Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение иммунорегуляторных медиаторов с помощью методов иммунной биотехнологии

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

КОВАЛЬЧУК АЛЕКСАНДР ЛЕОНИДОВИЧ

Изучение иммунорегуляторных медиаторов с помощью методов иммунной биотехнологии

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1990

Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава ССОР

Научный руководитель: кандидат медицинских наук Сидорович И. Г, . Научный консультант: Академик АН и АМН СССР Р. В. Петров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Суке Б. Б. доктор медицинских наук, профессор Ярилин А. А.

Ведущая организация - НИИ вакцин и сывороток им. И. И, Мечникова.

Защита диссертации состоится "¿1. "199/ г. в Л;.^часов на заседании специализированного совета Л 074.09.01. Института иммунологии Минздрава СССР по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии №3 СССР.

Автореферат разослан "Ж " ^^-¡АА. 199^ г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

А. Е Колобов

< ОБЩАЯ М}'АКТтЖ1ЖА РАБОТЫ

-------Актуальность проблемы.

Внутрисистемный- контроль за функционированием различных попу ляций лимфоцитов и клеток моноцитарно-макрофагального ряда ocj -ществляют регуляторные клетки иммунной системы либо непосредствен ■ но, в результате контакта с клетками-мишенями, либо с пометыi гуморальных, медиаторов. Часть регулятерных клеток входит в состпи различных компартментов, на территории которых идет пролиферация и созревание предшественников иммуноцитов, разворачиваются иммунлыо реакции, происходит распознавание и переработка антигена. А другая кх часть мигрирует в организме в составе периферической крови.

В настоящее время доказана и интенсивно изучается регулятор-аая.функция костного мозга, приоритет в исследовании которой принадлежит отечественным исследователям, Петров Р.Б. и Михайлова 4.А. (1969-1989) показали, что клетки костного мозга, принадлотита к моноцитарно-макрофагальному ряду, продуцируют • регулягоршк» тептиды, стимулирующие аитителопродукцию.' На -основе этих пептидов зоздан лекарственный препарат - миелопид, широко применяемый в клинике. Помимо стимуляторного, костный мозг оказывает ингибирум-lee влияние на иммунные реакции к различным антигенам (Патрон '.В. , Хаитов P.M. 1973 -1974, Duwe А.К., Singiial S.K., 1975).

Работы последних лет убедительно свидетельствуют, что осу пес-влете костным мозгом регуляторной функции зависит от Физиологи еского состояния организма (Новиков В.И., Сидорович И.Г., 1990), ак, у животных, иммунизированных различными антигенамй, ня0л*иа-гся антигензависимая утрата стимуляторной активности . и усиленно 1шрессорных свойств костного мозга. .Однако, непосредственно я ром органе вводимый антиген не. обнаруживается. Первой преградой з пути антигена является регионарные лимфатические узли и окя жже вовлечены в процесс регуляции иммунного ответа. Показано. 'О клетки этих органов, выделенные из организма через 4-6 часоп >сле иммунизации, продуцируют медиаторы, названные ФИЛУ (фоктс[.\; мунных лимфатических узлов) < Эти факторы циркулируют с тояг.м ови и жмфы и вызывают вышеупомянутые изменения в костаом мозз araskevas P. et. ai, 19S5-18S8, Новиков В.И. и соав-д B7-I990). Одновемэнно, в тех же условиях обнаруживаются зптклш эцифическиэ продуценты фактора подавления миграции ткрофагг,.!, горне обеспечивают локализацию клеток ¿иммуной скездю я месл зтакта с антигеном (Суслов А.П. и соавт., ISS-3) „

Исследование факторов, регулирущяг к

!••.. il .•>«.•• ^иющглрно-фагоцйтлрураей свстеш, осложняется гете; ,nu.)c-iiio исходных нопуляций клеток-продуцентов и ыулымфункцио-,:::,.L!i )Jj LW оаилх медлаторов. Для преодоления этих трудностей наи-

¡idpctioKïUbiiiiWii представляются метода мммушюй биотехнологии s; 'чшлаиерпой иммунологии". Подхода молекулярной биологии, генной ¡ih:.r.iïi)piiH( гибридомной техники позволяют нарабатывать гомогенные иролирьти яглгаунологачвски шгачимых веществ, в там число - ыэдаато-митоза системы и ыоноклоналышх аитигол к шш.

"Глсишртлш" популяции клаток являются наиболее удабшм ио-ïchjukcm для получения цитокшюв ь количествах, достаточшх для их очлс-.ткн ц молекулярного клонирования. В настоящее время с успехом ^ополшумсн клеточные клош, линии опухолевых клеток и функцио-hCiiibiiui,, в том числе 'Г-Т-клеточные, гибридоми, продуцирующие жела-сш!! фн:стор спонтанно или посла стимуляции каким-либо агентом (антигеном, митогеном). Анализ рецепторного. аштрата и поверхностных biipiwpaB, хромосомного набора и функциональных свойств таких кле-4vk позволит подробнеэ изучить механизмы функционирования рогуля-'Mpuiis клотсж in ui tu. Необходимым этапом исследования медиаторов iiHJi.-iorcfl получение к ним моноклонэлишх антител, что поиволяет определять их активность в биологических ишдкостях и тканях организм:) при различных состояниях.

1ШШ Е.4ШШ _ разработать имыуиобиотехнологические способы получения и исследования факторов, регулирующих взаимодействие лимфоцитов и клаток моноцитарио-фагощшфувдей системы.

йМШ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Дня выполнения'" намеченной цели били поставлены следующие ¿ьедча:

1. Исследовать мадиаторную активность культивируемых клеток лимфатических узлов мыш в ранние сроки развития иммунного ответа и изучить влияние продуцируемых медиаторов на мононуклеарные фагоцитирующие клетки.

2. Отобрать клони .шиш опухолевых клеток человека СЕМ, продуцирующие .фактор, подавляющий миграцию макрофагов;

а. Подобрать оптимальные условия для получения Т-Т-клеточных гибридом человека, продуцирующих лимфокины с действием, направленным на регуляцию активности моноцитаршх фагоцитов; ■t. На основе клеток ивтактного костного мозга получить шшиную ги-оридому, продуцирующую иммунорегуляторн.'.'й :прессоршй фактор;

¡3. Получить мшгатую гибридому, продунпрустую МРП'ЖЛОППЛ!.'"1^ тело к иммуностимуляторам мпелопептидэм;

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТ». -В результате селекции на среде с 8-пзагузвгаом полутопа м,утг\т;г"; линия клеток человека СЕМ-АеН и ее субклол, нро,пуциру)яет.а регулирующий функции мононуклеаршх фагоцптсп; -На основе одного из субклонов данной линии - СШгА£Л--К12 1ю.пуч»".ч клонн Т-Т-гибридомы человека с аналогичной специфичность»; -Исследована природа и функциональные свойства фактора шчунп:' лимфатических узлов мыши, полученного в ранние сроки после й!т*у1!"; защш, но являющегося Ш-1, ИЛ-2, интерферопом-гямма, и еиявлоч.? зго стимулирующее влияние на клетки монопуклеорнсй Фагоцитируг^' зистемн;

-Впервне получен клон гибридомннх клеток икни, свкретарущих з'тор, по ряду физико-химических и биологических свойств сходный с зупрессорным фактором костного мозга;

-Впервне получен клон гибридошшх" клеток мыши, яродунлрукячх м1' • юклональшо антитела, отменяющие биологическую активность, ирспя-)ата "миелопид".

основные положения выносимые на змцггу-. Культивируемые клетки иммунных лимфатических узлов тз ранлиг. ;роки после .иммунизации продуцируют' антигенспецифическпЯ 'Хт: 'ор(ы), регулирующий активность фагоцитов. ■

. Получен субклон опухолевой линии клеток человека СИ* и челок,о-еческие Т-Т-гибридомы, продуцирующие фактор(и) регулиру?я?1П /?дс • ивность мононуклеарных фагоцитов.

. Гибридома на основе клеток штшгаюго мозга мши и мпелота 3.Хбз.А^8.653 продуцирует термоствбильннй фактор с молекулярной ассой 7-8 кД, подавляющий пролиферацию опухолсвих клеток (часто-итомы Р815 и родительской миеломн).

. Получены мышиные моноклональнне антитела, отменяющие счглул'- ■ ущев действие миелопэптидов на антнтелолродукцию.

ШШ0=Ш1^Штлп ШШОСТЬ ЩОТЦ-

Резистентные к 8-озагуанину суйклош опухолевой уг

зка СЕМ могут быть использованы в качестве источника рпстгорпчх зкторов, регулирующих активность молонуя.таарш£с фопздпгирумт четок, а также для получения Г-Т-гибридом человека. Рго-рт«« с -зщью гибридомной техники получеии ропгеита (шюклси\'> п>- :-г

: ic киелопелтидам, супрессорный фактор), которые могут быть ис-!• !;!Г'Зоваш в практике научных исследований для изучения регулятор-функции костного мозга. Растворимые факторы, продуцируемые •■Л'"хк8ми иммунных лимфатических узлов, после их очистки и олреде--т'чгил стандартных характеристик (аллергенвость, токсичность и т.п.), по-видимому, можно добавлять к вакцинным препаратам, так ьак они обладают выраженным иммуноадъюЕантным действием. Результата данной роботы могут служить методической основой для создания и ™рактеристики клеточных линий как животных, так и человека, и Функциональных гибридом, продуцирующих медиаторы иммунной системы.

• . АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ И ПУБЛИКАЦИИ.

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической иммунология", Москва, 1989. Работа прошла апробацию на заседании секции N¡3 ученого'совета Института иммунологии Минздрава СССР, состоявшемся 27 июля 1989 года и рекомендована к защите. По материалам диссертации опубликовано .6 печатных работ. , .'

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. ' Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав: "Обзор литературы", "Материалы и -ме-. тода", "Результаты собственных исследований", "Обсуждение результатов" и выводов. Прилагаемый список литературы включает ' ссылок, из них на отечественных авторов. Диссертация содерзит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

материалы и методы исследования.

В экспериментах использовали мышей (CBA*C5?BL/6)P1, а также.' инбреданх линий dba/2, сзн/не, balb/c обоего пола, массой 18-22 г, ' полученных из- питомника АМН СССР "Столбовая".

Применены следувдие линии клеток человека — острого Т-лим£о- . лейкоза СЕМ, миэлолейкоза НХ60, эритромиелолейкоза К-Б62 и мыши -миеломы P3.X63.AgS.653 (Хбз), мастоцитомы Р81Б, интерлейкин-2 зависимых цитотоксическях Т-лимфоцитов - СТЫ.-2.

Для тестирования поверхностных антигенов лимфоцитов человека использовали моноклональные .антитела ОКТЗ, 0КТ4, 0КТ8, 0КВ7, OKla производства фирмы "Ortho Diagnostic Systems", США. Определение •антигенов глввного комплекса гястосовместимос. человека класса I

¡роводили с помощью типирукшх ангисыворотсх производства ¿aj ; ¡ 'Behring*, "Bio tent", "Ре1Ггеег".

Для создания Т-Т-гибридои человека в качество onyxojui-.ci о артнарп использовали клетки линии Cï?i-AgR-El 2, дефектные по Тренту гипоксантин-гуагатфосфорибозилтрансферазе, полученные no оду Gellagher G. et al. (1986). Моноиуклеарныэ клетки иерн^р-.з еской крови здоровых доноров, выделенные в одностугсшчаг,;;*. радиенте плотности фиколл-верографкна, активировали кошсанану^.п: ж А. при конечной концентрации I ккг/мл (Sigrr¡a, США). Сдцшпм ь.ч-элняля методом Irigoyen et al. (1981) с модификациями.

В качестве нормальных партнеров для гибридязащгл с клотка.-.-^ ¡еломы мыши хбз использовали: вЖлегка интактного костного мозго, ¡деленные из бедренных костей мшдей линии BALB/c; б)спленощгл; шей линии ВАТЛВ/с, трехкратно с интервалом в 2 недели иммуннзиро-1нных препаратом "миелопид", полученным из лаборатории профессора кайловой A.A.. Слияние клеток проводили по общепринятой штодпяо :«hler G., Milstein е., 1975). Гибридомц 2-3 раза клонировали, ражировали и криоконсервировали. /

Для получения фактора кмиушшх лимфатических узлов шпии 1>1 ¡¡ душечки всех конечностей еводнли клетки P8I5, поддераглваемло на ш ВБА/2, либо Хбз, поддерживаемые в культуре in vitro, п коти-рации 20 млн/мл по 0,1мл/конечность. Через 6 часов после кшущ-ции выделяли клетки паховых, подмышечных и подколенных лиг.Ги-чвских узлов, готовили суспензию с концентрацией 0 млн кл/мл и пьтивировали в бессывороточной среде Исков (Flow, Великобратг. -ï) в течение 18-20 часов при 37°С. Затем центрифугировали 15 шл i 200g, отбирали супернатант,- замораживали и'хранили при -20°С.

Влияние ФИЛУ на пролиферацию клеток лимфатических узлов сце-тли в модели in vivo. Мышам F1 в подушечку■ одной из задних ко шостей вводили 0,1 мл супернатанта культуры сингештх клогон ¡фатичоских узлов, полученных после иммунизации животных клехкй-' P8I5 (ФИЛУР815). В контрлатеральную конечность вводили коптро-ую среду. В различные сроки выделяли лимфатичеcraie узлы к ¡/ ных количествах клеток по включению 3И-тимидина оценивали с::л-ДНК. Вычисляли коэффициент стимуляции пролиферации ш фор-'у.'Н; = cpm оп./ ерш к.. Одновременно подсчитывали абсолютное чяого ток в каждом лимфатическом узле и определяли коэффициент стл:'у ки прироста клеток. ,,

Не специфическую тэдуностимулируюдую §ктизность С>11ЛУ с.се!ж а..■:;',

- б -

аа'шяйХ 1'1. йа 6 суток, до заражения Salmoneliae typhi Ту2 N4446 ь:;Утр'ибрхашшо вводили супернатант, содержащий ФИЛУ, либо фракцию с молекулярной массой 110 - 120 KD. Выживаемость животных в контрольной и опытной группах оценивали через 3 дня. Коэффициент про-uактивной активности рассчитывали по формуле: Kx=ldso ou./ldso к. Показатель LDso вычисляли по Körber (1962).

Б качестве супрессорного фактора использовали 2-3-х суточный cyjiüpnüTaiiT клеток ингактного костного мозга, выделенного из бедра иных костей мышей линии BALB/c.

Активность медиаторов, влияющих на миграцию макрофагов, оценивали в микрокапиллярном тесте (Суслов А.П., Черноусов А.Д., 1979) и в скршпшговом тесте миграции клеток из микрокультуры (Суслов А. II. и'др., 1989). Индекс подавления миграции рассчитывали по формуле MIIM=[I-(dson./dsK. )]*10СВ6. Воздействие медиаторов на функциональную активность макрофагов мышей изучали методом люминол зависимой хемилюминисцонции (Земсков В.М., Барсуков A.A., I98B), с помощью ферментной тест-системы (Дроженншсов В.А.,1988), по фагоцитозу латоксннх частиц (Ганковская Д.В. и др.;1986). Пролифе-ративуы активность клеток-мишеней оценивали по включению аН-тими-дина, а прямое цитотоксическое действие гуморальных факторов и активность пбритонеалышх киллеров - по лизису клеток-мишеней P8I5 меченых 51 Gr (Berke c.D. ct.al., 1975). Индекс пролиферации вычисляли по формуле ИП=(срш оп./ срп к.) * 10036, а индекс супрессии -ИС-100% - ИП. Значение отражающее увеличение числа киллерных

клоток в бршнов полости у одного животного определяли по методу Ляхова'В.В. и соавт.(1988).

Наличие в супернатантах клеточных культур активностей ииторлейгаша I (VDI-1), интерлейнина 2 (ИЛ-2), интерферона-гамма оценивали общепринятыми способами* (Smith К.к., Ruscetti F.W. 1901, Droge W. et. al., 1984-, Seki H. et al., 1986)..

Статистическая обработка экспериментальных дашшх проводилась общепринятым методом с использованием t-критерия Стьюдента. Для исследуемых величин определяли среднее квадратичное отклонение, ошибку репрезентативности, границы доверительного интервала а уровень значимости. Результаты считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И Ш ОБСУЖДЕНИЕ■ ' •

I. Фактор (и) шшушшх лимфатических узлов,

Культивируемые in vitro в течение 1В-20 "¿сов клетки лимфатических узлов, выдолошшх от мышей в ранние сроги после иммунизации

(через 6-18 часов), продуцируют фактор(н), назвашше ФИЛУ (фате/;.':' иммунных лимфатических узлов) (Новиков В.И. и сгэаг-т., 1087). От:>т фактор(ы) обладает полифункционалышм действием, антигенспецчтфн--чески влияя на продукцию медиаторов клетками костного мозга, существенно стимулируя клеточгше и гуморальные иммунша реакции независимо от природа антигена, использованного для получения фактора (Новиков В.И. и соавт., I987-I990). В данной работе проводо;: » дальнейшее исследование природы-и функциональных свойств ФИЛУ л, прежде всего, его влияния на дифференцировку и функциональные свойства (подвижность, фагоцитоз, активность ферментов) мононукло-арннх фагоцитов, являющихся; .по-видимому, основной точкой прилолэ-ния действия данного фактора.

■ Изучали влияние ФИЛУ, полученных при югмунязации различишь/ -антигенами, на миграцгоо перитонеальных макрофагов мыши. Индекс подавления .миграции (ИПМ) составил 28-52% в зависимости от разведения' препарата (см. рис.1).

Через- 24 часа после обработки ФИЛУ суспензия прилипагохх клеток перитонеального эксудата мыши происходило более, чем в 1,3 раза по сравнению с контролем, увеличение активности одного кз мяк-рофагальных ферментов - кислой фосфомоноэстеразы. Кромэ того, происходило ■ усиление люминолзависимой хемилюминисценции макрофагов *дши. При этом кислородный метаболизм клеток увеличивался на 84-[402 в зависимости от разведения супернатанта.

.Исследовали действие ФИЛУ на дифференцировку клеток-предаэст-зеииков. На 7 сутки совместной инкубации фактора с линией KL-6C габлюдали изменение морфологических свойств клеток, окрашенных по 'омановскому-Гимзе, характерное для индукции дяфференциревки по юноцитарному пути.

i ?

Таким образом, ФИЛУ способен ке только угнетать миграцию kj¿ -

} ^¡¡оцптартю-макрофагальной системы, усиливая при этом их функ-r-.-jî^'ii.ny» активность (кислородный метаболизм и ферментативная ак-■. '^'.'кль), но к направлять дифферонцяровку клеток-предооственникоь ; г г.кптарному пути развития.

Одним из наиболее распространенных аффектов различных медиато-:■:•') иммунной системы является их митогегаюе действие на клетку л:"г5огдпого ряда. Поэтому мы исследовали влияние ФИЛУ на пролифе-гзцкм иммунокомпотентнцх клеток. Результаты опытов представлены не рис.2. Видно, что максимальное значение коэффициента стимуляции пролиферации отмечалось на 6 сутки (6,02). При этом наибольший прирост'числа клеток в опытном лимфатическом узле определялся на ? сутки.

Исходя из аптигенспецифического' действия ФИЛУ на клетки костного мозга (Новиков В.И. и др., 1987), представляло интерес исследование непосредственного влияние ФИЛУ на пролиферацию опухолевых глоток, использованных для иммунизации. Оупернатанты, содержащие СИЛУ, полученные к различным антигенам добавляли к клеткам F-8I5 или Хбз. На рис.3 представлены основные данные этих экспериментов. Все <СИЛУ, в том числе и контрольный,супернатант клеток интактннх лимфатических узлов, обладали способностью ингибировать пролиферацию ыастоцитоми P8I5. Исключение составлял лишь Ф11ЯУра15 (рис.3.1, кривая 1 ). СИЛУхбз аналогичным обр'азом влиял на пролиферацию мио-ломы Х63 (рис.3.2, кривая 2). G учетом сходства гзплотипов Н-2 обоих опухолей, представленные данные свидетельствуют об антиген-специфическом (опухолеспепифическом) действии ФИЛУ-.

Проводились исслодования природы ФИЛУ" и его «частичная очистка. При фракционировании на колоше с сефадексом С200, препарат элюировался высокомолекулярным и пизкомолвкулярпнм пиками в области молекулярных масс соответственно 110 120 и 10-П кД.

Биологическую активность исходного суперпагапта и различи«.*, фракций оценивали на модели усиления пролиферации клеток нодколен-них лимфатических узлов (в момент максимальной активности на 6-е сутки). Поскольку ФИЛУ способен повитать гаштерную активность ие-ритонеалышх лимфоцитов (Ляхов В.В. и соавт., 1938), соответствующая модель также использовалось для тестирования ого биологического действия. На рис.4 представлены результат данной серии экспериментов. Митогенная и киллер-етимулирупцпя активности идентифицировались только во фракции с молекулярной массой 110-120 кД.

Специфическую сорбцию препаратов ФИЛУ проводили с помощью ан-тиснворотки кролика против- общей фракции иммуноглобулинов мши и моноклональшх антител к антигену i-Ak, проецируемых мнаиной гиб-ридомой, поддерживаемой в Институте иммунологии КЗ СССР. Результаты этой серии опытов представлены на рис.5. После сорбции суперна-тант не оказывал стимулирующего действия на пролиферацию клеток подколенных лимфатических узлов (рис.5,а) и но стимулировал кил-лернуго активность перигонеалышх лимфоцитов (рис.5,6).

Проводили сравнительный анал!!з биологического действия ФИЛУ н некоторых цитокинов (ИЛ-I, ИЛ-2, интерферона-гамма). Активности этих медиаторов в препаратах ФИЛУ не обнаруживались.

Таким образом, на основании ранее.установленной антиген-специфической природа факторов иммунных лимфатических узлов и данных представленных в настоящем разделе, можно заключить, что в состав ФИЛУ входят, по крайней мере, три компонента: детерминанты антигенов класса II главного комплекса гистосовместимости, детерминант« иммуноглобулина и, по-видимому, детерминанта антигена. То есть охарактеризованный нами медиатор идентичен комплексу, выявлонког.-у

в сыворотке мышей в ранние сроют после иммунизации другими овтсра-

11

ми (Faraskevas Г., Ьее S.-T., 1985-1968). Эксперименты, проводок-

дне в культуре in vitro,, показали, что формирование активных комплексов происходит при кооперации Т-лимфоцитов и макрофагов в присутствии аутологичной сыворотки крови. Можно предположить, что регионарные лимфатические узлы, в которые попадает до 99$ введенного антигена, и являются теш органами, в которых происходит продукция обнаруживаемых в сыворотке комплексов.

Из приведенных выше данных следует, что ФИЛУ обладал неспеци-фшшсккл активирующим действием на клетки моноцитарно-макрофагаль-ной системы. К'.ошю предположить, что при некоторых бактериальных инфекциях, Еажная роль в резистентности к которым принадлежит фа-гоцитсм,' профилактическое введение данного фактора будет оказывать защитный аффект. Исследования проводили на -модели антропонозной инфокщщ - брюшного тифа, вызываемого Salmonellae typhi Ту2 N4446.

В таблице I представлены результаты по определению действия оупориатантов, содержащих ФИЛУ, на выживаемость мышей, зараженных сальмонеллами. Как й в случае использования неразделенного супер-цатанта, так и фракции с молекулярной массой II0-I20 кв, на третьи

сутки после инъекции сальмонелл в опытной группе мышей выживала в

»

Таблица I. Влияние ФИЛУ на выживаемость мышей, зараженных В. typhi Ту2 IJ4446.

Решил введе- Доза Число" Выжи- LDso К*

ния препарата бактерий животных ваемость (МЛН МК)

(млн мк) в группе (Я) й

500 10 0

Однократно 166 10 0 85,9 1,66

55 10 80

500 9 0

Двухкратно 166 10 20 85,9 1,66

55 10 60

500 а 0

Контроль . IG& 10 0 57,1 -

55 9 30

1,66 раз больше, чем в контроле.

2. Конструирование человеческих Т-Т-клеточных гибридом -продуцентов факторов, регулирующих активность мопонуклеарных фагоцитов.

Исследование нами супернатантов лимфатических узлов, гиде -ленных в ранние сроки после иммунизации, показало присутствие в них активности, стимулирующей клетки мопонуклеарной фагоциптрупцеД системы. Из литературных источников известно, что в лимфатичоапи узлах клетками-продуцентами фактора, обладающего подобной активностью, являются активированные Т-МИФ продуценты хелперной природы, мигрирующие затем с током крови в селезенку (Суслов А.П. и др., 1988). Другие авторы получают факторы стимулирущие фагоциты при культивировании активированных клеток мононуклеарной фракции периферической крови кивотных (Ганковская Л.В. и Др., 1986). Кроме того, в ряде зарубежных работ описано получение человеческих т-Т-гибридом, продуцирующих фактор подавления миграции макрофагов (МИФ) и фактор активации макрофагов (МАФ) (Mayer L., 1987). Поэтому представляет несомненный интерес использование подходов габри-домной технологии для получение факторов, регулирующих активность мононуклеарных фагоцитов.

Полученная нами линия, обозначенная CEM-AgR и предназначенная для создания Т-Т-гибридом, была резистентна к 20 мкг/мл 8-аза-гуанина и чувствительна к селективной среде HAT. Клетки CEV-AgH клонировали методом лимитирующих разведений. Предварительно подбирали оптимальный вариант фидерных клеток и наилучший З'Макт получили при использовании 10 тысяч перитонеалышх клеток шиой П гл лунку культурального планшета после облучения ультрафиолотсм. По способности к клонированию отобрали 12 активно пролифэрнроваг'лтх субклонов.

> з

Исследовали спонтанную продукцию клетками субклонов покою-

{их кздиатороь и опредзлшш отсутствие в их супернатантах активностей штердейкша 2 и интерферона-гаша. Отсутствовала активация ими естественных киллеров, прямое цитостатичеисое и циготоксичес-коз действие на клетки ыастоцитомы Р815. Однако, было выявлено, «¡чо сушряьтанты некоторых субклонов вызывали подавление миграции паритошальшх макрофагов мшм из мшсроканилляров или микрокультур. Индекс подавления миграции составил 60-76$. Клон Da, проявлявший в данном тесте наибольшую активность, использовали'для изучения влияния продацируэмого им медиатора на мононуклеарные фагоци-тирущна клетки.' Клоп EI2, ке вызывавший подавления миграции макрофагов мыши, отобрали для получения Т-Т-гибридом. В ходе 3 гибридизаций получеш 18 активно пролиферировавших -на среде IIAT клонов клоток, супврнатанти которых анализировали, в скрининговом таете миграции из микрокультур. Супэрнатанты 4 клонов вызывали подавление миграции макрофагов (ИШ составлял 53-67$). В дальнейшей работе использовали гибридому, обозначенную 2-F-8 (ИПЫ=67%), дважды ев клонировали и перевали в массовую культуру. Остальные клони крио-консервировали.

г

Проводили доказательство гибридной природы клона 2-Р-8. В таблице 2 првдетавлаш некоторый сравнительные характеристики родительских опухолевых клеток и полученного клона. Взаимодействие клеток с-моноклоналышми антителами ОКТЗ возрастало соответственно-с 4 до 26,4$, а модальное число хромосом с 87 до 102. Реактивность с другими использованными моноклоналышми антителами существенно на изменялась. Клетки клона 2-Р-а зкспрессировали локусы антигенов класса I' главного комплекса гистосовыэстимости человека, характерные для обоих родителей.

Из приведенных данных следует, что- полученшй нами в' результате слияния опухоли CEM-AgE-El2 и лимфоците»; периферической крови

блица 2. Сравнительная характеристика родительскса линии сы-А{:К 112 и Т-Т-гибридомного клона 2-P-S.

Характеристики 0EM-AgR~H12 Т-Т-гибридома

Модальное число

хромосом 87 102

Процент клеток, реа-

гирующих с монокло-

налышмп антителами:

ОКТЗ 4 2S

0КТ4 90 94

0КТ8 8 3,4

ОКВ7 I 1,7

0К1а 3,5 4,6

Экспрессия ньа-а.в А2,А9,В13,В15 А1,А9,Aw19.В8,Б13,В15

,1мечатга: лимфоциты здорового донора, использованные для получе-1 гибридомы, экспрессировали следующие антигены класса I главно-комгглекса гпстосовместимостл человока (HLA): А1, iwi9, Е8, В27.

иовока, активировпшшх конканавалшгом А, клон 2-F-8 является Т-Т зтачной гибридомой, спонтанно продуцирующей фактор, подавлящий грацию макрофагов в моделях in vitro.

На следующем этапа проводили исследование влияния суперна-itob культур клеток Т-Т-гибридомы 2-F-8 и субклона CEM-AgR-Ш на псщга мононуклеарных фагоцитов. На рисунке 6 показано влияние ¡личных разведений супернатанта CEM-AgR-D8 и 2-F-8 на миграцию :рофагов в микрокапиллярном тесте. Пики мнгхбицди миграции перо-:ались зонами отсутствия активности или же стимуляции подвижнос-клоток и совпадали у обоих культур. Так для разведении в 4, 16, , 1024 раз ИЛИ составлял 60-70!?,' а в 2,8,128,256 раз (-)20-3Qi, . соответствует стимуляции подвижности клеток. Можно предполо-ь, что либо клетки одновременно синтезируют факторы с . оппозит-действкем, которое проявляется • в зависимости от разведения, о происходит расппг огчого фактора на несколько, субгёдивдц с юпчтт их обг»?ли»гнпем тоете в зависимости от разведения.

Изучгиг,! дейстым исслздуемах супернатантов на фагоцитоз мак-рофага-и; латекспых частиц и на активность кислой фосфомоноэстера-5Ц.' Пря обработка имя суспензии макрофагальных клеток активность фермента возрастала в 1.3 роза. Также происходило увеличение как количества фагоцитирувдн: клеток, так и числа поглощенных частиц на одну клетку по сравноши-о с контрольной средой, соответственно в 1.6 и в 1.2 раза. Анализируемые супернатанты существенно не разли-чсиязь гю своему действию на мононукпеаркые фагоциты.

, Таким оСрзгом нами подобраны оптимальные условия получения ?-Т-гибридом человека, спонтанно продуцирующих факторы, регулирующие функции моноцптарклс фагоцитирующих 1слеток, а также отобран субклгк рздктельской линии СЕМ-АвК-Ю, секретирующий медиатор с здавогкчнсЗ активностью.

з. Исследование костномозговых медиаторов с использованием гибри-домноп технологии.

и, ВИВСЫШ£ гибтадом уа основе клеток костного мозга.

Клетки лимфатических узлов, дренирующих область введения антигена, перерабатывают его до форм способных циркулировать с током » норхфс-ричоскоЗ крови и достигающих костного мозга, индуцируя в нем изменения в продукции факторов как стимулирующего, так и супрес-сорпого действия (Новиков В.М. и дрГ, 1988). За счет секреции этих медиаторов костный мозг регулирует иммунные реакции в других органах иммунной системы, в том числе в лимфатических узлах. Поскольку исследование костномозговых факторов затруднено вследствие гетерогенности популяции клеток-продуцентов, представляет интерес -использование методов гибридомиой технологии для изучения медиаторов, продуцируемых костным мозгом.

Исходя из того, что суперяатзн'г клеток интактного костного-мозга шли способен подавлять пролиферацию клеток мастоцитомы

Р-815 на 80-905В (Ляхов В.Е. и др., 1937), скскикнг п:б'Д1С!.; осуществляли на той же модели. В результате трех гибридипапга получо-ш 5 клонов, супернатанти которых вызывали подосленпэ згролифо рации клеток Р-815 на 50-8056 по сравнешга с контролем.

В дальнейшей работе использовали клон ЕЮ, скагизава^й максимальный супрессор1шй эффект (8035). После трех клонирований методом лимитирующих разведений количество поло'-ютелышх субклонов составило соответственно 502. 80;? и 95:1.. Клон ЕЮ Сил переведен в массовую культуру, поддерживался в течение I года и претерпел 110 клеточных пассажей. Неизменность величин» супрессорпсго действия (80-90$) и модального числа хромосом (32) свидетельствует о ста-, бильности полученной гибридомы.

Снижение пролифзративной активности клеток, культивируемых на кондиционированной среде, которой является супернатаят гибри-домного клона, может происходить вследствие исчергшвашш пптатель-1шх свойств среда и накопления в ней различных метаболитов. Кроме того, опухолевые клетки продуцируют опухолеспецифические супрес-сорные факторы, подавляюще пролиферацию любах других клеток. Поэтому, необходимо било оцепить влияние супернатанта гибридомы на пролиферацию на только клеток Р-815, но и родительской ыиеломы.

В первой серии опытов выясняли, какая доля эффекта супрессии приходится на опухолеспецифнческие супрессорила факторы и другие продукты клеточного метаболизма. Для этого к клеткам Р815 добавляли различные разведения супернатвпта 36 часовой культуры клона ЕЮ с исходной концентрацией 3*105 кл/мл, либо, аналогичным образом полученный супернатант миеломы. На рисунке 7 представлены результаты этой серии экспериментов. В первом случае для разведения 1:4 процент ингибинли пролиферации составил 76,5-86,6% по сравнению со свежей сродой. Во втором - также происходило подавление пролифера-

пни на 34,1%. Из этого следует, что часть супрессорного действия сунэрнатзнта гибридош можно отнести за счет совокупного действия вгаеггерзчисленных факторов.

Во второй серии экспериментов определяли долю эффекта кле-ючныз. метаболитов. Б качестве клеток-мишеней использовали родительскую шелому. На рисунке 8 представлены результаты этих экспериментов. Супарнатант гибридомного клона ЕЮ в разведении 1:4 подавлял пролиферацию родительской опухоли на 64,5-85,6$ по сравнений со свежей средой, а миеломк-лишь на 14,3%.

Из приведенных данных можно заключить, что полученная наш впервые функциональная гибридома на основе нефракционироЕанных клотск костного мозга и опухоли В-клеточной природы Х63. устойчива в культуре и спонтанно продуцирует фактор, подавляющий пролиферации опухолевых меток. Часть эффекта супрессии обусловлена продукта'.'-?; гвбридомой опухолеслецифических антиростовых факторов, а так ъ\'з присутствием в кондиционированной среде других продуктов жизнедеятельности клеток.

Анализ выживаемости клеток-мишеней после обработки фактором показал, что данный медиатор не обладал цитотоксичеким или цитоли-тпчесгам действием. Полученный медиатор так. же не оказывал какого-либо действия на миграцию поритонеальных макрофагов мыши.

Представляло интерес сравнить некоторые характеристики факторов , продуцируемых полученной гибркдомой и интактными клетками костного мозга. Исследуемые супернатанты оказывали ингибирукщее действие ка пролиферацию опухолевых клеток-мишеней как P-8I5, так к Хбз. процент супрессии при этом составлял 80-9QÍ. Частичная очистка супорзатанта гкбридомы ЕЮ, культивируемой в бессывороточной среде Исков (Serva, ФРГ), проводилась хроматографией на колонке с с?фадокссм G-25. Супрессорная активность идентифицировалась в пи-

, соответствующем молекулярной массе 7-3 кД. Инкубация ис следу их супернатантов при 57°С в течение 30 минут существенно не спала действие фактора. Результаты, полученные в этой серии опытов, лностыо соответствуют литературным данным о характеристиках еуп-ссорного Фактора, продуцируемого клетками ингантного костного зга (Сидорович М.Г. и соавт.,1989).

Таким образом, полученная гибридома ЕЮ продуцирует фактор, своим свойствам (клетки-мишени, процент супрессии, молекулярная сса, термолабильность) сходный с супрессорным фактором костного зга.

Псщз^вге моноклоналышя мтлтел к ^шелоиептпдам.

При изучении функциональных свойств миелопептидов на рлзлич-х биологических моделях выявляется их иммуностимуляторное, опеа-подобное и колоннестимулирующее действие. Можно предполсзкить, о такой широкий спектр присущих данному фактору активностей условлен ого гетерогенностью или недостаточной очиденностьи. По-ому, актуальным является'получение моноклоналышх антител к мио-пептидам, являющихся универсальным средством для исследования ирода и очистки медиаторов, а также для создания днзгностикумов, вводящих определять их содержание в биологических жидкостях.

Скрининг субклонов, продуцирующих моноклоналышо антитела, и редоление, к какому классу иммуноглобулинов они принадлежат,, вводились с помощью твердофазного иммуноферментного анализа Ы8А) в лаборатории иммунофчрментпого анализа Института икмуно-гии НЗ СССР. Проведено пять гибридизаций, из которых единствен-я оказалась результативной. В 15 лунках наблюдалась активная олиферопия клеток и только в одном ип супернптантсв (В.?) вылились антитела клагсч Ц:М, взаимодеЯатвопаг'лно с миолопептидами, рбировтнтми на плш; . Клетки ил этой лунки трижды клонирова-

(шслй -шрвого кюшроьания число положительных субклонов составило 30.?, после второго - 7.0%, а после третьего 95з6), перевели 1 массовую культуру, а оатем получили асцитную форму роста в брюшно! полости мшей. линии ВАЕВ/е. Анализ метьфазаых олас-тинок клеток, полученных.в результате слияния, свидетельствовал об их гибридной природа, поскольку модальное число хромосом ь них решалось 74.

Представляло интерес определить -отменяют ли полученные монок-лоаалышо антитела активность мшлопептвдов в биологических мода-лях оценки их действия. Наш выбрана модель - стимуляции миелопепти-дами антителопродукцш клетками иммунных лимфатических -узлов■ на пике вторичного иммунного ответа, в связи с тем, что это свойство яышется наиболее значимым -для их практического применения (Петров 1'Л1. и соавт., 1986-1939). '

Душ получения отимуляторного аффекта 50 тысяч клеток-мишеней обрабатывали ЬО мкг препарата "миелопид" (оптимальная стимулирую-

цая Доза в-данном тесте) или культивировали совместно с 50 тысяча/

№1 клеток интактного костного мозга мышей £4. В качестве мишеней

действия фактора иоиользоваяи клетки лимфатических узлов сингенных.

ьашо'пшх, выделенные на .пике вторичного иммунного ответа к эритро-

\

цитам барана. . - • -

Функциональную активность . Ж'лучащшх моноклональных антител определяли, обрабатывая ими клетки интактного КМ, либо препарат "¡.шолоппд". Снижение стмуллторного эф^экта на гуморальный ответ плиток лаифатичосма узлов оценивали- с помощью непрямого матода К-. пи ьЧ £11.(1965). Билл по кораны оптимальные для реакции антигок-ьиштила разпадышя культурального супариатанта и асцатической хдди^отн тзрэдоы ЕЯ: 1:40 и 1:200 соотъетстаенно.

Ро.!»мьтити этой сирии опытов, приьедонн в таблице 3., Соьмост-Ыч к^и.-шик^шш*..! к^пчмс пммуншх лпы^атнчиских узлов с клеткэдш

Таблица 3.' Тестирование нейтрализующего действия асщпяческсП тг.т кости, содержащей продукт гибридомн Е2 (раоведешга Т:200), в оиг шении стимуляторной активности "миелопида".

Вариантн

1. Клетки иммунных лимфоузлов;

2. Клетки иммунных лимфоузлов + клетки костного мозга;

3. Клетки костного мозга, обработанные асцитом Е2, t клетки иммуншх лимфоузлов;

4. Клетки иммуншх лимфоузлов, обработанные асцитом Е2;

5. "Миелопид", обработанный асцитом Е2, + клетки иммунных лимфоузлов;

6. "Миелопид" + клетки иммуншх лимфоузлов

АОК (млн)

95« 5 240+15

120+7

9014 100+6 I55I8

КО'^ффИШШНТ

стимуляции

2,5 1,2

1,6

кнтактного костного мозга или с препаратом "миелопид " приводило к увелкчетго числа антитедообразуидмх клеток (АОК) соответственно в 1,6-2,5 раз. Обработка ектиЕиругодих агентов продуктом гибридомн Е?, вела к отмене стимулирумцего эффекта. При этом, сама по себе асцч-тическая жидкость не влияла на количество аптителоиродуцентов п в клетках иммунных лимфатических узлов.

Таким образом, нами впервые получена гибридома мши, продуцирующая моноклонольюю антитела, связывающиеся с сорбированными нл твердой фазе миелопептидами и нейтрализующие их стимуляторнсе действие на клетки-мишени.

вывода.

1. Получены 12 резистентных к 8-азагуашшу субклонов линии СЕМ, чувствительных к среде НАГ. Отработаны оптимальные условия слияния субклоиа CEM-AgR-Ei2 с активированными конканавалином Л лимфоцитами периферической крови человека. 8 клонов Т-Т-гибри-домы человека и субклон родительской линии CEM-AgR-D8, спонтанно продуцировали фактор(ы), регулирувдие функциональную активность мононуклеарных Фагоцитов.'

2. На основе клеток плтантного костного мозга мышей линии ВАЪВ/с и миелсмн РЗ.ХйЗ.А.<>л.б53 получен гябридомный клон ЕЮ, спонтанно

продуцирунщнй супроссорный фактор по ряду характеристик (клет-ии-мишени, процент ипгибиции, молекулярная масса, термолабильность) сходный с cynpeccopifflM фактором, продуцируемым интактны-клетками костного мозга.

3. Гкбридома Е2, полученная при слиянии клеток селезенки мышей лиши ВЛЬВ/с, имглунизироващых препаратом "миелопид", и шеломы 1-3.>:53.а^8.65Э, секретировала моноклоналыше антитела класса Ií¿m, отменяющие стимулирующее действие миелопептидов на иммунный ответ в биологической модели.

4. Актигенспецифический фактор(ы), продуцируемый культивируемыми клетками лимфатических узлов маши в ранний период после антигенного воздействия, активирует мононуклеарные фагоцитирующие клетки (подавляет миграцию, усиливает кислородный метаболизм, активирует кислую фосфомонозстеразу, стимулирует фагоцитоз), индуцирует диНе'ренцпрсвку ' клеток-предшественников по моноци-тарвому пути и стимулирует пролиферацию сингенных лимфоцитов в 4-6 раз. Фактор(ы) не обладает активностями интерлейкинов I и 2, интерфзрона-гамма.

5. Профилактическое введение фактора, секретируемого клетками лимфатических узлов в ранний период после антигенного воздействия, оказывает выраженный протективннй эффект при заражении мышей Salmonellae typhi Ту2 N4446.

Спттсок Еябот,. шублжовгщных, по теме диссертации.

1. Новиков В.К., Ковальчук А.Д. Роль клеток лимфатических узлов в индуктивном периоде иммуногенеза. Тезисы докладов I Всесоюзного иммунологического съезда, Сочи, 1989, т.1, с. 83.

2. Ковальчук А.Л., Черпоусов А.Д., Симонова A.B., Баатарын Б. Селекция 8-азагуашст-резистентннх субклонов линии СЕМ, продуцирующих эф}екторше лимфоккны. В сб.: Мнтерлейкины и другие медиаторы в клинической иммунологии. М., 1939, с.164-167.

3. Новиков В.К., ВласоЕ A.A., Ковальчук А.Л., Раевская М.В., Барсуков A.A., Шанин C.G. Природа фактора, вырабатываемого клетками иммунных лимфатических, узлов, и его влияние на систему мо-юнукле арных фагоцитов. Иммунология, 1990, К1, с. 31-34.

4. Новиков В.И., Власов А.А, Ковальчук А.Л. Сравнительна?, характеристика и некоторые аспекты биологического действия антигенспе-ьпфических {акторов иммунных лимфатических узлов.'Иммунология, 7'У-О £ 22-3^.

5. Новальчук А.Л. .Новиков В.И.,Апарин П.Г. Повышение протаю^,.-/ ционной резистентности мышей, зараженных Salmonella typhi, торами иммунных лимфатических узлов. ШЭИ, 1990, N9, 0.77-йО.

fi. Kovalchuck А.Ъ., Novilrov УЛ., Sidorovich I.G. Hybrid«:... technique application to the bone marrow mediator activitic.-j research. B-cell development, N23- European federation or Immunological societies, 10th meeting, Edinburgh ,-Sept., Tj'j'.i.

г 4

8 16 32 64 128 256 Р131ППН 1НЛН

Рис.1. Влияние ФИЛУ Р815 на миграцию макрофагов из микрокапилляра.

12 3 4 5 17 ft«« пос» гидом jSffl)

Рис. 2. Влияние "WW на пролиферативную активность и' обаее число клеток подколенных лш$йтиче-ских' уедов. . , .

Индекс лрornffepai»« (х)

P3.X63.Agï.653

M 32 16 8 4 2 4 8 16 32 РШШЙ Ш

Рис. 3. Влияние сутюрнатантов клеток иммунных лимфатических узлов на пролиферацию клеток мастоцигомы Р815 и миеломы РЗ. Х63. Ag8. 653. 1-фИЛУ Р815; 2-ФИЛУ Х63; 3-супериатант клеток интактных лимфатических узлов; 4-ФИЛУ К562; 5-ФИЛУ к эритроцитам барана.

te 1В

8

6

4

2

S контроль 0 цельный

ЕЭ«и*икя 118-128 liS Ш иш*я 18-11 »

Рис.4. Действие ФИЛУ Р815, фракционированного на колонке с сефадексом Б*-200,' на: А-пролийеративную активность клеток подколенных лимфатических узлов; В-на киллерную активность леритокеалькых лимфоцитов.

11с ?

Б 5 4

3 2 1

а

Рис. е. специфическая сорбция ФИЛУ Р815. Действие фактора оценивали по; Л-пролифератиЕНой активности клеток подколенных лимфатических узлов; В-киллернсй активности перитонеашшх лимфоцитов.

¡¡х

РЮидо елвтт

6. Влияние различных разведений супернатантов СЕМ-АаЯ-БВ и Т-Т-гибридош 2-Р-8 на миграцию перитонеальных макрофагов шоти в микрокапиллярном тесте.

11/р г 4 в ркшда сттеяш

Рйс.7. Влияние различных разведений супернатантов клона ЕЮ и шелома РЗ. ХбЗ. Ае8.653 на пролиферацию клеток мастоцитомы Р815.-

2 4 в 16 Р83БЕШИЯ ШГНЯПНТИ Рис.8. Влияние различных разведений супернатантов клона ЕЮ и миеломы РЗ. ХБЗ. А?8.653 на пролиферацию клеток кие ломы РЗ. ХБЗ. Ар8.653.

Погггг.сганс пачагь 13.12.90г. Заказ ' 707 (йзхй/хб .Тцрак ПО

Тшгографгк ' ВА02ЙК

186 т

ШЕ10

0РЭ.Х63.йдв.653