Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение пассивного иммунитета у больных токсическими формами дифтерии

На правах рукописи

Гальвндис Инна Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ПАССИВНОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ ТОКСИЧЕСКИМИ ФОРМАМИ ДИФТЕРИИ

14.00.36- аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ии^448140

Москва- 2008

003448140

Работа выполнена в ГУ ПИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РЛМН

Научные руководители:

кандидат медицинских наук Свиридов В. В. кандидат медицинских наук Корженкова М.П.

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ. доктор медицинских наук, профессор М.П. Костииов

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича

на заседании диссергационного совета Д 001.035.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., д.5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток

им. И.И. Мечникова РАМН

кандидат медицинских наук И.В. Андреев

Защита диссертации состоится

часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь ученого совета кандидат биологических наук

Яковлева И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эпидемия дифтерии 90-х годов в России, вызванная циркуляцией в популяции высокотоксигенного возбудителя и значительной неиммунной прослойки среди населения, характеризовалась манифестностью развития процесса, увеличением числа осложнений и летальных случаев (Максимова Н.М., Маркина С.С., 1995; Корженкова М.П., Малышев H.A. и др. 1995; Galazka A.M., 1996; Костюкова H.H., 1999). Пассивная специфическая иммунотерапия больных дифтерией основывается на использовании антитоксической сыворотки, получаемой из крови гипериммунизированных лошадей. Особенности эпидемии требовали коррекции ургентной терапии, прежде всего увеличения доз и кратности введения антитоксина (от 100 тыс. до 2500 тыс. ME) в зависимости от тяжести заболевания и срока начала лечения (Корженкова М.П. и др., 1995, 1996, 2002; Платонова Т.В., Костинов М.П., 1997). Такие меры наряду с экстракорпоральной и инфузионной детоксикацией позволили в несколько раз снизить летальность при наиболее тяжелых вариантах токсической дифтерии, включая гипертоксическую, которая ранее в 80 - 100% случаев приводила к смерти (Берко А.И. и др. 2006).

Еще в 20-х годах прошлого века экспериментальным путем доказана целесообразность поддержания высокой концентрации антитоксина при заражении летальными дозами дифтерийного токсина (Гамалея Н.Ф., 1939). Однако, ряд специалистов резко возражают против увеличения доз противодифтерийной сыворотки (ПДС) при лечении наиболее тяжелых форм токсической дифтерии и связывают рост и тяжесть осложнений, развитие сывороточной болезни, запуск аутоиммунных механизмов, а также учащение случаев летального исхода, с длительным и многократным введением гетерологичного белка в виде ПДС (Матохина А.Г., 1996; Турьянов М.Х., 1996; Ющук Н.Д., 2003). На практике достаточность введенной больным сыворотки определяют по клинической картине - значительному

уменьшению токсикоза, отека слизистых оболочек, налетов и лимфаденита (Фаворова JI.A., 1988; Корженкова М.П. и др., 2002).

В связи с обозначенной проблемой создание метода, позволяющего оценить содержание гетерологичного антитоксина в крови пациентов, и выявление возможной взаимосвязи между этим показателем и тяжестью осложнений, представляется актуальным для коррекции объема и продолжительности лечения сывороткой.

Метод ИФА дает представление о содержании антител специфичных к различным эпитопам молекулы ДТ независимо от их эффекторных свойств, в то время как тест нейтрализации на биологической модели - клетках СНО (Chinese hamster ovary cells) свидетельствует об общей токсиннейтрализующей активности сыворотки независимо от видовой принадлежности антител. Результаты определения гетерологичного антитоксина в ИФА и эффекторной активности антител позволят выяснить уровень содержания и характер элиминации гетерологичного иммуноглобулина и протективных антител в зависимости от количества ПДС и тяжести интоксикации у больных токсической дифтерией.

Для лечения больных применяют ПДС разных производителей, поэтому представляет интерес сравнение образцов используемых лошадиных сывороток иммунохимическими методами. В настоящее время при контроле промышленного производства дифтерийного антитоксина используются метод Ремера на морских свинках и реакция флокуляции. Хотя для оценки дифтерийного антитоксина существуют более совершенные тесты (Miyamura К., 1974; Murphy J.R., 1978; Свиридов В.В., 1995).

Цель работы:

Изучение особенностей пассивного противодифтерийного иммунитета с помощью иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител (МкАт) и теста микроцитотоксичности у больных токсической дифтерией

Задачи исследования

1. Создать метод количественного определения лошадиного антитоксина в сыворотке крови больных дифтерией, получавших специфическую серотерапию:

а) получить МкАт к Р(аЬ')2 фрагментам иммуноглобулинов лошади, изучить их иммунохимические свойства;

б) синтезировать пероксидазный конъюгат на основе МкАт

в) изучить аналитические характеристики разработанного теста

2. Провести динамическое наблюдение за содержанием гетерологичного антитоксина и протективных антител в сыворотке крови больных дифтерией.

3. Сопоставить данные клинической эффективности серотерапии с уровнем дифтерийного антитоксина в сыворотке крови больных токсическими формами дифтерии в период развития осложнений.

4. Исследовать активность противодифтерийных лошадиных сывороток в культуральном и иммунохимических тестах.

Научная новизна

1. Получены моноклональные антитела специфичные к легким цепям иммуноглобулина лошади.

2. Впервые разработан иммуноферментный анализ для оценки концентрации гетерологичного противодифтерийного антитоксина в сыворотке больных, подвергнутых серотерапии.

3. Установлено отсутствие зависимости между тяжестью осложнений и уровнем лошадиных антитоксических антител у больных токсической дифтерией в период риска развития дифтерийных осложнений.

4. Предложены способы оценки противодифтерийных антител в образцах ПДС с использованием иммунохимических (ИФА, иммуноблотинг) и культурального методов.

Практическая значимость работы

1. Моноклональные антитела к легким цепям лошадиного иммуноглобулина могут быть использованы для оценки свойств и дополнительной характеристики широкого спектра антитоксических препаратов, на основе лошадиного иммуноглобулина, а также для идентификации ряда бактериальных экзотоксинов с помощью соответствующих антитоксинов.

2. Разработанный иммуноферментный метод количественного определения гетерологичного антитоксина в сыворотке крови больных токсическими формами дифтерии в ходе серотерапии может быть использован для контроля содержания и оценки достаточности доз ПДС.

3. Получены подтверждения правомочности использования высокодозовой серотерапии больных токсической и гипертоксической дифтерией в сочетании с сеансами плазмафереза и общепринятой базовой терапией.

Публикации Основные положения диссертации отражены в 6 печатных работах.

Апробация работы Материалы, изложенные в диссертации доложены: на X Всероссийском научном форуме им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2006), на заседании секции медицинской и фармацевтической микробиологии московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2007), на IV объединенном иммунологическом форуме в Санкт-Петербурге (2008).

Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 97 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, пять глав результатов и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы, включающего 162 источника, из которых 106 на русском языке. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 8 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинико-лабораторные исследования проведены в ГУЗ инфекционной клинической больнице № 1 г. Москвы (руководитель ГУМЦ по дифтерии, к.м.н. Корженкова М.П.) и в лаборатории клеточных гибридов ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН. Материалами для исследования служили сыворотки крови 67 взрослых людей в возрасте от 18 до 64 лет обоего пола с токсической дифтерией I степени тяжести (ТД I) - 12 человек, токсической II степени тяжести (ТД II) - 11, токсической III степени тяжести и гипертоксической дифтерией (ТД III и ГД) - 44 человека, находившихся на лечении в ИКБ № 1 г. Москвы с 1996 по 1999 гг. Все больные получали ПДС в соответствии со степенью тяжести токсической дифтерии (таблица 1).

Таблица 1.

Дозы вводимой ПДС в зависимости от степени тяжести дифтерии

Степень токсической дифтерии Кол-во больных (чел) Курсовая доза ПДС (тыс. ME) min - max Средняя доза ПДС (тыс. ME)

ТД I 12 150-500 342

тдп 11 150 - 1050 571

ТДШ 30 730-1900 1085

ГД 14 950-2100 1429

Образцы сывороток крови больных (486 проб) отбирали после введения курсовой дозы ПДС и экстракорпоральной детоксикации, со 2-ой недели от начала заболевания на протяжении 2-3 месяцев с недельными интервалами. Исследования включали определение: лошадиных антител к дифтерийному токсину в ИФА; токсиннейтрализующих антител в тесте

микроцитотоксичности; аутоантител к н-ДНК, д-ДНК, тканям сердца, легких, почек, основному белку миелина в ИФА.

В работе исследовались образцы противодифтерийных лошадиных сывороток производства: ФГУП «Аллерген», Ставрополь (1600 ME/мл), серия 29; ГУП «Иммунопрепарат», Уфа (1600 ME/мл), серия 141; НПО «Биомед», Пермь (1600 ME/мл), серия 104; «Boehringer», Германия (4000 ME/мл), серия 027011; «Paster Merieux», Франция (1000 ME/мл), серия к5496. Референтным образцом в ИФА, иммуноблотинге и в тесте микроцитотоксичности являлся контрольный антитоксин полученный из ГУ ГИСК им. Л. А. Тарасевича (10 МЕ/ мл).

Используемые реактивы: высокоочищенный лиофильно высушенный дифтерийный токсин (ДТ) 600 Lf/ml (ГУП НПО «Иммунопрепарат», Уфа), дифтерийный очищенный анатоксин (ДАТ) (НПО «Биомед», Пермь, серия 360) 550 Lf/ml, штамм 12 нетоксигенной С. diphtheriae биовар gravis (МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского), бактериальная вакцина Кодивак серии 61 (вакцина дифтерийная субклеточная лиофилизированная, ФСП 420381232002, МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского), гаммаглобулиновые фракции сыворотки крови лошади (ГГЛ) и барана (БГГ) (ФГУ ВГНКИ), пероксидазный конъюгат антител к мышиному IgG (АМ-ПХ), моноклонапьные антитела к дифтерийному, столбнячному токсину, ботулиническим типов А, В, Е токсинам/анатоксинам и протективному антигену В. anthracis (лаборатория гибридом ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН - Зайцев Е.М., 1985; Буркин М.А., 2004, 2006; Романов М.Г., 2005)

В качестве злокачественного партнера для гибридизации применяли клеточную линию миеломы мыши - P3-X63-Ag8.653. Для оценки протективной активности сывороток использовали культуру клеток СНО (Madshus I.H., 1994; Mattos-Guaraldi A.L. 2000).

Для получения МкАт использовали мышей линии BALB/c. Антисыворотку и иммунные спленоциты получали введением животным адсорбированного на гидроокиси алюминия препарата ПДС. Все процедуры

по получению гибридных культур, клонированию, культивированию и хранению выполнялись в соответствии с «Методическими рекомендациями по получению гибридом-продуцентов МкАт к бактериальным антигенам» (Свиридов В.В. и др., 1986).

Специфичность МкАт определяли в условиях непрямого ИФА. В качестве антигена использовали ГГЛ. Антитела выявляли пероксидазным конъюгатом кроличьих антител к IgG мыши (АМ-ПХ). Изотип МкАт определяли с помощью кроличьих антисывороток против тяжелых цепей мышиных иммуноглобулинов М, А, Gl, G2a, G2b, G3 в ИФА («Bio-Rad», США).

Иммуноблотинг проводили для уточнения специфичности МкАт и для характеристики дифтерийных антитоксинов, оценивая их взаимодействие с антигенами С diphtheriae. Антигенный материал (ГГЛ, вакцина Кодивак, препарат нетоксигенного штамма С. diphtheriae) подвергали электрофорезу (Laemmli U. К., 1970) в 10-15% полиакриламидном геле, содержащем 2,3% ДСН в камере для электрофореза («Hoefer», США) при 50-150 мА. Затем образцы переносили на нитроцеллюлозную мембрану 0,22 мкм («Bio-Rad», США), инкубировали с соответствующими МкАт или образцами ПДС и проявляли пероксидазными конъюгатами антивидовых антител. В качестве хромогена использовали 4-хлорнафтол.

Выделение МкАт из асцитной жидкости проводили на аффинном сорбенте ГГЛ-сефароза 4В (Wilson М.В., 1976). Синтез конъюгата аффинноочищенных антител с пероксидазой хрена проводили перйодатным методом (Nakane Р.К., 1974).

Антитоксиновые антитела в сыворотке крови человека и в лошадиных сыворотках определяли методом непрямого ИФА на планшетах «Dynatech» (Германия). В лунки планшета, сенсибилизированного дифтерийным токсином в концентрации 1 Lf/ml, вносили исследуемые сыворотки в разведениях 1/100, 1/1000, 1/10000, референтный образец ПДС в диапазоне концентраций 0,03-0,0001 ME/мл, а также отрицательный контроль по 100

мкл в лунку. Сыворотки разводили ФСБ, рН 7,2 содержащим 0,05% твин-20 и 1% бычьего сывороточного альбумина («Serva», Германия) (ФСБ-твин-1 % БСА). После инкубации в течение 1 ч вносили раствор пероксидазного конъюгата МкАт к F(ab')2 фрагменту иммуноглобулина лошади в разведении 1/1000 в ФСБ-твин-1% БСА. Для проявления реакции использовали субстратную смесь с о-фенилендиамином. Регистрацию проводили на фотометре («Dynatech MR 5000», Германия) при Х=492 нм. Содержание гетерологичных антител к дифтерийному токсину в сыворотках крови пациентов определяли по калибровочной кривой зависимости оптической плотности реакции от концентрации противодифтерийной сыворотки.

Протективная способность сывороточных антител изучалась в реакции нейтрализации цитотоксического действия ДТ на культуре клеток СНО (Свиридов В.В., 1995). Для разведения реагентов использовали среду RPMI-1640, содержащую 10% сыворотки плодов коровы. Серийные разведения анализируемых сывороток преинкубировали в лунках планшета («Falcon», США) с 4 минимальными цитотоксическими дозами ДТ, и затем в вносили по 104 клеток СНО. Учет реакции осуществляли через 48 часов, используя инвертированный микроскоп, либо через 4-5 дней, оценивая цветность культуральной среды в лунках.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В связи с инфузией при токсической дифтерии больших доз лошадиного антитоксина представляло интерес оценить изменение его содержания в сыворотке крови пациентов в процессе лечения.

Для разработки ИФА определения гетерологичных антител в сыворотках больных дифтерией, которым проводилась специфическая серотерапия, необходимо использование антивидового ферментного конъюгата. Коммерческие пероксидазные конъюгаты (как правило,

специфичные к цельным молекулам ^ или их Бс-фрагментам), а также синтезированные нами препараты на основе поликлональных антител кролика, осла и мыши к гаммаглобулину лошади (АЛ-ПХ) перекрестно взаимодействовали с гетерологичными иммуноглобулинами, в особенности мыши и человека (рис. 1). Факт перекрестного реагирования антисывороток с иммуноглобулинами различного видового происхождения общеизвестен (Мегап! С., 2003; Aggarwal N.. 2000). Он отражает генетическое родство этого семейства белков.

1/100 1/300 1/1000 1\3000

разведение конъюгата

Рис. 1. Перекрестное взаимодействие поликлонального конъюгата (АЛ-ПХ): ♦ - мышиный А- кроличий гаммаглобулин; • - человеческий

гаммаглобулин; х - лошадиный гаммаглобулин; + - бараний гаммаглобулин; ■ - лошадиный сывороточный альбумин

В связи с необходимостью создания инструмента для детекции лечебных лошадиных сывороток, полученных методом диаферм-3, и представляющих собой преимущественно Р(аЬ')2 фрагменты иммуноглобулинов, в качестве иммуногена использовали ПДС. Из панели МкАт, полученных на данный иммуноген, нами было отобрано антитело 2В7Е4 к легким цепям ^ лошади,

наиболее полно соответствующее нашим целям (рис. 2). Именно специфичность в отношении легких цепей позволяла выявлять антитела лошади независимо от класса иммуноглобулина.

1 2 3 4 5

-80 - б?

- 30

- 25

МкАт 1Е7 МкАт1Е10 МкАт1Н9 МкАт 2А6 МкАт 2G8 МкАт 2В7 МкАт 3D11 ПкАт анти-ПДС (мыш.)

9. АМ-ПХ

10. АЛ-ПХ

11. Маркеры мол. массы, кДа

Рис. 2. Взаимодействие моно- и поликлональных антител с ГГЛ в иммуноблотинге

Пероксидазный конъюгат МкАт 2В7Е4-ПХ не взаимодействовал с иммуноглобулинами человека, мыши, кролика, барана, а также лошадиным альбумином, что определило широкий спектр его применения. Наряду с МкАт к бактериальным токсинам и лошадиными антитоксическими сыворотками как лечебными, так и диагностическими использование 2В7Е4-ПХ в качестве универсального реагента позволило выявлять бактериальные токсины с высокой чувствительностью (рис. 3, таблица 2).

|.М0И01С1011ЛЛЫ1Ы1

Рис. 3 Принципиальная схема определения токсинов в сэндвич-ИФА с использованием 2В7Е4-ПХ

Таблица 2.

Определение бактериальных антигенов в сэндвич-ИФА при использовании конъюгата на основе МкАт

Определяемый антиген Чувствительность ИФА

Дифтерийный токсин 0,001 LF/мл

Дифтерийный анатоксин 0,0003 LF/мл

Столбнячный токсин 20 LD50^

Столбнячный анатоксин 0,005 ЕС/мл

Ботулинический анатоксин А 0,01 ЕС/мл

Ботулинический анатоксин В 0,001 ЕС/мл

Ботулинический анатоксин Е 0,0003 ЕС/мл

Протективный антиген В. ап1ЬгасЬ 1 нг/мл

Полученный конъюгат лег в основу метода контроля содержания гетерологичного антитоксина в сыворотках крови больных в процессе серотерапии. При иммуноферментном определении антител с помощью 2В7Е4-ПХ, взаимодействие конъюгата с адсорбированными на ДТ

человеческими антителами давало значения оптической плотности, не превышающие фоновых. Чувствительность ИФА при титровании референтного антитоксина составила 0,0005 МЕ/мл (рис. 4) и была сравнима с биологическими тестами in vitro (0,0002 - 0,0004МЕ/мл). Коэффициент вариации (п = 10) для концентраций 0,01-0,0001 МЕ/мл не превышал 9,8%.

Рис. 4. Калибровочная кривая иммуноферментного определения лошадиного антитоксина

Определение уровня гетерологичных антител проведено с учетом степени тяжести токсической дифтерии. Содержание антитоксина в сыворотках крови наблюдавшихся больных варьировало в широких пределах: от 88 до 0,003 МЕ/мл. Концентрации антитоксина находились в пределах 0,57 - 10 МЕ/мл при первой степени, 1,1 - 30 МЕ/мл при второй степени и 1 -88 МЕ/мл при третьей степени тяжести токсической дифтерии. Эти антитела элиминировали к началу 6 недели из сыворотки крови больных ТД I и ТД II и к началу 7 недели у больных с ТД III (рис. 5).

А

30

90

•s:

25 ■

20

15 -

10

"Iii I •

123456789

» *

) ! • 1 I | J . . .

0123456789 10 недели от начала болезни

80

70

60

50

40

30

20

t

. « *

♦ * I i t

! .

01 23456789 10

Рис. 5. Иммуноферментное определение лошадиного антитоксина в сыворотке крови больных токсической дифтерией разной степени тяжести: А - ТД I; Б - ТД II; В - ГД и ТД 111

Уровень антител в первых пробах (конец 1-ой начало 2-ой недели от начала заболевания) оказался максимальным и составил 3,3 ± 1,1, 12,2 ± 3,4 и 19,3 ± 3,8 ME/мл для ТД 1, ТД II, ТД III и ГД (таблица 3).

Значительный диапазон концентраций противодифтерийного гаммаглобулина у лиц с одинаковой степенью тяжести заболевания и сходным суммарным количеством введенной ПДС мог быть обусловлен как индивидуальными особенностями метаболизма, так и различной потребностью в антитоксине для нейтрализации поступающего из очага

токсина, а также разным объемом и кратностью экстракорпоральной детоксикации в остром периоде болезни.

Таблица 3.

Содержание дифтерийного антитоксина в сыворотках крови больных токсической дифтерией в начале 2-ой недели от начала заболевания

Степень токсической дифтерии Кол-во больных Уровень гетерологичного антитоксина (МЕ/мл) Уровень протективных антител (МЕ/мл)

ТД I 12 3,3 ± 1,1 9,6±3,2

тдп 11 12,2 ±3,4 8,4±3,2

ДТ III, ГТ 44 19,3 ±3,8 10,3±5,2

В ходе дальнейшей работы мы определяли у больных дифтерией количество токсиннейтрализующих антител в тесте микроцитотоксичности на культуре клеток СНО. В результате лечения ПДС в сыворотке крови больных с ТД I и ТД II наблюдали высокий пик содержания защитных противодифтерийных антител - 8 - 10 ME/мл к началу 2 недели заболевания, который постепенно снижался до 5 - 7 ME/мл к 5 неделе. У больных с ГД и ТД III после максимальных значений в начале 2 недели (таблица 3), снижение уровня антител до минимальных значений происходило к 9 неделе от введения ПДС.

Как видно из рисунка 6, большие дозы сыворотки не увеличивают длительность циркуляции антител в организме больного. Динамика снижения токсиннейтрализующих антител у больных наиболее тяжелыми формами -ГД и ТД III - очень сходна, несмотря на то, что вводимые индивидуальные дозы различались более чем в 3 раза, что можно рассматривать как адекватность эмпирически выработанной клиницистами тактики лечения.

недели от начала болезни

Рис. 6. Динамика уровня токсиннейтрализующих антител у больных ДТ III степени и ГД с различными дозами введения ПДС (тест микроцитотоксичности):

• -до 1000 тыс.МЕ, А - до 1500 тыс.МЕ, ■ - до 2500 тыс.МЕ

В тоже время большие дозы сыворотки не исключали тяжелых осложнений, вместе с тем для некоторых больных и более низкие дозы были вполне достаточны, для того чтобы избежать осложнений (таблица 4).

Таблица 4

Сопоставление тяжести осложнений у больных ДТ III степени и ГД с дозами

введенной сыворотки

Осложнения Кол-во (чел) Доза ПДС min - max (тыс. ME) Средняя доза на курс (тыс. ME)

тяжелые 9 610-2150 1256

средние 22 610-2250 1199

легкие 11 730-1350 1011

без осложнений 2 1100- 1450 1275

При ТДI осложнения в виде легкого миокардита и пареза мягкого неба на 3-4 неделях от начала болезни отмечены у 2 из 12 (16,7%). У 6 из 11 больных с ТД И осложнения наблюдались чаще (легкие - 45,5%, средней тяжести -18,2%). При ТД III легкие осложнения были у 30,0% больных против 14,3% при ГД, средней тяжести - у половины больных в этих группах, тяжелые осложнения были чаще среди больных гипертоксической дифтерией - 28,6% против 16,7% ТД III. Среди наблюдавшихся больных токсической дифтерией лишь у 13,6% лиц развились тяжелые осложнения, несмотря на то, что для 66,7% пациентов существовала угроза развития тяжелых осложнений.

Одной из причин развития тяжелых осложнений наряду с несвоевременным началом иммунотерапии является преждевременная отмена сыворотки при сохранении активности очага воспаления, так как продукция токсина в активном очаге воспаления и его резорбция продолжаются. У всех больных с осложнениями средней и легкой степенями тяжести, а также без осложнений признаков активности очага воспаления в момент отмены ПДС не отмечено (таблица 5).

Таблица 5

Развитие местного процесса в ротоглотке у больных ДТ III степени и ГД с осложнениями различной тяжести

Характеристика местного процесса В ротоглотке у больных дифтерией Степень тяжести осложнений

Легкая Средняя Тяжелая

Стабилизация от начала терапии (часы) 40 35 45

Улучшение после начала терапии (часы) 64 59 71

Продолжительность (дни) 10 9 14

Признаки активности в момент отмены ПДС нет нет есть

Средняя курсовая доза ПДС (тыс. МЕ) 994 1225 1227

Количество больных (человек) 11 22 9

Все 11 больных с легкими осложнениями и 20 из 22 больных с осложнениями средней тяжести продолжали получать ПДС от момента начала обратной динамики местного процесса в ротоглотке до ликвидации симптомов его активности. У всех 9 больных с тяжелыми осложнениями симптомы, свидетельствующие об активности очага воспаления (часы от начала лечения ПДС до стабилизации, первые признаки улучшения и продолжительность местного процесса в ротоглотке), отличались большей длительностью, чем в группе больных с осложнениями средней тяжести, и к моменту отмены лечения сохранялись. Вместе с тем средние курсовые дозы ПДС в этих группах были одинаковы - около 1225 тыс. МЕ. Таким образом, сохранение признаков активности воспаления в ротоглотке на момент отмены серотерапии, более медленное его угасание и исчезновение чаще сопровождались развитием в последующем тяжелых осложнений. Об этом свидетельствует и более быстрое снижение антитоксина, расходуемое на нейтрализацию ДТ после отмены ПДС у больных в последующем с тяжелыми осложнениями (рис. 7).

В ходе работы мы проанализировали в динамике заболевания сыворотки крови всех пациентов с токсической дифтерией на предмет содержания аутоантител к н-ДНК, д-ДНК, тканям сердца, легкого, почек, основному белку миелина. Исследование проводили в лаборатории иммунохимической диагностики (зав. д.м.н. Ястребова Н.Е.). Частота обнаружения антител к тканевым антигенам у больных токсической дифтерией с осложнениями не превышала 5%, что наблюдается и у клинически здоровых лиц (Ястребова Н.Е., 2007). Таким образом, не подтверждается аутоиммунный механизм развития постдифтерийных осложнений. Очевидно, что патологический процесс в данном случае связан не с массивной серотерапией, а имеет токсико-инфекционную природу.

120

Q 60

s

с 5

100

80

40

20

О

-ш

10

2

3

4

5

6

7

6

9

недели от начала болезни

Рис. 7. Содержание токсиннейтрализующих антител у больных токсической дифтерией у больных ТД III степени и ГД с осложнениями различной степени (тест микроцитотоксичности):

▲ - тяжелой степени, •- средней степени, ■ - легкой степени тяжести

Не получило подтверждение и мнение о высоком риске сывороточной болезни, так как у исследованных больных при повторном введении больших доз ПДС на фоне общепринятой профилактики аллергических осложнений, сывороточная болезнь не была зарегистрирована, реакции немедленного типа наблюдались у 3 (4,5%) больных.

Разработанный иммуноферментный метод оценки содержания лошадиных антитоксиновых антител в сыворотке крови больных дифтерией, а также её токсиннейтрализующей активности, определяемой как гетерологичными, так и собственными антителами больного, могут использоваться для оценки правильности серотерапии.

Принимая во внимание клиническое использование сывороточных препаратов разных производителей, целесообразным представлялось сравнить их эффекторные и иммунохимические свойства. При этом оценивали взаимодействие 6 препаратов ПДС разных производителей, с токсином, анатоксином и антигенами бактериальной клетки С. diphtheriae.

При сопоставлении кривых титрования сывороток с иммобилизованным ДТ и ДАТ была отмечена различная иммунохимическая активность сывороток. Их взаимодействие с анатоксином было вдвое активнее, т.е. для обеспечения одинаковой интенсивности реакции (1,0 оптической плотности) требуется в 2 раза меньшая концентрация ПДС (рис. 8). Это свидетельствует об антигенных отличиях, произошедших с ДТ в результате его токсоидирования, и о наличии доли антител к вновь приобретенным структурам, отсутствующим в нативном токсине.

А Б

концентрация, МЕ/мл

Рис. 8. Взаимодействие ПДС с иммобилизованным дифтерийным токсином (А) и анатоксином (Б) в ИФА. ПДС производства: 1 - Ставрополь, ФГУП «Аллерген», 2 - «Boehringer», 3- «Paster Merieux», 4 - ГИСК им. Л. А. Тарасевича, 5 - Пермь, НПО «Биомед», 6 - УФА, ТУП «Иммунопрепарат»

В то же время, результаты, представленные на рис. 9 свидетельствуют о различном уровне содержания антител к бактериальным антигенам в антитоксинах. Выявленные различия препаратов подтверждаются и картиной иммуноблотинга (рис.10). У препаратов ПДС, производства ФГУП «Аллерген» и ГУП «Иммунопрепарат» выявляются антитела к антигенам С. (ЬрШИепае в большей степени, чем у остальных образцов.

0,001 0,003 0,01 0,03 0,1 Концентрация, МЕ/мл

Рис. 9. Взаимодействие ПДС с иммобилизованным препаратом Кодивак в ИФА. ПДС производства: 1 - Ставрополь, ФГУП «Аллерген», 2 -«Boehringer», 3- «Paster Merieux», 4 - ГИСК им. Л. А. Тарасевича, 5 - Пермь, НПО «Биомед», 6 - УФА, ГУП «Иммунопрепарат»

Протективная активность всех исследованных образцов ПДС определенная в реакции нейтрализации ДТ в культуре клеток СНО оказалась сходной. Присутствие в антитоксинах отечественного производства антител к антигенам микроорганизма позволяет предположить их антибактериальный эффект, а также отражает присутствие микробного компонента в анатоксинах, используемых для иммунизации. Сравнение различных образцов ПДС выявило неоднородность в иммунохимических свойствах

лошадиных антитоксинов, что естественно не может не отразиться на результатах их применении в клинической практике.

- 92,5

Рис. 10. Взаимодействие ПДС с препаратами Кодивак (1-6) и дезинтегратом нетоксигенного штамма С. diphtheriae в иммуноблотинге (7-12) ПДС производства: 1,7 - Ставрополь, ФГУП «Аллерген», 2,8 - ГИСК им. Л. А. Тарасевича, 3,9 - «Boehringer», 4,10 - «Paster Merieux», 5,11 - Пермь, НПО «Биомед», 6,12 - УФА, ГУП «Иммунопрепарат».

Выводы

1. Получены МкАт, специфичные к легким цепям иммуноглобулина лошади, и не имеющие перекрестных взаимодействий с иммуноглобулинами других видов (человека, кролика, мыши, барана), а также лошадиным сывороточным альбумином.

2. На основе использования пероксидазного конъюгата МкАт в качестве универсального реагента для выявления антитоксических лошадиных иммуноглобулинов предложены сэндвич-варианты количественного ИФА дифтерийного, столбнячного, ботулинических типов А, В, Е токсинов/ анатоксинов и протективного антигена В. anthracis.

3. Разработан вариант иммуноферментного анализа для количественного определения гетерологичных антитоксических антител в сыворотках больных дифтерией, получавших серотерапию. Чувствительность метода 0,0005 МЕ/мл сопоставима с биологическими тестами in vitro.

4. Определены параметры элиминации противодифтерийных антител (гетерологичных и токсиннейтрализующих) из сыворотки крови больных токсической дифтерией. Отмечено, что не зависимо от дозы введения ПДС антитела выводятся из организма к 7 - 9 неделе от начала болезни.

5. Присутствие в организме гетерологичного антитоксина в диапазоне выявленных концентраций от 88 до 0,003 МЕ\мл не сопровождается синтезом органо- и тканеспецифичных аутоантител и не провоцирует утяжеление осложнений.

6. В коммерческих препаратах лошадиной противодифтерийной сыворотки, выпускаемой российскими производителями, выявляются антитела, специфичные не только к токсину, но и к антигенам коринебактерий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Титова Н.Г., Яковлева И.В., Гальвидис И.А., Буркин М.А., Корженкова М.П., Свиридов В.В. Оценка противодифтерийного гуморального иммунитета в различных тестах // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях. Доклады XIII Российской научной конференции. Челябинск.- 1997.-С. 159-160.

2. Яковлева И.В., Титова Н.Г., Селезнева Т.С., Буркин М.А., Смирнов В.Д., Гальвидис И.А., Свиридов В.В. Оценка напряженности антитоксического противодифтерийного иммунитета в различных тестах // Современная Вакцинология. Сборник докладов II Международной конференции, посвященной 100-летию Пермского НПО «Биомед». - июнь 1998.-С. 45.

3. Буркин М.А., Гальвидис И.А., Романов М.Г., Свиридов В.В. Моноклональные антитела к лошадиному иммуноглобулину как универсальный реагент при количественном определении в ИФА бактериальных токсинов, анатоксинов и соответствующих антитоксинов // Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8. - №2-3. - С. 415-416.

4. Burkin М.А., Gal'vidis I.A., Yakovleva I.V., and Sviridov V.V. Use of Monoclonal Antibodies against Horse Immunoglobulin in an Enzyme Immunoassay of Bacterial Toxins and Toxoids // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2007. - Vol. 43. - № 1. - P. 98-101.

5. Гальвидис H.A., Свиридов B.B. Исследование противодифтерийных сывороток в иммунохимических и культуральных тестах // Журнал эпидемиологии, микробиологии и иммунобиологии. - 2007. - №4. - С. 28 -32.

6. Гальвидис И.А., Корженкова М.П., Буркин М.А., Берко А.И., Свиридов В.В. Высокие дозы противодифтерийной сыворотки в лечении токсических форм дифтерии // Российский иммунологический журнал. -2008.-т.2(11). -№2-3. - С. 141.

Заказ № 148/09/08 Подписано в печать 1709 2008 Тираж ЮОэкз Уел пл 1,5

-"о ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \v\vw cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru

Актуальность проблемы Одной из причин резкого повышения заболеваемости дифтерией в 90-е годы послужило появление значительного неиммунного контингента взрослого населения и снижение охвата прививками детей [44, 50, 93, 118, 17, 134]. Достижение спорадического уровня заболеваемости дифтерией, прекращение эпидемических подъемов этой инфекции с начала 60-х годов привело к тому, что естественная иммунизация перестала играть роль фактора, поддерживающего взрослых. Вплоть до 2004 г. сохранялось лидирующее положение взрослых в возрастной структуре заболевших. В настоящее время в стране достаточный уровень грунд-иммунитета у заболеваемость снизилась до спорадических случаев, но эпидемический процесс дифтерии развивается и среди населения, имеющего иммунитет к этой инфекции. В связи с этим, изучение противодифтерийного иммунитета остается актуальным. Пассивная специфическая иммунотерапия дифтерии основывается на использовании гипериммунной лошадиной антитоксической сыворотки, которая вводится больным в дозах от тысячи до миллионов антитоксических международных большинства единиц (ME). Развитие манифестной интоксикации у больных в условиях эпидемии 90-х годов, неиммунных увеличение тяжести осложнений и летальности потребовали адекватного применения антитоксина с увеличением его доз и кратности введения (105 Ю6 ME и более) в зависимости от формы, тяжести заболевания и срока начала лечения [44, 45, 48]. Эти меры наряду с экстракорпоральнаой детоксикацией позволили в несколько раз снизить летальность при наиболее тяжелых вариантах токсической дифтерии, включая гипертоксическую (ГД), которая ранее сопровождалась 100 летальностью [46, 87, 9]. Присутствие в организме вьтсокоаффинных антител (Ат) к основному поражающему фактору при этой инфекции дифтерийному токсину (ДТ) является основным условием выздоровления [90,145]. В остром периоде болезни эффективность серотерапии и достаточность введенной больным дозы противодифтерийной сыворотки (ПДС) оценивают по клинической картине уменьшению и ликвидации очага воспаления [87]. Однако ряд специалистов считает, что рост и тяжесть осложнений, развитие сывороточной болезни, учащение случаев летального исхода связаны с длительным и многократным введением гетерологичного белка [87, 103]. Исследования эффективности различных доз ПДС, проводимые на лабораторных животных кроликах и морских свинках, свидетельствовали о том, что относительно малые дозы ПДС (эквивалентные 10 тыс. ME для человека) обеспечивали в течение недели достаточно высокий уровень антитоксина (до 2 МЕ/мл) [58]. Это наблюдение позволило авторам считать необоснованным использование больших доз сыворотки и их повторного введения больным дифтерией. Однако известно, что животные не могут служить адекватной моделью для воспроизведения дифтерийной инфекции. У заболевшего дифтерией человека вводимый из очага антитоксин расходуется на нейтрализацию поступающего воспаления ДТ. На практике эффективность серотерапии и достаточность введенной больным дифтерией дозы ПДС оценивают по клинической картине. Поэтому актуальным представляется установление взаимосвязи между тяжестью осложнений и уровнем гетерологичного антитоксина в сыворотке крови пациентов с токсической дифтерией, получивших большие дозы ПДС. Это позволит внести коррективы тактику лечения.При связывании ДТ с рецепторами клеток-мишеней задействован Сконцевой участок В-фрагмента молекулы токсина. Токсиннейтрализующий эффект наиболее выражен у антител, специфичных к этой детерминанте, которые предупреждают фиксацию ДТ на рецепторах [84, 86, 111, 152, 79]. Поэтому важным является определение именно протективной активности Ат. Используемые противодифтерийные в лечебной и лабораторной и практике зарубежного сыворотки отечественного производства, кроме Ат к ДТ, содержат Ат к антигенам микробной клетки [52]. Контроль и стандартизация параметров качества сывороточных препаратов, важнейший момент в их производстве. При оценке качества противодифтерийных сывороток (ПДС), окончательное заключение о активности делается на основе биологического тестирования в реакции нейтрализации ДТ на коже кролика или на морских свинках при сравнении испытуемых препаратов с отраслевым стандартным образцом. Активность ПДС, до сих пор оценивают в реакции флокуляции с ДТ [77]. По сравнению с вышеупомянутыми реакциями иммуноферментный анализ и тест на основе чувствительной к дифтерийному токсину культуры клеток имеют ряд преимуществ: высокая чувствительность, специфичность, стандартность, меньшая затрата времени и средств [138, 139, 140, 79]. В связи с обозначенной проблемой создание метода, позволяющего оценить содержание между антитоксина этим в крови и пациентов, тяжестью и выявление осложнений, взаимосвязи показателем представляется актуальным для оценки эффективности и коррекции лечения. Тестирование в ИФА дает представление о содержании специфичных к различным эпитопам молекулы антител ДТ независимо от их эффекторных свойств, в то время как тест нейтрализации ДТ in vitro (тест микроцитотоксичности) свидетельствует об общей токсиннейтрализующей активности сыворотки независимо от видовой принадлежности антител.Таким образом, анализ данных иммуноферментного определения гетерологичного антитоксина и эффекторной активности поможет антител в сыворотке крови больных токсической дифтерией выяснить характер элиминации гетерологичного иммуноглобулина и нейтрализующих антител в зависимости от количества инфузии ПДС и тяжести интоксикации. Использование этих методов для сравнения характеристик ПДС также представляет интерес в плане стандартизации этих препаратов. Цель исследования Изучение особенностей пассивного противодифтерийного иммунитета с помощью иммуноферментного анализа на основе МкАт, и теста микроцитотоксичности у больных токсической дифтерией Задачи исследования 1. Создать метод количественного определения лошадиного антитоксина в сыворотке крови больных дифтерией, получавших специфическую серотерапию: а) получить МкАт к F(ab)2 фрагментам иммуноглобулинов лошади, изучить их иммунохимические свойства; б) синтезировать пероксидазный конъюгат на основе МкАт в) изучить аналитические характеристики разработанного теста 2. Провести динамическое наблюдение за содержанием гетерогенного антитоксина и протективных антител в сыворотке крови больных дифтерией. 3. Сопоставить данные клинической эффективности серотерапии с уровнем дифтерийного антитоксина в сыворотке крови больных токсическими формами дифтерии в период развития осложнений. 4. Исследовать активность противодифтерийных лошадиных сывороток в культуральном и иммунохимических тестах.Научная новизна Получены моноклональные антитела специфичные к легким цепям иммуноглобулина лошади. Впервые концентрации разработан иммуноферментный анализ для оценки в гетерологичного противодифтерийного антитоксина сыворотке больных, подвергнутых серотерапии. Установлено отсутствие зависимости между тяжестью осложнений и уровнем лошадиных антитоксических антител у больных токсической дифтерией в период риска развития дифтерийных осложнений. Предложены способы оценки противодифтерийных антител в образцах ПДС с использованием иммунохимических культурального методов. (ИФА, иммуноблотинг) и Практическая значимость Моноклональные иммуноглобулина могут антитела быть к F(ab)2 фрагментам для оценки лошадиного свойств и использованы дополнительной характеристики полученных по технологии различных антитоксических препаратов, для идентификации диаферм-3, а также бактериальных экзотоксинов. Разработанный вариант иммуноферментного определения концентрации гетерологичного антитоксина в сыворотке крови больных токсическими формами дифтерии в ходе серотерапии может быть использован для контроля содержания и оценки достаточности доз ПДС. Полученные использования в работе данные подтверждают больных правомочность токсической и высокодозовой серотерапии гипертоксической дифтерией в сочетании с сеансами плазмафереза и общепринятой базовой терапией.Обзор литературы Современные аспекты патогенеза дифтерии С 1977 года начался подъем заболеваемости дифтерией. Он был обусловлен отсутствием иммунитета у большинства взрослого населения в связи с несоблюдением графика ревакцинаций и недостаточным охватом прививками детей [1, 2, 135]. Этому способствовало уменьшение процента привитых детей, увеличение интервалов между ревакцинацией и широкое использование для первичной вакцинации АДС-М анатоксина с низким содержанием антигена, предназначенного только для ревакцинирующих прививок [18]. В начале 80-х годов в России среди больных дифтерией взрослые стали составлять более 80 Помимо этого тяжелая эпидемия была обусловлена циркуляцией возбудителя биовара gravis, характеризующегося высоким токсинообразованием Проведение и выраженной и колонизационной профилактических взрослого подъема активностью. мероприятий населения противоэпидемических без массовой против дифтерии не смогло иммунизации высокого предотвратить развитие заболеваемости дифтерии в России в 90-е годы (1990-1999 гг.). Эта эпидемия дифтерии характеризовалась не только большим количеством больных, но и резко возросшей тяжестью и летальностью [67]. Полное искоренение дифтерийной инфекции невозможно, так как резервуаром для циркуляции возбудителя являются бактерионосители, имеющие высокие уровни противодифтерийных антител [49, 50]. Являясь источниками инфекции, они поддерживают скрытое течение эпидемического процесса. Дифтерия это острое токсикоинфекционное заболевание, характеризующееся фибринозным воспалением преимущественно слизистых оболочек рото- и носо- глотки как наиболее частых ворот инфекции [64, 73, 90]. Начальным и необходимым элементом патогенеза при дифтерии является адгезия коринебактерии дифтерии к клеткам хозяина [66]. В связи с тропностью возбудителя к слизистым оболочкам и защитной функцией лимфоидного кольца ротоглотки, местное фибринозное воспаление чаще всего развивается на миндалинах. Основным свойством Corynebacterium diphtheriae является его токсигенность т.е. способность синтезировать гистотоксин. Все токсигенные штаммы diphtheriae продуцируют идентичный токсин, действие которого проявляется не только локально в виде воспалительной реакции, но и в общей интоксикации организма, поражении особенно чувствительных к нему надпочечников, миокарда, нервной системы [61]. Некоторые исследователи к факторам патогенности токсигенной diphtheriae относят также антигены клеточных стенок возбудителя, среди которых выделены фракции белков, липидов, на полисахариды своей и [96]. Дифтерийный термолабильные микроорганизм содержит поверхности типоспецифические протеины термостабильные полисахариды и полисахаридные комплексы [90, 103]. Штаммы биотипов «gravis» и «mitis» имеют различные по специфичности поверхностные антигены, а внутри этих биотипов, различают серотипы. Антигенный состав дифтерийных коринебактерии неоднороден. В настоящее время нет их общепринятой серологической резистентности классификации у населения [90]. к Формированием антигенной колонизационной одной разновидности и отсутствием иммунитета к другому сероварианту можно объяснить смену био- и сероваров в течение эпидемического процесса. Каждому новому подъему заболеваемости предшествует подъем носительства, связанный с появлением нового антигенного варианта, к которому нет колонизационной резистентности [50]. Тканевые дифтерийного поражения токсина [68, связаны 10]. исключительно что с воздействием общей Установлено, тяжесть интоксикации определяется массивностью и темпами токсинообразования в очаге дифтеритического воспаления [90, 145]. На месте проникновения ДТ вызывает коагуляционный некроз поверхностного эпителия, повышение проницаемости, расширение и стаз сосудов. Фибриноген, содержащийся в плазме, при контакте с тромбопластином некротического эпителия переходит в фибрин, который выпадает в виде фибринозной пленки [11]. На слизистых оболочках ротоглотки покрытых многослойным эпителием, развивается характерное дифтеритическое воспаление, при котором фибринозная пленка связана с подлежащими тканями. Местное действие токсина сопровождается увеличением регионарных лимфатических узлов и появлением отека. Отечность мягких тканей (подкожно-жировой клетчатки) соответствует степени интоксикации [35]. Синтез экзотоксина сопровождается секрецией возбудителем целого спектра вспомогательных факторов, усиливающих местный эффект действия самого токсина. Среди них фермент гиалуронидаза, которая разрушает гиалуроновую кислоту, являющуюся межклеточным При этом матриксом повышается соединительной ткани человека и животных. проницаемость сосудов и других тканей, что усугубляет отек. Роль фактора диффузии, заметно повышающего распространение возбудителя, фермент нейраминидаза. Изучена роль гемолизина, играет обусловливающего развитие геморрагического синдрома при дифтерии [11, 90]. Выявленные общие закономерности в изменении показателей плазменных и мембранных окисления при липидов, процессов формах свободнорадикального характерны для токсических дифтерии, цитопатогенного эффекта бактериальных токсинов [51]. При дифтерии, как и при других бактериальных инфекциях снижается активность миелопероксидазы нейтрофилов, что снижает способность нейтрофилов секретировать в окружающую среду лизосомальные ферменты. Повышение активности щелочной и кислой фосфатаз в острый период болезни обусловлено участием этих ферментов в процессе фагоцитоза. Активность ЩФ и КФ несколько снижается у больных с токсической и субтоксическими формами дифтерии. Может наблюдаться недостаточность синтеза ферментов и рецепторной функции нейтрофилов. Группа ферментов, участвующих в дыхании клеток, в частности сукцинатдегидрогеназы, крайне чувствительны к гистотоксическим состояниям. Их активность достоверно снижается при всех формах дифтерии. Неспецефическая эстераза лимфоцитов маркерный фермент Т-лимфоцитов и моноцитов, снижается только у больных с токсической и субтоксической формами дифтерии, что связано с большой интоксикацией [95]. Токсинообразование diphtheriae обусловлено их лизогенизацией специфическим профагом. Хромосома коринефагов несет ген дифтерийного токсина. Он может экспрессироваться как в течение продуктивного цикла фага, так и после лизогенизации коринебактерий. Токсин синтезируется на мембранах рибосом и транспортируется из бактерии в виде полипептидной цепи с двумя дисульфидными связями и относительной молекулярной массой 62000 дальтон [39]. После процессинга образуется полноценная молекула токсина, состоящая из энзиматически активного N-концевого Афрагмента (22000 Д) и С-концевого В-фрагмента (40000 Д). Т.о. ДТ состоит из двух фрагментов А и В. В-фрагмент обеспечивает связывание бактерий с поверхностными рецепторами и проникновение в клетку. Он иммунологически активен, но не токсичен для организма. Фрагмент А непосредственно обеспечивает токсические свойства белка и проявляет свою активность, нарушая ферментный синтез белков, что приводит к гибели клетки [24, 114]. Он термостабилен, хорошо растворим в воде и устойчив в широком диапазоне рН. При «мягком» воздействии протеаз и при наличии в реакционной среде восстановителя тиогрупп молекула ДТ также распадается на А- и Вфрагменты, которые в интактной молекуле соединены двумя дисульфидными мостиками. По аминокислотному составу А-фрагмент заметно отличается от интактного токсина. Реакционный центр А-фрагмента состоит из основных нуклеозидсвязующих триптофана. химическими рибозилазной При субъединиц и содержит остатки тирозина, лизина, модификации этих остатков заметное Результаты соответствующими снижение АДФ- соединениями активности возникает А-фрагмента. иммунологических исследований с моноклональными антителами (МкАт) показали антигенную неоднородность А-фрагмента, обнаружено образование по крайней мере трех видов высокоспецифичных антител, реагирующих с разными компонентами молекулы [61]. В-фрагмент представляет собой термолабильньтй белок, устойчивый в водном растворе лишь при наличии мочевины. С-концевой участок В-фрагмента, обладающий сильно выраженными гидрофобными свойствами, представляет собой место связывания молекулы ДТ с фосфолипидами клеточных мембран [111, 143]. В-фрагмент, лишенный этого участка, теряет способность мембране взаимодействовать клетки-мишени. с рецепторами часть на В- цитоплазматической N-концевая фрагмента принадлежит к протеазочувствительному участку и обладает выраженными гидрофильными свойствами. Установлено, что амино- и карбоксильные концы В-фрагмента наиболее важны для связывания ДТ с цитоплазматической мембраной клетки-мишени [61, 28, 125]. Степень чувствительности клеток к ДТ in vivo определяется количеством специфических рецепторов на цитоплазматической мембране [61]. При высокой плотности специфических рецепторов клетки повреждаются малыми дозами ДТ, при низкой плотности цитопатогенный эффект проявляется при больших дозах. Поэтому разные типы клеток могут обладать различной рецепторно-зависимой резистентностью к ДТ. Основным механизмом трансмембранного транспорта ДТ в клетку является адсорбционный ДТ эндоцитоз [ПО, 28]. Вначале слабых необратимо протеаз, фиксированный подвергается воздействию сосредоточенных на поверхности цитоплазматической мембраны клеткимишени. Протеазы разрушают цепочку, связывающую А- и В-фрагменты, в результате чего высвобождается В-фрагмент, способный взаимодействовать с рецепторным участком мембраны. Считается, что В-фрагмент обладает большим сродством к рецепторам, чем целый токсин дифтерии [61]. Происходит активный процесс взаимодействия дифтерийного токсина с цитоплазматической мембраной чувствительной клетки, в котором фрагмент В токсина фиксируется на рецепторе, а фрагмент А при этом освобождается и свободно проходит в цитоплазму. То есть В-фрагмент служит «промотором для А-фрагмента» [24, 112, 143]. Взаимодействие В-фрагмента ДТ с рецепторными участками ведет к формированию трансмембранных каналов, которые действуют как простые транслокационные системы, выступающие в роли «иллюминаторов» в секреторном аппарате клеток [148]. Образование трансмембранных каналов вызывает дестабилизацию цитоплазматической мембраны, что способствует перемещению А-фрагмента в цитозоль [134, 155]. Более обоснованно представление о том, что А-фрагмент ДТ проникает в цитозоль в составе везикул эндосом [61, 127]. Это подтверждается результатами исследований цитопатогенного эффекта гибридного токсина, в котором натуральный В-фрагмент был заменен на другие виды белковых субстанций, не имеющих кокого-либо сходства с ДТ. Гибридный токсин фиксируется на цитоплазматической мембране соответствующего вида клеток, и трансмембранный перенос А-фрагмента в цитозоль не нарушается. Гибридный ДТ может оказывать цитопатогенное действие даже на такие виды клеток, которые в обычных условиях обладают высокой резистентностью к натуральному яду [126]. Вероятно в резистентных к ДТ клетках преобладает транспорт везикул эндосом в лизосомы, что обеспечивает быструю инактивацию А-фрагмента [61, 127, 137]. При изучении внутриклеточных механизмов цитопатогенного действия ДТ оказалось, что необратимое повреждение и гибель клеток в культуре тканей наступают при фиксации на цитолемме не менее 250 млекул ДТ [125].В чувствительных к ДТ клетках необратимое угнетение синтеза белка обусловлено взаимодействием токсина с никотинамиддинуклеотидом (НАД) источником АДФ-рибозы в процессе АДФ-рибозилирования и фактором элонгации EF-2 белковым компонентом, необходимым для удлинения пептидной цепочки на рибосомах [28, 144]. А-фрагмент токсина имеет в составе молекулы участок связывания НАД. В клетках, в которые попал токсин, усиление моно-АДФ-рибозилирования вызывает инактивацию фактора элонгации за счет утраты транслоказной активности, в результате чего тормозится синтез белков и клетка погибает [156]. В основе ингибиции синтеза лежит катализирование АДФ-рибозилтрансферазой ковалентного прикрепления АДФ-рибозилового фрагмента НАД к фактору элонгации EF2, что вызывает выпадение трансляции с мРНК в рибосомах и блокаду включения активированных аминокислот в растущую полипептидную цепочку [61, 144]. У клеток, обладающих высокой чувствительностью к ДТ, сродство А-фрагмента к фактору элонгации EF-2 определяется содержанием в последнем остатка дифтамида, специфически взаимодеймтвующей с определенным участком молекулы А-фрагмента ДТ. При взаимодействии А фрагмента ДТ с НАД+ у последнего ослабляется связь между никотинамидом и рибозой, в результате чего происходит реакция между АДФ-рибозилом и дифтамидом EFo. Образующийся неактивный дериват этого фактора блокирует этап элонгации белкового синтеза, что рассматривается как основная причина гибели клеток при дифтерийной интоксикации [87]. В нечувствительных к токсину клетках дифтамид отсутствует, и в этих случаях А-фрагмент не способен связываться с фактором элонгации тормозить белковый синтез [144, 61, 153]. Однако по мере накопления экспериментальных данных оказалось, что инактивация фактора элонгации EF-2 представляла собой стандартное звено механизма повреждения клеток токсическими протеинами всех видов, обладающих сходной структурой (рицин, холерный и коклюшный токсины, EF-2 и энтеротоксины коли-группы др.) [61, 126]. Поэтому особенности клинических симптомов при дифтерии связаны, в первую очередь, с типом клеток-мишеней и клеток иммунной системы, на которые направлено цитопатогенное действие ДТ. Системное действие экзотоксина проявляется в поражении нервной системы (преимущественно периферической), миокарда, налпочечников, печени, почечных канальцев и клинически выражается в развитии основных осложнений дифтерии полиневритов, миокардиодистрофий, инфекционнотоксического Дифтерийная аллергическим нефроза и тромбогеморрагического полинейропатия заболеванием с патогенетически синдрома является [37, 131]. токсико- чувствительными, двигательными, рефлекторными, трофическими расстройствами и бульбарным синдромом [32]. Острая дифтерийная полиневропатия является одним из наиболее тяжелых и опасных осложнений дифтерии, ее частота варьирует от 3,3 до 68 от общего числа больных и находится в прямой зависимости от степени дифтерийной интоксикации [7, 124, 149]. Причиной развития поражения периферических нервов при дифтерии является дифтерийный токсин, обладающий нейротропным действием. Действие ДТ на периферическую нервную систему и предположительно основных белков связано с подавлением в синтеза протеолипидов миелина олигодендроцитах (шванновских клетках) и перикарионе, что, в свою очередь, вызывает демиелинизацию и аксональную деструкцию. Течение дифтерийной полиневропатии имеет две фазы. Первая фаза объясняется фиксацией ДТ на клетках ганглиев и нервных стволов, прилегающих к основному очагу дифтерийной инфекции, и проявляется бульбарным синдромом. Вторая фаза связывается с последующим гематогенным распространением токсина по всему организму, что приводит к появлению генерализованной полирадикулоневропатии [83, 87]. Некоторые авторы связывают поздние неврологические осложнения при дифтерии помимо непосредственного действия токсина на клетки нервной как системы, развитием на демиелинизирующего процесса аутоиммунной реакции миелинсодержащие структуры центральных и периферических отделов нервной системы вследствие лечения большими дозами гетерологичной сыворотки [21, 40, 74, 91]. Поражение сердечно-сосудистой системы во многом определяло тяжесть течения и исходы дифтерии. Развивается токсический миокардит [61, 62]. Признаки поражения сердца (миокардиодистрофии) развиваются, как правило, на фоне уменьшения симптомов общей интоксикации и индуцируются дифтерийным токсином, который имеет высокую тропность к проводящей системе сердца [152]. ДТ оказывает рефлекторное воздействие на тонус блуждающего нерва, что приводит к нарушению экстракардиальной нервной регуляции миокарда [30, 90, 11]. Поражения почек при дифтерии протекает по типу инфекционно-токсического нефроза, который возникал в остром периоде на высоте интоксикации [30, 87]. Таким образом, иммунопатогенез дифтерии в настоящее время изучен достаточно хорошо, хотя и остаются некоторые спорные вопросы. Требует подтверждение осложнений. гипотеза об аутоиммунной природе дифтерийных Клинические формы дифтерии, специфическая терапия Для дифтерии наиболее характерно поражение слизистой ротоглотки. Выделяют дифтерию с типичной (частой) локализацией процесса ротоглотка, гортань, нос и редкой дифтерия глаз, уха, наружных половых органов, кожи, желудочно-кишечного тракта. Встречаются также комбинированные формы. Классические признаки дифтерийного воспаления фибринозные пленки, отек, регионарный лимфаденит и токсический синдром. Наиболее важными признаками пленок являются их фибринозный характер, плотная спаянность с подлежащими тканями и трудное удаление, (выделение токсигенного штамма коринебактерий дифтерии) в мазках из зева, носа и других поврежденных участков [7]. В лечении больных токсической и дифтерией инфузионная применяется терапия. специфическая, экстракорпоральная Первоначальные дозы и интервалы для повторного введения сыворотки соответствугот детоксикация клинической осуществляется форме дифтерии [124]. Специфическая лошадиной может парентеральным введением антитоксической противодифтерийной сыворотки. ПДС нейтрализовать только циркулирующий токсин, который еще не связан с тканями, поэтому необходимо безотлагательное ее введение при токсической и гипертоксической дифтерии, для создания и поддержания высокой концентрации антитоксина в крови. Задержка с введением ПДС увеличивает риск усиления тяжести болезни и развития тяжелых поражений сердца и нервной системы [46]. Дозы сыворотки и длительность ее применения определяются эмпирически. При гипертоксической дифтерии, которая ранее сопровождалась абсолютной летальностью, эффективных доз не существовало. В соответствии с большей манифестностью симптомов и тяжестью осложнений в 90-е годы при токсической дифтерии необходимо было увеличение объема серотерапии до сотен тысяч ME [9]. Однако, ряд специалистов связывает с длительным и многократным введением гетерологичного белка в виде ПДС рост и тяжесть осложнений, развитие сывороточной болезни, учащение случаев летального исхода [87, 103]. В экспериментах проведенных на кроликах и морских свинках было показано, что даже низкие концентрации антитоксина (0,03-0,125 МЕ/мл), создаваемые введением очень малой дозы сыворотки (15 МБ на 1 кг веса эквивалент 1 тыс. ME для человека) обеспечивали полную защиту 100 животных от 5,6 LD5o токсина. Дозы сыворотки в пределах 20 100 ME при однократном введении создают достаточно высокую концентрацию антитоксина (от 0,5 до 40 МЕ/мл) в течение 3-6 суток после введения. Не зависимо от дозы введения