Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение отдельных представителей рода Dioscorea L.

На правах рукописи

005555599

БУ ВЭЙ

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА БЮвСОКЕА Ь .

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 0 НОЯ 2014

Москва -2015

005555599

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Сорокина Алла Анатольевна — доктор фармацевтических наук, профессор Официальные оппоненты:

Киселева Татьяна Леонидовна - доктор фармацевтических наук, профессор, директор научно-исследовательского центра НО «Профессиональная Ассоциация Натуртерапевтов».

Потанина Ольга Георгиевна — доктор фармацевтических наук, директор центра научных исследований и разработок Центра коллективного пользования (научно-образовательный центр) ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов.

Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Россельхозакадемии.

Защита диссертации состоится « » 2015 г. в /¿/"часов

на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПСУПервый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117997, Москва, Нахимовский проспект, д. 49 и на сайте ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова: www.mma.ru

Автореферат разослан (у 2014 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор

Демина Наталья Борисовна

Общая характеристика работы Актуальность темы. Для флоры некоторых регионов России и Китая характерно наличие растений, применяемых в медицине и относящихся к одному ботаническому роду. Представителями этой группы лекарственных растений являются растения рода Dioscorea L.

Род Dioscorea L. включает более 650 видов, которые широко распространены на всех пяти континентах. Диоскорея ниппонская - Dioscorea nipponica Makino — двудомная лиана, произрастает в России на территории Дальнего Востока. В Китае диоскорея ниппонская встречается практически по всей северо-восточной части страны. Сырье этого вида диоскореи разрешено к медицинскому применению в обеих странах. Диоскорея супротивная - Dioscorea opposita Thunb - древнейшее культурное растение Китая и Японии, используемое как лекарственное, так и пищевое растение и известное под названием «китайский ямс».

В первой половине прошлого столетия медицинское применение диоскореи было ограниченным. Настойка из корневищ с корнями диоскореи входила в состав комплексного препарата «Холелитин» № 1, рекомендованного для лечения желчно-каменной болезни. Научный и практический интерес к растениям рода диоскорея возник в 60-70-х годах ХХв. как к источнику диосгенина, используемого в производстве кортикостероидных препаратов. Из-за невысокого содержания диосгенина сырье диоскореи ниппонской в России использовалось для получения препарата «Полиспонин», представляющего сумму водорастворимых стероидных сапонинов и применяемого как гипохолистеринемическое средство. Корневища с корнями диоскореи включены также в Перечень однокомпонентных гомеопатических лекарственных средств, разрешенных к применению в РФ. В Китае в медицинских целях для приема внутрь используются порошок подземных органов диоскореи ниппонской, отвар и спиртовая настойка. Показаниями к применению являются: ревматоидные

артриты, растяжения сухожилий, хронические бронхиты, астма др. В Корее сырье диоскореи ниппонской в форме отвара назначают при комплексном лечении сахарного диабета. Корневища диоскореи супротивной используются в традиционной китайской медицине при заболеваниях желудка, селезенки, анорексии с хронической диареей, при ряде урологических заболеваний и др.

В настоящее время на Российском фармацевтическом рынке присутствует достаточно большое число биологически активных добавок (БАД), в состав которых входит сухой экстракт диоскореи (Wild Yam, пилюли с диоскореей, Ливер-плас и др.). Основными показаниями к применению этих БАД являются: регуляция работы женских половых желез, остеопороз, снижение уровня холестерина в крови, нормализация артериального давления и др.

Документом, нормирующим качество корневищ с корнями диоскореи ниппонской, в РФ является фармакопейная статья (ФС) 42 1521-80. В Китае качество сырья диоскореи ниппонской и супротивной регламентируется соответствующими статьями ГФ КНР (2005). Эти нормативные документы нуждаются в совершенствовании в соответствии с современными критериями оценки качества лекарственного растительного сырья (ЛРС).

С учетом состояния изученности состава биологически активных веществ (БАВ) диоскореи, лекарственных форм, получаемых из ЛРС в китайской традиционной медицине (КТМ), развивающихся торговых отношений и с целью гармонизации требований к качеству сырья в РФ и КНР целесообразным и актуальным является углубленное изучение двух видов диоскореи (ниппонской и супротивной) и разработка современной нормативной документации (НД) на ЛРС, в соответствии с международными требованиями.

Степень изученности темы исследования. Несмотря на широкое присутствие на фармацевтическом рынке средств на основе экстракта диоскореи, подробные сведения о химическом составе корневищ с корнями

4

диоскореи, за исключением данных по стероидным сапонинам и диосгенину, практически отсутствуют. Нет научно обоснованного, экспериментального подтверждения применения сырья диоскореи в КТМ.

Целью исследования является углубленное изучение метаболома двух видов диоскореи - ниппонской и супротивной, и совершенствование нормативной документации на сырье.

Постановка задач и выбор средств для их решения:

Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. провести информационно-аналитическое исследование по вопросам изучения состава БАВ и фармакологической активности двух видов диоскореи;

2. изучить и уточнить состав БАВ двух видов диоскореи;

3. уточнить и разработать характеристики подземных органов диоскорей ниппонской и супротивной;

4. используя принципы доказательной медицины и опыт применения сырья диоскореи в КТМ, провести изучение фармакологической активности сырья диоскореи;

5. на основании полученных данных разработать проект НД на корневища с корнями диоскореи ниппонской, отвечающий современным требованиям.

Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведения экспериментальных исследований.

Научная новизна. Дана подробная качественная и количественная характеристика состава метаболома диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной с использованием комплекса современных методов анализа: тонкослойной хроматографии (ТСХ), титриметрии, потециометрии, спектрофотометрии, ВЭЖХ и др. Установлено наличие в ЛРС диоскореи помимо стероидных сапонинов полисахаридов, дубильных веществ, флавоноидов, органических кислот, аминокислот, свободных Сахаров.

5

Идентифицированы: флавоноиды-руган, кверцетин, кислоты-аскорбиновая, лимонная, яблочная, свободные сахара—глюкоза, манноза, фруктоза, рамноза, 17 аминокислот. Для определения содержания диосгенина, суммы органических кислот, кислоты аскорбиновой, дубильных веществ, суммы флавоноидов, полисахаридов, суммы свободных аминокислот адаптированы действующие методики определения.

Теоретическая значимость работы. Использование современных физико-химических методов анализа позволило получить новую информацию о качественном составе БАВ диоскорей ниппонской и супротивной и дать количественную оценку. Использование предложенных методик анализа сырья позволит систематизировать контроль качества сырья диоскореи. Экспериментально-практический материал, представленный в работе, может служить теоретической основой разработки лекарственных средств на основе диоскореи, применяемых в терапии сахарного диабета и ревматоидного артрита.

Практическая значимость результатов исследования. На основании проведенных исследований:

■ получены новые сведения о составе БАВ двух видов диоскореи -ниппонской и супротивной;

■ разработан проект ФС «Корневища с корнями диоскореи ниппонской»;

■ получены экспериментальные данные, подтверждающие эффективность применения диоскореи в КТМ в терапии сахарного диабета и ревматоидного артрита;

■ результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России в тему «Лекарственное растительное сырье, содержащее сапонины».

Методология и методы исследования. Объектами исследования служили высушенные корневища с корнями диоскореи ниппонской,

б

заготовленные в Ботаническом саду Первого МГМУ им. И.М.Сеченова (г.Москва) и корневища диоскореи супротивной, заготовленные в Ботаническом саду медицинского института г. ГЦучжон (КНР). При выполнении работы были использованы методы: макроскопический, микроскопический, ТСХ, спектрофотометрия, ВЭЖХ, титриметрия, потенциометрия, гравиметрия и др. Изучение морфолого-анатомических характеристик сырья диоскореи осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып.1. Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с ГФ XI, вып.1 и с помощью компьютерной программы 51аЙ81!са 7,0.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 статьи - в журналах, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ.

Степень достоверности результатов. Изучение качественного состава и количественного содержания БАВ диоскореи проводилось на сертифицированном оборудовании в достаточном числе повторностей (от 6 до 10). Сравнение полученных результатов с применением методов статистической обработки и выборов критериев при фармакологических исследованиях позволяют считать их достоверными.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на XXIV Московской Международной конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2014г.), XXIV Московской международной Гомеопатической конференции» (Москва, 2014г.), научно-практической конференции «II Гаммермановские чтения» (Санкт-Петербург, 2014г.), II научно-практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» (Москва, 2014г.), 09.06.2014 на научной межкафедральной конференции кафедры фармакогнозии фармацевтического факультет и лаборатории фармакогнозии НИИ Фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава Росии.

7

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведен мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования: от постановки задач, их теоретической и практической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения их в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2,3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (№ государственной регистрации 01.2.006 06352.) по научной проблеме «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований». Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты морфолого-анатомического изучения сырья диоскореи ниппонской и диоскореи супротивной;

- результаты изучения качественного состава и определения количественного содержания биологически активных веществ (органических кислот, кислоты аскорбиновой, дубильных веществ, флавоноидов, полисахаридов, аминокислот) в сырье двух видов диоскореи

— ниппонской и супротивной; - результаты изучения фармакологической активности сырья двух видов диоскореи.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 117 страницах компьютерного текста, содержит 18 таблиц и 32 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 экспериментальных глав, выводов, библиографии из 102 наименований, из которых 23 на иностранных языках и 5 интернет ресурсов, приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования. Объектами исследований служили: высушенные корневища с корнями диоскореи ниппонской, заготовленные в Ботаническом саду Первого МГМУ им. И.М.Сеченова (г.Москва) в сентябре 2011 г.; корневища диоскореи супротивной, заготовленные в Ботаническом саду медицинского института г.Щучжон (КНР) в августе 2011 г., водные и спирто-водные извлечения из сырья указанных видов диоскореи.

Для получения экспериментальных данных были использованы следующие методы:

-микроскопический метод применялся для выявления анатомо-диагностических признаков сырья диоскореи, проводился по ОФС «Техника микроскопического анализа» ГФ XI изд., вып.1 на оптическом микроскопе фирмы «ЛОМО» марки «МИКМЕД-6» при увеличении 10х, 20х, 40х. Микрофотографии выполняли с помощью фотоаппарата №соп; -метод гравиметрии использовался для количественного определения в сырье полисахаридов и экстрактивных веществ, извлекаемых водой и водно-спиртовой смесью в ЛРС диоскореи;

-метод титриметрии применялся для количественного определения содержания дубильных веществ, суммы органических кислот, кислоты аскорбиновой;

-спектрофотометрический метод использовался для определения содержания суммы фурастаноловых сапонинов в объектах исследования. Анализы проводили на спектрофотометре SPECORD 200 Analytik Jena (Германия); -потенциометрический метод применяли для определения содержания в объектах исследования дубильных веществ, органических кислот и аскорбиновой кислоты. Определение проводилось с помощью потенциометра «Аквилон рН-410» (Россия);

-метод ВЭЖХ использовали при определении содержания в сырье диоскореи диосгенина, флавоноидов и аминокислот. Исследования проводили на хроматографе Agilent 1100 LS/MS TOF (США) с фотометрическим детектором на диодной матрице и масс-спектрометрическим детектором; -содержание в сырье диоскореи аминокислот определяли также с помощью аминокислотного анализатора;

-метод ТСХ применяли в качественном анализе различных групп БАВ в сырье диоскореи (стероидных сапонинов, флавоноидов, органических кислот, аскорбиновой кислоты, свободных Сахаров, аминокислот). Сорбенты, подвижные фазы и детекторы указаны в третьей главе работы.

Морфолого-анатомическое изучение сырья

В ходе исследования были уточнены внешние признаки сырья диоскореи, дана характеристика цельного сырья диоскореи супротивной. Изучение вариабильности диагностически значимых признаков анатомического строения сырья диоскореи позволило выявить наиболее устойчивые - рафиды и строение проводящих пучков (рис. 1,2,3).

А Б

Рисунок 2. «Давленный» микропрепарат измельченных корневищ с корнями ниппонской. Ув. х 10 Рафиды (А), проводящие пучки (Б).

1 V

_ » • *

А Б

Рисунок 1. Микропрепарат поперечного среза корневищ диоскореи ниппонской (А) и супротивной (Б) Ув. х200. 1 -пучки рафид 2- проводящие пучки

Рисунок 3. «Давленный» микропрепарат измельченных корневищ диоскореи супротивной. Ув. хЮ. Рафиды (А), проводящие пучки (Б).

Изучение качественного состава БАВ сырья двух видов диоскореи

Анализ литературных данных показал, что химический состав БАВ корневищ с корнями диоскореи ниппонской и корневищ диоскореи супротивной изучен не в полном объеме, в связи с чем было проведено изучение качественного состава этих видов сырья с использованием цветных реакций и метода ТСХ. Были применены известные фармакопейные реакции, а также реакции, приведенные в научной литературе. ТСХ-анализ проводили на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-Ф», использовали подвижные фазы и детектирующие реагенты, соответствующие классу исследуемых соединений.

В результате в подземных органах двух видов диоскореи было установлено наличие стероидных гликозидов и диосгенина, полисахаридов, дубильных веществ, флавоноидов (кверцетина и его гликозидов), свободных Сахаров (фруктозы, маннозы, рамнозы, глюкозы), 17 аминокислот. В корневищах диоскореи супротивной было установлено наличие аскорбиновой кислоты.

Определение в сырье диоскореи количественного содержания отдельных групп БАВ

Предварительно в исследуемых образцах сырья диоскореи было определено содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой и 50% спиртом, в соответствии с гравиметрической методикой общей фармакопейной статьи ГФ XI, вып.1. Результаты представлены в табл.1.

Определение содержания фурастаноловых гликозидов и диосгенина

Использование сырья диоскореи в медицине, в том числе и сырья изучаемых видов, обусловлено содержанием стероидных сапонинов. В России в корневищах с корнями диоскореи ниппонской спектрофотометрически определяется сумма фуростаноловых сапонинов (ФС 42-1521-80), в Китае -

содержание диосгенина методом ВЭЖХ (ГФ КНР, 2005). Корневища диоскореи супротивной, также включенные в ГФ КНР, по содержанию действующих веществ не оцениваются.

Приведенные в этих НД методики были адаптированы для анализа изучаемого ЛРС. При ВЭЖХ определении наилучшие результаты показали применение подвижной фазы метиловый спирт-вода (68:32) и аналитической длины волны 210 нм, которые и были использована в дальнейших исследованиях. Результаты представлены на рис.4 и в табл. 1.

Определение содержания полисахаридов

В опытных образцах сырья диоскореи методом гравиметрии в соответствии с методикой ст. 20 ГФ XI изд. определяли содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье. В результате проведенного анализа установлено, что в корневищах диоскореи супротивной содержится в 2,7 раза больше полисахаридов, чем в корневищах с корнями диоскореи ниппонской (19,49±0,04% и 7,25±0,03% соответственно).

д. ниппонская

I *»ч

д.супротивная

Рисунок 4. ВЭЖХ-хроматограммы определения диосгенина в сырье двух видов диоскореи 1 - диосгенин

Определение содержания полисахаридов

В опытных образцах сырья диоскореи методом гравиметрии в соответствии с методикой ст. 20 ГФ XI изд., вып.2 определяли содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье. В результате проведенного анализа установлено, что в корневищах диоскореи супротивной содержится в 2,7 раза больше полисахаридов, чем в корневищах с корнями диоскореи ниппонской (19,49±0,04% и 7,25±0,03% соответственно).

Определение содержания суммы флавоноидов Сумму флавоноидов определяли методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1100 LS/MS TOF (США) с фотометрическим детектором на диодной матрице и времяпролетным масс-спектрометрическим детектором. В следующих условиях: колонка Nucleosil С18 250 х 4,6 мм 5 мкн; подвижная фаза А - 1% раствор муравьиной кислоты, В - ацетонитрил (0 мин -20% В, 40 мин - 40% В, 51 мин - 20% В, 60 мин - 20% В); время анализа 60 мин, скорость потока -5 мл/мин; температура 30° С, длина волн детектора 360 ни и 290 нм. Результаты представлены на рис.5 и в табл.1.

Рисунок 5. ВЭЖХ-МС хроматограммы спиртового извлечения корневищ с корнями диоскореи ниппонской.

Таблица 1. Содержание БАВ в подземных органах двух видов диоскореи

14

БАВ Содержание, %

Корневища диоскореи супротивной Корневища с корнями диоскореи ниплонской

Экстрактивные вещества, извлекаемые водой 28,74+0,10 27,31+0,80

Экстрактивные вещества, извлекаемые 50% спиртом 34,87+0,62 33,86±0,60

Сумма фурастаноловых сапонинов 3,50 ±0,14 3,86 ±0,17

Диосгенин 2,00±0,08 2,20±0,09

Полисахариды 19,49 ±0,04 7,25 ± 0,03

Сумма флавоноидов (в пересчете на рутин) 0,94±0,04 (в пересчете на кверцетин) 0,180±0,008

Определение содержания дубильных веществ в пересчете на танин Дубильные вещества широко распространены в растительном мире, встречаются они и в однодольных растениях, к которым относятся растения рода диоскорея. Обладая широким спектром фармакологического действия, дубильные вещества вносят существенный вклад в общую активность ЛРС и суммарных растительных препаратов, даже не являясь основной действующей группой БАВ. Накапливаются дубильные вещества преимущественно в подземных органах лекарственных растений.

Для количественного определения дубильных веществ в сырье диоскореи были использованы две методики: фармакопейная (ГФ XI изд., вып.1) -перманганатометрическое титрование, и потенциометрическое титрование (методика А.И.Мараховой), позволяющее получать более точные результаты. Результаты представлены в табл.2

Установлено, что сырье диоскореи характеризуется невысоким содержанием дубильных веществ (0,26-0,53%). Диоскорея ниппонская, произрастающая в РФ, накапливает дубильных веществ в два раза больше, чем диоскорея супротивная.

Таблица 2. Содержание дубильных веществ и органических кислот в сырье двух видов диоскореи (п=6, р=0,95)

ЛРС Содержание, %

дубильные вещества в пересчете на танин органические кислоты в пересчете на лимонную кислоту

Методика ГФ XI Потенциометрия Титриметрия с индикатором Потенциометрия

Корневища с корнями диоскореи ниппонской 0,53±0,08 0,46±0,01 0,64±0,06 0,64±0,07

Корневища диоскореи супротивной 0,26±0,07 0,23±0,02 0,57±0,02 0,59±0,04

Определение содержания свободных органических кислот и аскорбиновой кислоты Свободные органические кислоты являются неотъемлемой частью метаболома лекарственных растений, в том числе и диоскорей. Исследования проводили двумя методами: обратным титрованием и потенциометрически. Результаты анализа представлены в таб.2.

В ходе исследования показано, что подземные органы диоскорей ниппонской и супротивной содержат практически одинаковое количество органических кислот в пересчете на кислоту лимонную и абсолютно сухое сырье - 0,64 % и 0,57 % соответственно.

Количество аскорбиновой кислоты в корневищах диоскореи супротивной также определяли двумя методами: по методике ст. 38 «Плоды шиповника» ГФ XI изд. (титрование 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия) и потенциометрически. Кривые титрования представлены на рис.6. В результате было установлено, что содержание аскорбиновой кислоты в сырье составило 0,16±0,07% (титриметрия) и 0,22±0,05% (потенциометрия) при п=6; р=0,95.

1б

Интегральная кривая титрования АК сырья диоскореи супротивной

т Дифференциальная кривая титро вания сырья диоскореи АК супро тивной

100

/ / \

/

/ \ ............ .............

, . . . Лч > 1 >

0 ШгШШМ

оо.иго.мя.я.1

УК.

Т(чммр ф-фни),Ш1

Рисунок 6. Интегральная и дифференциальная кривые потенциометрического титрования аскорбиновой кислоты в корневищах диоскореи супротивной.

Определение содержания аминокислот Метод ТСХ оказался малоинформативным в анализе аминокислот диоскореи. В связи с этим определение содержание свободных аминокислот в корневищах с корнями диоскореи ниппонской проводили методом ОФ ВЭЖХ (рис.7), в корневищах диоскореи супротивной - на аминокислотном анализаторе (рис.8). Исследования проводили с использованием стандартных образцов сооветствующих аминокислот. В сырье определены 16 и 17 аминокислот соответственно, из них 7 незаменимых (валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, лизин и фенилаланин). Результаты анализа представлены в табл. 2.

Рисунок 7. ВЭЖХ-хроматограмма аминокислот в корневищах с корнями диоскореи ниппонской.

; 4 1»С Ы V »

••й I/

щ 1

г 1 1

I е

з^ §

ррфьи.

Рисунок 8. Хроматограмма аминокислот в корневищах диоскореи супротивной, полученная на аминокислотном анализаторе.

Таблица 3. Содержание аминокислот в подземных органах двух видов диоскореи

Содержание, %

Аминокислота Корневища с корнями Корневища диоскореи

диоскореи ниппонской супротивной

Аспартат 0,21 0,91

Треонин* 0,07 0,25

Серии 0,1 1,12

Глутамат Отсутствие 0,91

Глицин 0,03 0,35

Алании 0,21 0,50

Цистин Отсутствие 0,16

Валин* 0,06 0,34

Метионин* 0,12 0,08

Изолейцин* 0,07 0,23

Лейцин* 0,08 0,42

Фенилаланин* 0,09 0,29

Тирозин 0,1 0,17

Лизин* 0,08 0,30

Гистидин 0,13 0,15

Аргинин 0,2 0,73

Пролин Отсутствие 0,35

Цистеин 0,4 Отсутствие

Аспарагин 0,06 Отсутствие

Сумма 2,01 7,26

*— незаменимые аминокислоты

Результаты морфолого-анатомического изучения сырья диоскореи ниппонской и исследования БАВ сырья были использованы при разработке проекта фармакопейной статьи «Корневища с корнями диоскореи ниппонской».

Изучение фармакологической активности сырья диоскореи

Учитывая опыт применения сырья диоскореи в КТМ на следующем этапе исследований в опытах на животных было проведено изучение некоторых видов фармакологической активности диоскореи.

Изучение гипогликемической активности полисахаридов диоскореи супротивной.

Изучение гипогликемической активности полисахаридов диоскореи супротивной проводили на модели аллоксанового диабета на 80 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 22,0±2,0г. Результаты эксперимента оценивали по весу мышей, уровню глюкозы в крови и с помощью глюкозо-толерантного теста. Полученные результаты представлены на рис.9, 10.

Влияние полисахаридов диоскореи супротивной на вес животных

Группы животных

Рисунок 9. Влияние полисахаридов диоскореи супротивной на вес животных (п=10).

Полученные в ходе эксперимента результаты показали, что полисахариды диоскореи супротивной статистически достоверно (р<0,05)

повышают вес диабетических мышей на 5,55%, 10,68% и 11,53% в зависимости от вводимой дозы (10мг/кг, 20мг/кг, ЗОмг/кг). Введение подопытным животным с диабетом полисахаридов диоскореи супротивной достоверно (р<0,05) снижало содержание сахара в крови по сравнению с контрольной диабетической группой, не получавшей лечения, (рис.9) на 5,68%; 21,52% и 24,08% соответственно в зависимости от вводимой дозы (10мг/кг, 20мг/кг, ЗОмг/кг). Наибольший гипогликемический эффект давало введение полисахаридов в дозе 30 мг/кг.

Влияние полисахаридов диоскореи супротивной на содержание глюкозы в крови животных

■ Начало амгакримепта

фпш жиьоткых

Рисунок 10. Влияние полисахаридов диоскореи супротивной на содержание глюкозы в крови животных (п=10).

Изучение иммуномоделирующего действия сапонинов диоскореи ниппонской при адьювантном артрите.

Исследования проводили на крысах-самцах линии \Vistar весом 160-180г. Артрит вызывали введением животным полного адъюванта Фрейнда. Подопытным животным вводили экстракт диоскореи ниппонской в дозах 20мг/кг, 40 мг/кг и 80 мг/кг веса. Оценку действия сапонинов диоскореи ниппонской устанавливали по изменению индексов веса животного, индексов тимуса и селезенки, а также по уровню цитокинов 11,-1, 1Ь-6, 1Ь-8, ТМР-а в крови и синовиальной жидкости. Препаратом сравнения служили гликозиды трехкрыльника, используемые в Китае для лечения ревматоидного артрита.

Развитие артрита вызывало у животных снижение веса в 1,7 раза, индекса тимуса - в 2 раза и увеличение индекса селезенки в 2,3 раза. Введение экстракта диоскореи ниппонской приводило к статистически значимому (р<0,05) положительному влиянию на все индексы (рис.11)

Изучение влияния сапонинов диоскореи ниппонской на уровни цитокинов в сыворотке крови и синовиальной жидкости крыс с адъювантным артритом (табл.4,5) показало, что у животных всех групп, получавших растительные экстракты, уровни всех изучаемых цитокинов были статистически ниже (р<0,05), чем у животных, не получавших лечения -группа АА.

Влияние сапонинов диоскореи супротивной на индексы веся

группы

Влияние сапонинов диоскореи ниппонской на индексы тимуса и селезенки животных

» о -.-.-■-.-.-.-

ВС Ш Ч Ш> И) и ТР группы

Рисунок 11. Влияние сапонинов диоскореи ниппонской на индексы веса (I тимуса (Т1) и селезенки (81) животных с адъювантным артритом (п=20).

Таким образом, в ходе проведенных исследований было статистически достовено показано влияние сапонинов диоскореи ниппонской на иммунную систему животных с адъювантным артритом, сопоставимое с действием гликозидов трехкрыльника.

Таблица 4. Влияние сапонинов диоскореи ниппонской на цитокины сыворотки крови животных (п=20)

группы 1Ь-6, р§/т1 1Ь-8, pg/ml

ЫС 0,18 ±0,04 8,74 ± 6,27 11,09 ±5,58 1,14 ±0,59

АА 0,56 ±0,13 393,14 ±122,48 82,59 ±26,44 2,44 ± 0,85

НЭ 0,27 ±0,09 215,23 ±99,39 39,11 ±27,32 1,73 ±0,71

МО 0,28 ± 0,08 205,16 ±88,43 40,24 ± 16,35 1,68 ±0,72

ьэ 0,29 ±0,09 226,52 ± 106,51 37,74 ±25,56 1,79 ±0,99

ТР 0,30 ± 0,07 211,47 ±86,63 42,36 ± 18,81 1,67 ±0,54

Таблица 5. Влияние сапонинов диоскореи ниппонской на цитокины синовиальной жидкости животных (п=20)

группы 1Ъ-6, р^ш! 1Ь-8, р^ш! ТЫР-а, П(ут1

N0 0,36 ± 0,09 8,71 ±4,65 11,39 ±5,96 1,05 ±0,36

АА 1,18 ±0,36 914,09 ±247,48 134,42 ±55,15 2,02 ± 0,88

НО 0,65 ±0,18 544,25 ± 129,08 80,24 ±41,16 1,19 ±0,49

МО 0,61 ±0,22 519,05 ±109,94 85,04 ±49,96 1,14 ± 0,37

ьо 0,63 ± 0,29 495,27 ±146,86 82,21 ±38,89 0,21 ±0,35

ТР 0.69 ±0,32 523,34 ± 122,67 76,23 ± 35,45 1,14 ±0,33

Общие выводы

1. Проведено информационно-аналитическое исследование вопроса изучения метаболома и морфолого-анатомических признаков корневищ с корнями диоскореи ниппонской и корневищ диоскореи супротивной.

2. При морфолого-анатомическом изучении сырья двух видов диоскореи — ниппонской и супротивной - дана характеристика внешнего вида сырья, уточнены и визуализированы диагностические признаки анатомического строения цельного и измельченного сырья.

3. Проведено углубленное изучение состава биологически активных веществ в корневищах с корнями диоскореи ниппонской и корневищах диоскореи супротивной. Установлено, что в сырье двух видов диоскореи кроме стероидных сапонинов содержатся полисахариды, флавоноиды, дубильные

вещества, аскорбиновая кислота, органические кислоты, аминокислоты. В корневищах с корнями диоскореи ниппонской аскорбиновая кислота отсутствует.

4. Установлено, что корневища с корнями диоскореи ниппонской содержат: 27,31±0,80% экстрактивных веществ, извлекаемых водой; 33,86±0,60% -извлекаемых 50% спиртом; 3,86±0,17% суммы фурастаноловых гликозидов и 2,20±0,09% диосгенина; 7,25±0,03% полисахаридов; 0,180±0,008% суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин; 0,53±0,08% дубильных веществ в пересчете на танин; 0,64±0,06% суммы органических кислот в пересчете на лимонную кислоту; 2,01% свободных аминокислот.

5. Корневища диоскореи супротивной содержат: 28,74±0,10% экстрактивных веществ, извлекаемых водой; 34,87±0,62% - извлекаемых 50% спиртом; 3,50±0,14% суммы фурастаноловых гликозидов и 2,00±0,08% диосгенина; 19,49±0,04% полисахаридов; 0,94±0,04% суммы флавоноидов в пересчете на рутин; 0,26±0,07% дубильных веществ в пересчете на танин; 0,57±0,02% суммы органических кислот в пересчете на лимонную кислоту; 0,22±0,05% аскорбиновой кислоты; 7,26 % свободных аминокислот.

6. Полученные данные по изучению морфолого-анатомических признаков и метаболома корневищ с корнями диоскореи ниппонской положены в основу разработанного проекта фармакопейной статьи «Корневища с корнями диоскореи ниппонской» для ГФ КНР.

7. В экспериментах на животных (мышах) на модели аллоксанового диабета установлено наличие гипогликемического действия полисахаридов, выделенных из корневищ диоскореи супротивной. Статистически достоверно (р<0,05) показано, что полисахариды снижают содержание глюкозы в крови животных и способствуют увеличению их веса; Установлено иммуномоделирующее действие экстракта корневищ с корнями диоскореи ниппонской на иммунную сиситему животных (крыс) с адьювантным артритом. Введение экстракта приводило к увеличению веса

23

крыс и индекса тимуса, а также снижало индекс селезенки. У животных, получавших экстракт диоскореи, уровни всех изучаемых цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-a) в сыворотке крови и в синовиальной жидкости были статистически ниже (р<0,05), чем у животных, не получавших лечения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Bu Wei, Liu Yu , Li Defeng . Study on the Quality Standards of Yangshen Chuanxiong Xingnao Tablet. // Shanxi Med J .2013,- №12.-C.1427-1429.

2. Сорокина A.A., Бу Вэй, Марахова А.И. Содержание дубильных веществ в двух видах диоскореи. // Фармация — 2014.— №1.— с. 14-16.

3. Сорокина А.А., Бу Вэй. Изучение фенольных соединений двух видов диоскореи. //Сборник материалов XIX Международного конгресса «Человек и лекарство», Москва, 7-11 апреля 2014 - с. 329.

4. Сорокина А.А., Бу Вэй. Соврешенствование характеристик подлинности сырья диоскореи ниппонской. // Сборник материалов XIX Международного конгресса «Человек и лекарство», Москва, 7-11 апреля 2014 - с. 329.

5. Сорокина А.А., Бу Вэй. Изучение иммуномодулирующего действия сапонинов диоскореи при артрите. // Фармация.-2014.-№ 3- с. 45-48.

6. Bu Wei, Shen Xin. Clinical analysis of the eficacy Bulbifera and Fosinopril treatment of diabetic nephropathy. // Chinese Journal of Gerontology. 2014

7. Бу Вэй, Сорокина А.А. Сравнительный анализ требований к качеству сырья диоскореи в России и Китае. // Сборник научных трудов «II Гаммермановские чтения». Санкт-Петербург, 03-06 февраля 2014-с.40-43.

8. Бу Вэй, Сорокина А.А. Изучение состава гидрофильных биологически активных веществ диоскореи ниппонской. // Сборник материалов XXIV Московской международной гомеопатической конференции «Развитие

гомеопатического метода в современной медицине», Москва, 25 января 2014,-с. 149-150.

9. Бу Вэй, Сорокина A.A. Содержание диосгенина в двух видах диоскореи. //Материалы II научно-практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» (тезисы докладов). Сеченовский вестник. 2014-№1 (15).- с. 120.

10. Бу Вэй, Сорокина A.A. Изучение состава биологически активных веществ диоскореи супротивной. // Сборник материалов научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию кафедры фармакогнозии и фармацевтической технологии Ярославской государственной медицинской академии. Ярославль, 2014.- с.61-63.

Список использованных сокращений:

ЛРС — лекарственное растительное сырье

БАВ - биологически активные вещества

БАД - биологически активная добавка

КТМ - китайская традиционная медицина

ИД — нормативный документ

ГФ - государственная фармакопея

ФС — фармакопейная статья

ЛП - лекарственный препарат

ТСХ - тонкослойная хроматография

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

MC - масс-спектрометрия

Подписано в печать: 29.10.2014 Объем: 1,5 усл.пл. Тираж: 100 экз. Заказ № 1000 Отпечатано в типографии «Реглет» 107031, г. Москва, ул. Рождественка, д. 5/7, стр. 1 (495) 623 93 06; www.reglet.ru