Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Изучение клинико-морфологических и молекулярно-биологических аспектов карциномы Меркеля

На правах рукописи

Орлова Кристина Вячеславовна

ИЗУЧЕНИЕ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ КАРЦИНОМЫ МЕРКЕ ЛЯ

14.01.12 — онкология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 з МАЙ 2015

005568883

Москва - 2015

005568883

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» (директор - академик РАН, профессор Михаил Иванович Давыдов)

Научные руководители: Демидов Лев Вадимович

Официальные оппоненты:

Молочков Владимир Алексеевич

Соколов Дмитрий Викторович

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского, заведующий отделением дерматовенерологии и

дерматоонкологии

Доктор медицинских наук, Государственное автономное учреждение здравоохранения города Москвы «Московская городская онкологическая больница № 62 Департамента здравоохранения города Москвы», заведующий кабинетом фото динамической терапии и дерматоскопии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится на заседании

диссертационного совета (Д 001.017.01) ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» (115478, Москва, Каширское шоссе, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24 и на сайте www.ronc.ru

Автореферат разослан

Jj

2015г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Шишкин Ю.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

В настоящее время интерес к изучению карциномы Меркеля в мире возрастает по мере роста заболеваемости, а также появлении в 2008 году сведений о возможном вирусном канцерогенезе этой опухоли. Карцинома Меркеля по классификации ВОЗ - это редкая злокачественная первичная опухоль кожи с эпителиальной и нейроэндокринной дифференцировкой. Данные базы SEER (выживаемость, эпидемиология и конечные результаты, база данных Национального института рака) свидетельствуют о ежегодном увеличении количества зарегистрированных случаев карциномы Меркеля в США с 1986 (0,15 на 100000 населения) по 2006 г. (0,6 случаев на 100000 населения). Причины данного феномена до конца не ясны, авторы исследования связывают рост заболеваемости, прежде всего, с совершенствованием методов морфологической диагностики данного заболевания, но не исключают влияние таких факторов как изменение условий окружающей среды и воздействие ультрафиолетового облучения [Nghiem Р., 2008].

Для стран Европейского Союза также существуют эпидемиологические данные. Для Финляндии стандартизованный по возрасту показатель заболеваемости карциномой Меркеля на 100000 населения увеличился с 0.17 в 1993-1997гг. до 0.35 в 2003-2007гг. В то время как для России на сегодняшний день не существует эпидемиологических данных о карциноме Меркеля. Смертность от карциномы Меркеля по данным разных авторов варьирует от 33% до 46% , что делает эту проблему еще более актуальной.

У больных карциномой Меркеля наблюдается неблагоприятный прогноз течения заболевания. Часто это связано с поздней диагностикой и несвоевременной морфологической верификацией опухоли. До настоящего момента ни один, из представленных в информационных источниках, литературный обзор не включал в себя детальное изучение клинических, морфологических и молекулярно-биологических особенностей карциномы Меркеля. Встречаются лишь отдельные статьи/обзорные публикации, посвященные клиническим и морфоиммуногистохимическим особенностям, а также описания клинических случаев. В Российских изданиях встречаются лишь единичные публикации, посвященные карциноме Меркеля. Между тем, доля этих пациентов среди всех больных злокачественными новообразованиями в США и странах Европейского Союза стабильно увеличивается. В целом, проблема диагностики и лечения больных карциномой Меркеля недостаточно изучена. Отсутствуют общепризнанные критерии выбора варианта лекарственного лечения в зависимости от характеристик опухоли. Таким образом, можно сделать вывод о том, что заболеваемость карциномой Меркеля увеличивается, а научные данные о болезни недостаточны.

Представленная работа посвящена изучению карциномы Меркеля, направленному на поиск клинических, морфологических и молекулярно-биологических факторов прогноза заболевания, а также потенциальных предсказательных маркеров эффективности лекарственной терапии. Что позволит более персонализировано назначать лекарственное лечение и прогнозировать течение болезни.

Цель исследования

Выявление клинических, морфологических и молекулярно-биологических особенностей карциномы Меркеля, позволяющих прогнозировать течение болезни и предсказывать эффективность лекарственного лечения

Задачи исследования

1. Охарактеризовать клинические особенности течения карциномы Меркеля

2. Изучить морфоиммуногистохимические и молекулярно-биологические аспекты карциномы Меркеля

3. Оценить возможности цитологического метода исследования при морфологической диагностике карциномы Меркеля

4. Выявить факторы прогноза течения заболевания

5. Определить потенциальные предсказательные маркеры эффективности лекарственной терапии

6. Оценить выживаемость без прогрессирования и общую выживаемость больных карциномой Меркеля

Научная новизна исследования Впервые в России проведено клинико-морфологическое и молекулярно-биологическое исследование карциномы Меркеля на основании анализа 65 пациентов; а также иммуногистохимическое и молекулярно-генетическое определение полиомавируса клеток Меркеля (МСРуУ), впервые выявленного Н.Ревд и коллегами в 2008 году.

Впервые в мире проведено иммуногистохимическое исследование рецепторов соматостатина 2 и 5 типа среди 32 больных карциномой Меркеля.

Впервые в мире было показано, что среди пациентов с карциномой Меркеля есть группа больных имеющих экспрессию рецепторов соматостатина 2 типа (2+/3+). При проведении анализа зависимости медианы ВБП от экспрессии рецепторов соматостатина 2 типа выявлены статистически значимые различия между группами в пользу группы с экспрессией 2+/3+.

Впервые в России проведено иммуногистохимическое и молекулярно-генетическое определение полиомавируса клеток Меркеля. Распространенность МСРуУ, впервые

4

изученная среди популяции пациентов с карциномой Меркеля, составила: по данным молекулярно-генетического исследования - 76%, по данным иммуногистохимического исследования - 71%, что говорит о возможности использования данных методик для определении МСРуУ.

На основании детального клинико-морфологического и молекулярно-биологического исследования карциномы Меркеля, выявлены потенциальные предсказательные факторы (экспрессия рецепторов соматостатина 2 типа и мутации в гене Р13КСА) ответа опухоли на терапию (эффективность лекарственной терапии с учетом выявленных предсказательных факторов требует дальнейшего изучения) и факторы прогноза, произведена корреляция между полученными результатами и выживаемостью пациентов.

Научно-практическая значимость исследования

В процессе выполнения работы впервые в комплексе были оценены клинико-морфологические и молекулярно-биологические особенности карциномы Меркеля, что позволяет улучшить непосредственные результаты диагностики и лечения этой опухоли. Выявление факторов, обладающих прогностической значимостью в отношении выживаемости пациентов может изменить стратегию лечения этого заболевания и выделить группу больных неблагоприятного прогноза, которым необходимо проведение адъювантной терапии. Выявление потенциальных предсказательных маркеров эффективности лекарственной терапии позволит индивидуализировать лекарственное лечение.

Личный вклад автора

Определение цели и задач исследования; работа в архиве ФГБНУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина», а также проспективный набор пациентов в исследование. Планирование, сбор и подготовка гистологических препаратов, участие в подготовке образцов для молекулярно-генетического исследования (макро- и микродиссекция). Подготовка базы данных и анализ полученных результатов.

Результаты представленной исследовательской работы доложены на II Российской конференции по нейроэндокринным опухолям «Редкие нейроэндокринные опухоли. Трудные вопросы лечения нейроэндокринных опухолей» (12 ноября 2012 г., Москва, РФ), 26-м Европейском конгрессе патологов (30 августа - 3 сентября 2014 г., Лондон, Великобритания), Съезде онкологов и радиологов стран СНГ (16-18 сентября 2014 г., Казань, РТ), Евразийском форуме по меланоме и опухолям кожи (10-12 октября 2014, г. Суздаль, РФ).

Апробация диссертации

Материалы диссертации были доложены 17 декабря 2014 г. на совместной научной конференции отделения биотерапии опухолей, отделения амбулаторной химиотерапии, отдела общей онкологии, отделения химиотерапии и комбинированного лечения злокачественных опухолей, отделения химиотерапии, отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии, лаборатории онкогеномики и отдела химического канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина».

Внедрение результатов в клиническую практику

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность отделения биотерапии НИИ клинической онкологии ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина».

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста. Содержит список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение и выводы. Указатель литературы включает 131 источник, из которых 6 отечественных и 125 зарубежных источника. Работа дополнена 11 таблицами и проиллюстрирована 35 рисунками.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 «онкология», конкретно пункту 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая часть исследования проведена на базе отделения биотерапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина» и состоит из двух частей: - ретроспективный сбор данных и анализ пациентов (п=39): работа в архиве ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» с историями болезни пациентов, проходивших лечение в период с 1990 года по 2011 год по кодификатору рака кожи, отбор пациентов с диагнозом нейроэндокринный рак кожи/ карцинома Меркеля/ рак из клеток Меркеля; работа в архиве отделения патологической анатомии ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина», выявление морфологических заключений по кодификатору рака кожи в период с 1990 года по 2011 год, отбор пациентов с диагнозом нейроэндокринный рак кожи/ карцинома Меркеля/ рак из клеток Меркеля;

- проспективный набор и анализ пациентов (п=2б): обследование и лечение пациентов, обратившихся в поликлинику ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина», в период с 2012 года по 2014 год; работа совместно с отделением патологической анатомии ООД г. Пензы, заведующая отделением Пономарева Е. Е. (4 случая карциномы Меркеля). Таким образом, в данное исследование и анализ включено 65 пациентов с морфологически подтвержденным диагнозом «карцинома Меркеля».

Основные оцениваемые клинические параметры: пол, возраст на момент постановки диагноза, состояние иммуносупрессии, наличие второго злокачественного новообразования; характеристики первичной опухоли: локализация первичной опухоли, воздействие УФ, отсутствие/наличие болезненности, быстрый рост (увеличение в 2 и более раза в течение < 3 месяцев), размер первичной опухоли и распространенность опухолевого процесса на момент постановки диагноза.

Пациенты были прослежены для оценки показателей выживаемости:

1) выживаемости без прогрессирования (ВВП) - время от начала терапии до прогрессирования болезни или летального исхода по любой причины;

2) общей выживаемости (OB) - время от момента постановки диагноза до летального исхода по любой причине;

3) опухоль-специфической выживаемости (ОСВ) - время от момента постановки диагноза до летального исхода на фоне прогрессирования карциномы Меркеля. Показатель ОСВ был рассчитан ввиду того, что в анализ вошли пациенты

пожилого возраста (карцинома Меркеля более характерна для пациентов старше 65 лет), у которых при длительном сроке наблюдения летальный исход наступал не по причине прогрессирования карциномы Меркеля (а на фоне других сопутствующих заболеваний); а также в наш анализ вошли пациенты с другими ЗНО (у двух пациентов летальный исход наступил по причине прогрессирования другого ЗНО).

Морфологическое изучение материала проводилось в соответствии с Международной гистологической классификацией опухолей кожи ВОЗ в отделении патологической анатомии д.м.н. Делекторской В.В., к.м.н. Вишневской Я.В.; а также в лаборатории клинической цитологии д.м.н. Кондратьевой Т.Т., ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина». Для иммуногистохимического исследования (ИГХ) серийные парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм депарафинизнровали и регидратировали по стандартной схеме. Исследование проводили по стандартной методике с применением специфических антител к маркерам эпителиальной дифференцировки - цитокератину АЕ1/3, цитокератину 18, цитокератину 20, маркерам нейроэндокринной дифференцировки -хромогранину А, синаптофизину, CD56.

В качестве дополнительных иммуногнстохимическпх маркеров, для достижения поставленной цели исследования, в данной работе использовали:

1) для анализа экспрессии рецепторов соматостатина 2 и 5 типа были использованы моноклонапьные антитела к SSTR2A (клон UMB-1) и SSTR5 (клон UMB), фирма «Epitomics»;

2) для анализа экспрессии полиомавируса клеток Меркеля были использованы моноклональные антитела против MCPyV Large T-ag (клон СМ2В4), фирма «Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA»;

3) для анализа экспрессии р53 (в качестве суррогатного маркера мутации гена ТР53) в клетках карциномы Меркеля были использованы моноклональные антитела против белка р53 (клон D07), фирма «Dako»;

4) для изучения уровня пролиферативной активности, Ki-67, использовали антитела к антигену клеточной пролиферации Ki 67 (MIB-1), фирма «Dako». Молекулярно-генетическое исследование было разделено на две части и

проводилось на базе лабораторий:

- онкогеномики НИИ канцерогенеза под руководством д.б.н., проф. Мазуренко H.H. (исполнитель: н.с., к.б.н. Цыганова И.С.) - определение активирующих мутаций PI3KCA;

- отдела химического канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» под руководством д.м.н. Якубовской М.Г. (исполнители: с.н.с., к.б.н. Лесовая Е.А., с.н.с., к.б.н. Кирсанов К.И.) - определение наличия ДНК полиомавируса клеток Меркеля в опухоли по фрагменту 3 экзона большого Т-антигена (LT3), по фрагме1пу ДНК 1 экзона большого Т-антигена (LT1), по фрагменту ДНК вирусного капсида (VP1). В качестве положительного контроля использовали ДНК клеток мегакариобластного лейкоза линии MKL1, присутствие вирусной ДНК в геноме которой ранее было показано [Rodig et al, 2012].

Методы статистической обработки данных

Для статистической обработки все данные о пациентах и результатах морфологического и молекулярно-биологического методов исследования формализованы с помощью разработанного кодификатора и внесены в базу данных, созданную на основе электронных таблиц EXCEL. Для статистической обработки данных использовался пакет программ IBM SPSS версия 21.0 (Statistical Package for the Social Sciencessoftware program v. 21.0). Продемонстрированы демографические данные. Для описания исследуемой выборки применена итоговая статистика. Все непрерывные числовые данные проанализированы методами описательной статистики, включая медиану, среднее

арифметическое, среднее квадратичное отклонение и доверительные интервалы. Проводился корреляционный, регрессионный, факторный анализ данных. Выживаемость без прогрессирования, а также общая выживаемость в группах проанализирована по методу Каплана-Мейера и регрессии Кокса. Для сравнения кривых выживаемости в группах использован логарифмический ранговый критерий. Во всех случаях применяли 95% доверительный интервал и двусторонний Р. Различия считались достоверными при уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика пациентов

В исследование включено 65 пациентов с морфологически подтвержденным диагнозом карцинома Меркеля. Характеристика пациентов и клиническое течение болезни представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Общая характеристика пациентов

Показатель Абс. %

Пол

Мужчины 25 38.5

Женщины 40 61.5

Возраст, лет

Среднее 61.6 (±1.6)

Диапазон 29-98

Наличие второго ЗНО 15 23

Солидные опухоли 10 66.7

В-клеточные неоплазии 5 33.3

Локализация первичного очага

Голова и шея 12 18.5

Верхние конечности 15 23

Нижние конечности 23 35.4

Туловище 8 12.3

Без ВПО 7 10.8

AEIOU

Asymptomatic/lack of tenderness — отсутствии болезненности 44/58 76

Expanding rapidly - быстрый рост 42/57 74

Immunosuppression - состояние иммуносупрессии 14/51 21.5

Older than 50 years — пациенты старше 50 лет 55/65 85

Ultraviolet-exposed - воздействие УФ 50/65 77

Размер первичной опухоли

< 2см 13/49 26.5

> 2см 36/49 73.5

Наличие регионарных или отдаленных метастазов на

момент постановки диагноза

Метастазы в регионарные лимфатические узлы 20 31

Отдаленное метастазирование 7 10.8

Была произведена статистическая оценка общей выживаемости и опухоль-специфической выживаемости пациентов, вошедших в исследование. На момент проведения анализа 54% пациентов умерли (как от карциномы Меркеля, так и от других причин). Медиана ОВ составила 5.2 года (95% ДИ, 2.04 - 8.4) (рисунок 1). Медиана ОСВ составила 5.2 года (95% ДИ, 0.3 - 10) (рисунок 2).

а н а

ч >>

-

а

Время, годы

Рисунок 1. Оценка ОВ у пациентов с карциномой Меркеля.

ч г

Время, годы

Рисунок 2. Оценка ОСВ у пациентов с карциномой Меркеля.

Клинические факторы прогноза.

В качестве клинического фактора прогноза рассмотрен размер первичной опухоли на момент постановки диагноза. При распределении пациентов в зависимости от размера первичного очага (таблица 1) за основу был взят размер первичной опухоли, учитываемый в системе стадирования карциномы Меркеля. Так, первая стадия (1А и 1В) характеризуется наличием первичной опухоли менее или равное 2 см, что было взято за основу для первой группы. Для второй стадии (НА и НВ) характерно наличие первичного очага более 2 см (что и было взято за основу для второй группы), при НС - инвазия за пределы кожи (Т4). Таким образом, пациенты в нашем исследовании были распределены на две группы по размеру первичного очага для оценки влияния размера на прогноз заболевания. В первую группу вошло 13 пациентов (26.5%), 2 группу составило 36 пациентов (73.5%).

При проведении статистической обработки данных и оценки влияния размера первичного очага на выживаемость без прогрессирования и общую выживаемость пациенты с наличием отдаленных метастазов были выключены из анализа.

При оценке выживаемости без прогрессирования в зависимости от размера первичного очага были получены статистически значимые различия между первой и второй группами. Так, медиана ВБП для первой группы (п=13) составила 109 мес. (95% ДИ, 13 - 204), а для второй группы (п=36) всего 10 мес. (95% ДИ, (4.8 - 16), р=0.036 (рисунок 3).

1 группа - < 2см

2 группа - > 2см

Время, мес.

Рисунок 3. Выживаемость без прогрессирования в зависимости от размера первичного очага на момент постановки диагноза.

При оценке опухоль - специфической выживаемости в зависимости от размера первичного очага также были получены статистически значимые различия между первой и второй группами. Так, медиана ОСВ для первой группы не достигнута, при максимальном времени наблюдения 14.7 лет; для второй группы составила 3.69 года (95% ДИ, 1.27 - 6.11), р=0.04 (рисунок 4).

к

ч >>

1 группа - < 2см

2 группа - > 2см

Время, годы

Рисунок 4. ОСВ в зависимости от размера первичного очага на момент постановки диагноза.

Цитологическое исследование.

Анализ цитологического материала (п=21) ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» показал, что эта опухоль имеет характерную цитологическую картину. В первую очередь, при малом увеличении микроскопа, это очень клеточный плотный инфильтрат, преимущественно из округлых недифференцированных клеток (рисунок 5а); однако на отдельных участках могут встречаться структуры сходные с железистыми (рисунок 56). Как правило, даже при малом увеличении отмечается большое количество митозов (рисунок 5а). При большом увеличении микроскопа отличительными чертами опухолями являются отчетливо выраженные признаки злокачественности клеток; признаки нейроэндокринной дифференцировки (сходство с МРЛ), наличие характерных перинуклеарных глобул (рисунок 5в); большое количество митозов. Спектр морфологического разнообразия карциномы Меркеля варьирует от плотного клеточного инфильтрата до разрозненно лежащих клеток и плотных скоплений из разрушенных пикнотичных ядер. При типичной картине карцинома Меркеля цитоплазма отсутствует либо определяется в виде узкого ободка, однако встречаются варианты с

обильной цитоплазмой, где более отчетливо выявляется эпителиальная природа клеток (рисунок 5г). Как показал анализ материала, несмотря на низкую дифференцировку клеток, особенности их цитоморфологии в сочетании с клиническими данными позволяет высказаться о карциноме Меркеля при цитологическом исследовании (при пункции лимфатических узлов, мягких тканей, мазков-отпечатков с опухоли). Отмечая сложности морфологической диагностики карциномы Меркеля, следует подчеркнуть, что не стоит пренебрегать дополнительным использованием доступного цитологического исследования при верификации диагноза.

Рисунок 5. Особенности цитологической диагностики КМ: а - плотный клеточный инфильтрат, большое количество митозов (стрелочками указаны); б - железистая структура; в - перинуклеарные глобулы (стрелочками указаны); г - обильная цитоплазма.

Иммуногистохимическое исследование и факторы прогноза.

В качестве морфологических факторов прогноза произведено изучение уровня пролиферативной активности Кл-67; экспрессии рецепторов соматостатина 2 типа (55Т]?2), полиомавируса клеток Меркеля (МСРуУ) и р53.

Оценка индекса пролиферативной активности (Кл-67) была проведена у 43 пациентов. Уровень Ю-67 варьировал от 15% (1 случай) до 95%. При проведении статистической обработки данных был выявлен пороговый уровень 55%, который может иметь прогностическое значение. Пациенты были распределены на 2 группы в зависимости от уровня кь67: 1 группа - < 55%, 2 группа - > 55%. При статистическом анализе пациентов без наличия отдаленных метастазов и метастазов в регионарные лимфатические узлы на момент постановки диагноза (п=27) ОСВ различалась между пациентами первой (п=15) и второй группы (п=12). Медиана ОСВ для пациентов первой группы составила -11.4 года, для второй группы - 3.06 года, р=0.038 (рисунок 6).

1.0-

&

л а

о: га

ей О.Д-

X

Н

с >

I «-

о.о-

.00 2,00 4,00 £,00 8,00 10,00 12,00

Время, годы

Рисунок 6. Опухоль-специфическая выживаемость в зависимости от уровня Кл-67.

Влияния уровня Ю-67 на ОСВ среди всех пациентов (в анализ включены как пациенты с метастазами в регионарные лимфатические узлы, так и с отдаленными метастазами, п=43) продолжает сохраняться с потерей статистической значимости. Медиана ОСВ для первой группы (п=21) - 8.8 года (95% ДИ, 3.2 - 14.3), для второй группы (п=22) - 3. 7 года (95% ДИ, 2.2 - 5.1), р=0.056. При оценке влияния уровня К1-67 на ВБП статистически значимых различий между группами получено не было.

1 группа - < 55%

2 группа - > 55%

Впервые в мире была изучена экспрессия рецепторов соматостатина 2 (55ТК2) и 5 (Б5ТК5) у 32 пациентов с карциномой Меркеля (количество случаев обусловлено количеством пациентов, у которых был дополшггельный морфологический материал для исследования). При иммуногистохимическом анализе экспрессии рецепторов соматостатина в опухолях больных карциномой Меркеля специфическая иммунореактивность определялась на уровне клеточных мембран, демонстрируя различную интенсивность окрашивания и количество антиген-позитивных клеток (рисунок 7). Иммунореактивность к ББТЯ не была ограничена нейроэндокринными опухолевыми клетками, а наблюдалась также в лимфоидных элементах, зонах некроза, эндотелии сосудов (рисунок 7г). В других клетках и структурах стромы экспрессия маркера отсутствовала.

Оценку экспрессии 55ТЯ2 и 55ТЯ5 проводили по бальной системе. При дальнейшем анализе оценка реакции «1+» соответствовала низкому уровню иммунореактивности, «О» - отсутствию экспрессии. Оценка реакции «2+/3+» соответствовала умеренному и высокому уровню экспрессии рецепторов, коррелирующему по данным литературы с ответом опухоли на терапию аналогами соматостатина.

Пациенты, имевшие значение экспрессии 0/1+ составили первую группу - 14 (43.75%) пациентов (4+10, соответственно). Высокий уровень экспрессии 55ТЯ2 (2+/3+) был выявлен у 18 (56,25%) пациентов (8+10, соответственно) и эти пациенты составили вторую группу.

При оценке ВБП выявлены статистически значимые различия между группами (рисунок 8). Для первой группы (п=13) медиана составила 8.18 мес. (95% ДИ, 4.6 - 11.6), в то время как для второй группы (п=15)-33.4 мес. (95% ДИ, 25.5 -41.3), р = 0.004.

Рисунок 7. ИГХ выявление экспрессии рецепторов соматостатина в КМ. а. Высокий уровень экспрессии Б5ТК2 в виде полной мембранной реакции в большинстве клеток опухоли (3+) (х400). б. Клетки опухоли демонстрируют неполную мембранную экспрессии 58ТЯ2 умеренной интенсивности (2+) (х400). в. Низкий уровень мембранной экспрессии 85ТЯ2 в части клеток опухоли (1+) (х400). г. Экспрессии БвТЯЗ не выявляется в клетках опухоли (0), но видна в эндотелии сосудов (х200). Ядра клеток докрашены гематоксилином Майера,

I 2 группа - ББТКг 2+/3+

1

- ББТЯг 0/ 1+

—I-1-I-I—

до.ао 60,00 ео.фс юо.оо Время, мес.

Рисунок 8. ВВП в зависимости от экспрессии БЭТ!^ среди пациентов без отдаленных метастазов.

При выключении из анализа пациентов, которые на момент постановки диагноза имели метастазы в лимфатические узлы (в данный дополнительный анализ включены пациенты, имевшие только первичный очаг - 22 пациента, у которых была оценка экспрессии 58Т112) также получены различия в ВБП между первой (п=12) и второй (п=10) группами (рисунок 9). Так, медиана ВБП для первой группы составила - 6.2 мес. (95% ДИ, 2.7 - 9.7), для второй группы - 50 мес. (95% ДИ, 15.8 - 84.9), р=0.01.

При оценке ОСВ (пациенты без отдаленных и регионарных метастазов на момент постановки диагноза) статистически значимых различий между группами не выявлено. Однако, как видно на графике (рисунок 10) отмечается тенденция к лучшей ОСВ у пациентов из второй группы, однако количество пациентов в нашем анализе не позволяет сделать такой вывод. В то время как, в отношении ВБП отмечаются статистически значимые различия между группами в пользу второй группы.

н я

>, а

1 группа

.00 20,00

ч

>>

2

2 группа - 55Т(?2 2+/3+

1 группа -ЗЗТ(?2 0/ 1+

Время, мес.

Рисунок 9. ВБП в зависимости от экспрессии 88ТЛ2 у пациентов без отдаленных и регионарных метастазов на момент постановки диагноза.

ч

2 группа - ББТКг 2+/3+

1 группа - 5БТ[?2 0/ 1+

Время, годы

Рисунок 10. ОСВ в зависимости от экспрессии ББИИ.

Интересным также является тот факт, что рецепторы соматостатина 2 и 5 типа рассматривались в качестве потенциальных предсказательных маркеров эффективности лекарственного лечения аналогами соматостатина, а также проведения молекулярно-направленной диагностики распространенности опухолевого процесса. Однако наш анализ также выявил и продемонстрировал значимость экспрессии рецепторов соматостатина 2 типа в отношении выживаемости пациентов.

Экспрессия SSTR5 полностью отсутствовала в большинстве (28/32; 87.5%) исследованных наблюдений. Экспрессия маркера определялась только в 12.5% (4/32) первичных опухолей, демонстрируя при этом неравномерное, слабое мембранное окрашивание клеток и низкий уровень иммунореактивности (1+). Во всех исследованных метастатических фокусах экспрессия рецептора 5 подтипа была негативной (0). Следует отметить, что ко-экспрессия двух изученных рецепторных подтипов (SSTR2 и SSTR5) наблюдалась в четырех опухолях (12.5%), экспрессия только подтипа 5 не выявлялась ни в одном случае.

Результаты настоящего исследования показывают, что основным рецепторным подтипом, экспрессия которого наиболее часто наблюдается в карциноме Меркеля, является SSTR2, в то время как SSTR5 практически отсутствует в большинстве образцов опухоли.

Впервые в России было проведено иммуногистохимическое исследование экспрессии большого Т-антигена полиомавируса клеток Меркеля в опухоли с использованием антител СМ2В4 (Santa Cruz) (рисунок 11). Оценка экспрессии Т-антигена полиомавируса клеток Меркеля была произведена у 32 пациентов. При статистической обработке данных пациенты были также распределены на две группы в зависимости от уровня экспрессии. Первая группа (п=10, 31%) - соответствовала отсутствию/низкому уровню экспрессии, пациенты, имевшие значение экспрессии 0/1+; вторая группа (п=22, 69%) - соответствовала высокому уровню экспрессии и оценки реакции 2+/3+. При статистической обработке данных и оценке влияния экспрессии Т - антигена MCPyV на медиану ВВП отмечена тенденция к статистическим различиям между группами (пациенты без отдаленных метастазов на момент постановки диагноза, п=29) (рисунок 12). Так медиана ВВП для первой группы (п=8) составила 12 мес., для второй (п=21) - 29 мес., р=0.05.

При оценке влияния на ОСВ (пациенты без отдаленных и регионарных метастазов на момент постановки диагноза, п=22) (рисунок 13) наблюдается тенденция к различиям между первой (п=8) и второй (п=14) группами, в сторону более лучшей ОСВ у пациентов второй группы (р=0.06).

Рисунок IX. Экспрессия большого Т-антигена МСРуУ в клетках опухоли, а. Выраженная ядерная экспрессия высокой интенсивности (3+) в большинстве опухолевых клеток. х400 б. Гетерогенная ядерная экспрессия (2+) в части опухолевых клеток. х400 в. Ядерная экспрессия (1+) умеренной интенсивности в отдельных опухолевых клетках. х400 г. Отсутствие ядерной

экспрессии (0) в клетках опухоли. Ядра клеток докрашены гематоксилином Майера

й

г >1 И

2 группа - Т-А§ 2+/3+

1 группа - Т-А§ 0/ 1+

:■! 2СОЕ 40 0(1 50 00 8641 <00.ОС

Время, мес.

Рисунок 12. ВБП в зависимости от уровня экспрессии Т - антигена МСРуУ.

2 группа - Т-А§ 2+/3+

Аё 0/ 1+

6,00 8,00 10,00 12,00 Время, годы

Рисунок 13. ОСВ в зависимости от экспрессии Т - антигена МСРуУ.

Оценка экспрессии р53 была произведена у 32 пациентов (количество случаев обусловлено количеством пациентов, у которых был дополнительный морфологический материал для исследования). При статистической обработке данных пациенты были также распределены на две группы в зависимости от уровня экспрессии. Первая группа (п=19, 59,4%) - соответствовала отсутствию/низкому уровню экспрессии, пациенты, имевшие значение экспрессии 0/1+; вторая группа (п=13, 40,6%) - соответствовала высокому уровню экспрессии и оценки реакции «2+/3+».

При проведении статистической обработки данных (пациенты без отдаленных метастазов на момент постановки диагноза, п=29) и оценке влияния экспрессии р53 на медиану ВВП (рисунок 14) статистически значимых различия между группами получено не было, однако отмечена тенденция к различиям между первой (п=16) и второй (п=13) группами, в сторону первой группы (р=0.05). Так, медиана ВВП для первой группы не достигнута, для второй группы составила 12 мес. Что позволяет сделать вывод о том, что пациенты, не имеющие экспрессии р53, имеют лучшую ВВП; и экспрессия р53, определяемая при ИГХ исследовании, может служить прогностическим фактором. В дальнейшем при оценке влияния экспрессии р53 на ОСВ статистически значимых различий получено не было. При проведении корреляционного анализа выявлена корреляция между р53 и полиомавирусом клеток Меркеля (коэффициент корреляции Спирмена-0.500, р=0.018).

=

Р -

ч >1 г

1 группа -Т-

г 1

•а

н

и

о

« а

1 группа - р53 0/ 1+

л я к

я =

а

н г

ч

Рисунок 14. Влияние экспрессии р53 на медиану ВВП.

Таким образом, на основании проведенного анализа можно сделать вывод о том, что к морфоиммуногистохимическим факторам неблагоприятного прогноза следует отнести: уровень пролиферативной активности Кт-67 > 55%, отсутствие экспрессии БЗТГИ, наличие экспрессии р53.

Исследование мутаций в гене Р13КСА. В связи с отсутствием активации митоген-активируемого тирозинкиназой патологического пути (МАРК пути) в карциноме Меркеля было проведено изучение гена Р13КСА, как части пути Р13К/Ак1/тТ(Ж, значение которого было впервые показано в 2012 году для пациентов с карциномой Меркеля. У 31 пациента наличие дополнительного морфологического материала для исследования позволило провести изучение наличия мутаций Р13КСА в 9 и 20 экзонах. По данным литературы активирующие мутации Р13КСА встречаются при КМ в 10% случаев. В исследовании ЫагШ и коллег в 2012 году при изучении 60 образцов карциномы Меркеля было выявлено, что в 6 из 60 (10%) встречаются активирующие мутации Р13КСА. Также была выявлена мутация - Р13КСА (Я19К), ранее не известная для опухолей. Важно отметить, что присутствие Р1КЗСА активирующих мутаций было связано с чувствительностью к лечению 25ТК474 (ингибитор РБК) и МУР-ВЕг235 (двойной ингибитор Р13К/тТ(Ж). В нашем исследовании у 4 пациентов (13%) выявлены мутации Р13К: Е545К (1 пациент- рисунок 15), Е545А (2 пациента) и Е542К (1 пациент).

2 группа - р53 2+/3+

Время, мес.

Молекулярно-генетическое исследование.

Е545К

ш

А А Т С А С ТО А

в

1633(ОАО-»ААС), Е545К

Точечная замена нуклеотида О в положении 1633 на А (С1633А) на белковом уровне соответствует замене Е545К (01и545Ьуз).

Рисунок 15. Результат прямого секвенирования ПЦР-продукта с праймерами к 9 экзону гена Р13К.

Определение наличия ДНК полиомавируса клеток Меркеля в опухоли по фрагменту 3 экзона большого Т-антигена (ЬТЗ), по фрагменту ДНК 1 экзона большого Т-антигена (1ЛТ), по фрагменту ДНК вирусного капсида (\Ф1). Было проанализировано 25 образцов ДНК, выделенных из срезов тканей, залитых в парафиновые блоки. В 19 (76%) образцах из 25 было продемонстрировано наличие ДНК полиомавируса Меркеля, причем 18 образцов (72%) были положительны по фрагменту 3 экзона большого Т-антигена (ЬТЗ), 3 образца (12%) были положительны по фрагменту ДНК 1 экзона большого Т-антигена (1Т1), 12 образцов (48%) были положительны по фрагменту ДНК вирусного капсида (УР1). Необходимо отметить, что во всех образцах, положительных по УР1, было продемонстрировано наличие фрагмента ЬТЗ. В двух образцах иммуногистохимическое окрашивание на полиомавирус клеток Меркеля дало отрицательный результат, в то время как ПЦР-анализ показал наличие вирусной ДНК в ткани. Это можно объяснить низким уровнем трансляции вирусной РНК в данных образцах, что ведет к низкому содержанию белка.

На рисунке 16 представлены данные характеристического электрофореза ПЦР-продуктов из образцов, положительных по наличию вирусной ДНК (Дорожки 2-4: 2 -УР1+, ЬТЗЗ - УР+, 4 - УР1+, ЬТЗ+, 1ЛТ+, а также отрицательных по наличию вирусной

ДНК (Дорожки 5-7). В качестве положительного контроля использовали ДНК клеток мегакариобластного лейкоза линии MKL1, присутствие вирусной ДНК в геноме которой ранее было показано (Rodig et al, 2012). Положительный контроль - ДНК клеток мегакариобластного лейкоза линии MKL1 любезно предоставлен Paul Nghiem (University of Washington, Skin Oncology Clinical Program, Seattle Cancer Care Alliance, Сиэтл, Вашингтон).

Ж«—щ^щ Р1Р1|ЩЯ2Я1

VP1 LT1 LT3 1 VP1 LT1 LT3 2 VP1 LT1 LT3 3 VP1 LT1 LT3 4 ..............................щ VP1 LT1 LT3 5 VP1 LT1 LT3 6 VP1 LT1 LT3 7

Рисунок 16. Определение полиомавируса Меркеля в образцах ДНК, полученных от пациентов.

ВЫВОДЫ:

1. Клиническим фактором неблагоприятного прогноза является размер первичной опухоли более 2 см на момент постановки диагноза. Медиана ВБП при размере < 2 см - 109 мес. (95% ДИ, 13 - 204), в то время как при размере > 2см - 10 мес. (95% ДИ, (4.8 - 16) (р=0.037); медиана ОСВ - не достигнута, при максимальном времени наблюдения 14.7 лет и 3.69 года, соответственно (95% ДИ, 1.27 - 6.11) (р=0.04).

2. Морфологическим фактором неблагоприятного прогноза является уровень Ki-67, при пороговом показателе ИГХ исследования > 55%.

3. Морфологическим фактором благоприятного прогноза является наличие экспрессии SSTR2, определяемой при ИГХ исследовании в опухоли: медиана ВБП для первой группы (низкая/отсутствие экспрессии) составила 8.18 мес. (95% ДИ, 4.6 - 11.6), в то время как для второй группы (умеренная/высокая экспрессия) -33.4 мес. (95% ДИ, 25.5-41.3), р = 0.004.

4. Впервые в мире показано принципиальное наличие ИГХ экспрессии SSTR2 при КМ. Показатель экспрессии 3+/2+наблюдался в 56%, что можно рассматривать в качестве маркера эффективности возможной лекарственной терапии аналогами соматостатина.

5. В виду отсутствия активации МАРК пути при КМ было проведено изучение гена PI3KCA, как части пути PI3K/Akt/mTOR, значение которого было впервые показано в 2012 году; и выявлено наличие активирующих мутаций в 9 экзоне гена PI3K.CA у 13% пациентов.

6. Распространенность MCPyV, впервые изученная среди популяции пациентов с КМ в РФ, составила: по данным ПЦР - 76%, по данным ИГХ - 71%, что говорит о возможности использования, как ИГХ, так и ПЦР при определении MCPyV.

7. Определение при ИГХ исследовании Т-антигена MCPyV и р53 имеет прогностическое значение, MCPyV-позитивные и р53-негативные пациенты имеют тенденцию к лучшей выживаемости (ВБП и ОСВ).

Список работ, опубликованных по теме диссертации, в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Орлова, К. В. Карцинома Меркеля. / К. В. Орлова, А. А. Маркович, Н. Ф. Орел, Л. В. Демидов. // Современная онкология. - 2011. - №3. - С. 41-45.

2. Орлова, К. В. Распространенность полиомавируса клеток Меркеля и его клиническое значение у пациентов с карциномой Меркеля / К. В. Орлова, В. В. Делекторская, М.Г. Якубовская, Я.В. Вишневская, Т.Т. Кондратьева, Н.Ф. Орел, Л. В. Демидов. // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. - 2014 - № 3-4. -С. 58-62

Другие работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Орлова, К. В. Рак из клеток Меркеля: клинико-морфологические аспекты. / К. В. Орлова, Т. Т. Кондратьева, С. Субраманиан. // Евразийский форум по меланоме и опухолям кожи.-2011. -С.35.

2. Орлова, К. В. Карцинома Меркеля. / К. В. Орлова, Н. Ф. Орел, А. А. Маркович, С. Субраманиан, В. Ю. Сельчук, Л. В. Демидов. // Русский медицинский журнал. -2012. -№2(2). -С. 26-27.

3. Орлова, К. В. Карцинома Меркеля. / К. В. Орлова, Н. Ф. Орел, А. А. Маркович, С. Субраманиан, В. Ю. Сельчук, Л. В. Демидов. // II Российская конференция по НЭО. Материалы конференции. - 2012. - С. 30 -34.

4. Орлова, К. В. Нейроэндокринные опухоли головы и шеи. / А.А. Маркович, К.В. Орлова, Н.Ф. Орел, С.О.Подвязников // Опухоли головы и шеи. - 2011. - №3. -С. 32-36.

5. Orlova, К. Role of somatostatin analogues in the treatment of Merkel cell carcinoma: a case report. / К. V. Orlova, A. A. Markovich, N. F. Orel, L. V. Demidov. // Neuroendocrinology 2012; 96 (suppl l):l-72, (abstr. B29).

6. Orlova, K. Prospective pilot study of Merkel cell carcinoma. / К. V. Orlova, A. A. Markovich, V. Y. Selchuk, L. V. Demidov, N. F. Orel, S. Subramanian. // J Clin Oncol 30,2012 (suppl; abstr el9005).

7. Orlova, K. Immunohistochemical expression of somatostatin receptor subtypes 2 and 5 in Merkel cell carcinoma: Preliminary data. / V. V. Delektorskaya, К. V. Orlova, L. V. Demidov. // Virchows Archiv, 2014 T. 465, № 2. стр. 25.

Подписано в печать 10.02.14. Формат 60x84/16. Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 экз. Заказ № 124. Отпечатано на участке множительной техники ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24