся высокой скоростью пролиферации: костный мозг, эпителий кишечника, органы репродуктивной системы, лимфоидные органы (тимус и селезенка). Кроме того, они способствуют возрастанию степени эндогенной интоксикации, связанной с интенсификацией клеточной деструкции, одним из ведущих механизмов которой является перекисное окисление липидов, белков, нуклеиновых кислот [8, 139].

239

После апластического состояния, вызванного облучением и воздействием цитостатиками, кислота феруловая проявляла выраженное миелопротекторное действие, ускоряя восстановление общего числа миелокариоцитов костного мозга и, как следствие, общего количества лейкоцитов и ретикулоцитов периферической крови. По степени миелопротекторного действия кислота феруловая была более эффективна препаратов сравнения цистамина и мексидола. Результаты экспериментов показали, что кислота феруловая на фоне действия цитостатиков обеспечивала стимуляцию гранулоцитарного и моноцитарного звеньев лейкопоэза. Это проявилось в увеличении абсолютного числа нейтрофилов и моноцитов периферической крови в процессе восстановления лейкоцитарной формулы. Эффект препарата сравнения мексидола по этим показателям был значительно менее выраженным.

Кислота феруловая способствовала интенсификации процесса регенерации эритроидного ростка костного мозга эритропоэза. Это проявилось увеличением в крови количества высокорезистентных эритроцитов.

Повышение интенсивности регенерации костного мозга после на фоне действия кислоты феруловой может быть связано с ее цитопротекторной активностью в отношении стволовых клеток, а также повышением выработки колониестимулирующих факторов клетками микроокружения.

Результаты экспериментальной работы по изучению влияния кислоты феруловой на степень эндогенной интоксикации, оценку которой вели по накоплению молекул средней массы и малонового диальдегида в плазме крови, подтвердили антиоксидантый характер механизма действия исследуемого соединения, связанный с торможением процессов перекисного окисления липидов.

Микроядерный тест, позволяющий оценить антимутагенную активность, показал, что кислота феруловая способствовала снижению

240 содержания полихроматофилов с микроядрами в костном мозге, предотвращая нарушение хода клеточного деления и накопление клеток с патологическими митозами.

Гистоморфологический анализ подтвердил достоверность проведенных исследований, показав высокую степень протекции кислоты феруловой, способствующей ускорению регенерации «критических органов»: тимуса, селезенки, эпителия тонкого кишечника и семенников при однократном общем облучении и воздействии цитостатических лекарственных препаратов.

Цитопротекторная активность кислоты феруловой по отношению к стабильным тканям была доказана высокой степенью защитного действия данного соединения в условиях экспериментального токсического гепатита.

Кислота феруловая при остром поражении тетрахлорметаном способствовала нормализации биохимических параметров, отражающих функциональное состояние печени. Профилактическое применение кислоты феруловой привело к достоверному по сравнению с контролем снижению активности АлАт, щелочной фосфатазы, содержания холестерина, повышению уровня глюкозы.

Сдерживание накопления малонового диальдегида в ткани печени свидетельствует о реализации цитопротекторного действия кислоты феруловой через механизм торможения перекисного окисления липидов.

При интоксикации тетрахлорметаном кислота феруловая препятствовала гистоморфологической деструкции печени, что выражалось в снижении количества некротизированных гепатоцитов более чем на 25% относительно контроля, отсутствии крупнокапельной жировой дистрофии и жировых кист.

На моделях глобальной (постоянной и преходящей) и фокальной ишемий мозга была установлена нейропротекторная активность кислоты феруловой. Кислота феруловая в дозе 30 мг/кг увеличивала выживаемость

241 животных при билатеральной окклюзии общих сонных артерий до 70%. При фокальной ишемии мозга введение кислоты феруловой уменьшило зону некроза в 3 раза по сравнению с контролем. Кислота феруловая увеличивала потребление мозгом глюкозы и уменьшала накопление лактата при фокальной ишемии мозга и в норме.

Подтверждена способность кислоты феруловой ингибировать процессы свободнорадикального окисления и увеличивать активность антиоксидантной защиты в ишемизированной ткани мозга. Для этого использовали модель с максимальной активацией свободнорадикального окисления в постреперфузионном периоде - временной глобальной ишемии, вызванной гравитационными перегрузками в кранио-каудальном направлении. Кислота феруловая уменьшала образование малонового диальдегида и увеличивала активность каталазы. На этой же модели подтверждена способность кислоты феруловой уменьшать цитотоксический отек мозга.

Таким образом, кислота феруловая защищает ишемизированную ткань от гибели в условиях ишемии, как при фокальной ишемии, так и при ишемии всего головного мозга. Но при ишемии целого мозга структуры гиппокампальной области и клетки коры мозга страдают в первую очередь и погибают раньше, чем нейроны других отделов. Для исследования влияния кислоты феруловой на отделы мозга, которые при ишемии страдают в первую очередь, была проведена серия экспериментов по определению функционального состояния мозга. Исследования касались коры головного мозга в тестах «открытое поле», «экстраполяционное избавление», «УРПИ» и «вращающийся стержень». Введение кислоты феруловой заметно уменьшало расстройства, регистрируемые данными тестами.

Неизбирательность действия данного соединения свидетельствует о единстве механизма развития повреждения при разных моделях цитотоксического воздействия, следствием которого является индукция свободнорадикального перекисного окисления мембран клеток.

Проведенная экспериментальная работа доказала, что кислота феруловая успешно справляется с задачами цитопротекции в различных моделированных патологических условиях. Таким образом, обеспечив рациональную протекцию, можно создать оптимальные условия для осуществления естественного хода регенерации (лабильные и стабильные клетки тканей), или сохранения структурной и функциональной целостности органа при невозвожности к естественному самообновлению (статические клетки тканей).

Как показали экспериментальные исследования, на современном этапе развития медицины антиоксиданты должны включаться в комплексную терапию заболеваний различной природы (облучение, интоксикация химическими веществами, ишемия), так как они обладают цитопротекторным и мембраностабилизирующим действием, защищают генетический аппарат клеток, улучшают внутриклеточный метаболизм. Данный вид биологической активности многократно повышает эффективность лечения основного заболевания специфическими лекарственными препаратами, нивелируя в некоторых случаях их токсические эффекты.