Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологическая регуляция функции Na+-K+-2Cl--котранспортера скелетных мышц и изучение его роли в гомеостазе калия и воды

На правах рукописи

ГОСМАНОВ АЙДАР РАУИСОВИЧ

ФАРМАКОЛОгаЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИИ №+-^-2^-

КОТРАНСПОРТЁРА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО РОЛИ В ГОМЕОСТАЗЕ КАЛИЯ И ВОДЫ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Казань-2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» и Научно-клиническом Центре университета Теннеси (Мемфис, США)

Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор Рофия Хафизьяновна Хафизьянова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Лилия Евгеньевна Зиганшина

доктор медицинских наук, Сергей Михайлович Горбунов

доктор биологических наук,

профессор Фарит Габдулхакович Ситдиков

Ведущее учреждение: Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится «/Ь » О (&клА1 . 2005 г. на заседании диссертационного совета Д.208.034.01 ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет»: 420012, г.Казань, ул.Бутлерова, Д.49

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (420012, г.Казань, ул.Бутлерова, д.49, корпус Б)

,7-

г*

в/-—часов

Автореферат разослан

« 7^» Сьел^иг^

2005 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

А.П.Киясов

ОБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Трансмембранный перенос ионов и молекул воды является одним из интегральных биологических процессов, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность клеток млекопитающих [D.Haussinger et al., 1994; F.Lang et al., 1998; W.C.O'Neill, 1999]. Показано, что Na+-K+-2C1-котранспортёр играет важнейшую роль в регуляции клеточного содержания электролитов и воды [С.Н.Орлов и др., 1996, 1997; M.Haas et al., 1994, 2000; J.M.Russell, 2000]. В последние годы были получены молекулярные и функциональные доказательства наличия Ка+-К+-2СЬкотранспортёра в поперечно-полосатой мышечной ткани [А.Х.Уразаев, 1997; L.Fu et al., 1999; M.I.Lindinger et al., 2001; J.A.Wong et al., 1999]. Показано, что в сердечной мышце крыс он участвует в поддержании концентрации калия мышечных клеток [G.O.Andersen et al., 1998]. Однако, несмотря на доказательства о присутствии Na+-K+-2Cl-котранспортерa в скелетной мускулатуре, его роль в этой ткани остаётся малоизученной.

Скелетная мышца является уникальной тканью, так как она содержит в себе до 75% калия и до 40% воды всего организма [AAMcDonough et al, 2002]. Поэтому нарушения в функционировании механизмов, участвующих в транспорте калия и воды, могут привести к значительным сдвигам в концентрации калия и осмолярности плазмы и пагубным последствиям на работу сердца и мозга [D.W.Foster, 1974; F.Lang et al., 1998; M.I.Lindinger, 1995; O.M.Sejersted, 2000]. Согласно современным представлениям, Na+-K+-2C1-котранспортёр является единственным клеточным механизмом по одновременной стимуляции транспорта как калия, так и воды в клетку [J.M.Russell, 2000]. Однако ни в одном из исследований оценка активности Na+-К+-20-котранспортёра по переносу калия и воды в скелетных мышцах не проводилась. Также не было изучено, какие стимулы надо приложить для активации котранспортёра. Изучение данного вопроса является важным для понимания процессов, задействованных в поддержании гомеостаза калия и воды как в скелетных мышцах, в частности, так и в организме целом.

Внутриклеточные механизмы регуляции работы N а+-К+-20-котранспортёра скелетных мышц также до сих пор остаются малоизученными.

В настоящее время имеются сведения, что при воздействии на мышцы гормонами, повышением осмолярности или сократительной активности происходят изменения в системе вторичных посредников и трансмембранных ионных потоков, что в свою очередь влияет на функциональную активность мышечной клетки [D.Haussinger et al., 1999; F.Lang et al., 1998; K.Sakamoto, LJ.Goodyear, 2002; J.F.Wojtaszewski et al., 2002]. Наиболее значимы в скелетной мышечной клетке такие системы как митоген-активируемые протеинкиназы, фосфатидилинозитол 3-киназа(Р13-K)/Akt, а также протеинкиназа A [F.Hoover et al., 2001; A.Thorell et al., 1999; UWidegren et al., 2001; Widmann et al., 1999; J.F.Wojtaszewski et al., 1999]. Существуют данные и о сопряжении работы калиевых каналов с активностью Na+-K+-2Cl-котранспортёра [MAClark et al., 1993; W.C.O'Neill et al., 1995; S.N.Orlov et al., 1996; J.Suvatne et al., 2001; T.Wang, 2003]. Однако влияние описанных процессов на работу Na+-K+-2C1-котранспортёра в скелетной мышце до сих пор не было исследовано.

Сахарный диабет является распространённым патологическим состоянием, которое сопровождается гипергликемией, гиперкалиемией и гилеросмолярностью плазмы [J.R.Gavin, 1998; H.King et al, 1998; A.E.Kitabchi et al., 2001; P.Zimmet et al., 2001]. Терапия сахарного диабета лекарственными препаратами, а также систематическими физическими упражнениями улучшает механизмы по гомеостатическому контролю транспорта глюкозы и ионов через плазматическую мембрану мышечных клеток [T.Clausen, 1998; C.Y.Christ et al., 2002; R.DeFronzo, 1999; J.L.Evans, 2002; AJ.Scheen et al., 1998; A.R.Harmer et al., 2000; J.O.Holloszy, 2003 ; H.Klitgaard et al., 1989; J.W.Ryder et al., 2001]. Несмотря на эти данные, функционирование N а+-К+-20-котранспортёра скелетных мышц при сахарном диабете и после его лекарственного лечения экспериментально не изучалось.

Таким образом, в связи с тем, что функционирование Na+-K+-2C1-котранспортёра вовлечено в течение ряда важных физиологических и патологических процессов в клетках организма, раскрытие функций Na+-K+-2C1 -котранспортёра и разработка способов их фармакологической регуляции в скелетных мышцах является актуальной проблемой современной базисной и клинической фармакологии.

Цель исследования. Изучение фармакологической регуляции работы №+-К+-2С!-котранспортёра в поддержании гомеостаза калия и воды в скелетных мышцах.

Задачи работы:

1. Оценить роль Ма+-К+-2С1-котранспортёра в регуляции содержания калия и воды в скелетных мышцах крысы.

2. Выявить роль агонистов адренергических рецепторов (изопреналина, фенилэфрина, эпинефрина), инсулина, короткого курса мышечных сокращений и гиперосмолярной среды в регуляции активности Ка+-К+-2С1-котранспортёра по транспорту калия и воды в скелетных мышцах крысы.

3. Изучить роль внутриклеточных вторичных посредников Raf-1-MEK-ERK1,2 МАРК, р38 МАРК и фосфатидилинозитол З-киназы/ЛЙ в регуляции работы Ка+-К+-2С11-котранспортёра в "медленных" и "быстрых" скелетных мышцах крысы.

4. Оценить роль каскада вторичных посредников цАМФ-аденилат циклаза-протеинкиназа А, гликолиза и АТФ-зависимых К-каналов в активации №+-К+-2С1-котранспортёра гиперосмолярной средой в "медленных" и "быстрых" скелетных мышцах крысы.

5. Провести оценку фармакологической регуляции активности №+-К+-2С1-котранспортёра в изолированных культурах клеток скелетной мышцы крысы.

6. Изучить влияние длительного курса физической нагрузок на активность Ка+-К+-2С1-котранспортера в "медленных" и "быстрых" скелетных мышцах крысы с оценкой воздействия на работу котранспортера изопреналина и инсулина.

7. Оценить функционирование Ка+-К+-2С1-котранспортёра и активность вторичных посредников по его регуляции в скелетных мышцах крысы и человека, страдающих сахарным диабетом, до и после лекарственной терапии заболевания пиоглитазоном и инсулином.

Научная новизна. Впервые выявлено, что агонисты адренергических рецепторов (изопреналин, фенилэфрин, эпинефрин), гиперосмолярная среда и мышечные сокращения стимулируют работу Ка+-К+-2С1-котранспортёра в скелетной мускулатуре крысы, что сопровождается усилением транспорта калия и воды в мышечные клетки, который наиболее выражен в "медленных"

мышцах крысы. Инсулин подавляет активацию Ка+-К+-20-котранспортёра в изоосмотической среде.

Установлено, что активация вторичных посредников системы внеклеточно-регулируемых киназ митоген активируемых протеинкиназ (ERK1,2 МАРК) необходима для Ка+-К+-20-котранспортёр-опосредованного переноса калия. Фармакологаческая стимуляция вторичных посредников протеинкиназы В (Akt) и р38 митоген активируемых протеинкиназ ( р38 МАРК) угнетает функцию Ка+-К+-20-котранспортёра по переносу калия за счет угнетения ERK1.2 МАРК.

Получены данные о роли АТФ-зависимых К-каналов (Кдтф-каналов) в регуляции работы Ка+-К+-20-котранспортёра скелетных мышц в гиперосмолярной среде: активация -каналов в "медленной мышце" и их угнетение в "быстрой" мышце опосредует стимуляцию Na+-K+-2C1"-котранспортёра в гиперосмолярной среде, причем в "медленной" мышце стимуляция КдтФ-каналов происходит в результате подавления активности протеинкиназы А и угнетения образования гликолитического АТФ.

Показано, что активность Ка+-К+-20-котранспортёра в клеточных культурах in vitro угнетается изопреналином, форсколином и фармакологическими агентами, повышающими цАМФ в клетке.

• Впервые установлено, что Ка+-К+-20-котранспортёр скелетных мышц активируется после курса дозированной физической нагрузки, что сопровождается улучшением как транспорта калия, так и воды в мышечные клетки. В этих условиях активация адренергических рецепторов изопреналином угнетает работу Ма+-К+-20-котранспортёра, а инсулин не влияет на его функцию.

Выявлена резистентность активации ERK1,2 МАРК и Akt инсулином в мышечной ткани животных и человека, страдающих сахарным диабетом. Фармакотерапия диабета инсулином и пиоглитазоном сопровождается нормализацией работы вторичных посредников по регуляции Na+-K+-2C1-котранспортёра в скелетных мышцах параллельно снижению уровня гипергликемии и гиперинсулинемии.

Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты исследования расширяют представления о роли скелетных мышц в регуляции

гомеостаза калия и воды в организме, протекающего с участием котранспортёра.

Полученные данные об ингибирующем влиянии буметанида па работу Na+-К+-2СГ-котранспортёра скелетных мышц расширяют представления о механизмах действия "петлевых диуретиков". Результаты исследований позволяют считать соединения, относящиеся к блокаторам ERK1,2 МАРК, в качестве фармакологических ингибиторов работы -котранспортёра.

Выявлена способность глибенкламида и пиоглитазона повышать активность -котранспортёра в скелетных мышцах. Результаты

исследования раскрывают молекулярные механизмы антидиабетического действия пиоглитазона, обосновывая возможность применения этого препарата для профилактики и лечения сахарного диабета.

Раскрытие молекулярных механизмов по модуляции активности 2С1'-котранспортёра позволило сформулировать единую концепцию внутриклеточной регуляции работы этого транспортного протеина в скелетной мышце.

Изучение систем вторичных посредников в "медленной" и "быстрой" мышцах, регулирующих активность котранспортёра, способствует

раскрытию фенотипических различий в скелетной мышечной ткани. Также проведенные исследования по оценке роли котранспортёра в

поддержании гомеостаза калия и воды имеют практическое значения для понимания патогенеза метаболических расстройств, связанных с нарушением функции мышечной ткани.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях предметно-проблемной комиссии КГМУ (2001,2004); съездах Федерации Амерканских Обществ Экспериментальной Биологии (Orlando, 2001; New Orleans, 2002; San Diego, 2003; Washington, 2004); 61-ой, 62-ой и 63-ей Научных Сессиях Американской Диабетической Ассоциации (Philadelphia, 2001; San Francisco, 2002; New Orleans, 2003); кафедре эндокринологии Ыаучно-клинического Центра Университета Теннеси (2002, 2003, Memphis); кафедре физиологии Научно-клинического Центра Университета Теннеси (2003, Memphis); съездах "Вопросы биологического транспорта" Американского Физиологического Общества (2002, 2003,

Cumburland Lake, Kentucky); XI Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2004); Международной научно-практической конференции "Рациональное использование лекарств" (Пермь, 2004); V Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 научные работы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. №+-К+-2СГ-котранспортёр скелетных мышц участвует в регуляции клеточного гомеостаза калия и воды. В изоосмолярных условиях котранспортёр переносит калий в клетку, а в гиперосмолярных условиях - препятствует потере воды из клетки.

2. В изоосмолярных условиях - и -адренергические агонисты стимулируют, а инсулин угнетает активность N а+-К+-2С1"-котранспортёра. Фармакологическая активация системы вторичных посредников, входящих в каскад ERK1,2 МАРК, необходима для усиления работы N а+-К+-2СГ-котранспортёра. Передача внутриклеточного сигнала через каскады р38 МАРК и фосфатидилинозитол З-киназа/Akt (PI З-K/Akt) в "медленной мышце" и PI 3-K/Akt в "быстрой мышце", подавляет активацию ERK1.2 МАРК и котранспортёра.

3. В гиперосмолярных условиях активация -котранспортёра не зависит от системы ERK1.2 МАРК, р38 МАРК и Akt, а опосредована угнетением функции протеинкиназы А (ПКА). В "медленной" мышце подавление ПКА опосредует данный эффект в результате снижения гликолиза и активации Кдтф-каналов. В отличие от этого в "быстрой" мышце угнетение функции -каналов гиперосмолярностью стимулирует работу котранспортёра.

4. Однократная и длительная физические нагрузки усиливают активность

-котранспортёра в скелетных мышцах, которая подавляется изопреналином и фармакологическими блокаторами функции ERK1,2 МАРК и не изменяется при действии инсулина.

5. В скелетных мышцах крыс с наследственным сахарным диабетом и больных с впервые выявленным сахарным диабетом выявлен дисбаланс в

функционировании вторичных посредников, регулирующих Na+-K+-2Cr-котранспортёр. Терапия заболевания пиоглитазоном и инсулином оказывает нормализующее влияние на изменения во внутриклеточных связях.

Структура и объем работы. Диссертация объемом 228 страниц машинописи состоит из введения, обзора литературы, главы - Материалы и методы исследования, 7 глав результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 437 источников, из них 21 отечественных авторов. Диссертация содержит 82 рисунка и 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на кафедре фармакологии ГОУ ВПО "Казанского государственного медицинского университета", Казань, Россия и на кафедре физиологии Научно-клинического Центра Университета Теннеси, Мемфис, США1. Экспериментальная часть работы посвящена изучению фармакологической регуляции функциональной активности котранспортёра в поддержании гомеостаза калия и воды в норме и при патологии. В исследовании были использованы парные "медленные" камбаловидные (m.soleus) и "быстрые" подошвенные (m.plantaris) мышцы от 1291 крысы линии Sprague-Dawley и 18 крыс лини fa/fa Zucker с наследственным сахарным диабетом; культуры скелетных мышечных (L6) и кишечных эпителиальных (IEC-6) клеток крысы и эмбриональных клеток почек человека (НЕК-293); а также биоптаты скелетных мышц от четырёх пациентов с впервые выявленным сахарным диабетом.

Опыты на изолированных скелетных мышцах крысы и мышечных биоптатах больных с диабетом проводили в термостабильных ванночках (Т ЗО°С), содержащих оксигенированный раствор Кребса-Рингера, по методике, описанной JA.Wong et al. (2001). Транспорт калия в мышечных препаратах и клеточных культурах оценивали по внутриклеточному переносу радиоактивного ''Rb [H.H.Ussing, 1965,1980] с последующим подсчётом константы транспорта

1 Автор выражает искреннюю благодарность доктору Дональду Томасону за всесторонюю помощь при проведении экспериментов.

радиоизотопа по J.A.Wong et al. (2001). Содержание внутриклеточной воды измеряли по распределению радиоактивных -мочевины и -маннитола во внеклеточном и внутриклеточном пространствах по Hayama et al. (1993).

Активность Ка+-К+-2СГ-котранспортёра определяли с использованием специфического фармакологического ингибитора буметанида в концентрации 10"5 М [J.Russel,2000]. В качестве растворителя буметанида применяли ДМ СО. Буметанид-чувствительная (На+-К+-2С1'-котранспортёр-опосредованная) часть исследуемого физиологического процесса (коэффициент транспорта калия или внутриклеточный объём воды) определялась путём вычитания значения, полученного в мышце, инкубированной с буметанидом, из значения, полученного в противоположной мышце, инкубированной только с ДМСО.

Функциональное состояние внутриклеточных киназ, ответственных за работу определяли иммунологическим методом по

детекции фосфорилирования и экспрессии протеинов. Для этого скелетные мышцы после инкубации, проведённой без добавления радиоизотопов и буметанида, моментально замораживали, лизировали в буфере, содержащем ингибиторы фосфатаз, и центрифугировали. Изучение фосфорилирования и экспрессии протеинов осуществляли иммунопреципитацией и иммуноблотингом. Принцип этих методов заключается в том, что при использовании специфических антител, произведённых к протеину интереса, происходит иммунологическое связывание протеина и антитела. При проведении иммуноблотинга этот комплекс детектировали вторым антителом, сшитым с пероксидазой хрена, и затем обрабатывали реагентами для индукции свечения пероксидазы, что затем фотографировали на плёнку. При минорном содержании белка в клетках, проводили сначала иммунопреципитацию (или выделение белка), а затем осаждённый протеин определяли иммуноблотингом. Степень фосфорилирования протеинов вычисляли как соотношение интенсивности свечения фосфорилированной формы протеина к интенсивности свечения общего протеина. Далее уровень фосфорилирования в базальном состоянии принимали за 1.0 и фосфорилирование протеина во всех экспериментальных группах перерасчитывали к базальным значениям.

Для изучения роли инсулиновых и адренергических рецепторов в модуляции активности котранспортёра применяли инсулин,

фенилэфрин (а-адренергический агонист), изопреналин (Р-адренергический агонист) и эпинефрин (а,Р-адренергический агонист). Оценку вовлечённости вторичных посредников в регуляцию работы N а+-К+-2С1"-котранспортёра проводили с использованием фармакологических ингибиторов PD098059 и U0126 (для подавления активности ERK1.2 МАРК), SB203580 (для подавления активности р38 МАРК), wortmannin и LY294002 (для подавления активности PI 3-К),Н-89 и КТ-5720 (для подавления активности промин киназы А), коклюшный токсин (для ингибирования активации О^-протеинов). Активность протеин киназы С и Raf-1 киназы ингибировали соединениями GF109203X и GW5074 соответственно. Активность ПКА повышали холерным токсином, форсколином или 8-Бромо-цАМФ. Функцию АТФ-зависимых К-каналов (Кдтф-каналы) повышали пинацидилом или угнетали глибенкламидом. Гликолитический распад глюкозы в клетках подавляли йодоуксусной кислотой (ЙУК) или замещением глюкозы на пируват.

Влияние гиперосмолярности на активность №+-К+-2С1"-котранспортёра и функцию вторичных посредников изучали добавлением в изоосмолярный растовор Кребса-Рингера (298 мОсм) 20 мМ глюкозы или 20 мМ маннитола, чем достигали повышения осмолярности раствора до 318 мОсм - величины осмолярности, которая регистрируется в крови пациентов при сахарном диабете [RSchliess, D.Haussinger, 2003].

Для оценки влияния мышечных сокращений на функцию Иа+-К*-2СГ-котранспортёра крыс подвергали сеансу бега на механизированной беговой дорожке в течение 30 минут со скоростью 20 м/мин при наклоне полотна в 20% [D.B.Thomason et al., 1987]. Для изучения эффектов многократных сеансов мышечных сокращений крысы ежедневно бегали две или четыре недели. Активность цитрат синтетазы в мышцах оценивали по методу Srere (1969).

Работу котранспортёра изучали в нескольких типах культур

клеток. В экспериментах использовали скелетные мышечные низкодиффренцированные (миобласты) и высокодифференцированные (миотубы) L6 клетки [Y.Mitsumoto, A.Klip, 1992], кишечные эпителиальные клетки крысы а также нативные и экспрессирующие Kir 6.2

субъединицу КдтФ-канала НЕК-293 клетки [SAJohn et al., 2001].

Оценку антидиабетического действия препарата из группы тиазолидинедионов (TZD) пиоглитазона на активность вторичных посредников, регулирующих активность Ма+-К+-2СГ-котранспортёра скелетных мышц, проводили на модели сахарного диабета у fa/af Zucker крыс, имеющих мутацию в гене, кодирующем рецептор к лептину [GABray, 1977]. Изучаемое соединение вводили один раз в день внутрижелудочно курсом однократно или 14-кратно. Для суждения о влиянии диабета на активность Na+-K+-2C1-котранспортёра в склетных мышцах у людей, пациентов с первично выявленным диабетом и уровнем гликемии равным 30 мМ в течение десяти недель лечили подкожными инъекциями инсулина до достижения ремиссии заболевания [G.E.Umpierrez et al., 1995]. Мышечные биоптаты брали у пациентов из поверхностных слоев мышцы vastus lateralis бедра до начала, а также после завершения курса фармакотерапии. Течение сахарного диабета у крыс и больных характеризовали по уровню глюкозы и содержанию инсулина в крови.

Статистический анализ достоверности полученных результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Математические подсчёты проводили с использованием компьютерной программы "Excel" на компьютере Macintosh 9.O. Интенсивность свечения иммуноблотов подсчитывали с помощью компьютерной программы NIH Image 1.62. Построение графиков и таблиц осуществляли с использованием компьютерных программ "Graph Cricket 3.0", Adobe Illustrator 10.0 и Excel/Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Функциональная роль активации Ка+-К+-2СГ-котранспортёра в "медленной" и "быстрой" скелетных мышцах крысы.

Фармакологическая стимуляция транспорта калия инсулином и катехоламинами в скелетную мышцу частично опосредована повышением активности Ка+,К+-АТФ-азы [T.Clausen, 1986, 1998]. В изолированной камбаловидной и подошвенной мышцах крысы, инкубированных в

изоосмолярной среде, транспорт калия посредством N а+-К+-2С1'-котранспортера, оцененный как буметанид-чувствительный транспорт 86Rb, отсутствовал (Рис1). Стимуляция скелетных мышц а-адреноагонистом фенилэфрином и ß-адреноагонистом изопреналином в концентрациии з*Ю"5 м приводила к активации N а+-К+-2С1'-котранспортера-опосредованного транспорта калия, которая была более выражена в камбаловидной мышце, в то время как инсулин в концентрации 100 мкЕд/мл не проявлял эффекта. В скелетных мышцах животных, подверженных 30-минутному бегу их на тредмиле, также происходило повышение транспорта калия в клетки посредством котранспортёра, что согласуется с литературными данными, указывающими на активацию клеточных механизмов по восстановлению содержания калия в скелетных мышцах после сеанса сократительной активности [T.Clausen, 2003; M.I Lindinger, 1995; J.Renaud, 2002].

Рис 1. Влияние фармакологических агентов и сократительной активности на буметанид-чувствительный транспорт калия в скелетных мышцах крысы. * -Р<0.05 по сравнению с базальным уровнем.

Оценка роли Ка+-К+-2СГ-котранспортёра в под держании гомеостаза воды в скелетных мышцах, что ранее было охарактеризовано как неотьемлимая часть работы котранспортёра в других типах клеток [\У.С.ОчКеШ, 1999; LM.Russel, 2000], выявила, что повышение осмолярности на 20 мОсм глюкозой или маннитолом приводило к достоверной стимуляции транспорта воды в скелетные мышцы крысы за счёт активации работы котранспортёра, так как

буметанид, не влияющий на содержание воды в мышцах, инкубированных в изоосмолярных растворах, снижал объём камбаловидной мышцы на 15% (Р<0.05) (Рис. 2) и подошвенной мышцы на 8-10% (Р<0.05) в гиперосмолярных растворах. В связи с тем, что и гиперосмолярные растворы и агонисты адренергических рецепторов повышали активность Ка+-К+-2СГ-котранспортёра, представляло интерес изучение роли катехоламин индуцированного повышения функции Nа+-К+-2СГ-котранспортёра в регуляции объёма скелетных мышц. Стимуляция изопреналином камбаловидной и подошвенной мышц, инкубированных в изоосмолярной среде не изменяла объёма скелетных мышц как при отсутствии, так и наличии буметанида; воздействие инсулином также не приводило к изменениям в транспорте воды в мышечной ткани (Рис. 2).

Рис. 2. Влияние буметанида на объём камбаловидной мышцы при её инкубации в базальтом состоянии (БАЗ), с инсулином 100 мкЕд/мл (ИНС), изопреналином 3*10" М (ИЗО) или в гиперосмолярных растворах. * - Р<0.05 по сравнению с ДМСО.

Таким образом, на основании анализа результатов экспериментов установлено, что котранспортёр выполняет двойную функцию в

регуляции транспортных процессов в мышечной ткани крысы. В изоосмолярных условиях стимуляция котранспортёра приводила к усилению транспорта калия в клетку без изменений в клеточном объёме. Повышение ормолярности

сопровождалось усилением N аМС^2СГ-котранспортёр-опосредованного транспорта воды, направленного на предотвращение сморщивания (снижения содержания воды) мышечных волокон.

Действие изопреналина, фенилэфрина и инсулина на Na^K^Cl'-котранспортёр-опосредоваиный транспорт калия в "медленной" и "быстрой" скелетных мышцах крысы.

Так как литературные данные указывали на вероятность подобной диссоциации в функционировании ионных транспортёров клеточных мембран и с целью выявления молекул, ответственных за регуляцию Na+-K+-2Q"-котранспортёра в этих условиях, в дальнейших экспериментах проводили фармакологический анализ внутриклеточных механизмов, осуществляющих обе функции котранспортёра. Действие катехоламинов на мышечную клетку приводит к стимуляции вторичных посредников из системы внеклеточно-регулируемых киназ митоген активируемых протеин киназ (ERK1,2 МАРК) [G.O.Andersen et al., 1998; R.Napoli et al., 1998, R.P.Xiao et al., 1995]. Фармакологическая блокада этой системы соединениями PD98059 и1Л)126 угнетала котранспортёр-опосредованный транспорт калия,

вызванный фенилэфрином или изопреналином, в камбаловидной и подошвенной мышцах, что согласуется с предыдущими исследованиями Andersen et al. (1998), указывающими на необходимость активации катехоламинами ERK1,2 МАРК для стимуляции работы N а+-К+-2СГ-котранспортёра в сердечной мышце.

Ингибитор активации мембранных G^-протеинов - коклюшный токсин -предотвращал стимуляцию буметанид-чувствительного транспорта калия и повышение активности ERK1.2 МАРК изопреналином в камбаловидной мышце; однако он не проявлял подобного действия в подошвенной мышце (Рис. 3). Наши исследования показали, что супрессивное действие коклюшного токсина опосредуется активацией протеинкиназы Б (Akt) и угнетением активности Raf-1 киназы, являющейся сигнальной молекулой системы ERK1,2 МАРК, за счёт повышения фосфорилирования Raf-1 по аминокислотному остатку Ser*59. В экспериментах, проведённых CRommel et al. (1999) и S.Zimmermann, K.Moelling (1999) было показано, что в мышечных клетках Akt непосредственно

фосфорилирует Raf-1 no Ser259 , тем самым угнетая активность ERK1.2 МАРК. Результаты фармакологического анализа показали, что активация р38 МАРК не опосредует усиление активности NKCC, вызванной изопреналином, в скелетных мышцах крысы.

Рис. 3. Влияние изопреналина и блокады Ол/гпротеинов на активность ККСС (А) и фосфорилирование БИК1,2 МАРК (Б) в скелетных мышцах крысы. Р<0 05 по сравнению с базальным и изопреналином в камбаловидной мышце, соответственно.

Несмотря на способность инсулина активировать N а+-К+-2С1 -котранспортёр-опосредованный транспорт калия в других клеточных типах [G.Sweeney et al, 1998; G Sweeney, A.Klip, 1998], аналогичного влияния гормона на мышечную ткань крысы не было выявлено. Литературные данные указывали, что отсутствие эффекта инсулина может быть связано с активацией вторичных посредников, которая не наблюдалась при действии изопреналина [R.Napoh et al, 1998]. Инкубация скелетных мышц с фармакологическими блокаторами фосфатидилинозитол 3-киназы (wortmannin и LY294002) и р38 МАРК

(SB203580) в присутствии инсулина сопровождалось достоверной стимуляцией буметанид-чувствительного транспорта калия по сравнению с действием инсулина в отсутствии блокаторов. котранспортёр-стимулирующее

действие wortmannin и LY294002 регистрировалось в обоих фенотипах мышц, в

то время как SB203580 повышал работу котранспортёра только в камбаловидной мышце (Рис. 4). Иммунологический анализ активности этих киназ показал, что инсулин стимулирует активность PI З-K/Akt в обеих мышцах, а р38 МАРК активируется только в камбаловидной мышце, что подтверждает механизм действия фармакологических ингибиторов этих молекул. В литературе описано, что стимуляция PI З-K/Akt и р38 МАРК угнетает функцию ERK1.2 МАРК [C.Rommel et al., 1999; J.D.Laporte et al., 2000]. В экспериментах нами выявлено, что действие фармакологических блокаторов систем PI З-K/Akt и р38 МАРК действительно сопровождается угнетением инсулин-индуцированной активности ERK1.2 МАРК (Рис.5). Более того, мы обнаружили ингибирующий эффект инсулина на изопреналин-индуцированную стимуляцию транспорта калия посредством NKCC, что, согласно данным V.Karoor et al. (1998), обусловлено антагонистическим эффектом инсулина на взаимодействие изопреналина с его рецептором в клеточной мембране. Блокатор активации р38 МАРК - соединение SB203580 восстанавливал эффект изопреналина на активность NKCC в подошвенной мышце.

□ Базальный

■ Инсулин

И ИНО LY294002

£к Камбаловидная Подошвенная

Рис. 4. Влияние комбинированного воздействия 100 мкЕд/мл инсулина и фармакологических ингибиторов активности Р1 3-К или р38 МАРК на ]ЧКСС-опосредованный транспорт калия в скелетных мышцах крысы. *, I - Р<0.05 по сравнению с базальным и инсулином, соответственно.

П Базальный ■ Инсулин

2 ИНС+1_У2940(2 О ИНСМог&паптп В ИНС+З 0203580

Камбаловидная Подошвенная

Рис. 5. Влияние 100 мкЕд/мл инсулина и фармакологических ингибиторов активности Р1 3-К или р38 МАРК на фосфорилирование ЕКК1.2 МАРК в скелетных мышцах крысы. t - Р<0 05 по сравнению с базальным и инсулином, соответственно.

Фармакологическая регуляция трансмембранных потоков калия в сокращающейся мышце представляет особый интерес для клинической медицины, так как позволяет определить стратегию предотвращения гиперкалиемии во время физических упражнений [М I.Lindmgeг, 1995; DJ.Paterson, 1995]. Соединение PD98059, которое угнетает функцию ERK1,2 МАРК, подавляло активацию Ка+-К+-2С1-котранспортера скелетных мышц, выделенных у животных после 30-минутного бега на беговой дорожке (Рис. 6). Активация |3-адренергических рецепторов изопреналином угнетала усиление буметанид-чувствительного транспорта калия; аппликация адреноблокатора пропранолола снимала угнетающее действие изопреналина. Наши данные объясняют описанные в литературе результаты работ E.L.Rollet et э1. (1990) и J.Hallen et я1. (1996), показывающих угнетение транспорта калия (5-адреномиметиками в мышечной ткани после физической нагрузки.

Следовательно, активация N а+-К+-2С1 -котранспортёра мышечными сокращениями представляет собой регулируемый процесс, имеющий важные последствия для гомеостаза калия в организме.

Рис. 6. Влияние изопреналина и 30-минутного бега по отдельности и в комбинации на NKCC-опосредованный транспорт калия в скелетных мышцах крысы. t - Р<0.05 по сравнению с базальным и изопреналином у не бегавших крыс соответственно.

При анализе ингибируещего действия изопреналина было выявлено, что он не угнетал двукратное повышение фосфорилирования ERK1,2 МАРК в камбаловидной мышце (Табл. 1). В подошвенной мышце, несмотря на 30% (Р<0.05) повышения фосфорилирования изопреналином и сократительной активностью по отдельности, при их совместном влиянии происходило достоверное угнетение этого показателя до величин, зарегистрированных в базальном состоянии у мышц контрольных крыс, находящихся в состоянии покоя. В отличие от действия изопреналина на скелетные мышцы контрольных крыс, 30-минутный бег на беговой дорожке повышал фосфорилирование Akt по Thr308 в камбаловидной и в два раза в подошвенной мышцах и совместная инкубация этих мышц в присутствии изопреналина не изменяла эти показатели Мышечные сокращения также стимулировали фосфорилирование Akt no Ser473,

□ Базалькый □ Бег ■ Бегтизопреналин

13 Йюпреналии К Бег + 0 Бегч-изопреналик PDC96059 пропра колол

Камбаловидная

Подошвенная

что необходимо для полной активации этой молекулы [Б.Р.Бга211 е! а1., 2001, 2002], в 2-2,5 раза в обоих фенотипах мышц; изопреналин при действии на сокращавшиеся мышцы не вызывал изменений в фосфорилировании этой молекулы. Вероятным вторичным посредником, опосредовавшим ингибирующее воздействие изопреналина на активность КаМС^СГ-котранспортёра после физической нагрузки является активация р38 МАРК. В камбаловидной и подошвенной мышцах значения фосфорилирования р38 МАРК, зарегистрированные при воздействии изопреналина на мышечную ткань после однократной физической нагрузки были достоверно выше по сравнению с действием изопреналина и мышечных сокращений на этот показатель по отдельности.

Таким образом, стимуляция ЕКК1.2 МАРК является ключевым моментом в передаче внутриклеточного сигнала при действии адренергических агонистов, инсулина и мышечных сокращений для стимуляции работы котранспортёра в изоосмолярных условиях. В медленной мышце происходит активация мембранных ^м-протеинов и ИаМ киназы, однако эти элементы не играют роль в стимуляции ЕЯК1.2 МАРК в быстрой мышце. Активация системы Р1 З-К/АЙ и р38 МАРК угнетает в скелетных мышцах крысы как активацию ЕКК1.2 МАРК, так и перенос котранспортёром калия. Если в медленных мышцах больше выражено ингибирующее влияние р38 МАРК, то блокирующее действие Р1 З-К/АЙ: распостранялось и на медленные и на быстрые мышцы (Рис. 7).

Рис. 7. Схематическое изображение роли вторичных посредников при действии инсулина на активацию Ка+-К+-2С1"-котранспортёра в скелетных мышцах крысы. стимулирование, Т - ингибирование.

Таблица 1

Влияние однократной мышечной тренировки на фосфорилирование некоторых вторичных посредников в отсутствии и присутствии изопреналина в "медленной" и "быстрой" скелетных мышцах крысы.

Камбаловидная Подошвенная

Сидячие крысы Бегующие крысы Сидячие крысы Бегующие крысы

Базальный Изопре-напин Базальный Изопре-налин Базальный Изопре-налин Базальный Изопре-налин

КПК 1,2 МАРК АМТЬг3" АМ Яег473 Р38МАРК 1.0 ±0.04 1.8±0.1б* 1.0 ±0.1 1.4 ±0.15 1.0 ±0.15 1.2 ±0.10 1.0±0.06 0.8±0.12 1.9 ±0.20* 2.0±0.18* 6.8 ± 1.1' 4.8 ± 1.1* 2.6 ±0.13* 2.8±0.13* 0.9±0.11 2.0±0.14*п 1.0 ±0.06 1.3±0.06* 1.0 ±0.12 1.2 ±0.14 1.0 ±0.14 1.0 ±0.12 1.0±0.08 1.5±0.10* 1.3 ± 0.05* 0.8±0.05п 2.4 ±0.18* 3.1±0.22* 2.0 ± 0.15* 2.2±0.15* 1.8±0.15* 3.2±0.18*+а

*, 1", а- Р<0.05 по сравнению с базальным и изопреналином у сидячих и базальным у бегающих крыс, соответственно

Фармакологическая регуляция активности Ка+-К+-2СГ-котранспортёр-опосредованного транспорта воды в "медленной" и "быстрой" скелетных мышцах крысы в гиперосмолярной среде.

Повышение осмолярности раствора на 20 мОсм маннитолом, глюкозой и её производными приводило к усилению активности Ма+-К+-2СГ-котранспортёра, которое не ингабировалось инсулином (Табл. 2).

Таблица 2

Эффект повышения осмолярности на активность NKCC в скелетных мышцах в отсутствии и присутствии инсулина в концентрации 100 мкЕд/мл.

Константа буметанид-чувствительного транспорта ^Ь ((г/мл)"1 х мин'хЮ"3)

Камбаловидная Подошвенная

Базалъный Инсулин Базальный Инсулин

298 мОсм 0.4 ± 0.8 -0.2 ±0.5 0.5 ± 1.0 0.2+1.1

+20 мМ Глюкозы 9.5 * 2.5* 7.2 ± 2.6* 4.5 ± 1.3* 3.9 ± 1.5*

+20 мМ Маннитола 10.1 ±2.2* 9.5 ± 2.8* 3.5 ± 1.2* 5.2 ± 2.0*

+20 мМ Глюкозамина 7.0 ± 2.5* 9.5 ± 2.0* 5.4 ± 1.8* 5.2 ± 1.2*

+20 мМ 3-0-М-Глюкоза 10.2±0.8* 10.0±2.5* 5.3 ± 2.0* 5.0 ± 2.0*

* - Р<0.05 по сравнению с базальным значением в изоосмолярной среде.

Известно, что воздействие гиперосмолярной среды на скелетные мышцы приводит к усилению активности ERK1.2 МАРК и р38 МАРК [К.Опо, 2000; C.Widraann et al., 1999]. В последующих опытах было выявлено, что фармакологические блокаторы ERK1,2 МАРК (соединение PD98059) ир38 МАРК (соединение SB203580) не изменяли активации Na+-K+-2C1-котранспортёра гиперосмолярными средами, полученными добавлением 20 мОсм глюкозы или маннитола (Табл. 3). Однако при стимуляции скелетных мышц изопреналином или форсколином, которые повышают содержание внутриклеточного цАМФ и актвность протеин киназы А (ПКА) [A.Klrp et al., 1988; S.J.Roberts et al., 1998], наблюдалось достоверное угнетение работы Na+-котранспортёра вне зависимости от природы углевода, повышавшего осмолярость.

Только повышение осмолярности глюкозой, но не маннитолом, приводило к усилению фосфорлирования ERK1.2 МАРК. Активирующее влияние шсулина на фосфорилирование этой молекулы не изменялось ни в среде с добавлением глюкозы, ни в гиперосмолярном растворе с маннитолом. Глюкоза и маннитол усиливали фосфорилирование р38 МАРК только в камбаловидной мышце. Повышение осмолярности не только не влияло на уровень фосфорилирования Akt no Ser4", но и более того, в случае с глюкозой происходило на 50% (Р<0.01) снижение фосфорилирования этой молекулы в подошвенной мышце. Инсулин одинаково стимулировал р38 МАРК и Akt в скелетных мышцах крысы, инкубированных как в изоосмолярном растворе, так и в гиперосмолярной среде с маннитолом. Однако наличие повышенной концентрации глюкозы в растворе снижало инсулин-индуцированное фосфорилирование р38 МАРК в камбаловидной мышце и Akt в подошвенной мышце (Табл. 4). Также исследовали влияние соединений PD98059 и SB203580 на активность вторичных посредников. PD98059 угнетал фосфорилирование ERK1.2 МАРК и SB203580 подавлял активность р38 МАРК в скелетных мышцах, инкубированных в гиперосмолярных растворах с глюкозой и маннитолом, что согласуется с литературными данными о механизме действия этих соединений на изучаемые вторичные посредники [D.Alessi et al., 1995; S.P.Davies et al., 2000; R.Somwar et al., 2000].

Результаты экспериментов показали отсутствие влияния инсулина на изменения буметанид-чувствительного транспорта воды в мышцах, инкубированных в гиперосмолярных растворах. Однако добавление в гиперосмолярные растворы изопреналина или форсколина сопровождалось достоверным снижением объёма камбаловидных и подошвенных мышц; причём размеры этих мышц не отличались от размера мышц, на которые воздействовали буметанидом без добавления активаторов протеинкиназы А, что свидетельствовало об угнетающем влиянии изопреналина и форсколина на транспорт воды, опосредованный NKCC в скелетных мышцах крысы (Рис. 8).

Таким образом, инсулин и стимуляция ERK1.2 МАРК, р38 МАРК и Akt не участвовали, а стимуляция системы АЦ-цАМФ-ПКА подавляла работу Na+-K+-

Таблица 3

Действие фармакологических ингибиторов ЕИК1.2 МАРК и р38 МАРК и их комбинации с инсулином, а также

активаторов ПКА на активность NK.CC в скелетных мытттттях. инкубированных в гиперосмолярной среде._

_Константа буметанид-чувствительного транспорта "ЯЬ ((г/мл)1 X мин 'хЮ"3)

318 мОсм (глюкоза)

Камбаловидная

Подошвенная

318 мОсм (маннитол)

Камбаловидная

Подошвенная

Вязальный

+ PD98059

+Инсулин+Р098059

+SB203580

+Инсулин+8В203580

+Изопреналин

+Форсколин

9.5 ± 2.4 8.9 ± 3.0 8.8 ± 2.1

9.8 ±3.1 12.0 ± 3.0 2.8 ± 1.5* 3.0 ± 1.2*

4.5 ± 1.3

6.8 ± 1.4 5.7 ± 2.2

4.9 ± 2.2 5.4 ± 1.9 1.0 ±0.5* 1.2 ±0.8*

10.3 ± 2.0

11.4 ±2.5 11.0 ±3.6 9.4 ± 1.5 8.4 ± 2.5 3.0 ± 1.6* 0.3 ± 1.9*

3.5 ± 1.2 4.5 ± 2.0 5.2 ± 2.4 6.1 ± 1.9 4.0 ± 0.5 0.3 ± 1.0* 0.5 ± 0.8*

* - Р<0.05 по сравнению с базальным значением в гиперосмолярной среде. Таблица 4 Влияние инсулина и гиперосмолярных сред по отдельности и в комбинации на фосфорилирование ERK1.2 МАРК, р38 МАРК и Akt в скелетных мышцах крысы.

Фосфорилирование вторичного посредника

298 мОсм 318 мОсм (глюкоза) 318 мОсм (маннитол)

Камбало- Подош- Камбало- Подош- Камбало- Подош-

видная венная видная венная видная венная

ERK1,2 Базальный 1.0 ±0.18 1.0 ± 0.07 1.48 ±0.12* 1.98 ±0.08* 0.99 ±0.10 0.89 ±0.13

Инсулин 1.45 ±0.10* 1.92 ±0.25* 1.54 ±0.16* 2.20 ± 0.22* 1.70 ±0.20* 1.64 ±0.18*

p38 Базальный 1.0 ±0.15 1.0 ±0.11 2.40 ± 0.25* 1.13 ±0.20 3.90 ±0.85* 1.17 ±0.28

Инсулин 4.5 ± 0.80* 0.78 ±0.19 1.20 ±0.17* 0.78 +0.15 6 40± 1.20* 1.05 ±0.20

Akt Базальный 1.0 ±0.10 1.0 ±0.13 0.82 ±0.16 0.45 ± 0.041 1.06 ±0.23 1.33 ±0.20

Инсулин 4.79 ± 0.60* 4.43 ± 0.70* 4.80 ± 0.60* 1.37 ±0.25* 5.35 ± 0.49* 4.28 ± 0.55*

*, t - Р<0.05 по сравнению с базальным и инсулином в изосмолярной среде, соответственно.

Рис. 8. Влияние 3*10"5 М изопреналина, 2*10'3 М форсколина и гиперосмолярных сред по отдельности и в комбинации на объём скелетных мышц крысы. * -Р<0.05 по сравнению с соответствующим базальным значением с ДМСО.

2С1'-котранспортёра в гиперосмолярной среде. Природа добавляемого сахара (глюкоза или маннитол) не изменяла внутриклеточные механизмы по активации Ка+-К+-2С1"-котранспортёра, что свидетельствовало о том,. что простое повышение осмолярности, а не внутриклеточный метаболизм глюкозы, представляло собой стимул для усиления работы котранспортёра. В отличие от стимуляции в изоосмолярной среде, для которой

необходима ЕЯК1,2 МАРК, такой поворот событий в случае с гиперосмолярной регуляцией котранспортёра не является единственным примером модуляции мембранного транспорта. Результаты исследований, проведённых Ь.БкпсМт Ы а1. (1994) и Б.ОйИв Ы а1. (2001), показали зависимость стимуляции

Ка+,Н+-обменника-1 в изоосмолярной среде от ERK1.2 МАРК, в то время как его стимуляция в гиперосмолярной среде уже не опосредовалась этим вторичным посредником. Хотя объём обуславливает нормальную функцию любой клетки и отклонения в содержании внутриклеточной воды играют немаловажную роль в патогенезе некоторых заболеваний [F.Lang et al., 1998], ни одно из ранее проведённых исследований не было посвящено изучению молекулярных механизмов регуляции активности котранспортёра в

гиперсмолярной среде.

Роль протеин киназы А и АТФ-зависимых калиевых каналов в регуляции активности №+-К+-2СГ-1котранспортёра в "медленной" и "быстрой" скелетных мышцах крысы.

Результаты экспериментов показали, что в основе активации работы Na+-котранспортёра в гиперосмолярных растворах лежит подавление активности ПКА, так как активаторы ПКА угнетали деятельность котранспортёра. Фармакологические ингибиторы активности ПКА - соединения КТ5720 и Н-89 - стимулировали функцию котранспортёра в камбаловидной мышце, но не проявляли действия на работу котранспортёра в подошвенной мышце. Одним из последствий подавления функции ПКА в скелетной мышце является угнетение образования гликолитического АТФ, что в свою очередь активирует функцию КдтФ-каналов [M.R.Dietz et al., 1980; J.HJames et al., 1999; J.M.Renaud, 2002; J.N.Weiss, 1987, 1989; DA.Young et al., 1985]. Активация КдтФ-каналов фармакологическим агентом пинацидилом или ингибированием гликолиза йодоуксусной кислотой (ЙУК) или пируватом вызывала достоверную активацию Ма+-К+-2СГ-котранспортёра в камбаловидной мышце (Рис. 9), но не влияла на его активность в подошвенной мышце. Наличие каналов в скелетных мышечных клетках описано в литературе [W.Matar, J.M.Renaud, 1997; JJ.Nielsen et al., 2003]; для дальнейшего изучения взаимосвязи Na+-K+-2C1" -котранспортёр - канал применяли фармакологический блокатор канала глибенкламид. В камбаловидной мышце глибенкламид угнетал активацию Na+-К+-2СГ-котранспортёра, вызванную Н-89, стимуляцией КлтФ-каналов и гиперосмолярностью (Рис. 9). Однако воздействие глибенкламида на подошвенные мышцы наоборот увеличивало работу котранспортёра и не

ингибировало №+-К+-2СГ-котранспортёр в гиперсмолярной среде. В специальной серии экспериментов нами было установлено, что активация КАТФ-каналов в камбаловидной и их угнетение в подошвенной мышцах сопровождались усилением буметанид-чувствительного транспорта воды в мышечные волокна, что было аналогично активации котранспортёра в гиперосмолярной среде.

Рис. 9. Влияние активации и ингибирования Клтф-каналов на №+-К+-2С1"-котранспортбр-опосредованный транспорт в камбаловидной мышце. Р<0.05 по сравнению с базальным и без лечения с глибенкламидом, соответственно.

Более того, была оценена работа Ма+-К+-2С1"-котранспортёра в НЕК-293 клетках, которые были трансфецированы ю:г6.2 субъединицей кдтф-канала. В обычных НЕК-293 клетках, в которых КдтФ-канал отсутствует, угнетение гликолиза подавляло активность котранспортёра, что ранее было описано на этом типе клеток [J.M.Russel, 2000]. Однако экспрессия функционально активного канала достоверно повышала работу

котранспортёра в присутствии ингибитора гликолиза на 50% и 26% по сравнению с клетками не содержащими и содержащими Кдтф-канал в отсутствии ЙУК соответственно (Рис. 10). Интересно, что активация Кдтф-канала ингибитором гликолиза сопровождалась усилением выхода калия из НЕК-293 клеток [A.R.Gosmanov et э1., 2004]. Мы предполагаем, что высвобождение ионов калия во внеклеточное пространство является стимулом

для усиления работы Ма+-К+-2СГ-котранспортёра в скелетных мышцах, инкубированных в гиперосмотической среде. Подобная регуляция работы котранспортёра была описана в эпителиоцитах петли Генле, которые подвержены постоянному гиперосмотическому воздействию [M A. Clark et al, 1993; T.Wang, 2003].

Наряду с активацией Ка+-К+-2СГ-котранспортёра в камбаловидной мышце, соединение Н-89 повышало фосфорилирование ERK1,2 МАРК на 40% (Р<0.05), которое блокировалось блокатором стимуляции ERK1.2 МАРК -соединением PD98059. Однако ни PD98059, ни инсулин не угнетали Н-89-индуцированную функцию Ма+-К+-2СГ-котранспортёра в камбаловидной мышце. Другим экспериментальным доказательством независимости активации котранспортёра блокатором ПКА от активности ERK1.2 МАРК явилось отсутствие влияния комбинации Н-89 и PD98059 на фосфорилирование р38 МАРК и Akt.

о

□ -KiflJ 2 (контроль) *'о 1 +Ки6 3 (грлнсфещии;

3 х

Рис. 10. Активность котранспортёра в контрольных и

имеющих высокую активность Кдтф-каналов НЕК-293 клетках при воздействии ингибитора гликолиза ЙУК. t - Р<0.05 по сравнению со значением в контрольных и трансфецированных клетках соответственно.

Таким образом, при оценке механизма стимуляции работы Ка+-К+-2СГ-котранспортёра в гиперосмолярой среде было выявлено, что в медленной мышце, гиперосмолярность угнетает активность ПКА, что в свою очередь подавляет интенсивность гликолиза и образования АТФ; понижение концентрации гликолитического АТФ приводило к активации каналов с

последующим усилением работы Ка+-К+-2СГ-котранспортёра. В противоположность этому в быстрой мышце ингибитор активности Кдтф-каналов способствовал активации №+-К+-2СГ-котранспортёра.

Фармакологическая регуляция активности NKCC в изолированной культуре клеток.

Наряду со зрелой мышечной тканью животных, исследователи часто используют культуры клеток in vitro для изучения фармакологической регуляции внутриклеточных процессов (J.M.Russel, 2000). Мы установили, что в базальном состоянии в активно пролиферирующих L6 миобластах NaMC^Cl" -котранспортёр опосредует 50% общего транспорта i6Rb, в то время как по мере дифференцировки мышечных клеток этот показатель снижался до 28% в L6 миотубах. Фармакологические блокаторы ERK1.2 МАРК, PI 3-К и ПКС не изменяли базальную активность котранспортёра в мышечных

клетках, что согласуется с результатами экспериментов, проведённых Sweeney et al. (1998), показавших отсутствие эффекта этих ингибиторов на активность котранспортёра в культивируемых фибробластах. Однако мы впервые выявили ингибирующее действие стимуляторов ПКА изопреналина и форсколина, угнетавшим на 36% (Р<0.01) и 27% (Р<0.05) соответственно буметанид-чувствительный транспорт радиоизотопа в L6 миобластах. В экспериментах изучали фармакологическую регуляцию активности котранспортёра и в культуре клеток кишечника крысы - IEC-6. Блокаторы ERK1.2 МАРК не были способны подавить базальный уровень буметанид-чувствительного транспорта 86Rb, опосредовавшего 30% общего переноса радиоизотопа. Однако аппликация изопреналина и форсколина вела к двукратному (Р<0.05) снижению транспорта 86Rb посредством Na+-K+-2C1'-котранспортёра, в то время как соединение Н-89, ингибирующее активность ПКА, в два раза (Р<0.05) усиливало работу котранспортёра.

Таким образом, в культуре клеток скелетной мышцы и кишечного эпителия крысы котранспортёр высокоактивен в базальном состоянии и его

работа усиливалась параллельно повышению пролиферативной активности клеток; этот феномен был описан Raat et al. (1996) на эпителиоцитах почек.

Внутриклеточная регуляция активности Ка+-К+-2СГ-котранспортёра в изолированных клетках не вовлекала функцию ERK1.2 МАРК, а напрямую зависела от системы цАМФ-ПКА. Следовательно, такой тип регуляции работы котранспортёра в культуре клеток сходен с таковым в зрелой мышечной ткани при воздействии гиперосмолярной среды.

Влияние длительного курса физических упражнений и сахарного диабета на активность Na+-K+-2Cr- котранспортёра в скелетной мышце крысы и человека.

Литературные данные, указывавшие на патологическую роль снижения интенсивности процессов, обеспечивающих поддержание внутриклеточной концентрации калия и воды при сахарном диабете [M.S.Djurhuus et al., 2001, 2002; FXang et al., 1998; F.Schliess, D.Haussinger, 2000, 2003], и результаты собственных экспериментов по оценке роли в гомеостазе калия и воды и внутриклеточных механизмов, регулирующих активность котранспортёра в скелетных мышцах здоровых животных, позволили нам предположить, что при этом заболевании усиление функции котранспортёра способно противодействовать развитию этой патологии. Общепризнано, что длительные физические нагрузки предупреждают развитие сахарного диабета [D.F.Kelley, B.H.Goodpaster, 2001], однако роль Ка*-К+-2СГ-котранспортёра при этом оставалась не изученной. Ежедневные 30-минутные сеансы бега животных на тредмиле повышали интенсивность окислительных процессов, судя по активности цитрат синтетазы, в камбаловидной после двух и в подошвенной мышце после четырёх недель тренировки на 56% и 69% соответственно, что является маркером усиления метаболизма глюкозы [J.O.Holloszy, 2003] (Табл. 5). Масса крыс и масса их скелетных мышц не изменялась в процессе курса физических нагрузок. Общий транспорт повышался в скелетных мышцах вне зависимости от длительности тренировок, что подтверждало концепцию улучшения гомеостаза калия в мышцах после длительных тренировок [T.Clausen, 1998; M.I.Lindninger, 1995]. Такое усиление в общем транспорте калия было частично обусловлено усилением базальных значений активности Ка+-К+-2СГ-котранспортёра в камбаловидной мышце после двух недель и в подошвенной мышце после четырёх недель тренировок (Табл. 6). Примечательно,

Таблица 5

Влияние длительной мышечной тренировки на массу, активность цитрат синтетазы и обищй транспорт Rb в

"медленной" и "быстрой" скелетных мышцах крысы.

2 недели бега 4 недели бега

Сидячие крысы Бегующие крысы Сидячие крысы Бегующие крысы

Камбало- Подош-видная венная Камбало- Подош-видная венная Камбало- Подош-видная венная Камбало- Подош-видная венная

Масса мышц (мг) 81±1 189±1 83±1 191±1 77±1 184±1 79±1 190±1

Активность цитрат синтетазы (мкмоль/г/ми н) 24.7 * 5.3 45.2 ± 8.2 38.6 * 4.9* 49.2 ± 8.5 28.4 * 5.2 32.5 * 5.0 25.9 * 3.3 55.0 * 7.2*

Общий транспорт ИЬ ((г/мл)"1 X мин'х!0 3) 27.8*2.0 16.5*1.5 38.6*2.5* 21.5*2.1* 19.6 * 0.7 13.9 * 1.4 24.0 * 2.0* 16.6 ± 0.8*

* - Р<0.05 по сравнению с соответствующим значением у сидячих крыс. Таблица 6 Влияние длительной мышечной тренировки на Ка^-К^СГ-котранспортбр-опосредованный транспорт ^ЯЬ и фосфорилирование ERK1,2 МАРК в отсутствии и присутствии гормонов в "медленной" и "быстрой" скелетных мышцах крысы.

2 недели бега 4 недели бега

Сидячие крысы Бегующие крысы Сидячие крысы Бегующие крысы

Камбало- Подош-видная венная Камбало- Подош-видная венная Камбало- Подош-видная венная Камбало- Подош-видная венная

NKCC Баэальный Изопреналин Инсулин 0.6 ±0.8 0.1 ±0.5 6.5 ±1.6* 2.7 ±0.4* 0.3 ± 0.5 1.0 ± 0.6 5.8 * 1.0* 1.0 * 0.6 -0.3*0.8* -0.5*1.1* 5.4*1.1** -0.7*0.9 1.0*0.9 -0.8*0.6 6.2*1.3* 3.9 ±0.6* 0.6 * 0.2 0.3 ± 0.5 -0.4 * 1.2* 2.8 * 0.5* 0.2 ±1.0* -0.3 ±1.0* 0.3 * 0.8 -2.9*0.5**

ERK МАРК Базальный Изопреналин Инсулин 1.0 ±0.08 1.0 ±0.09 1.5*0.12* 1.5±0.15* 1.4*0.08* 1.4*0.07* 1.4*0.10* 1.2*0.11 1.7*0.18* 1.4*0.03* 1.0*0.10* 0.8*0.10* 1.0 ±0.11 1.0*0.07 1.6*0.10* 1.7*0.13* 1.4*0.05* 1.5*0.12* 1.0*0.12 1.9*0.15* 1.7*0.08* 1.6*0.13* 1.1 ±0.08* 1.8*0.12*

*, t - Р<0.05 по сравнению с базальным и изолреналином или инсулином у сидячих крыс, соответственно.

что повышение работы Ка+-К+-2СГ-котранспортёра на этих сроках сопровождалось усилением фосфорилирования ERK1.2 МАРК. Однако изучение гормональной регуляции активации Ма+-К+-2СГ-котранспортйра в тренированных мышцах показало, что работа котранспортёра может регулироваться ERK1,2 МАРК-независимым путём. Нами выявлено, что изопреналин, который активировал ERK1,2 МАРК и N а+-К+-2СГ-котранспортёра в мышцах контрольных крыс в состоянии покоя, подавлял повышенную функцию или вообще не был способен стимулировать Na+-K+-2CT-котранспортёра в тренированных мышцах при отсутствии действия гормона на фосфорилирование ERK1.2 МАРК (Табл. 6). В то время как инсулин не проявлял ингибирующего воздействия на работу котранспортёра в

тренированных скелетных мышцах, но достоверно угнетал фосфорилирование ERK1.2 МАРК в камбаловидной и подошвенной мышцах после двух недель и в камбаловидной мышце после четырёх недель бега. В последующих экспериментах мы обнаружили, что такое ингибирование инсулином ERK1,2 МАРК в камбаловидной мышце после четырёх недель эксперимента происходило на фоне сенситизации действия инсулина в отношении активности Akt. При действии инсулина на тренированные мышцы регистрировали семикратное (Р<0.001) повышение фосфорилирования Akt по Ser473 по сравнению с контрольными крысами; в то время как инсулин и физическая активность по отдельности усиливали фосфорилирование только в 3 раза

Таким образом, результаты исследований выявили активирующее влияние физических нагрузок на работу Ка+-К+-2С1"-котранспортёра. Этот процесс сопровождался стимуляцией функции ERK1.2 МАРК, но также и характеризовался ингибирующим воздействием изопреналина на функцию котранспортёра. Мы предполагаем, что усиление функциональной деятельности котранспортёра в скелетных мышцах крыс после курса физической активности, которое регулировалось ERK1.2 МАРК-зависимыми и -независимыми вторичными посредниками, указывало на улучшение котранспортером как гомеостаза калия, так и воды.

При сахарном диабете в ткани скелетных мышц выявлены патогенетические изменения в функционировании вторичных посредников, необходимые для регуляции работы Показано, что

мышца при диабете характеризуется пониженной активностью ERK1.2 МАРК и Akt [J.L.Evans et al„ 2003; J.W.Ryder et al„ 2001; J.Zierath et al„ 2000].

На модели сахарного диабета у тучных fa/fa Zucker крыс 14-дневное внутрижелудочное введение пиоглитазона оказывало гипогликемический эффект, проявляйся в снижении сахара крови на 39% (Р<0.05), и снижало гиперинсулинемию в 3,75 (Р<0.01) раза - что является основной целью антидиабетического лечения (Табл. 7).

Таблица 7

Показатели концентраций глюкозы и инсулина в крови у fa/fa Zucker диабетических крыс без лечения или при лечении пиоглитазоном.

Контрольная группа Однократное введение 14-дневное введение

ДеньО День 14 ДеньО День 14 ДеньО День 14

Глюкоза (ммоль/л) 9,4±0,37 11,65±0,54 10,94+1,8 13,54±1,5 8,38+0,42 8,39±0,69*

Инсулин (нмоль/л) 0,87±0,1 0,74±0,07 0,81±0,06 0,89±0,02 0,75+0,08 0,20±0,1*

* - Р<0.05 по сравнению с отсутствием лечения на 14 дне эксперимента.

Без лечения пиоглитазоном инкубация инсулином в концентрации 100 мкЕд/мл угнетала фосфорилирование ERK1.2 МАРК в камбаловидных мышцах диабетических крыс в два раза (Р<0.05), не влияя на этот показатель в подошвенных мышцах (Табл. 8). Клинический эффект терапии пиоглитазоном сопровождался устранением угнетающего влияния инсулина на фосфорилирование ERK1.2 МАРК в камбаловидной мышце. Однако в подошвенных мышцах животных, леченных однократно или в течение 14 дней, происходило повышение базального уровня фосфорилирования вторичного посредника в 2,5-3 раза (Р<0.05), которое угнеталось при стимуляции этих мышц инсулином. Терапия пиоглитазоном не изменяла показатели фосфорилирования Akt no Ser4'3 в камбаловидной мышце у больных животных.

Пиоглитазон, однако, улучшал базальную функцию Akt в подошвенной мышце, которая не изменялась при инкубации мышц с инсулином. Нами впервые показано, что пиоглитазон является эффективным антидиабетическим препаратом и одним из механизмов реализации его эффектов является улучшение функционирования вторичных посредников в мышечной ткани.

Таблица 8

Значения базального и инсулин-стимулированного фосфорилирования ERK1.2 МАРК и Akt в скелетных мышцах контрольных и леченых пиоглитазоном й/Ь Zucker диабетических крыс.

Контрольная группа Однократное введение 14-дневное введение

Базальный Инсулин Базальный Инсулин Базальный Инсулин

ERK МАРК Камбало-видная 1.0±0.02 0.5±0.03* 1.1±0.12 1.7±0.50 1.4±0.15 1.7±0.22*

Подошвенная 1.0±0.03 1.1 ±0.05 2.5±0.30* 1.3±0.13* 2.7±0.25* 1.4±0.15*

Akt Ser473 Камбало-видная 1.0*0.10 1.0±0.21 0.9±0.16 1.3±0.17 0.9±0.14 1.1*0.22

Подошвенная 1.0+0.06 1.2+0.08 2.7±0.45* 2.6*0.40* 3.0+0.36* 2.8±0.19*

*, Ь - Р<0.05 по сравнению с базальным и инсулином у нелеченных крыс, соответственно.

Больные, страдающие впервые выявленным сахарным диабетом, на момент диагноза имели ожирение и высокую концентрацию глюкозы в крови (Табл. 9).

Таблица 9

Клинические и метаболические характеристики пациентов, страдающих сахарным диабетом, на момент первичного диагноза и после лечения инсулином.

Возраст (годы) Масса (кг) Глюкоза (тМ/л) Инсулин плазмы (мкЕд/мл) - Р<0.05 по сравнению с отсутствием лечения

До лечения

42.3 ±4.9 98.1 ±7.2 30.5 ±4.8 31.1 ±20.4

После лечения

42.5 ± 4.9 93.3 ± 8.3 6.9 ±1.1* 22.0 ± 4.4

Так как длительный курс инсулинотерагош сопровождается осложнениями, препятствующими дальнейшему лечению инсулином [М.И.Балаболкин, 1994;

О.М.Смирнова, 1996], мы провели короткий, 10-недельный курс подкожных инъекций инсулина. Терапия инсулином практически нормализовала содержание глюкозы в крови у диабетических пациентов.

При анализе активности вторичных посредников в биоптатах мышц у этих пациентов было обнаружено, что во время и гипергликемии и нормогликемии инсулин был способен в 3 раза активировать фосфорилирование инсулинового рецептора по фосфотирозиновым остаткам. Действительно, J.T.Brozinick et al. (2003) показали, что при сахарном диабете возбуждение рецептора гормоном в мышечной ткани не изменено. Более того, в дальнейших экспериментах бьшо выявлено, что стимуляция инсулином фосфорилирования Akt no Thr308 в мышечной ткани во время гипергликемического кризиса также не нарушена (Рис. 12). Однако антидиабетическая терапия способствовала восстановлению нарушенной при гипергликемии способности инсулина повышать фосфорилирование Akt no Ser4'3, что необходимо для полной активации этой молекулы [D.P.Brazil et al, 2003].

Рис. 12. Влияние инсулина в концентрации 100 мкЕд/мл на фосфорилирование Akt по Thr308 (А) и Ser4'3 (Б) в биоптатах во время гипергликемии и после её лечения. * - Р<0.05 по сравнению с базальным во время гипергликемии.

Инсулин не проявлял активирующего действия в отношении фосфорилирования БЯК1,2 МАРК как во время гипергликемии, так после эффективного лечения заболевания. Аналогично анализу экспрессии №+-К+-2С1"-котранспортёра в скелетных мышцах диабетических крыс, терапия

заболевания у пациентов не изменяла первоначальный уровень синтеза котранспортёра, зарегистрированный до начала лечения.

Таким образом, длительный курс физических упражнений является методом, улучшающим транспорт калия и воды в мышечную ткань посредством -котранспортёра. Фенотипические характеристики скелетных мышц обуславливали такое усиление в медленных мышцах на более ранних сроках тренировок, сменявшимся затем улучшением работы котранспортёра в быстрых мышцах. Патологические сдвиги в содержании глюкозы и инсулина в крови и глубокие нарушения в функции ERK1,2 МАРК и Akt в мышечной ткани при сахарном диабете у крыс и людей корригировались коротким курсом терапии инсулином и пиоглитазоном. Улучшение деятельности этих вторичных посредников указывает на важную роль активности котранспортёра в поддержании гомеостаза калия и воды при этом заболевании.

ВЫВОДЫ

1. котранспортёр скелетных мышц выполняет двойную функцию: он усиливает транспорт калия в изоосмолярной среде и увеличивает перенос воды в гиперосмолярной среде.

2. Выявлены функциональные последствия фармакологической модуляции работы котранспортёра в скелетных мышцах:

- в изоосмолярной среде агонисты адренергических рецепторов активируют, а инсулин ингибирует транспорт калия, опосредованный Na+-K+-2СГ- -котранспортёром,

- в гиперосмолярной среде и после короткого курса мышечной активности происходит стимуляция работы котранспортёра, которая ингибируется изопреналином и не изменяется инсулином.

3. Функциональная активность На+-К+-2СГ-котранспортёра по переносу калия и воды в мышечной ткани обусловлена специфичностью внутриклеточных механизмов по регуляции этих функций:

- фармакологическая активация каскада вторичных посредников ERK1,2 МАРК необходима для повышения транспорта калия. Ингибирование калий-транспортирующей функции котранспортёра осуществляется при

фармакологической стимуляции каскада посредников PI З-K/Akt и р38 МАРК в "медленных" мышцах и PI З-K/Akt - в "быстрых мышцах",

- поддержание гомеостаза воды Ка+-К+-2С1"-котранспортёром в гиперосмолярной среде в обоих фенотипах мышц происходит без участия вторичных посредников из каскадов ERK1.2 МАРК, PI З-K/Akt и р38 МАРК.

4. Усиление транспорта воды Ыа+-К+-2СГ-котранспортёром в скелетных мышцах в гиперосмолярной среде происходит при ослаблении активности вторичных посредников в каскаде аденилат циклаза - цАМФ - протеинкиназа А. В "медленной1 мышце это ведёт к угнетению гликолиза и стимуляции Кдтф-каналов, а в "быстрой" мышце для активации котранспортёра критическим является ингибирование каналов.

5. Активность Та+-К+-2СГ-котранспортёра в скелетных мышечных клетках крысы in vitro:

- угнетается препаратами, усиливающими внутриклеточную передачу сигнала в каскаде аденилат циклаза - цАМФ - протеинкиназа А,

- не изменяется при воздействии инсулина и фармакологических агентов, подавляющих активность вторичных посредников ERK1,2 МАРК и PI З-K/Akt.

6. Длительная физическая нагрузка улучшает гомеостаз калия и воды в скелетных мышцах крыс. Активация работы -котранспортёра происходит в "медленных" мышцах на более ранних сроках и в "быстрых" мышцах при более длительных нагрузках. При этом Ыа+-К+-2СГ-котранспортёр угнетается изопреналином, а инсулин не оказывает модулирующего воздействия.

7. В скелетных мышцах животных и больных, страдающих сахарным диабетом, происходит снижение активности в функционировании внутриклеточных механизмов, регулирующих активность котранспортёра. Эффективная фармакотерапия сахарного диабета приводит к улучшению нарушенных внутриклеточных взаимодействий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Перспективным является поиск и доклиническое исследование препаратов, регулирующих функционирование котранспортёра

среди соединений, селективно регулирующих активность вторичных посредников из каскадов ERK1,2 МАРК, PI 3-K/Akt, p38 МАРК и протеинкиназы А.

2. Пиоглитазон может быть рекомендован для профилактики и лечения сахарного диабета в качестве препарата, нормализующего действие инсулина в скелетной мышечной ткани.

3. При рассмотрении в клинической практике механизмов действия "петлевого диуретика" буметанида рекомендуется учитывать его способность модулировать активность №+-К+-2СГ-котранспортёра в скелетных мышцах.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Wong J.A. Insulin-independent, МАРК-dependent stimulation of NKCC activity in skeletal muscle / Wong JA, Gosmanov A.R., Schneider E.G., Thomason D.B. // Am. J. Physiol. (Regulatory Integrative Сотр. Physiol.).- 2001.- Vol.281.- P. R561-R571.

2. Gosmanov A.R. Fiber-type Specific Signaling Pathways for Potassium Transport by Skeletal Muscle / Gosmanov A.R., Thomason D.B. // FASEB J.- 2001.-Vol.l5(4),P. A-87.

3. Gosmanov A.R. Insulin Reduces Isoproterenol-Stimulated Potassium Transport in Skeletal Muscle by a PI 3-Kinase-Insensitive Mechanism / Gosmanov A.R., Thomason D.B. // Diabetes.- 2001.- Vol.50 (Suppl. 2).- P. A298.

4. Gosmanov A.R. Insulin and isoproterenol differentially regulate MAP kinase-dependent Na+-K+-2Cl'-cotransporter activity in skeletal muscle / Gosmanov A.R., Thomason D.B. // Diabetes.- 2002,- Vol.51.- P.615-623.

5. Gosmanov A.R. ERK МАРК Activation Is Involved In Exercise-Induced Regulation of Skeletal Muscle Na+-K+-2C1"-cotransporter (NKCC)-Mediated Potassium Uptake / Gosmanov A.R., Nordtvedt N.C., Brown R., Thomason D.B. // FASEB J.- 2002.- Vol. 16(4).- P. A448.

6. Gosmanov A.R. ERK and p38 МАРК Pathways Do Not Mediate NKCC Stimulation by Hyperosmotic Stimuli / Gosmanov A.R., Thomason D.B. // Diabetes.-

2002.- Vol.51 (Suppl. 2).- P. A363.

7. Gosmanov A.R. Duality of G protein-coupled mechanisms for p-adrenergic activation of NKCC activity in skeletal muscle / Gosmanov A.R., Wong J.A., Thomason D.B. // Am. J. Physiol. (Cell. Physiol.).-2002.- Vol.283.- P. C1025-C1032.

8. Gosmanov A.R. Exercise effects on muscle ^-adrenergic signaling for MAPK-dependent NKCC activity are rapid and persistent / Gosmanov A.R., Nordtvedt N.C., Brown R., Thomason D.B. // J. Appl. Physiol.- 2002.- Vol.93.-P.1457-1465.

9. Gosmanov A.R. NKCC activity restores muscle water during hyperosmotic challenge independent of insulin, ERK, and p38 МАРК / Gosmanov A.R., Schneider E.G., Thomason D.B. // Am. J. Physiol. (Regulatory Integrative Сотр. Physiol).-

2003.- Vol.284.- P. R655-R665.

10. Gosmanov A.R. Tonic Inhibition of Cotransporter Activity by PKA in Slow-Twitch Skeletal Muscle Under Isosmotic Conditions / Gosmanov A.R., Thomason D.B. // FASEB J.- 2003.- Vol.l7(4).- P. A440.

11. Gosmanov A.R. [beta]-Cell Function and Muscle Insulin Signaling in Obese African Americans with Atypical Diabetes / Gosmanov A.R., Umpierrez G.E., Cuervo R., Karabell A., Thomason D.B. // Diabetes.- 2003.- Vol.52 (Suppl. 2).- P. A287.

12. Госманов А.Р. Регуляция активности Na+-K+-2C1' котранспорте'ра в скелетно-мышечных и эпителиальных клетках кишечника крысы / Госманов А.Р., Томасон Д.Б. // Цитология.- 2003.- Том 45(8).- С. 812-816.

13. Gosmanov A.R. Riding the tides: [K+] and volume regulation by muscle Na+-K+-2C1" cotransporter / Gosmanov A.R., Lindinger M.I., Thomason D.B. // News Physiol. Sci.- 2003.- Vol.18.- P. 196-200.

14. Gosmanov A.R. ATP-sensitive Potassium Channels Mediate Hyperosmotic Stimulation of NKCC in Slow-twitch Muscle / Gosmanov A.R., Fan Z., Mi X.,

Schneider E.G., Thomason D.B. // Am. J. Physiol. (Cell. Physiol.).- 2004.- Vol. 286.-P. C586-C595.

15. Gosmanov A.R. Na+-K+-2C1" cotransporter in skeletal muscle: new story about an old protein / Gosmanov A.R. Thomason D.B. // Recent Res. Dev. Physiol-2004.-Vol. 2.-P. 149-166.

16. Госманов А.Р. Влияние физиологической дозировки инсулина на фосфорилирование вторичных посредников в скелетной мышце крысы / Госманов А.Р., Хафизьянова Р.Х., Томасон Д.Б. // Тезисы Рос. научно-практ. конф. с межд. участием "Рациональное использование лекарств" .- Пермь, 2004.- С. 29

17. Госманов А.Р. Клинические аспекты фармакологической регуляции Ка+-К+-2СГ-котранспортера в скелетной мышце / Госманов А.Р., Хафизьянова Р.Х., Томасон Д.Б. // Казан. Мед. Журнал.- 2004.- Том 85(2).- С. 135-138.

18. Госманов А.Р. Адренергическая регуляция активности Na+-K+-2C1" котранспортера скелетных мышц крысы / Госманов А.Р., Хафизьянова Р.Х., Томасон Д.Б. // Тезисы 10 Рос.Нацио-нального Конгресса "Человек и Лекарство".- М, 2004.- С. 865.

19. Gosmanov A.R. Hyperglycemia disrupts both insulin signaling and neuromuscular communication in skeletal muscle of diabetic patients / Gosmanov A.R., Umpierrez G.E., Thomason D.B. // FASEB J.- 2004,- Vol.l8(4).- P. A364.

20. Gosmanov A.R. Impaired Expression and Insulin-Stimulated Phosphorylation of Akt-2 in Muscle of Obese Patients with Atypical Diabetes / Gosmanov A.R., Umpierrez G.E., Cuervo R., Karabell A.H., Thomason D.B. // Am. J. Physiol. (Endocrinol. Metab.).- 2004.- Vol.287.- P. E8-E15.

21. Госманов А.Р. Влияние различных концентраций инсулина на общий и

котранспортер-опосредрванный транспорт калия в скелетных мышцах крысы / Госманов А.Р., Хафизьянова Р.Х., Томасон Д.Б. // Науч. труды V Межд. научно-практ. конф. «Здоровье и образование в XXI веке».- Москва, 2004.-С.94.

22. Госманов А.Р. Исследование воздействия инсулина на Na+-K+-2C1' котранспортер-опосредрванный транспорт калия в скелетных мышцах крысы после длительных физических нагрузок / Госманов А.Р., Хафизьянова Р.Х.,

Томасон Д.Б. // Науч. труды V Межд. научно-практ. конф. «Здоровье и образование в XXI веке».- Москва, 2004.-С.95.

23. Госманов А.Р. Роль Ыа+-К+-2СГ -котранспортера в гомеостазе калия скелетных мышц крысы при воздействии фармакологических агентов, стимулирующих инсулиновый и адренергический рецепторы / Госманов А.Р., Хафизьянова Р.Х. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины.-2005-Том 180.-С.80-86.

24. Госманов А.Р. Фармакологическая модуляция работы Ка+-К+-2СГ котранспортера и содержания внутриклеточной воды в скелетных мышцах крысы в гиперосмолярной среде / Госманов А.Р., Хафизьянова Р.Х. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины, - 2005.-Том 180.-С.87-94.

Список сокращений, использованных в диссертации:

АЦ - аденилат циклаза ДМСО - диметилсульфоксид

ЕКК1.2 - киназа, регулируемая экстрацеллюлярными стимулами Ш81.2- Инсулин рецепторный субстрат 1,2

каналы- АТФ-зависимые калиевые каналы МАРК-миоген активируемая протеин киназа ЫКСС - Ма'МС^СГ-котранспортер ПКА - протеин киназа А Р13-К - фосфатидил инозитол 3-киназа СД - сахарный диабет Т2Б - тиозолиндеоны

Отпечатано в 000«Печатный двор». г. Казан ь,у л. Журналистов, 1/16, оф. 207 Тел.72-74-59,41- 76-41,41- 76-51. Лицензия ПД№7-0215от 01.11.01 ВыданаПоволжскиммежрегиональным территориальнымупраелениемМПТРРФ. Подписано впечать 15.04.2005г. Усл. п.п 2,0. Заказ№K-2727. Тираж 100экз. Формат60x841/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.

i' гт