Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение метаболома сырья и лекарственных форм крапивы двудомной

На правах рукописи

?

Скалозубова Татьяна Александровна

Изучение метаболома сырья и лекарственных форм крапивы двудомной

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

31 ОКТ 2013

Москва - 2013

005536422

005536422

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения

Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,

профессор Сорокина Алла Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ

им. И.М. Сеченова Минздрава России Прокофьева Вера Ивановна

кандидат фармацевтических наук, руководитель отдела клинических исследований и регистрации лекарственных средств

ЗАО «SKY LTD» Чубарова Галина Дмитриевна

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится 2013 г. в_часов на

заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан »

2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор

Наталья Борисовна Демина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Несмотря на достигнутые успехи в области синтеза лекарственных веществ, лекарственные растения остаются важным источником для получения лекарственных препаратов. В их число входят препараты, получаемые из листьев крапивы двудомной.

Крапива двудомная используется в официнальной и народной медицине в качестве кровоостанавливающего и витаминного средства, применяется в гомеопатии. Наиболее часто листья крапивы используются в виде настоя, также разрешен к применению жидкий экстракт.

Крапива двудомная изучалась достаточно подробно (работы Сошниковой О.В., Сапроновой H.H. и др.), однако данные о гидрофильной фракции биологически активных веществ (БАВ) растения представлены недостаточно. Действующая на настоящий момент нормативная документация на листья крапивы не отвечает современным требованиям стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС).

Рост заболеваний, связанных с нарушением обмена кальция в организме (остеопороз, дефицит кальция у детей), обуславливает повышенный интерес к лекарственным средствам (JIC), являющимися источниками кальция. Широкий спектр таких JIC в аптеках представлен, в основном, синтетическими препаратами, которые имеют ряд побочных эффектов. В тоже время, минеральные вещества лекарственных растений (JIP) находятся в биоусваиваемой форме и более эффективны в нормализации минерального обмена.

Листья крапивы двудомной, помимо богатого комплекса БАВ (флавоноиды, витамины, дубильные вещества, органические кислоты и др.), содержат значительное количество кальция, который переходит в жидкие лекарственные формы (работы Арзамасцева А.П., Листова С.А., Петрова A.B. и др.), поэтому, получаемые из сырья крапивы, настой и жидкий экстракт могут рассматриваться в качестве возможного источника кальция.

Целью исследования является углубленное изучение гидрофильной части

БАВ и минерального состава метаболома крапивы двудомной, а также

з

рассмотрение возможности получения лекарственной формы (ЛФ) крапивы двудомной, обогащенной кальцием.

Постановка задач и выбор средств для их решения: Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. провести информационно-аналитическое исследование по вопросам изучения метаболома и биологической активности крапивы двудомной;

2. изучить гидрофильную фракцию БАВ и минеральный комплекс сырья крапивы двудомной;

3. уточнить и разработать характеристики листьев крапивы двудомной для создания проекта фармакопейной статьи (ФС) на сырье;

4. провести сравнительный анализ БАВ в сырье, аллопатических и гомеопатических лекарственных формах крапивы двудомной, используя принцип «сквозной стандартизации»;

5. изучить факторы, способствующие переходу кальция из сырья в ЛФ. Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и

проведения экспериментальных исследований.

Научная новизна. Дана подробная качественная и количественная характеристика гидрофильной фракции БАВ и минерального состава метаболома крапивы двудомной с использованием комплекса современных методов анализа (тонкослойная хроматография (ТСХ), атомно-абсорбционная спектрометрия, титриметрия, потенциометрия, спектрофотометрия). Идентифицированы: флавоноиды - рутин, кверцетин, лютеолин, кумарин - скополетин, кислоты -аскорбиновая, кофейная, галловая, хлорогеновая. Для определения содержания суммы свободных органических кислот, кислоты аскорбиновой, дубильных веществ, суммы флавоноидов, суммы гидроксикоричных кислот, хлорофилла, полисахаридов, восстанавливающих моносахаров, суммы свободных аминокислот, макроэлементов кальция и магния адаптированы действующие и разработаны оригинальные методики определения, защищенные двумя патентами РФ на изобретение.

В процессе исследований в сравнительном аспекте методик титриметрического анализа (титрование 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия, йодометрия и йодатометрия) показана равноценная возможность их использования для анализа кислоты аскорбиновой в листьях и ЛФ крапивы. Установлено, что наиболее оптимальной для анализа является методика йодометрии.

Разработаны оригинальные методики комплексонометрического определения макроэлементов кальция и магния, и определения содержание кальция методом потенциометрии с использованием ионоселективного кальциевого электрода в листьях и ЛФ крапивы двудомной, методики защищены патентами РФ № 2466387 и № 2488818.

Подобраны условия увеличивающие переход кальция и магния из сырья в извлечение. Показана возможность получения методом дробной мацерации жидкого экстракта листьев крапивы двудомной, обогащенного ионами кальция. Дана качественная и количественная характеристика полученного экстракта.

Практическая значимость результатов исследования. На основании проведенных исследований:

- разработан проект ФС «Крапивы листья» для ГФ XII изд. В проект ФС введены новые разделы «Количественное определение» и «Микробиологическая чистота», существенно дополнены разделы: «Внешние признаки» (добавлено описание порошков разной степени измельченности), «Микроскопия» (проведена визуализация и добавлены микроскопические характеристики на измельченное сырье и порошки), «Качественные реакции» (добавлены хроматографические характеристики сырья по аскорбиновой кислоте и флавоноидам), «Числовые показатели» (введены разработанные показатели содержания действующих веществ и показатели, характеризующие порошки крапивы);

- в работу испытательной лаборатории ООО «ЦККЛС «Центр Экофарм» внедрена йодометрическая методика количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственном растительном сырье, содержащем витамины, и

методика определение кальция в растительных биологически активных добавках (БАД) методом потенциометрии с использованием кальций-селективного электрода;

- в учебный процесс кафедры фармакогнозии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России в тему «Лекарственное растительное сырье, содержащее витамины» внедрена альтернативная методика определения аскорбиновой кислоты методом йодометрии и йодатометрии.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведен мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования: от постановки задач, их теоретической и практической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения их в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 6 и 7 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 6 статей - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 патента РФ на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения состава и определения содержания биологически активных веществ (органических кислот, кислоты аскорбиновой, дубильных веществ, флавоноидов, гидроксикоричных кислот и хлорофилла, полисахаридов,

восстанавливающих моносахаров, аминокислот, макроэлементов кальция и магния) в листьях и лекарственных формах крапивы двудомной;

- данные по изучению ЛФ крапивы: настоя и жидкого экстракта из листьев крапивы, настоя гомеопатического и настойки матричной гомеопатической;

- результаты исследований по разработке методик количественного определения макроэлементов кальция и магния в листьях и ЛФ крапивы двудомной.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на XXI Московской Международной Гомеопатической конференции (Москва, 2011 г.), Итоговой Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, 2011 г.), конференции «Вопросы стандартизации лекарственных препаратов» (секция молодых ученых) (Москва, 2010 г.), 5-й Международной научно-методической конференции «Фармобразование-2013. Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2013 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (№ государственной регистрации 01.2.006 06352) по научной проблеме «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований».

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 36 таблиц и 21 рисунок.

Работа состоит из введения, обзора литературы, 8 экспериментальных глав, выводов, библиографии из 135 наименований, из которых 14 на иностранных языках и 3 интернет ресурса, приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили: промышленные образцы листьев крапивы фирмы ЗАО АПФ «Фито-ЭМ», в пачках по 50 г серии 020210; высушенные и свежие трава, листья, корневища и корни крапивы двудомной собранные в Домодедовском районе Московской области в 2011 году; настой листьев крапивы 1:10, приготовленный по методике ГФ XI изд.; настой гомеопатический листьев крапивы, приготовленный по методике ОФС 42-0001-00; жидкий экстракт листьев крапивы 1:1, приготовленный методом дробной мацерации; настойки гомеопатические матричные, приготовленные из свежего целого цветущего растения крапивы двудомной и из свежих листьев крапивы двудомной по методике ВФС 42-279996.

Для получения экспериментальных данных были использованы следующие методы:

- метод спектрофотомерии применялся для изучения количественного содержания суммы флавоноидов, суммы аминокислот, восстанавливающих моносахаров, гидроксикоричных кислот и хлорофилла в объектах исследования. Исследования проводили на спектрофотометре SPECORD 200 Analytik Jena (Германия). Этот метод применялся также для получения абсорбционных спектров сырья и настоев крапивы, которые снимали как в видимой, так и в УФ области при длинах волн от 200 до 800 нм;

- метод титриметрии применялся для количественного определения суммы свободных органических кислот, аскорбиновой кислоты, дубильных веществ, кальция и магния;

- метод гравиметрии использовался для количественного определения полисахаридов и экстрактивных веществ, извлекаемых водой и водно-спиртовой смесью в JIPC крапивы, а также сухого остатка в ЛФ крапивы;

- метод потенциометрии использовался для определения pH настоев и определения содержания кальция и магния в объектах исследования. Определение

проводилось с помощью потенциометра (иономера) «И 130 М» (Россия);

- метод ТСХ использовался для идентификации различных групп Б AB: кумаринов, флавоноидов, органических кислот в сырье и ЛФ крапивы. Сорбенты, подвижные фазы и детекторы указаны в третьей главе работы;

- метод атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС) применялся для количественного определения кальция и магния в сырье крапивы. Был использован атомно-абсорбционный спектрометр AAS Solaar 969 MKII (Германия).

Для определения качественного состава БАВ сырья и лекарственных форм крапивы использовали качественные реакции, методики которых приведены в статьях ГФ XI, вып. 2, стр. 275 «Листья толокнянки» (дубильные вещества), ГФ XI, вып. 2, стр. 323 «Трава зверобоя», ГФ XI, вып. 2, стр. 244 «Цветки бессмертника песчаного» (флавоноиды), ГФ XI, вып. 2, стр. 264 «Листья подорожника большого», а также методики описанные в научной литературе.

Микроскопический анализ проводился по общей фармакопейной статье (ОФС) «Техника микроскопического анализа» ГФ XI изд. на оптическом микроскопе фирмы «ЛОМО» марки «МИКМЕД-6» при увеличении 10, 20, 40.

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 1, стр. 199, а также с помощью компьютерной программы STATISTICA 7,0.

Изучение гидрофильных биологически активных веществ листьев крапивы

двудомной

Листья крапивы двудомной являются фармакопейным сырьем, и используются в официнальной медицине в качестве кровоостанавливающего средства в виде водных или водно-спиртовых ЛФ — настоя и жидкого экстракта. Что потребовало углубленного изучения состава гидрофильной фракции растительного сырья.

Для проведения качественного анализа получали водные и водно-спиртовые извлечения из листьев крапивы двудомной в соотношении 1:10. С использованием пробирочных реакций в сырье было показано наличие сапонинов, дубильных веществ, флавоноидов, полисахаридов. Для доказательства присутствия в сырье аскорбиновой кислоты, флавоноидов, кумарина скополетина, фенолкарбоновых кислот использовали метод ТСХ. Определено содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой и 50% спиртом этиловым (17,35±0,03% и 25,01±0,02%, соответственно).

Для количественной оценки БАВ, входящих в гидрофильную фракцию метаболома крапивы двудомной, был адаптирован ряд фармакопейных методик, применяемых в анализе ЛРС. Полученные данные приведены в табл. 6.

Анализ УФ-спектров спиртовых извлечений листьев крапивы двудомной показал возможность определять количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, используя в качестве рабочей длину волны 410 нм. Учитывая химический состав и реакцию среды извлечений из листьев крапивы, определение флавоноидов проводили с использованием ацетатного буфера (рН 4,75).

Содержание аскорбиновой кислоты в листьях крапивы определяли тремя методиками: по методике ст. 38 ГФ XI «Плоды шиповника» (титрование 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия), по методикам йодатометрии и йодометрии, используемым в анализе субстанции и препаратов аскорбиновой кислоты и модифицированным для анализа листьев крапивы. Исследование проводили на одной серии сырья. Проведенный сравнительный анализ (табл. 1, 2), вследствие сопоставимости результатов, показал возможность их использования для анализа аскорбиновой кислоты в листьях крапивы двудомной. Данные, полученные нами, подтверждают результаты, описанные в работе Сергуновой Е.В. (2002 г.) для плодов шиповника.

Таблица 1. Содержание аскорбиновой кислоты в листьях крапивы, определенное разными методиками (п=10; р=0,95)

Методика количественного определения Содержание аскорбиновой кислоты, мг%

Титримстрия (ГФ XI) 30,15±0,03

Иодатометрия 36,40±0,02

Иодометрия 34,35±0,02

Таблица 2. Метрологические характеристики методик количественного определения аскорбиновой кислоты в листьях крапивы (п=10; р=0,95)

X, мг% 1 ^ 1 8 1 ±ДХ 1

Титрование 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия

30,15 1 2,42 1 1,56 1 0,03 1 0,10

Иодатометрия

36,40 1 0,77 0,88 1 0,02 1 0,05

Иодометрия

34,35 1 1,03 1 1,01 1 0,02 | 0,06

Для последующих исследований нами был использован метод йодометрии, как наиболее легкий в исполнении и воспроизводимый.

Изучение содержания макроэлементов кальция и магния в крапиве

двудомной

Содержание кальция (Са) и магния (М§) в крапиве двудомной определяли методом ААС, комплексонометрически, а также потенциометрически с использованием кальций-селективного электрода.

Для определения методом ААС образцы сырья (листья, стебли, корневища и корни крапивы двудомной) предварительно измельчали и подвергали сухому озолению, с последующим растворением в разбавленной 1:1 кислоте азотной. Полученные данные представлены в табл. 3.

Для решения одной из задач настоящего исследования (изучение возможности получения ЛФ крапивы двудомной, обогащенной Са) необходимо было разработать точную, простую и быструю в исполнении методику количественного определения. За основу была взята методика

комплексонометрической оценки субстанции кальция хлорида, используемая в российской и британской фармакопеях.

Таблица 3. Содержание кальция и магния в крапиве двудомной, определенное методом ААС

ЛРС Содержание, %

Кальций Магний

Листья 1,3000 0,9000

Стебли 1,1000 0,8000

Корневища и корни 1,1000 0,9000

В разработанной для анализа листьев крапивы методике определение складывалось из следующих этапов: к водному извлечению добавляли раствор натрия гидроксида концентрированный для осаждения катионов магния в виде магния гидроксида, т.к. они мешают определению, катионы кальция остаются в анализируемом образце. Полученный осадок отфильтровывали, а фильтрат нейтрализовали кислотой хлористоводородной концентрированной до рН = 7-8. Дальше рН фильтрата доводили до значения, при котором работает индикатор, добавляли небольшое количество индикаторной смеси и титровали 0,05 М раствором трилона Б (ЫаЭДТА) до перехода окраски. Была рассмотрена возможность использования трех индикаторов: эриохрома черного Т, мурексида и хромогена темно-синего. Результаты, полученные при использовании всех индикаторов, сопоставимы (табл. 4, 5). Для дальнейшего исследования был выбран хромоген темно-синий, вследствие легкости регистрирования конечной точки титрования из-за очень четкого перехода окраски. Разработанная методика защищена патентом РФ. Метрологические характеристики показали возможность использования методики для количественного определения Са и М§ в сырье крапивы.

Таблица 4. Содержание кальция в листьях крапивы двудомной, определенное комплексонометрическим методом (п=10; р=0,95)

Анализируемое сырье Содержание кальция, %

Индикатор

Эриохром черный Т Мурексид Хромоген темно-синий

Листья 0,4732±0,0005 0,4904±0,0002 0,4904±0,0005

Стебли 0,3760±0,0005 0,3727±0,0002 0,3171±0,0005

Корневища и корни 0,3123±0,0002 0,2853±0,0007 0,2171±0,0005

Таблица 5. Метрологические характеристики методики комплексонометрического определения кальция в листьях крапивы (п=10; р=0,95)

X, мг% 8* 5 ±ДХ Е,%

Индикатор - эриохром черный Т

0,4732 0,0007 0,0266 0,0005 0,1145

Индикатор - мурексид

0,4904 0,0001 0,0116 0,0002 0,0232

Индикатор - хромоген темно-синий

0,4904 0,0007 0,0267 0,0005 0,0535

Также была разработана методика потенциометрического определения Са с использованием электрода, селективного к элементу, обратимого по отношению к этому иону и реагирующего на Са2+ с высокой чувствительностью. В разработанной методике проводили измерение электродвижущей силы анализируемой пробы, доведенной до рН 5 кислотой хлористоводородной, с добавлением раствора калия хлорида с концентрацией 1 моль/л в соотношении 5:1, с помощью хлорсеребряного и кальций-селективного электродов с последующим нахождением концентрации кальция по калибровочному графику. Содержание Са в сырье крапивы, определенное потенциометрически составило в листьях 0,4698±0,0004%, стеблях 0,4088±0,0004%, корневищах и корнях 0,3246±0,0003%, полученные результаты сопоставимы с данными комплексонометрического определения (табл. 4).

Изучение динамики накопления гидрофильных БАВ и макроэлементов кальция и магния в листьях крапивы двудомной

Разработанные в ходе исследования методики количественного определения БАВ были использованы для изучения динамики накопления в сырье крапивы аскорбиновой кислоты, флавоноидов, кальция и магния. Для анализа было использовано ЛРС крапивы, заготовленное в Московской области (Домодедовский район) в различные фазы вегетации растения (с апреля по сентябрь 2011 г.).

Анализ полученных данных (рис. 1, 2) показал, что наибольшее содержание аскорбиновой кислоты (44,85±0,06 мг% - 46,97±0,04мг%) и суммы флавоноидов (0,2194±0,0001% - 0,3004±0,0001%) накапливается в листьях крапивы двудомной в фазу цветения (июль - август месяцы). В это же время в сырье отмечено и максимальное содержание Са (4,2436±0,0003% 4,4256±0,0003%) и Mg (1,8411±0,0004% - 2,6640±0,0003%).

Рисунок 1. Динамика накопления аскорбиновой кислоты и флавоноидов листьях крапивы по фазам вегетации

4,5 - | - -

4 . 1 I в Апрель

2,5 1 А I 1 1 А-I---- и Июнь

2 111111 ,1 ■ Июль

• Д1Й11Д ¡1мЖА - - "Август

ни Ш 1 ААашЛА УСентябрь

О ¥—-1-Г

Содержание кальция Содержание магния

Рисунок 2. Динамика накопления кальция и магния в листьях крапивы по фазам вегетации

Изучение лекарственных форм, получаемых из крапивы двудомной

Зарегистрированными ЛФ крапивы двудомной являются настой и жидкий экстракт, которые применяются в качестве кровоостанавливающего средства. Это фармакологическое действие обеспечивает витамин Кь обладающий коагуляционной способностью. Однако в настой витамин К1 практически не переходит, и кровоостанавливающее действие осуществляется за счет других БАВ метаболома крапивы двудомной, таких, как флавоноиды, дубильные вещества и соединения минеральной природы - соли кальция.

Для изучения ЛФ крапивы двудомной готовили настой (1:10) из листьев по фармакопейной методике. Жидкий экстракт (1:1) из листьев крапивы был получен в лабораторных условиях методом дробной мацерации, с использованием в качестве экстрагента 50% спирта этилового. Полученный жидкий экстракт соответствовал требованиям статьи «Экстракты» ГФ XI, вып. 2. Полученные ЛФ крапивы были охарактеризованы по внешнему виду, в них были определены рН и сухой остаток.

В гомеопатии крапива двудомная применяется в форме настоя гомеопатического и настоек гомеопатических матричных (из свежего цельного растения и из свежих листьев), которые были изготовлены в соответствии с

ОФС 42-0001-00 (настой гомеопатический) и ВФС 42-2799-96 (настойки гомеопатические матричные).

Исходя их принципа «сквозной стандартизации», методики, разработанные для анализа БАВ, Са и в ЛРС крапивы были

модифицированы и адаптированы для анализа ЛФ крапивы. Результаты представлены в табл. 6.

Таким образом, в ходе проведенного исследования была дана оценка ЛФ крапивы двудомной по содержанию гидрофильных БАВ и макроэлементов Са и А также показана возможность применения разработанных методик для количественной оценки содержания кальция и магния в ЛФ крапивы двудомной. Методика количественного определения Са в жидких экстрактах из ЛРС защищена патентом РФ.

Получение ЛФ крапивы двудомной, обогащенной кальцием

Имеющиеся на отечественном фармацевтическом рынке лекарственные препараты, содержащие соли Са, имеют ряд противопоказаний и могут вызывать серьезные побочные эффекты. Применение лекарственных растений и растительных препаратов, в которых макро- и микроэлементы находятся в биоусваиваемой форме, может быть более эффективным для нормализации минерального баланса организма (Кудрин А.В., Ноздрюхина Л.Р. и др.).

В ходе исследования были подобраны условия, увеличивающие переход Са и М§ из растительного сырья в извлечение. Кальций в листьях крапивы содержится в цистолитах и друзах в свободном (ионном) виде, а также в виде комплексных солей. Наибольшее количество магния входит в состав хлорофилла и представлено солями органических кислот. Все эти соединения под действием сильной минеральной кислоты (кислоты хлористоводородной) разрушаются, и макроэлементы в виде растворенных солей переходят в извлечение. Это было подтверждено микроскопически на микропрепаратах из ЛРС, обработанных 8% раствором кислоты хлористоводородной, характерных

Таблица 6. Содержание БАВ в листьях, аллопатических и гомеопатических лекарственных формах крапивы

двудомной (п=10; р=0,95)

Название БАВ/ группы БАВ Листья Настой Жидкий экстракт Настой гом. Настойка матричная гом. (целое растение) Настойка матричная гом. (листья)

Флавоноиды 1,0879±0,0005% 0,0485±0,0002 мг% 0,0175±0,0001 мг% 0,0170±0,0001 мг% 0,0315±0,0001 мг% 0,0515±0,0002 мг%

Дубильные вещества 3,59±0,02% 3,476±0,009 мг% 4,017±0,003 мг% 1,085±0,002 мг% 1,81±0,01 мг% 2,08±0,01 мг%

Полисахариды 5,62±0,01% 0,584±0,001% 0,380±0,001% 151,66±0,04 мг% 5,42±0,01 мг% 5,37±0,01 мг%

Восстанавливающие моносахара 4,063±0,018% 0,1593±0,0003% 0,0841±0,0003% 6,08±0,01 мг% 0,0335±0,0001 мг% 0,0311 ±0,0001 мг%

Аскорбиновая кислота 33,64±0,02 мг% 0,0311 ±0,0002 мг% 0,0377±0,0001 мг% 0,0280±0,0002 мг% 0,0320±0,0002 мг% 0,0445±0,0002 мг%

Свободные органические кислоты 1,503±0,004% 1,471 ±0,002 мг% 6,152±0,003 мг% 2,45±0,01 мг% 7,42±0,01 мг% 6,04±0,02 мг%

Гидроксикоричные кислоты 2,4942±0,0002% 2,417±0,001% 1,541 ±0,001% 1,511 ±0,002% 0,43 7±0,002% 0,433±0,002%

Свободные аминокислоты 0,593±0,001% 0,1401 ±0,0002% 0,603±0,001% 0,128±0,001% 0,294±0,001% 0,244±0,001%

Хлорофилл 6,5015±0,0003% не определено 1,055±0,003% не определено не определено не определено

Кальций 0,4773±0,0004% 0,689±0,001 мг% 0,8025±0,0003 мг% 0,589±0,002 мг% 0,343±0,003 мг% 0,302±0,003 мг%

Магний 0,4952±0,0001% 0,3770±0,0005 мг% 0,4710±0,0005 мг% 0,328±0,003 мг% 0,282±0,003 мг% 0,239±0,002 мг%

В настоях не определяли содержание хлорофилла, так как он, являясь липофильным соединением, очень плохо переходит в

воду.

для листьев крапивы анатомо-диагностических признаков нет: друзы в мезофилле отсутствуют, а у цистолитов, расположенных в клетках эпидермиса, сохраняется только оболочка (рис. 3, 4).

Использование 8% раствора кислоты хлористоводородной позволило увеличить в извлечении из листьев крапивы содержание кальция в 3 раза, магния - в 2 раза.

а б

Рисунок 3. Цистолита (1). а - стандартный микропрепарат, б - микропрепарат, полученный после кипячения в 8% кислоте хлористоводородной. Увеличение х 200

Рисунок 4. а - цепочки друз (стандартный микропрепарат), увеличение х 90; б — сосуды без цепочек друз оксалата кальция, увеличение х 200 (микропрепарат, полученный после кипячения в 8% кислоте хлористоводородной)

В лабораторных условиях методом дробной мацерации был получен жидкий экстракт листьев крапивы с использованием в качестве экстрагента 50% спирта этилового, подкисленного до рН=2 кислотой хлористоводородной. В полученном экстракте было определено содержание суммы флавоноидов, кальция и магния (табл. 7).

Таблица 7. Содержание суммы флавоноидов, кальция и магния в экстрактах листьев крапивы двудомной (п=10; р=0,95)

БАВ Содержание, мг%

Жидкий экстракт Са-жидкий экстракт*

Флавоноиды 0,0175±0,0001 0,0221±0,0001

Кальций 0,8025±0,0003 1,9900±0,0005

Магний 0,4710±0,0005 1,1095±0,0006

* Са-жидкий экстракт — экстракт, полученный на подкисленном спирте этиловом.

ВЫВОДЫ

1. С использованием современных физико-химических методов проведено комплексное изучение гидрофильных БАВ и минерального состава метаболома крапивы двудомной. Доказано наличие дубильных веществ, сапонинов, полисахаридов, флавоноидов рутина, лютеолина, кверцетина, а также кумарина скополетина, аскорбиновой, кофейной и хлорогеновой кислот.

2. Для количественной оценки БАВ в листьях крапивы подобраны и адаптированы существующие методики. С их помощью установлено, что в сырье содержится 1,0879±0,0005% суммы флавоноидов в пересчете на рутин; 3,59±0,02% дубильных веществ в пересчете на танин; 5,62±0,01% полисахаридов и 4,063±0,018% восстанавливающих моносахаров; 33,64±0,02 мг% аскорбиновой кислоты; 1,503±0,004% суммы свободных органических кислот в пересчете на яблочную кислоту; 2,4942±0,0002% суммы

гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту; 0,593±0,001% суммы свободных аминокислот в пересчете на глутаминовую кислоту; 6,5015±0,0003% хлорофилла;

3. Методом атомно-абсорбционной спектрометрии установлено, что в листьях крапивы двудомной содержится 1,3% кальция и 0,9% магния.

4. Разработаны оригинальные методики комплексонометрического определения Са и М§ в сырье и лекарственных формах крапивы двудомной и потенциометрического определения Са с использованием электрода, селективного к элементу. Проведено валидирование разработанных методик. Приоритетность научных исследований защищена патентами РФ № 2466387 и №2488818.

5. Изучена динамика накопления аскорбиновой кислоты, флавоноидов, Са и М§ по органам крапивы двудомной и фазам вегетации растения. Максимальное содержание анализируемых соединений приходится на фазу цветения растения (июль - август месяцы).

6. В лабораторных условиях получены лекарственные формы крапивы двудомной: настой, жидкий экстракт, настой гомеопатический и две настойки гомеопатические матричные (из свежего цельного растения и свежих листьев крапивы). Дана характеристика изготовленных лекарственных форм и, в соответствии с принципом «сквозной стандартизации» и с использованием разработанных методик в них определено содержание БАВ, Са и Mg.

7. Подобраны условия, увеличивающие переход кальция и магния из сырья крапивы двудомной в извлечение. Использование в качестве экстрагента 8% раствора кислоты хлористоводородной приводит к полному переходу кальция из сырья в извлечение, что было подтверждено микроскопическим методом. С использованием полученных данных в лабораторных условиях получен жидкий экстракт крапивы, обогащенный ионами кальция и магния.

8. Проведено углубленное изучение листьев крапивы для уточнения, дополнения и расширения характеристик подлинности и показателей качества

сырья (цельное, измельченное, порошка). Результаты исследований оформлены в виде проекта фармакопейной статьи «Крапивы листья» для ГФ РФ XII изд.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Скалозубова Т.А., Марахова А.И., Сорокина A.A. Определение содержания суммы свободных органических кислот и витамина С в сырье и настое крапивы двудомной // II Российский фитотерапевтический съезд: сб-к научных трудов (Москва, 22 - 23 октября 2010 г.). - М.: Изд-во «ИМЕДИС», 2010.-С. 223-225.

2. Скалозубова Т.А., Марахова А.И., Сорокина A.A. Титриметрический метод в определении биологически активных веществ листьев и настоя крапивы двудомной // Прикладная аналитическая химия. -2010.-№1 (1).-С. 35-38.

3. Скалозубова Т.А., Марахова А.И., Сорокина A.A. Содержание суммы флавоноидов в листьях и настое крапивы двудомной // XXI Московская Международная Гомеопатическая конференция «Развитие гомеопатического метода в современной медицине»: тезисы докладов (Москва, 2011 г.). — М.: Изд-во ГЦ «Здоровье и реабилитация», 2011. - С. 196 - 198.

4. Скалозубова Т.А., Марахова А.И., Сорокина A.A. Изучение фенольных соединений листьев крапивы двудомной // Прикладная аналитическая химия. - 2011. - №3 (5). - С. 20 - 26.

5. Марахова А.И., Федоровский H.H., Скалозубова Т.А., Аврач A.C., Сорокина A.A., Сергунова Е.В. Методологические подходы к использованию спектрофотометрии в анализе лекарственного растительного сырья [Электронный ресурс] // Электронный научный журнал «Медицина и образование в Сибири». - 2011. - №5. - Режим доступа: http://www.ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=526. - Загл. с экрана.

6. Скалозубова Т.А. Изучение минерального состава листьев и настоя крапивы двудомной [Электронный ресурс] // Итоговая Всероссийская научная

конференция молодых исследователей с международным участием «Татьянин день»: электрон, версия тезисов докладов. - Текстовые дан. (5,12 Mb). - М.: Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа», 2011. - 1 электрон, опт. диск (CD-R).

7. Скалозубова Т.А., Марахова А.И., Сорокина A.A. Полисахариды в листьях и настое крапивы двудомной // Фармация. - 2012. - №2. - С. 5 - 7.

8. Скалозубова Т.А., Марахова А.И., Сорокина A.A., Морохина C.JI. Проблемы спектрофотометрического анализа флавоноидов в водных извлечениях // XXII Московская Международная Гомеопатическая конференция «Развитие гомеопатического метода в современной медицине»: сб-к материалов конф. (Москва, 2012 г.). — М.: Изд-во ГЦ «Здоровье и реабилитация», 2012. - С. 229 - 231.

9. Марахова А.И., Аврач A.C., Скалозубова Т.А., Сорокина A.A., Сергунова Е.В., Федоровский H.H. Спектрофотометрия в анализе сборов [Электронный ресурс] // Электронный научный журнал «Медицина и образование в Сибири». - 2012. - №2. Режим доступа: http://www.ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=706. - Загл. с экрана.

10. Сорокина A.A., Скалозубова Т.А., Марахова А.И. Определение кальция и магния в листьях и настое крапивы двудомной // Фармация. — 2013. -№2. -С. 5-8.

11. Скалозубова Т.А., Марахова А.И., Сорокина A.A. Изучение гомеопатических лекарственных форм крапивы двудомной // V Международная научно-методическая конференция «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ»: материалы конф. (Воронеж, 2013 г.). -Воронеж.: Издательско-полиграфический центр ВГУ, 2013. - С. 504 - 507.

12. Способ количественного определения кальция и магния в лекарственном растительном сырье: пат. 2466387 Рос. Федерация/ Скалозубова Т.А., Марахова А.И., Федоровский H.H. - № 2011142057/15; заяв. 18.10.2011; опубл. 10.11.2012, Бюл.№ 31.

13. Способ количественного определения содержания кальция в жидких экстрактах из лекарственного растительного сырья: пат. 2488818 Рос. Федерация/ Марахова А.И., Скалозубова Т.А., Самылина И.А., Сорокина A.A., Федоровский H.H. - № 2012117691/15; заяв. 28.04.2012; опубл. 27.07.2013, Бюл. №21.

Заказ № 52-Р/10/2013 Подписано в печать 16.10.13 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; e-maihinfo@cfr.ru