Изучение механосенситивных клеток предсердий крыс в норме и при воздействии некоторых фармакологических агентов

Кондратьев, Денис Вадимович

Диссертации по медицине → Нормальная физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Изучение механосенситивных клеток предсердий крыс в норме и при воздействии некоторых фармакологических агентов

АВТОРЕФЕРАТ

Кондратьев, Денис Вадимович Москва 1995 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.17

Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение механосенситивных клеток предсердий крыс в норме и при воздействии некоторых фармакологических агентов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи - НОЯ уДК [612.822+612.172]-014.42: 547.964

КОНДРАТЬЕВ Денис Вадимович

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАПОСЕПСИТИВПЫХ КЛЕТОК ПРЕДСЕРДИЙ КРЫС В НОРМЕ II ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НЕКОТОРЫХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ

(14.00.17 — нормальная физиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1995

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии с курсом физиологии медико-биологического факультета (по курсу) Российского государственного медицинского Университета (Россия, Москва).

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор А. Г. Камкин

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор А. С. Пылаев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н. А. Соколова

доктор медицинских наук, профессор В. И. Савчук

Ведущая организация:

Ордена Дружбы Народов Российский Университет дружбы народов.

Защита диссертации состоится « . . . ».......

1995 г. в . . . . часов на заседании диссертационного Совета Д.084.14.06 при Российском Государственном медицинском университете по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Автореферат разослан « . . .»....... 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Т. Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние несколько лет большое внимание уделяется изучению биоэлектрических свойств электроневозбудимых клеток и механизму возникновения осцилляцнй их мембранного потенциала. Эта достаточно новая область исследований дала неожиданный поворот в изучении сердца и механизмов его функционирования. Известно, что нормальный миокард содержит два типа клеточных компартментов. Первый - те или иные мноциты, представляющие собой электровозбудимые сократительные клетки и второй - сопутствующие немышечные клетки, которые электроневозбудимы. Этот последний компартмент состоит из различных клеточных типов, где доминируют фнбробласты, которые формируются в онтогенезе из нервной трубки. Показано, что на ранних этапах онтогенеза тубулярное сердце теплокровных содержит только миоциты и является гомогенной структурой. Дальнейшие этапы морфогенеза коррелируют с первыми сокращениями сердца. После этого морфогенез прогрессирует и появляются немышечные элементы, включая фибробласты, эндотелиальные клетки, нервные клетки и фагоциты. В работах на сердце холоднокровных животных показано, что фибробласты сердца являются электроневозбуднмыми, но механосенситивными клетками и, как фнбробласты других типов, вероятно, имеют ионные потенциалчувствитель-ные каналы, реагирующие на сжатие или растяжение. Их рецепторами являются впервые описанные в 1985 году F.Sachs механорецепторы, связанные с" ионными каналами. В зависимости от того активируются или инактивируются эти каналы при растяжении, они были названы stretch-activated (inactivated) channels. Мембраны подавляющего большинства возбудимых клеток содержат, как обнаружено в последние годы, не только потенциалаависимые и хемо-чувствительные, но и ионные каналы, функционирующие при механическом воздействии.

Физиологический ответ клетки на прямое механическое воздействие возникает как следствие взаимосвязанного функционирования ее структурных элементов и вторичных мессенжероз. Белки клеточной поверхности и экстрацеллюлярный матрикс, связанные посредством трансмембранных белков с цитосхелетом, активируют ионные каналы при механической деформации клетки. Преобразование механического сигнала на уровне клетки может.

выражаться как в ее электрофизиологических, так и в биохимических ответах. Изменение концентрации биологически активных лигандов на поверхности клетки также может быть непрямым механизмом преобразования механического сигнала. Для ряда электроневозбудимых клеток показано, что механизм преобразования механического сигнала представляет собой комбинацию между передачей силы растяжения или сжатия через цнтоскелетные элементы на механосенситивные ионные каналы и преобразование силы растяжения ¡1ли сжатия в биохимические сигналы на механопреобразующем участке клетки. Большинство авторов рассматривают в качестве принципиальной преобразующей системы F-ахтин микрофиламентов, поскольку показано, что стимуляция аденилатциклаэы и механосенситивный ответ клетки на деформацию ингибируется специфическим деполимеризующим актин мнкрофиламентов агентом. Микрофиламентная сетка поддерживает натяжение в клетке, которое совместно с микротубулярной жесткостью определяет клеточную форму.

Поскольку фибробласты сердца являются механосенситнвными клетками, было предположено, что они являются механоэлектрическим преобразователем в сердце и служат базовыми элементами для реализации механизма обратной связи между возбуждением и сокращением (Kohl et al„ 1992), который пытаются найти на уровне кардиомиоцитов (Lab, 1982). Хотя гистологически фибробласты сердца изучены достаточно хорошо, их электрофизнологическое исследование проведено только в условиях культуры ткани неонатального сердца крыс (Rook et al„ 1989) и на целом сердце холоднокровных животных (Kamkin, 1991; Kohl et al., 1992).

Эти исследования позволяют предположить, что сжатие или растяжение фибробласта в моменты сокращения или расслабления миокарда через цнтоскелет вызывают изменение функционирования (активацию или инактивацию) stretch-activated channels и, как следствие, возникновение потенциалов, названных mechano-induced potentials (MIP). Можно предположить, что в формировании М1Р принимают участие и осцилляции внутриклеточного кальция, что типично для электро'невозбудимых клеток. Проверке этой гипотезы посвящена настоящая работа.

Исходя из этих предпосылок мы сформулировали цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение механосенситивных клеток сердца крысы и исследование опосредованных через цитоскелет механизмов возникновения MIP у этих клеток.

Исследование включало решение следующих задач:

1) Электрофизиолопгческое выявление в сердце крысы механосенситивных клеток и картирование области их расположения;

2) Введение в исследуемые клетки флюоресцентного маркера Lucifer Yellow для их идентификации;

3) Гистологическое исследование региона, содержащего максимальное количество изучаемых клеток;

4) Изучение электрофизиологических характеристик механосенситивных клеток сердца крысы;

5) Изучение роли внеклеточного и внутриклеточного кальция в генерации

Ml Р.

6) Выявление роли stretch-activated channels в возникновении MIP механосенситивных клеток сердца крысы;

7) Изучение роли цитоскелета механосенситивных клеток сердца крысы в иозникновении MIP.

Научная новизна раОоты

В результате выполнения настоящей .работы методами микроэлектродной-техники было показано, что в предсердиях крысы находятся механосенситив-ные клетки, биоэлектрические параметры которых сходны с биоэлектрическими параметрами немышечных клеток предсердий лягушки, описанных в литературе. Показано, что максимальное количество этих клеток расположено в регионе синусного узла сердца. Введение в исследуемые клетки маркера Lucifer Yellow для их предварительной идентификации с помощью флюоресцентной микроскопии подтверждает, что исследуемые клетки являются немышечными клетками сердца. Гистологическое исследование региона синусного узла с помощью электронной микроскопии выявляет там преимущественно кардиомио-циты и фибробласты, что соответствует литературным данным и позволяет допустить, что выявленные электрофиэиологическим методом клетки являются фибробластами сердца. Изучено влияние на возникновение MIP специфического блокатора stretch-activated channels Gadolinium, который ннгибирует MIP как на фоне спонтанных сокращений препарата, так и при искусственном

растяжении ткани предсердий. Полученные данные свидетельствуют, что в возникновении М1Р играют роль stretch-activated channels. Изучены эффекты внутриклеточного введения Cytochalasin В и Colchicine, которые ингибируют М1Р, что свидетельствует о роли в и* возникновении цитоскелета. Используя внутриклеточное введение хелатора кальция ВАРТА и внеклеточное добавление в бескальцпевую среду ЕСТА, было показано, что в генерации MIP принимают участие внеклеточный кальций и осцилляции внутриклеточного кальция.

Теоретическая и практическая значимость результатов и их внедрение

Выявление в предсердиях млекопитающих немышечных клеток - фнбро-бластов, которые могут играть роль механоэлектричесхого преобразователя в сердце, изучение их биоэлектрических параметров и механизмов генерации биоэлектрических потенциалов имеет большое теоретическое значение для понимания фундаментальных механизмов работы сердца.

Практическое значение работы заключается в том, что с позиций известных представлений о роли фибробластов в сердце и получении данных о механизмах нх функционирования можно определить новые направления в фармакологической коррекции ряда сердечных заболеваний. Основные положения, внногимнв на защиту

1. В зоне синусного узла сердца крысы выявлены электроневозбудимые, но механосенснтивные клетки, которые на основании электрофизиологических данных мы относим к фибробластам сердца.

2. Результаты введения в изучаемые клетки флюоресцентного красителя Lucifer Yellow свидетельствуют о том, что исследуемые механосенснтивные клетки являются немышечными клетками, а гистологический. анализ зоны локализации микроэлектрода выявил в этом районе преимущественно кардномиоциты и фибробласты.

3. Совокупность гистологических и электрофизиологических данных позволяют допустить, что исследуемые клетки - фибробласты сердца, MIP которых вызван как спонтанными сокращениями, так и искусственным растяжением ткани и возникает с задержкой относительно потенциала действия близлежащего кардиомиоцита, но практически синхронно с пиком мехапограммы.

4. В основе механизма возникновения М1Р лежит, с одной стороны, ироподнмость мембраны для ионов кальция через stretch-activated channels,

контролируемые цитоскелетом, а с другой стороны, внутриклеточные осцилляции ионов кальция.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на Scientific Meeting of the Physiological Society of United Kingdom (UK, Southampton, 1993), International Symposium Biological Motility (Россия, Пущино на Оке, 1994), XV European Section Meeting of International Socie'v for Heart Research (Denmark, Copenhagen, 1994).

Диссертация апробирована на объединенном заседании кафедры нормальной физиологии с курсом физиологии медико-биологического факультета РГМУ н кафедры морфологии медико-биологического факультета РГМУ.

Диссертация состоит из обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов с их обсуждением, выводов и списка цитированной литературы.

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, включая 33 рисунка и список литературы из 169 источников.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЭлектроФшиолотческие исследования

Работу выполняли на механосенситивных клетках, расположенных в предсердиях изолированного сердца крыс (Rattus norwegicus) различного пола. Всего было поставлено 286 экспериментов (п = 286).

Для обеспечения жизнедеятельности миохардиальной ткани изолированный синусный узел сердца крысы на протяжении экспериментов постоянно перфузирсвалн солевым раствором следующего состава (мМ): 118 NaCl, 2.7 КС1, 1.2 СаС12, 1.2 Mg2S04 , 2.2 NaH2P04 , 25 NaHC03 , 5 Glucose. Все реактивы были получены от фирмы SIGMA. Осмолярность раствора была равна 290 ± 5 мОсМ. Через раствор постоянно проходили пузырьки карбогена (5% СС>2 в 02 ) и рН раствора была 7.4 при температуре 37 ± 0.2 °С.

Для изучения биоэлектрических параметров мембран клеток внутрикле-точно подавали прямоугольные поляризующие импульсы электрического тока силой 10"9А и длительностью не менее 2 сек.

Д\я изучения роли внеклеточного кальция в механизме генерации М1Р использовали бескальциевый раствор, содержащий 2 мМ EGTA. Для определения роли внутриклеточного кальция в генерации MIP использовали ВАРТА, которая является хелатором Са1*. ВАРТА вводили внутрь клетки путем диффузии из микроэлектродов, где соединение было в концентрации 100 цМ. В качестве специфического блокатора stretch-activated channels применяли Gadolinium, раствором которого в концентрации. 50 цМ перфузировали препарат правого предсердия. Для изучения возможности вовлечения цитоскелета н, в частности, микрофиламентов в работу stretch-activated channels был использован Cytochalasin В, который гидролизует АТФ актина и, тем самым уменьшает стабильность этого полимера. Cytochalasin В вводили в клетку посредством диффузии из микроэлектрода, где он находился совместно с электролитом в концентрации 100 цМ. Для изучения роли мпкротубул в регуляции воротного механизма stretch-activated channels был использован Colchicine, специфичесхи деполимеризующий тубулин. Colchicin вводили в клетку также посредством диффузии из микроэлектрода, где он находился совместно с электролитом в концентрации 100 рМ. Используемые соединения были получены от фирмы SIGMA.

В экспериментах на фрагментах предсердия с зоной синусного узла с помощью механотрона производили искусственное растяжение препаратов в диапазоне 100мг-500мг.

Микроэлектроды готовили из стекла марки "Пирекс" по способу, разработанному К.Тасаки. Для заполнения микроэлектродов использовали 140 мМ раствор КС1. Электрическое сопротивление используемых микроэлектродов лежало в диапазоне 7-10 МОм.

Для выполнения поставленных экспериментальных задач была использована промышленная экспериментальная установка, изготовленная Межотраслевым медико-биологическим производственным объединением и включающая систему жизнеобеспечения клеток в процессе исследований и электронно-измерительную систему, обеспечивающую регистрацию потенциалов клеток и искусственную внутриклеточную поляризацию их мембран с применением одногомикроэлектрода (режим current clamp).. В качестве регистратора использовали Digital type recorder DTR-1800 фирмы Bio-Logic (Франция). Данные обрабатывали на PC IBM-AT(486) при помощи программы

"Sygnalis" (Германия) с использованием АЦП BE 490 от Bakker Electronics (Германия). Экспериментальные кривые выводили на плоттер RP-11G (Япония).

Для этих исследований было выполнено 86 экспериментов (п = 86). С целью гистологической идентификации клеток использовали метод введения в них флюоресцентного красителя. Микроэлектроды заполняли 4%-м раствором Lucifer Yellow. Их сопротивление лежало в диапазоне от 7 до 10 МОм. Для введения красителя внутрь клетки с генератора подавали прямоугольные шперполяризующие импульсы длительностью 1 сек с силон тока 1.4*10"9 А в течение 1-3 минут. Затем препарат помещали в 4%-й раствор параформаль-дешда на 0.05 М фосфатном буфере на 6 часов при t" = 4°С . Криостатные срезы толщиной около 10 иМ просматривали в люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ -ИЗ с фильтрами СЗС+ФС 1-2 и "зеленой" светоделительной пластинкой при увеличениях до 600 с последующим увеличенном при печати в 3-5 раз.

Для электронномикроскопического исследования препаратов, используемых в электрофизиологических экспериментах, вырезали область правого предсердия. Выделенную область предсердия немедленно помещали в 4%-й раствор глутарового альдегида на буфере Миллонига (рН = 7.4, t°-=4°C). Далее-проводили отмыв препарата в буфере (2 - б часов, 4°С) и постфиксацию в 1% 0s04 на том же буфере (1 час, 4°С). Затем препарат снова отмывали в буфере (2 -б часов, 4°С) и проводили дегидратацию в спиртах восходящей крепости по известной схеме. После дегидратации образцы заливали в Эпон-812 или Аралдит по стандартным методикам. Ультратонкие срезы получали на микротоме Reichert, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в электронном микроскопе Hitachi HU-11Е-2 при увеличениях от 3.2 до 31 тысяч с последующим увеличением при печати в 3-5 раз.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Я. Электрофнзиологическая идентификация механосенситивных клеток в предсердиях крысы и картирование зон их распространения В обоих предсердиях изолированного сердца крысы, в ритме спонтанных сокращений препарата у части клеток регистрировали возникновение осцилляции мембранного потенциала (Рис. 1 А,Б), форма и электрофизиологические характеристики которых были сходны с ранее описанными mechano-

induced potentials (MIP) у фибробластов, расположенных в предсердиях лягушки.

Форма М1Р, представленная на рис. 1Б, принципиально отличается от формы потенциалов действия клеток сердца. Амплитуда зарегистрированных М1Р была либо соизмерима с величиной мембранного потенциала, либо значительно меньше его. Характерной особенностью, отличающей MIP от потенциалов действия кардиомиоцита, было и отсутствие овершута.

О -

-20

-40

-20 -

-40

100

200

Рис. 1. А - Биоэлектрическая активность механосенсенситивнон клетки предсердия крысы; Б - М1Р в развертке.

На рис. 2 продемонстрирован основной феномен в миокарде лягушки (Каткт, 1991) (2А) и крысы (собственные данные) (2Б). На каждой панели похазаны два наложенных сигнала от двух микрсэлектродов, находящихся на расстоянии на более 100 цм. Один (АР), полученный от типичного кардиомиоцита, имеет известные овершут и амплитуду потенциала действия. Другой (М1Р), полученный от клетки сшшатриального узла, заметно отличается от биоэлектрической активности нормальных мнохардиальных клеток. У этого сигнала нет овершута, потенциал начинается позднее (на 60 мсек. у лягушки и на 10 мсек. у крысы) и амплитуда его значительно меньше, чем у потенциала мноцита. Длительность этого потенциала соответствует длительности механо-граммы регистрируемых сокращений ткани.

М1Р

АР

50 шУ

М1Р

АР

50 шУ

05 б

0.1 э

Рис. 2. Синхронная регистрация потенциалов действия (АР) кардиомноцитов и М1Р у лягушек (Катк1п, 1991) (А) и крыс (собственные данные) (Б).

Основным тестом, при помощи которого мы идентифицировал!! исследуемые клетки в предсердиях крыс, служила их специфическая реакция на искусственную внутриклеточную поляризацию.

Обычно у исследуемых клеток спонтанно сокращающегося фрагмента правого предсердия искусственная гиперполярнзация мембраны приводила к увеличению амплитуды М1Р тем большему, чем на большую величину смещался потенциал. Искусственная деполярнзация'мембраны приводила к уменьшению амплитуды М1Р тем большему, чем большая поляризация имела место, вплоть до полного прекращения возникновения М1Р при достижении потенциала реверсии. При дальнейшем увеличении сдвига мембранного потенциала М1Р вновь появлялись, но уже инвертированной формы, и направление их пиков было также в сторону потенциала реверсии, а амплитуда увеличивалась с увеличением деполяризации.

Хотя исследуемые клетки выявляли достаточно часто в обоих предсердиях, наибольшее количество клеток, генерирующих М1Р, регистрировали вдоль относительно крупной артерии, проходящей через толщу синусного узла и являющейся его маркером. Причем, максимальная плотность исследуемых клеток была определена в месте разветвления этой артерии, а при удалении от него количество идентифицируемых клеток уменьшалось. ■

Эти результаты показали, что в области синусного узла сердца крысы, вдоль артерии, являющейся его маркером, в большом количестве расположены клетки, которые по электрофизиологнческим свойствам соответствуют механо-сенсптнвным, электроневозбудимым клеткам, описанным для венозного синуса изолированных сердец лягушки.

S2. Гистологическое исследование механосенситивных клеток

2.1. Гистологическое исследование с помощю флюоресцентного маркера

На первом этапе для морфологической идентификации исследуемых клеток, генерирующих MIP, были проведены эксперименты с введением внутрь клетки через микроэлектрод флюоресцентного красителя Lucifer Yellow. Для контроля Lucifer Yellow вводился и в кардиомиоциты. Преимущество данного красителя состоит в том, что при введении его внутрь клетки выполняются условия, обеспечивающие точную регистрацию электрофизиологических характеристик исследуемых клеток и максимальную сохранность клеточных структур. Кроме того, цитолемма изучаемых клеток непроницаема для данной внутриклеточной метки, а время ее введения сведено до минимума. Известно, также, что Lucifer Yellow способен проходить через высокопроницаемые контакты.

На 3 препаратах правого предсердия в 12 клеток, идентифицированных по электрофнзнологическим характеристикам как кардиомиоциты, был введен маркер. При помощи ультрафиолетового микроскопа выявили 8 клеток со специфической флюоресценцией. В этих 8 случаях краситель находился внутри кардномиоцитов.

На 12 препаратах правого предсердия в 74 клетки, идентифицированных ио электрофизиологнческим характеристикам как механосенситивные, был введен маркер. При помощи ультрафиолетового микроскопа выявили 56 клеток со специфической флюоресценцией. В этих 56 случаях краситель находился внутри немышечных клеток, или кластеров этих клеток.

Таким образом, полученные на основании применения в качестве внутриклеточного маркера флюоресцентного красителя Lucifer Yellow экспериментальные данные свидетельствуют о том, что механосенситивные клеткп| расположенные в предсердиях крысы, являются немышечными клетками. Анализ формы исследуемых клеток, наличие у них отростков, а также их механосенснтивность, что в совокупности типично для фибробластов сердца,

подтверждают точку зрения, обсуждаемую в литературе, о том, что MIP регистрируются именно от клеток этого типа. Кроме того, эксперименты с применением внутриклеточного маркера Lucifer Yellow, способного проходить через высокопроницаемые контакты, продемонстрировали что исследуемые клетки могут быть объединены в кластеры, по-видимому на основе именно этих мембранных структур. Эти данные подтверждают представленную в литературе точку зрения, базирующуюся на электрофизиологическнх экспериментах, о наличии высокопроницаемых контактов между фибробластами в предсердиях лягушки.

1.1. Электронномикроскопнческое исследование препаратов, используемых в электрофизиологических экспериментах

Для гистологического исследования региона, содержащего максимальное количество немышечных клеток, предположительно фибробластов, после проведения электрофизиологических исследовании, использовали метод электронной микроскопии. Было показано, что область локализации микроэлектрода имеет характерную для миокарда предсердий гистологическую структуру. Вытянутые пучки сформированы контактирующими кардиомиоци-Т'Тми. Прослойки рыхлой соединительной ткани содержат кровеносные сосуды обменного типа, коллагеновые волокна и клеточные элементы фибробластичес-кого ряда. Пучки кардномиоцитов располагаются относительно рыхло, частота обнаружения клеток и волокон соединительной ткани достаточно высока.

Структура кардномиоцитов предсердий соответствует литературным данным. Структура фибробластов предсердий также соответствует литературным данным. Фибробласты имеют многочисленные тонкие отростки, содержащие элементы гранулярной цитоплазматнческой сети и, в ряде случаев, мелкие и средние вакуоли. Фибробласты закономерно распределены между пучками кардномиоцитов, прикрывая их своими отростками.

Контактные взаимоотношения фибробластов и кардномиоцитов всегда опосредованы базальной мембраной мышечной клетки. В значительном числе случаев плазмолемма фибробласта плотно прилежит к базальной мембране кардиомиоцита. Эти участки, на наш взгляд, могут иметь особые свойства. Субсарколеммально во всех кардиомиоцитах определяется некоторое количество везикул, по структуре сходных с пиноцитарными. Эти везикулы относятся к классу кальций-запасающих структур и именуются кавеолами. В

наших исследованиях обнаруживается отчетливая корреляция между плотпосгыо расположения субсарколеммальных везикул и наличием контактов отростков фнбробластов с базальной мембраной кардиомиоцитов.

Таким образом, результаты электронномикроскопического исследования зоны локализации микроэлектрода в регионе, содержащим максимальное количество немышечных клеток, свидетельствуют о наличии там контактирующих друг с другом кардиомиоцитов и фибробластов.

$3. Биоэлектрические характеристики механосенситивных клеток 3.1. Мембранный потенциал, сопротивление мембраны и MIP Как в обоих предсердиях на внешней, внутренней поверхности и в глубине ткани, так и непосредственно в зоне синусного узла изолированного правого предсердия крысы, встречались фибробласты, величина мембранного потенциала которых варьировала в широком диапазоне от -5 мВ до -70 мВ. Исследование величин мембранного потенциала у фибробластов сердца крыс весом 100 г и 400 г выявило некоторые различия. Распределение клеюк в группы по величине мембранного потенциала в предсердиях крыс весом 100 г и крыс весом 400 г показало, что мембранный потенциал фибробластов предсердий крыс весом 100 г был обычно в диапазоне от -10 мВ до -15 мВ (п = 124), а у крыс весом 400 г находился в области от -20 мВ до -25 мВ (п= 162). Статистический анализ показал, что мембранный потенциал фибробластов крыс весом 100 г равен 19.23 ± 1.02 мВ, а мембранный потенциал фибробластов крыс весом 400 г равен 29.41 ± 1.23 мВ.

Сопротивление мембраны фнбробластов предсердий крыс весом 100 г было обычно в диапазоне от 0.4 Gil до 0.6 Gil, а у крыс весом 400.г.лежало в диапазоне от 0.7 Gfl, до 1 СП.

Данные о величине мембранного потенциала и сопротивления мембраны фнбробластов выявляют определенную корреляцию этих параметров. Ее существо сводится к тому, что чем больше сопротивление мембраны клетки, тем большая величина мембранного потенциала регистрируется.

В ходе экспериментов регистрировали MIP различной формы, с разной скоростью наростания потенциала. Это объясняется тем, что в структуре ткани клетки имеют разную степень предрастяжения в момент регистрации.

Спонтанные сокращения пли искусственное растяжение ткани предсердий крыс вызывало два различных типа биоэлектрической реакции

исследуемых механосенситивных клеток. В первом случае на фоне исходного отрицательного мембранного потенциала направление пиков М1Р было в область более положительных значений, то есть к потенциалу реверсии (обычно' -10 + -3 мВ); в другом случае, также на фоне исходного отрицательного мембранного потенциала пики М1Р были направлены в область более отрицательных значений, то есть от потенциала реверсии. Вероятнее всего, что эти различия определяются либо сжатием, либо растяжением данной механосенситивной клетки в момент сокращения (растяжения) препарата. Аналогичные результаты были описаны для механосенситивных клеток предсердия лягушки. Авторы на основании тщательного ана 1за экспериментов различных типов выдвигают предположение о том, какое направление М1Р связано с растяжением клетки, а какое с ее сжатием. Мы, однако, полагаем, что ответ на этот вопрос может быть только в экспериментах с растяжением и сжатием изолированного фибробласта.

3.2. Влнпние искусственной внутриклеточной поляпизапии на биоэлектрическую активность исследуемых клеток Поляризация мембраны клеток выявила две диаметрально противоположные реакции исследуемых клеток на искусственную поляризацию (п = 74).

При исходном направлении М1Р в область более положительных значений искусственная внутриклеточная птерполяризация мембраны приводила к увеличению амплитуды М1Р, тем большему, чем на большую величину смещался потенциал Длительность М1Р оставалась постоянной при всех величинах пшерполяризации.

Искусственная внутриклеточная деполяризация мембраны этих клеток приводила к уменьшению амплитуды М1Р, тем большему, чем большая поляризация имела место, вплоть до полного прекращения возникновения потенциалов при достижении потенциала"' реверсии. При дальнейшем увеличении сдвига мембранного потенциала в положительную область, М1Р вновь появлялись, но уже обратного знака, причем их амплитуда была тем больше, чем большая величина сдвига мембранного потенциала имела место. В этом случае направление пика было в сторону потенциала реверсии. Длительность М1Р оставалась постоянной при всех величинах деполяризации.

При исходном направлении пика М1Р в область более отрицательных значений искусственная внутриклеточная птерполяризация мембраны

приводила к увеличению амплитуды М1Р, тем большему, чем большая поляризация имела место. Но в этих случаях потенциалы были направлены в противоположную сторону от потенциала реверсии. Длительность М1Р оставалась постоянной при всех величинах гиперполярнзации.

В этих же опытах искусственная внутриклеточная деполяризация мембраны приводила к увеличению амплитуды М1Р, тем большему, чем большая поляризация имела место. Но и в этих случаях направление пика было в противоположную сторону от потенциала реверсии, т.е. в область более положительных значений. Длительность М1Р оставалась постоянной при всех величинах деполяризации.

3.3. Регистрация биоэлектрической активности механоеенситивнмх клеток при искусственном растяжении ппепарата В экспериментах на фрагментах предсердий с зоной синусного узла сердца крыс производили искусственное растяжение препаратов (п= 12).

В большинстве случаев М1Р, вызванные искусственным растяжени.-м, были направлены в область более отрицательных значений. Однако в части случаев М1Р были направлены в область более положительных значений. Их амплитуда определялась силон искусственного растяжения препарата. Увеличение силы растяжения фрагмента предсердия приводило к увеличению амплитуды М1Р, однако, при направленности М1Р к потенциалу реверсии его амплитуда никогда не превышала нулевую линию. При растяжении препарата с различной силой и в различной последовательности амплитуда М1Р всегда коррелировала с величиной механической стимуляции. При этом, величина мембранного потенциала оставалась неизменной, что. свидетельствует о хорошей фиксации мпкроэлектрода мембраной клетки. Длительность потенциалов соответствовала длительности искусственного растяжения препарата, а их форма коррелировала с формой механограммы.

$4. Изменение М1Р. вызванных спонтанными сокращениями ткани и ее искусственным растяжением, в условиях длительной перфузии препаратор физиологическим раствором 4.1. Изменения М1Р. вызванных спонтанными сокращениями ткани, в условиях длительной перфузии препаратов физиологическим раствором Регистрировали изменения М1Р изучаемых клеток, вызванных спонтанными сокращениями ткани, поддерживая потенциал на уровне -50 мВ, в течение

60 мин на фоне постоянной перфузии препарата физиологическим раствором (п = 20).

На протяжении времени регистрации амплитуда М1Р не менялась. Величина мембранного потенциала также оставалась на постоянном уровне, что свидетельствует об устойчивой фиксации микроэлектрода мембраной клетки.

Зависимость амплитуды МГР от величины смещения мембранного потенциала, вызванного ступенчатой пшерполяризацией до -100 мВ, линейна в начале эксперимента (сразу после введения микроэлектрода) и в конце эксперимента (через 60 мин). В пределах этих величин пшерполяризации амплитуда М1Р увеличивалась от 5 мВ до 70 мВ.

Эти эксперименты показали, что на протяжении времени регистрации амплитуда М1Р не менялась. Это позволило поставить эксперименты, связанные с изучением влияния на исследуемые клетки некоторых фармакологических агентов, вводимых внутриклеточно. При этом, спонтанные сокращения ткани, не меняющиеся в течение 60 мин, рассматривались в качестве механости-мулятора клетки.

4.2. Изменения М1Р. вызванных искусственным растяжением ткани в условиях длительной перфузии препаратов физиологическим раствором

Регистрировали изменения М1Р изучаемых клеток, вызванных искусственным растяжением ткани, в течение 60 мин на фоне постоянной перфузии препарата физиологическим раствором (п = 12).

Эти эксперименты показали, что на протяжении времени регистрации амплитуда М1Р, вызванных искусственным растяжением ткани, не менялась. Это познолило поставить эксперименты, связанные с изучением влияния на исследуемые клетки некоторых фармакологических агентов, вводимых в псрфузионный раствор.

55. Влияние некоторых фармакологических агентов на биоэлектрическую

Исследование влияния некоторых фармакологических соединений на М1Р било обусловлено необходимостью изучения принципиальных механизмов,

лежащих в основе его генерации. Поскольку исследуемые клетки являются механосенситивными, что подразумевает наличие в их мембранах stretch-activatcd channels, внеклеточно был применен блокатор этого типа каналов -лантаноид Gadolinium, который, по мнению ряда авторов, является их специфическим блокатором. Однако, считают, что воротный механизм stretch-activated channels определяется взаимодействием между цитоскелетом и stretch-activated channels поверхностной мембраны клеток. Для проверки этой позиции исследовали влияние внутриклеточно вводимых Cytochalasin В и Colchicine. Далее, на основании предположения о том, что в механизме генерации MIP играет роль внеклеточный кальций, была изучена возможность его генерации в бескальцневом растворе, содержащем EGTA. Наконец, для определения вклада осцилляцнй внутриклеточного кальция был использован внутриклеточно вводимый хелатор кальция ВАРТА.

5.1. Изучение роли stretch-activated channels в механизмах генерации MIP

Для определения роли stretch-activated channels в механизмах генерации MIP, вызванных спонтанными и искусственными растяжениями препарата, использовали специфический блокатор stretch-activated channels Gadolinium. В экспериментах Gadolinium вводили в перфузионный раствор в концентрации 50 цМ (п= 18).

На протяжении нескольких минут регистрации до введения Gadolinium амплитуда механограммы и амплитуда MIP не менялись. Введение в перфузионную среду Gadolinium не сказывалось на амплитуде механограммы, но на протяжении 6 мин выраженно уменьшало MIP, вызванные спонтанными сокращениями. Отмыв препарата в течение 20 минут возвращал амплитуду MIP до исходных величин. Как и в экспериментах на спонтанно сокращающемся фрагменте предсердия, Gadolinium практически полностью блокировал MIP механосенситивных клеток, вызванные искусственным растяжением ткани, не влияя при этом на механическую активность фрагмента предсердия, т. е. не влияя на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов.

Эти эксперименты продемонстрировали участие stretch-activated channels в механизмах генерации MIP, вызванных как спонтанными сокращениями, так н искусственным растяжением фрагмента сердца крысы.

исследуемых механосенситивных клеток. В первом случае на фоне исходного отрицательного мембранного потенциала направление пиков MIP было в область более положительных значений, то есть к потенциалу реверсии (обычно--10 + -3 мВ); в другом случае, также на фоне исходного отрицательного мембранного потенциала пики MIP были направлены в область более отрицательных значений, то есть от потенциала реверсии. Вероятнее всего, что эти различия определяются либо сжатием, либо растяжением данной механосенситивной клетки в момент сокращения (растяжения) препарата. Аналогичные результаты были описаны для механосенситивных клеток предсердия лягушки. Авторы на основании тщательного ана 1за экспериментов различных типов выдвигают предположение о том, какое направление М1Р связано с растяжением клетки, а какое с ее сжатием. Мы, однако, полагаем, что ответ на этот вопрос может быть только в экспериментах с растяжением и сжатием изолированного фибробласта.

3.2. Влияние искусственной внутриклеточной поляризации на биоэлектрическую активность исследуемых клеток Поляризация мембраны клеток выявила две диаметрально противоположные реакции исследуемых клеток на искусственную поляризацию (п = 74).

При исходном направлении MIP в область более положительных значений искусственная внутриклеточная пшерполяризацня мембраны приводила к увеличению амплитуды MIP, тем большему, чем на большую величину смещался потенциал. Длительность М2Р оставалась постоянной при всех величинах пшерполяризации.

Искусственная внутриклеточная деполяризация мембраны этих клеток приводила к уменьшению амплитуды MIP, тем большему, чем большая поляризация имела место, вплоть до полного прекращения возникновения потенциалов при достижении потенциала? реверсии. При дальнейшем увеличении сдвига мембранного потенциала в положительную область, MIP вновь появлялись, но уже обратного знака, причем их амплитуда была тем больше, чем большая величина сдвига мембранного потенциала имела место. В этом случае направление пика было в сторону потенциала реверсии. Длительность MIP оставалась постоянной при всех величинах деполяризации.

При исходном направлении пика М1Р в область более отрицательных значении искусственная внутриклеточная пшерполяризацня мембраны

В этих же опытах искусственная внутриклеточная деполяризация мембраны приводила к увеличению амплитуды М1Р, тем большему, чем большая поляризация имела место. Но и в этих случаях направление пика было в противоположную сторону от потенциала реверсии, т.е. в облапь более положительных значений. Длительность М1Р оставалась постоянной при всех величинах деполяризации.

3.3. Регистрация биоэлектрической активности механосенситивных клеток при искусственном растяжении препарата В экспериментах на фрагментах предсердий с зоной синусного узла сердца крыс производили искусственное растяжение препаратов (п = 12).

В большинстве случаев М1Р, вызванные искусственным растяжением, были направлены в область более отрицательных значений. Однако в части случаев М1Р были направлены в область более положительных значений. Их амплитуда определялась силой искусственного растяжения препарата. Увеличение силы растяжения фрагмента предсердия приводило к увеличению амплитуды М1Р, однако, при направленности М1Р к потенциалу реверсии его амплитуда никогда не превышала нулевую линию. При растяжении препарата с различной силой и в различной последовательности амплитуда М1Р всегда коррелировала с величиной механической стимуляции. При этом, величина мембранного потенциала оставалась неизменной, что. свидетельствует о хорошей фиксации микроэлектрода мембраной клетки. Длительность потенциалов соответствовала длительности искусственного растяжения препарата, а их форма коррелировала с формой механограммы.

§4. Изменение М1Р. вызванных спонтанными сокращениями ткани и ее искусственным растяжением, в условиях длительной перфузии

4.1. Изменения М1Р. вызванных спонтанными сокращениями ткани, в условиях длительной перфузии препаратов физиологическим раствором Регистрировали изменения М1Р изучаемых клеток, вызванных спонтанными сокращениями ткани, поддерживая потенциал на уровне -50 мВ, в течение

60 мин на фоне постоянной перфузии препарата физиологическим раствором (п = 20).

Зависимость амплитуды М1Р от величины смещения мембранного потенциала, вызванного ступенчатой гиперполяризацией до -100 мВ, линейна в начале эксперимента (сразу после введения микроэлектрода) и в конце эксперимента (через 60 мин). В пределах этих величин пшерполяризации амплитуда М1Р увеличивалась от 5 мВ до 70 мВ.

Эти эксперименты показали, что на протяжении времени регистрации амплитуда М!Р не менялась. Это позволило поставить эксперименты, связанные с изучением влияния на исследуемые клетки некоторых фармакологических агентов, вводимых внутриклеточно. При этом, спонтанные сокращения ткани, не меняющиеся в течение 60 мин, рассматривались в качестве механостн-мулятора клетки.

Эти эксперименты показали, что на протяжении времени регистрации амплитуда М1Р, вызванных искусственным растяжением ткани, не менялась. Это позволило поставить эксперименты, связанные с изучением влияния на исследуемые клетки некоторых фармакологических агентов, вводимых в псрфузионнын раствор.

активность механосенситивных клеток сердца крысы

Исследование влияния некоторых фармакологических соединений на М1Р было обусловлено необходимостью изучения принципиальных механизмов,

лежащих в основе его генерации. Поскольку исследуемые клетки являются механосенситнвными, что подразумевает наличие в их мембранах stretch-activatcd channels, внеклеточно был применен блокатор этого типа каналов -лантаноид Gadolinium, который, по мнению ряда авторов, является их специфическим блокатором. Однако, считают, что воротный механизм stretch-activated channels определяется взаимодействием между цитоскелетом и stretch-activated channels поверхностной мембраны клеток. Для проверки этой позиции исследовали влияние внутриклеточно вводимых Cytochalasin В и Colchicine. Далее, на основании предположения о том, что в механизме генерации MIP играет роль внеклеточный кальций, была изучена возможность его генерации в бескальцневом растворе, содержащем EGTA. Наконец, для определения вклада осцилляции внутриклеточного кальция был использован внутриклеточно вводимый хелатор кальция ВАРТА.

5.1. Изучение роли stretch-activated channels в механизмах генерации М1Р

На протяжении нескольких минут регистрации до введения Gadolinium амплитуда механограммы и амплитуда MIP не менялись. Введение а перфузионную среду Gadolinium не сказывалось на амплитуде механограммы, но на протяжении 6 мин выраженно уменьшало MIP, вызванные спонтанными сокращениями. Отмыв препарата в течение 20 минут возвращал амплитуду MIP до исходных величин. Как и в экспериментах на спонтанно сокращающемся фрагменте предсердия, Gadolinium практически полностью блокировал MIP мехапосенситивных клеток, вызванные искусственным растяжением ткани, не влияя при этом на механическую активность фрагмента предсердия, т. е. не влияя на биоэлектрическую активность кардиомиоцитов.

Эти эксперименты продемонстрировали участие stretch-activated channels в механизмах генерации MIP, вызванных как спонтанными сокращениями, так и искусственным растяжением фрагмента сердца крысы.

АЛШШ

0.5 ж

' Т/ТУ] I'гсп [л

- г

^тттупппгу

0.5»

ПППГ ]лПП/[-

шт

аллаалм

и"

Рис. 4. Вляние СайсНяат иа М!Р исследуемых клетох, =ыззгккых слэзгганнъа»™ сокращениями (А,Е,В) и ксхусстваиным растяженмеи (Г,ДЕ,! пргягргта. Верхняя кривея - гадксь механической ехтивкостя препарата, !:пл'с:;?;: кривая - бнсглехтрэтесжгя гхткгкоэтъ ::сследуе>з:;£ хлггсх.А,Г - фраг?1е:п' зарегистрированных хрлэьгл после ззэдекня ник::сглехгседа в хлэтху; Б,Д - фрагмент зарегкстрнрсзЕкных кривых через 6 кин посла ~ерфуз::и препарата физиологическим раствором, ссдяргсЕ::;::?-; £-('.о11г.::иг;. 3,2 -фрагмент зарегистрированных хргаых после 20 мин отмына препарата физиологическим растаором.

дтстгегнсста исслеАуечмх меток 5,2.1. Вдпявде С&ссШаз1п В ка биоэлектрическую актизность исследуэмых клеток В экспериментах Суtochal.cs(п В вводили внутрь клетки путем диффузии ;:з микроэлектродов, где соединение находилось в концентрации ¡00 цМ (п = К).

v.l»«

Рис. 5. Влияние Cytochalasin В на MIP исследуемых клеток. А - начало регистрации; D - через 25 мин. после внутриклеточного введения Cytochalasin В. 15 - зависимость амплитуды MIP от величины смещения мембранного потенциала при внутриклеточном введении Cytochalasin В.

Показано, что Cytochalasin В приводил к уменьшению в течение 25 мин на 40% амплитуды MIP, вызванных спонтанными сокращениями препарата. Зависимость амплитуды MIP от величины смещения мембранного потенциала до -100 мВ на фоне действия вещества становилась экспоненциальной с выходом на плато при гиперполяризации около -80 мВ. На уровне -100 мВ гиперполяризадии амплитуда MIP была около 28 мВ.

: Таким образом, эксперименты с внутриклеточным введением Cytochalasin В, который специфически гидролизует АТФ актина микрофилам ен-' тов, подтверждают гипотезу об участии цитоскелета в формировании биоэлектрической активности механосенситивных клеток сердца крысы.

5.2.2. Влиянии (^r.lchicine на биоэлектрическую активность исследуемых клеток В экспериментах Colchicine вводили внутрь клетки путем диффузии из микроэлектродов, где соединение находилось в концентрации 100 цМ (п=9).

100 200

-Ю0 -«О -«О -ТО -«О -во -SO -JO Ю О

CdcMctM I Л • О МН к - 2в E»lnV1

Рис. б. Вляние Colchicine на MIP исследуемых клеток. А - начало регистрации; Б - через 25 мин. после внутриклеточного введения Colchicine. 3 - зависимость амплитуды MIP от величины смещения мембранного потенциала при внутриклеточном введении Colchicine.

Показано, что Colchicine приводил к уменьшению з течение 25 мин на 45% амплитуды MIP, вызванных спонтанными сокращениями препарата. И в отсм-случае зависимость амплитуды М!Р от величины смещения мембразшсго потенциала, вызванного ступе'гттсй гиперполярнзацией до '100 мВ, становилась экспоненциальной с выходом на плато при шсерполяригащга около -80 мВ. На уровне -100 мЗ пшерполяризацин амплитуда MIP была около 25 ..iB.

Эксперименты с внутриклеточным введением Colchicine, который специфически деполимернзует тубулин микротубул, подтверждают гипотезу об участии цитоскелета в формировании биоэлектрической активности механосен-ситивных клеток сердца крысы.

5.3. Изучение роли внеклеточного Са**п гвиеоаиии М1Р

Для изучения роли внеклеточного кальция в механизме генерации М1Р использовали бескальцкезый раствор, содержащий £СГА. и изучали М1Р, вызванные искусственным растяжением ткани (п = 5).-;

Л mV

0 1 2 3 4

\ЛЛА^ДЛЛАА.

2 . 3 4

Рис. 7. Влияние EGTA на MIP исследуемых клеток, вызванные искусственным растяжением препарата. А - перфузия препарата физиологическим раствором; Б - 2 мин. перфузии препарата бескальциевым раствором, содержащим 2мМ EGTA; В - 2 мин. после отмыва препарата физиологическим раствором. AS - момент искусственное растяжения ткани.

В экспериментах, после введения микроэлектрода в изучаемую клетку и регистрации вызванных искусственным растяжением MIP, переключали перфузию препарата с физиологического раствора на бескальциевый раствор, содержащий 2мМ EGTA.

• На протяжении времени регистрации на фоне перфузии препарата физиологическим раствором амплитуда MIP не менялась. Величина мембранного потенциала также оставалась на постоянном уровне. После переключения перфузии препарата с физиолопгческого раствора на бескальциевый раствор, содержащий '2мМ EGTA, амплитуда MIP, вызванных искусственным растяжением ткани, уменьшалась в течение 2 мин. до 50% от исходных значений. Отмыв препаратов физиологическим раствором возвращал значение амплитуды MIP, вызванного искусственным растяжением ткани, до исходных величин

уже через 2 минуты перфузии. Таким образом, полученные данные иридемип-сгрировали роль внеклеточного кальция в генерации М1Р.

5.4. Изучение роли внутриклеточного Са* в генерации М1Р Для определения роли внутриклеточного Са1+ в механизме генерации М1Р мы использовали ВАРТА (хелатор кальция), который препятствует накоплению Са,+ внутри клетки. В экспериментах ВАРТА вводили внутрь клетки путем диффузии из микроэлектродов, где соединение находилось в концентрации 100 цМ (п = 8).

-юо -во -«О -ГО -00 -ёо -М -Ю -в 0 '

Рис. 8. Влияние ВАРТА на М1Р исследуемых клеток, вызванные спонтанными сокращениями препарата. А - М1Р после введения микроэлектрода в клетку; Б - 10 мин. после внутриклеточного введения ВАРТА. В - зависимость амплитуды М1Р от величины смещения мембранного потенциала на фоне внутриклеточном введении ВАРТА.

Диффузия ВАРТА нз микроэлектрода через 10 мшгут приводила к умрш.шег-но амплитуды М1Рдо 20% от первоначальных значений. Длительность

MIP также уменьшалась до 20% от исходной величины. Было показано, что при значениях мембранного потенциала от 0 мВ до -20 мВ, устанавливаемых искусственной поляризацией, MIP не генерируются. Зависимость амплитуды MIP от величины смещения мембранного потенциала, вызванного ступенчатой гиперполяризацией от -20 мВ до -100 мВ, линейна. На уровне -100 мВ гиперполяризации амплитуда MIP была около 35 мВ. Эти данные демонстрируют роль внутриклеточного кальция, участвующего в генерации MIP. Под влиянием ВАРТА менялась также реакция на пшерполяризацию. Эти результаты позволяют предположить, что механически индуцированные изменения концентрации внутриклеточного кальция, определяют электрический ответ клетки. Такое высвобождение кальция из внутриклеточных запасников и обратная АТФ-зависимая реабсорбция были продемонстрированы для большого количества электроневозбудимых клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении можно высказать следующие предположения о механизме генерации MIP. Прежде всего, возникновение MIP определяется механическим воздействием на клетку и связано с изменениями в проводимости внеклеточного кальция и. изменениями концентрации внутриклеточного кальция. Оба этих процесса могут контролироваться цитоскедетом, который взаимодействует с механосенситивнымн ионйыми каналами и может быть связан с каналами эндоплазма'пгаеского ретикулюма. Ключевым звеном этих процессов является увеличение концентрации внутриклеточного кальция. Мы предполагаем, что кальциевый ток через stretch-activated channels и кальциевый выход из эндоплазматического ретикулюма увеличивают внутриклеточную концентрацию кальция и осуществляют кальций-зависимый кальциевый вход в клетку или кальций-зависимый вход ионов по ионнеселективным каналам.

ВЫВОДЫ

1. В зоне синусного узла сердца крысы выявлены электроневозбудимые, но мехапосенситивные клетки, которые на основании электрофизиологических данных мы относим к фибробластам сердца. Величина их мембранного потенциала у крыс весом 100 г равна 19.23 ± 1.02 мВ и у крыс весом 400 г - 29.41 ± 1.23 мН. Величина входного сопротивления мембраны у крыс весом ЮОглежитв пределах от 0.4 ГОм до 0.6 ГОм и у крыс весом 400 г - от 0.7 ГОм до 1 Гом.

2. Резулвгаты введения в изучаемые клетки через мнкроэлектрод флюоресцентного красителя Lucifer Yellow свидетельствуют о том, что исследуемые механосенситивные клетки являются немышечными клетками. Гистологический анализ зоны локализации микроэлектрсда выявил в этом районе преимущественно кардиомиоциты и фнбробласты. В совокупности с электрофнзиологическими, эти данные позволяют допустить, что исследуемые клетки - фибробласты сердца.

3. Показано, что MIP фибробласта возникает с задержкой относительно потенциала действия близлежащего кардиомноцита, равной 10 мсек, но практически синхронно с пиком механограммы. Спонтанные сокращения и искусственное растяжение фрагмента предсердия вызывают MIP, направленные как в сторону деполяризации, так и в сторону пшерполяризации. Первые ассоциируются со сжатием клетки, вторые - с растяжением.

4. Гииерполяризация мембран... приводит к увеличению амплитуды MIP, вызванных спонтанными сокращениями ткани, и MIP, вызванных искусственным растяжением препарата, а деполяризация приводит к их уменьшению вплоть до полного прекращения возникновения на уровне потенциала реверсии от -3 мВ до -10 мВ. Дальнейшая деполяризация вызывает инверсию MIP и увеличение их амплитуды, тем большее, чем большая деполяризация имеет место.

5. Добавление в перфуэионный раствор Gadolinium приводило к блокированию М1Р, вызванных как спонтанными сокращениями, так и искусственным растяжением ткани, не влияя прн этом на собственную механическую активность препарата. Это свидетельствует об участии stretch-activated channels в генерации MIP фнбробластов сердца крысы.

6. Внутриклеточное введение Cytochalasin В и Colchicine приводит к уменьшению амплитуды М1Р и свидетельствует об участии цитоскелета в (формировании биоэлектрической активности фнбробластов сердца.

7. В1гутриклеточное введение хелатора кальция ВАРТА уменьшает амплитуду и длительность MIP, что Демонстрирует роль внутриклеточного кальция в их генерации. Добавление EGTA в перфузионнын раствор обратимо уменьшает амплитуду MIP, что свидетельствует о роли внеклеточного кальция в генерации MIP.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

[ 1 I Kondratjev D„ Pylaev A., Klseleva I., Kohl P., Kamkin AVMechanosensitlve electrically non-excitable cells in the atria of the frog and rat heart//J.Physiol (Great Britain).- 1993.-473.-258P.

[ 2 J Kondratjev D., Pylaev A., Klseleva I., Kohl P., Kamkin A. (Introduced by D. Noble)/ Mechanosensitive electrically non-exitable cells in the atria of frog and rat heart// Proceedings of the Physiological Society.-1993.-p. 121.

( 3 | Kamkin A, Kiseleva I., Kohl P., Kondratjev D., Lab MJ./Stretch-activated

channels in mechano-sensitive fibroblasts in frog and rat heart and their possible modulation by the cytoske-leton///nternationa/ Society for Heart Research. XV European Section Meeting. Ed: Stig Haunsq & Keld Kjedsen. Monduzzi Editore.-1994.-p.443-446.

I i J Kondratjev D„ Kohl P., Klseleva I., Kamkin AVStretch-induced peak potentials In mechano-sensitive fibroblasts of the hearts and their possible modulation by the cytoskeleton//BioJogica/ Motility. Intenational Symposium. Abstracts. Pushchino Sept.25-October 1. 1994.-p.245-246.

Подписано к печати 20.10.95 г. Объем 1,5 п.л. Зак.ЗВО. Тиг.ЮО. Типография Ml ТУ им.Н.с.Баумана

Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение механосенситивных клеток предсердий крыс в норме и при воздействии некоторых фармакологических агентов

Похожие научные работы

Каталог диссертаций