Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Изучение фармакокинетики бортезомиба методом жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием

На правах рукописи

ИСМАГИЛОВ ТИМУР ДАМИРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ БОРТЕЗОМИБА МЕТОДОМ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СЕЛЕКТИВНЫМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ

14.03.06. - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-■8 ДЕК 2011

Старая Купавна - 2011

005005401

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Минздравсоцразвитня России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Миронов Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

заслуженный деятель науки, член-корр. РАМН, профессор

Гуськова Татьяна Анатольевна

доктор медицинских наук, профессор

Яворский Александр Николаевич

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвитня России

Диссертационного Совета Д 217.004.01 при Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ по адресу 142450, Московская область, п. Старая Купавна, ул. Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ. Автореферат разослан «_»_2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Яснецов В.В.

Защита состоится «_»

2011г. в_часов на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Множественная миелома (ММ) - это злокачественное лимфопролиферативное заболевание, характеризующееся инфильтрацией костного мозга плазматическими клетками, наличием моноклонального иммуноглобулина в сыворотке крови и/или в моче и остеолитическими поражениями костей. ММ составляет 1% от всех онкологических заболеваний и немногим более 10% среди всех гемобластозов [Андреева Н.Е. 2001; Голенков А.К. 1995; Калимулина Д.Х. и др. 2004].

До середины прошлого века лекарственных средств, эффективных при миеломе, не было. До появления алкилирующих агентов средняя продолжительность жизни больных ММ составляла от момента первых симптомов 17 мес, а от начала лечения 7 мес [Osgood Е.Е., 2001].

Благодаря значительным успехам в фундаментальных исследованиях, посвященных биологии ММ, на рубеже XXI века появились новые эффективные лекарственные препараты [Бударин А.Н. и др., 2006; Высоцкая Л.М.и др., 2008; ]. Целый ряд лекарственных средств разработан на основе воздействия на целенаправленные механизмы, посредством которых регулируется рост миеломных клеток и их апоптотическая смерть, состояние микроокружения костного мозга, межклеточная передача сигналов в миеломные клетки. К наиболее перспективным лекарственным препаратам относится бортезомиб.

Бортезомиб (PS-341) обратимо ингибирует химотрипсиноподобную активность протеасомы 26S. Протеасома 26S - крупный белковый комплекс, который катализирует расщепление основных белков и регулирует их внутриклеточные концентрации. Так называемый «убиквитин-протеасомный путь» играет важную роль в регуляции уровня специфических белков, поддерживая таким образом гомеостаз внутри клеток млекопитающих.

Ингибируя химотрипсиноподобное действие протеасомы 26S, бортезомиб вызывает торможение протеолиза, приводящего к сложному сигнальному каскаду внутри клетки, нарушение нормального клеточного гомеостаза и, возможно, апоптоз. Эксперименты продемонстрировали, что бортезомиб цитотоксичен для большего числа типов опухолевых in vitro. Он также вызывает задержку роста опухоли in vitro в неклинических моделях опухолей, включая множественную миелому.

Во II фазе клинических испытаний бортезомиб у больных с рецидивами и рефрактерной ММ показана эффективность препарата. У 35% пациентов получен эффект (минимальный эффект + полная ремиссия + частичная ремиссия) и в 59% случаев достигнута стабилизация. В исследование вошли 202 больных, в среднем получивших 6 программ химиотерапии. Медиана выживаемости без прогрессирования составила 12 мес, медиана общей выживаемости - 16 мес, по сравнению с историческим контролем в аналогичной группе - 6-9 мес. Переносимость препарата была удовлетворительной. Наиболее частыми побочными эффектами были утомляемость, тошнота, диарея, тромбоцитопения, периферическая нейропатия, запоры, лихорадка, рвота [Ricardson Р,2003].

ЗАО «Фарм-Синтез» разработало отечественный генерический препарат бортезамиба препарат Миланфор, который имеет фармацевтическую эквивалентность Велкейду (бортезомиб, BEN VENUE Laboratories, Inc. (США). Разработка данного препарата соответствует провозглашенной Правительством РФ лекарственной политики, направленной на импортзамещение, что подтверждается фактом включения бортезомиба в список стратегически важных ЛС, производство которых должно быть налажено на территории РФ (Постановление Правительства РФ №1141-р от 6 июля 2010, подписано Председателем Правительства Российской Федерации В.Путиным). В соответствии с нормами Федерального закона №61-ФЗ от 12 апреля 2010 года «Об обращении лекарственных средств» перед внедрением воспроизведенного препарата

бортезомиба Миланфор должны быть проведены сравнительные фармакокинетические исследования на животных и человеке ( исследования эквивалентности) для чего необходимо разработать методику количественного определения бортезомиба в биологических жидкостях.

Все выше изложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель и задачи исследования. Изучение фармакокинетики воспроизведенного отечественного препарата бортезомиба Миланфор у животных и человека методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести качественную и количественную оценку субстанции бортезомиба.

2. Разработать методику количественного определения бортезомиба в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором.

3. В эксперименте на животных сопоставить влияние кроветворения препаратов бортезамиба Миланфор (отечественный воспроизведенный препарат) и Велкейд (оригинальный препарат).

4. Определить динамику концентрации бортезомиба в плазме животных и человека после однократного введения препаратов Миланфор (отечественный воспроизведенный препарат) и Велкейд (оригинальный препарат) и рассчитать фармакокинетические параметры модельно-независимым методом статистических моментов.

5. Провести сравнительное изучение экспериментальной и клинической фармакокинетики препарата Миланфор (отечественный воспроизведенный препарат).

Научная новизна. Разработаны методики количественного определения бортезомиба в лекарственной форме и в биологических жидкостях; впервые изучена экспериментальная и клиническая фармакокинетика нового отечественного воспроизведенного препарата

Миланфор; впервые установлена корреляция концентрации бортезомиба в плазме крови собак и больных.

Практическая значимость работы. Разработана методика, позволяющая с высокой точностью определять концентрации бортезомиба в плазме крови, обеспечивающая повышение контроля качества воспроизведенных лекарственных средств, содержащих бортезомиб.

В ходе исследований сравнительной фармакокинетики у животных и больных с множественной миеломой сопоставлены основные фармакокинетические параметры после однократного введения препаратов Миланфор и Велкейд. Это позволило сделать заключение о фармакокинетической эквивалентности отечественного воспроизведенного препарата Миланфор оригинальнлму препарату Велкейд и выпустить на отечественный фармацевтический рынок новый российский препарат, соответствующий мировым стандартам лечения.

Внедрение в практику.

Результаты исследования используются . в аналитической и клинической практике в Центре клинической фармакологии и в Филиале «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН, в педагогическом процессе на кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Публикации по работе. По результатам диссертационного исследования опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 1 публикация в зарубежном издании.

Личный вклад соискателя.

Организация исследования на лабораторных животных, подготовка биологического материала к проведению аналитического исследования, разработка метода определения концентрации бортезомиба в биологическом материале, непосредственный анализ биопроб на ВЭЖХ, расчет фармакокинетических параметров с использованием компьютерной программы выполнялись непосредственно соискателем.

Статистическая обработка данных, анализ результатов исследования, иллюстрированный материал, написание диссертации выполнены автором самостоятельно.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции с международным участием «Достижения современной клинической фармакологии в России (Москва, сентябрь 2009 г), школе клинических фармакологов (Германия, Дрезден, октябрь 2010 г.), на 2-ом Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, октябрь 2010), на совместной научно-практической конференции Филиала «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН, кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, Центра клинической фармакологии ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России (Москва, 2011 г.).

Основные положения выносимые на защиту.

1. Разработанная методика определения бортезомиба в плазме крови с помощью метода ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием.

2. Результаты фармакокинетического исследования препаратов Велкейд и Миланфор у животных.

3. Уровни концентрации бортезомиба у больных множественной миеломой после введения препаратов Миланфор и Велкейд.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов.

Результаты эксперимента обобщены 39 таблицами и проиллюстрированы 14 рисунками. Библиографический указатель включает 104 отечественных и иностранных публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использована субстанция: бортезомиб , производитель ЗАО «Фарм-Синтез».

В работе использованы препараты:

- препарат испытуемый -Миланфор, раствор для инъекций 3,5 мг, производства ЗАО «Фарм-Синтез» (Россия) ;

- препарат сравнения (контроль) - Велкейд, раствор для инъекций 3,5 мг, производства «BEN VENUE Laboratories, Inc.» (США)

Лекарственная форма: лиофилизат для приготовления раствора с целью внутривенного введения.

В работе использовано следующее оборудование и материалы: весы аналитические, рН-метр MetroHm 744, водяная баня, магнитная мешалка, лабораторная центрифуга, вибровстряхиватель, роторный испаритель с вакуумным насосом, дозаторы автоматические.

Все реактивы, используемые в анализе, были марок «ЧДА» и «для ВЭЖХ».

Для количественной оценки в тонкослойной хроматографии использовался денситометр Сорбфил.

Анализ проб, с целью определения качества и количества бортезомиба в лекарственной форме и субстанции, проводили на жидкостном хроматографе Gilson (Франция) со спектрофотометрическим детектором.

Концентрацию бортезомиба крови добровольцев определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (система Agilent 1200 Serie SL).

Экспериментальное фармакокинетическое исследование проводили на крупных лабораторных животных (беспородные собаки, самцы) изначальной массой 19,4±0,64 кг. Формировали 2 группы по 10 животных методом простой рандомизации. Препараты «Миланфор» и «Велкейд» вводили собакам в вену предплечья (на наружной поверхности, посередине между

локтевым и запястным суставами). Собак фиксировали, шерсть выстригали, кожу обрабатывали антисептиком, пережимали конечности выше места инъекции резиновым жгутом, вкалывали иглу скосом вверх, под острым углом, параллельно вене. После прокола кожи прокалывали вену, продвигали иглу внутрь вены на несколько миллиметров, оттягивали поршень шприца до появления крови, освобождали вену от жгута и осуществляли инъекцию.

Кровь отбирали из вены предплечья и латеральной подкожной вены голени до и через 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 6; 12 и 24 часа после введения одного из препаратов в дозе 1,45 мг. Плазму отделяли центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин), переносили в пластиковые пробирки и хранили при -35°С до анализа.

В клиническое фармакокинетическое исследование были включены пациенты с множественной миеломой, резистентные к лечению или имеющие рецидив после терапии. Пациенты были разделены на две группы (по 12 человек): 1-ой группе вводили препарат Миланфор, 2-ой - Велкейд.

До приема препаратов отбирали пробу крови, затем пациенту натощак вводили внутривенно-струйно (3,5 мг) одного из препаратов. Отбор проб крови осуществлялся с помощью кубитального катетера из локтевой вены другой руки. В 1 день цикла отбор проб осуществляли в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1.

График отбора проб крови 1 день цикла

№ пробы 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Время после 0 15 30 1 2 4 6 12 24

приема мин мин час часа часа часов часов часа

препарата

При курсовом введении препараты вводили на 4. 8. 11 день цикла и 1-й день второго цикла. Отбор проб крови осуществлялся в эти дни через 2 часа после введения. Цикл введения препаратов состоял из 11 дней, затем был 10-дневный перерыв, далее цикл повторялся.

В ходе исследования проводилось динамическое наблюдение (клинический осмотр, измерение АД, ЧСС, ЧД).

Повторное исследование проводилось через 10 дней по идентичной схеме.

Кровь в количестве 5 мл отбирали в гепаринизированные пробирки. Пробирки для отбора проб крови имели маркировку с указанием шифра испытуемого, номера пробы, название препарата, время отбора. Плазму отделяли центрифугированием и хранили при -35°С до проведения анализа.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета Microsoft Office Excel 2007 для персонального компьютера. Рассчитывались следующие статистические параметры: среднее арифметическое значение (Mean), стандартное отклонение (SD), ошибка среднего (SE) и коэффициент вариации (CV), границы доверительного интервала. Достоверность различий полученных параметров оценивали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA). Различия считались достоверными при р<0,05. Также проводили корреляционный анализ средних значений концентрации бортезомиба в плазме собак и пациентов (критерий Пирсона). Проведено попарное сравнение фармакокинетических параметров.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнительное изучение препаратов Миланфор и Велкейд на кроветворение у животных.

В субхроническом эксперименте по сравнительному исследованию влияния синтетического противоопухолевого препарата Миланфор и синтетического противоопухолевого препарата сравнения Велкейд на систему кроветворения (клеточную картину костного мозга) у собак (проанализировано 19 видов клеток костного мозга) и физиологические показатели крупных лабораторных животных в течение одного стандартного курса в терапевтической и в дозе, двукратно превышающей терапевтическую

(фон, на 3,7,11,18 дни курса), проведено сравнительное изучение этих препаратов.

Изученные препараты не оказали достоверного влияния на динамику массы тела, потребления корма и воды, общее состояние животных. Прослежено идентичное влияние препаратов на частоту дыхания, ректальную температуру, количества потребляемой воды и корма подопытных животных.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при 18-дневном воздействии сравниваемых препаратов в терапевтической и двойной дозе отсутствовали достоверные различия со стороны клеточной картины выявлено идентичное влияние сравниваемых препаратов на показатели кроветворения всех животных.

Таким образом, для лечения ММ разработан препарат Миланфор (ЗАО «Фарм-Синтез», Россия), который по изученным параметрам не отличается от зарубежного аналога препарата Велкейд.

2. Разработка методики количественного определения бортезомиба в плазме крови.

В результате исследования были подобраны оптимальные хроматографические условия разделения бортезомиба

В таблице 2 представлены условия масс-спектро метрического детектирования бортезомиба.

Масс-спектрометрическое детектирование проводилось в режиме положительной ионизации электрораспылением (ESI/APCI, Positive). В масс-спектре бортезомиба, полученном при ионизации вещества в режиме MC (или MS) с двойным квадрупольным анализатором, наблюдался интенсивный пик с m/z 367, соответствующий протонированному молекулярному иону (М+Н)+ целевого вещества.

Условия масс-спектрометрического детектирования бортезомиба

Ионизация Электроспрей + ионизация

Режим Positive

Тип сканирования MRM (Multiply Reaction Monitoring)

Параметры ионизации Расход газа азота - 5 л/мин Температура газа - 350°С Температура испарителя - 250°С Напряжение капилляра - 2000 В Давление небулайзера -15 psi Коронный разряд-4 мкА

Параметры фрагментации Fragmentor = 100 В Collision Energy = 5В

Молекулярный ион m/z 367

Дочерний ион m/z 226

Программный софт MassHunter

В анализе использован мониторинг 1 выбранного иона: первый анализатор (МС1) настроен на пропускание ионов с одним фиксированным значением m/z (для бортезомиба 367), второй анализатор (МС2) фиксирует количество прошедших ионов либо по одному, либо по нескольким (Multiple Reaction Monitoring - MRT) каналам с заданными значениями m/z фрагментов (m/z выбранного дочернего иона бортезомиба - 226). Параметры работы детектора подбирались для достижения максимального выхода MRM.

В таблице 3 представлены условия хроматографического анализа (разделения) бортезомиба.

Таблица 3

Условия хроматографического анализа бортезомиба

Режим работы насоса Изократический

Скорость потока 0,3 мл/мин

Мобильная фаза 0,1% муравьиная кислота : ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислотой - 70:30 v/v

Стационарная фаза Zorbax SB CI8 (4,6x50мм; 1,8 мкм) Agilent

Температура колонки 30°С

Объем пробы вводимой в хроматограф 30 мкл

Общее время анализа 5 мин

Время удерживания 2,4 ±0,05 мин

Таким образом ,наилучшее разделение бортезомиба было достигнуто при температуре разделения 30°С, подвижной фазе состоящей из смеси ацетонитрила и деионизированной воды с 0,1% муравьиной кислоты (30:70, v/v), скоростью потока 0.3 мл/мин. Объем вводимой пробы - 30 мкл. Фрагментатор 100В, температура азота 350°С, расход газа 5,0 л/мин, давление небулайзера 15 psi.

Детектирование с использованием масс-спектрометрического детектора позволяет достичь необходимого предела обнаружения бортезомиба с хорошей воспроизводимостью результатов.

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки. При регрессионном анализе выявлена линейная зависимость между концентрацией бортезомиба в интервале 1 - 200 нг/мл.

Порог чувствительности метода (абсолютная чувствительность по бортезомибу в анализируемой пробе) составляла не ниже 0,4 нг бортезомиба в мл плазмы крови. Относительная ошибка определения составляла 8,2; 4,5; 3,1; 5,8; 7,4; 6,2 и 7,1% при концентрации препарата 1, 10, 25, 50, 100, 150 и 200 нг/мл соответственно. Истинное содержание препарата в пробах

находится в рассчитанных доверительных границах, а представленная методика количественного определения бортезомиба в плазме крови свободна от систематических ошибок. Следовательно, разработанная методика отвечает основным требованиям, предъявляемым к аналитическим методам, используемым для изучения распределения лекарственных препаратов в биологических жидкостях.

3. Экспериментальная фармакокинетика препаратов Миланфор и Велкейд на животных (собаки)

Значение усредненных концентраций бортезомиба в крови собак после внутривенного введения препаратов Миланфор и Велкейд представлены в таблицах 4, 5 и на рис. 1.

Как видно из представленных данных (табл.4) максимальная концентрация бортезомиба в крови животных (собак) наступает сразу после введения препарата, что характерно для внутривенного введения и составляет в среднем 69,9±14,0 нг/мл. Через 0,5 часа в крови обнаруживается 28,8±7,5 нг/мл, что практически в 2,4 раза меньше первоначальной концентрации. К 24 часам обнаруживается в среднем 0,8±0,3 нг/мл бортезомиба.

Таблица. 4

Усредненная динамика концентрации бортезомиба в крови собак после

однократного внутривенного введения препарата Миланфор

№ Время после приема препарата, час

0,25 0,5 1 2 4 6 12 24

Меап 69,9 28,8 11,6 6,3 3,9 2,1 1,3 0,8

в теап 68,7 27,9 10,7 5,7 3,8 1,9 1,2 0,7

80 14,0 7,5 4,8 3,1 1,2 0,9 0,4 0,3

СУ 20 26 41 49 31 42 32 39

МесНап 68,4 29,7 10,4 5,4 3,4 1,7 1,3 0,8

Имел место умеренный разброс индивидуальных значений концентрации бортезомиба во всех точках отбора (С.V.=20-49%), причем наибольший разброс наблюдался через 1 и 2 часа после введения препарата Миланфор.

Таблица 5

Усредненная динамика концентрации бортезомиба в крови собак после

однократного внутривенного введения препарата Велкейд

№ Время после приема препарата, час

0,25 0,5 1 2 4 6 12 24

Меап 66,6 22,5 10,7 6,4 3,5 2,4 1,2 0,8

в шеап 65,4 20,9 10,2 6,2 3,4 2,2 1,1 0,7

13,5 9,9 3,6 1,9 1,0 0,9 0,4 0,4

СУ 20 44 34 30 29 42 34 49

МесНап 62,3 20,8 9,9 5,9 3,4 2,3 1,2 0,7

Максимальная концентрация составляет 66,6±13,5 нг/мл. Однако к двум часам концентрация снижается до 6,4±1,9 нг/мл.

Как видно из рисунка 1, профили индивидуальных фармакокинетических кривых изучаемого препарата схожи. Приведенные данные свидетельствуют о том, что средние значения концентраций в плазме крови собак для каждого момента времени статистически достоверно не различаются для исследуемых препаратов.

s

г 2

70 60 50 40 30 20 10

- Миланфор Велкейд

20

30

Время, час

Рис. I Динамика усредненных концентраций бортезомиба в плазме собак после введения препаратов Миланфор и Велкейд

По полученным значениям концентрации бортезомиба были рассчитаны фармакокинетические параметры. Значения усредненных фармакокинетических параметров представлены в таблицах 6,7.

Таблица 6

Усредненные фармакокинетические параметры препарата Миланфор (собаки)_

№ живот. AUC0.t AUCq^o CI Kel T|/2 vss

нгхч/мл нгхч/мл л/час 1/час час л

Mean 105,0 116,4 0,71 0,07 10,5 4,9

G mean 103,6 114,8 0,70 0,07 10,1 4,6

S.D 18,2 21,3 0,11 0,02 2,9 1,9

C.V. 17 18 16 25 28 38

Median 101,5 112,5 0,71 0,07 10,5 4,9

Площадь под фармакокинетической кривой, после однократного в/в введения препарата Миланфор собакам, составила 105,0±18,2 нгхч/мл. Время полуэлиминации - 10,5±2,9 ч.

Усредненные фармакокинетические параметры

№ живот. AUCo-t AUCq-СП С1 Ке, Tl/2 V V ss

нгхч/мл нгхч/мл л/час 1/час час Л

Mean 109,2 119,2 0,69 0,07 9,9 4,4

G mean 107,7 117,6 0,68 0,07 9,6 3,9

S.D. 19,4 20,7 0,11 0,02 2,4 1,9

C.V. 18 17 17 24 25 44

Median 105,5 113,5 0,70 0,08 9,5 4,4

Площадь под фармакокинетической кривой, после однократного в/в введения препарата Велкейд собакам, составила 119,2±18,2 нгхч/мл. Время полуэлиминации - 9,9±2,4 ч.

Значения всех фармакокинетических параметров изученных препаратов сходны.

Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать вывод об одинаковых уровнях концентраций и сходном фармакокинетическом профиле бортезамиба у собак после однократного внутривенного введения препаратов Миланфор производства ЗАО «Фарм-Синтез», Россия и Велкейд «BEN VENUE Laboratories, Inc.», США.

4. Фармакокннетика бортезомиба после однократного введения препаратов Миланфор и Велкейд пациентам с ММ.

Усредненная динамика концентрации бортезомиба в плазме крови пациентов после однократного внутривенного введения препаратов Миланфор и Велкейд , определяемая с помощью метода ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием, представлена в таблицах 8,9 и рис. 2.

В нулевой точке (перед введением препарата) исследование проб крови всех испытуемых не выявило присутствия в плазме крови бортезомиба. В

последующие сроки наблюдения в пробах было обнаружено достаточное для анализа количество исследуемого препарата.

Таблица 8

Усредненная концентрация бортезомиба (нг/мл) на фоне введения препарата Миланфор в 1-й день 1-го цикла

Время после введения, час

0,25 0,5 1 2 4 6 12 24

Mean 97,7 56,2 22,7 10,6 7,1 5,3 3,8 2,8

G mean 91,2 52,2 20,6 10,3 6,7 5,0 3,5 2,6

S.D. 41,7 22,6 10,9 2,5 2,2 1,8 1,4 1,1

C.V. 43 40 48 24 31 33 37 39

Median 87,5 53,0 19,3 10,9 7,5 5,3 3,9 2,7

Максимальная концентрация в среднем составляет в среднем 97,7±41,7 нг/мл и наступает через 0,25 ч, т.е. при внутривенном введении бортезомиб сразу же поступает в кровь.

Таблица 9

Усредненная концентрация бортезомиба на фоне введения

№ Код пациента Время после введения, час

0,25 0,5 1 2 4 6 12 24

Среднее 95,7 54,3 26,5 15,0 8,6 4,9 2,9 2,1

Ср.геомет. 88,6 46,9 24,5 14,1 8,2 4,6 2,8 2,0

S.D. 40,9 30,2 10,7 5,7 2,6 1,8 0,7 0,6

C.V. 43 56 40 38 31 36 25 26

Median 87,5 47,6 24,3 15,6 9,2 4,8 2,9 2,1

Имеет место умеренный разброс индивидуальных значений концентраций бортезомиба (С.У.= 25-56%). Причем он выше на стадии распределения.

В результате исследований установлено, что имеющиеся различия не носят систематический характер.

На рис.2 представлены профили усредненных кинетических кривых после однократного в/в введения препаратов Миланфор и Велкейд.

Время, час

Рис.2. Динамика усредненных концентраций бортезомиба в плазме крови пациентов. (1 день, 1 цикл).

Как видно из рисунка 2, профили усредненных фармакокинетических кривых изучаемых препаратов идентичны.

Полученные экспериментальные данные концентрации исследуемого вещества были обработаны с использованием метода математического моделирования, что позволило количественно оценить фармакокинетические процессы и рассчитать параметры фармакокинетики. Результаты представлены в таблицах 10,11.

Фармакокинетические параметры препарата Миланфор (пациенты)

№ пац. AUCo-t AUC0.M С1 Ке. Tl/2 VSS

нгхч/мл нгхч/мл л/час 1/час час Л

Среднее 189,8 242,3 0,02 0,06 13,3 0,22

Ср.геом. 184,3 232,7 0,02 0,05 12,9 0,21

S.D. 45,9 69,7 0,01 0,01 3,8 0,07

C.V. 24 29 36 26 28 32

Median 193,5 242,0 0,02 0,06 12,7 0,22

После введения препарата Миланфор, площадь под фармакокинетической кривой в среднем составляет АиС0.м= 242,3±69,7 нгхч/мл, период полуэлиминации (Т,/2) - 13,3±3.8 ч. Имел место незначительный разброс фармакокинетических параметров после введения препарата Миланфор (С.У.=24 - 36%).

Значения всех фармакокинетических параметров после приема препарата Миланфор статистически достоверно не различались.

Таблица 11

Фармакокинетические параметры препарата Велкейд (пациенты)

№ пац. AUC0.t AUCQ.00 CI ке1 Tl/2 Vss

нгхч/мл нгхч/мл л/час 1/час час л

Среднее 187,1 217,8 0,02 0,07 10,9 0,19

Ср.геом. 181,9 213,3 0,02 0,06 10,7 0,17

S.D. 45,6 44,5 0,01 0,01 2,4 0,09

C.V. 24 21 39 19 22 45

Median 191,5 233,5 0,02 0,07 10,4 0,18

После введения препарата Миланфор, площадь под фармакокинетической кривой в среднем составляет АЧС^ 217,8±44,5

нгхч/мл, период полуэлиминации (Т1/2)- 10,9±2.4 ч. Имел место умеренный разброс фармакокинетических параметров после введения препарата Велкейд (С.У.=19-45%).

Значения всех фармакокинетических параметров после приема изучаемого препарата статистически достоверно не различались.

Как видно из представленных данных фармакокинетические параметры после однократного введения препаратов Миланфор и Велкейд статистически достоверно не различаются.

Проведенное исследование позволяет сделать вывод об одинаковых уровнях концентраций и сходном фармакокинетическом профиле бортезамиба у людей после однократного внутривенного введения препаратов Миланфор производства ЗАО «Фарм-Синтез», Россия и Велкейд «Бен Венью Лабораторис Инк.», США.

Таким образом, в целях повышения экономической доступности лекарственных средств (Распоряжение правительства РФ от 6 июля 2010 г № 1141-р) для лечения ММ разработан препарат Миланфор (ЗАО «Фарм-Синтез», Россия), который по изученным параметрам не отличается от зарубежного аналога препарата Велкейд.

ВЫВОДЫ

1. Разработан чувствительный, воспроизводимый метод количественного определения бортезомиба в плазме крови добровольцев с помощью ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором: подобраны оптимальные условия экстракции, хроматографического разделения и детектирования. Предел обнаружения бортезомиба в плазме крови составил 0,5 нг/мл.

2. Анализ результатов, полученных при проведении сравнительного исследования влияния препарата Миланфор и препарата Велкейд на кроветворение и физиологические показатели крупных лабораторных животных (собаки) в течение одного стандартного курса в терапевтической и

двукратно превышающей дозе показывают, что изменения жизненно важных показателей на фоне приема препарата Миланфор не имеют значимых отличий по сравнению с результатами при приеме препарата Велкейд.

3. Изучена фармакокинетика и определены основные фармакокинетические параметры бортезомиба после однократного внутривенного введения препаратов Миланфор и Велкейд у экспериментальных животных. Уровень максимальной концентрации после приема изучаемых препаратов в среднем составляет 69,9±14,0 и 66,6±12,5 нг/мл для препарата Миланфор и Велкейд соответственно. Площадь под фармакокинетичексой кривой составляет 116,4±21,3 нгхч/мл для препарата Миланфор и 119,2±20,7 нгхч/мл (р>0,05) для Велкейда. Период полуэлиминации - 10,5±2,9 ч и 9,9±2,4 ч (р>0,05) для препаратов соответственно.

4. Оценены основные фармакокинетические параметры (AUC o-t„ AUC о-», Tl/2, CI, Kel, Vss) после однократного введения препаратов Миланфор и Велкейд пациентами с ММ. Площадь под фармакокинетической кривой в среднем составляет 242,3±69,7 нгхч/мл для Миланфора и 217,8±44,5 нгхч/мл для Велкейда (р>0,05). Период полуэлиминации - 13,3±3,0 ч и 10,9±2,4 ч соответственно (р>0,05) для изучаемых препаратов. Полученные данные свидетелствуют о эквивалентности препаратов.

5. Проведенный нами корреляционный анализ показал, что имеет место высокая статистически достоверная корреляция между значениями концентрации бортезомиба в плазме собак и пациентов с ММ. При этом, выявленные различия в фармакокинетике бортезомиба у собак и человека, по-видимому, обусловлены различиями в метаболизме.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. И.В. Кукес, Т.Д Исмагилов . Перспективы внедрения модели персонализированной медицины для совершенствования системы

здравоохранения в странах СНГ: экономические и прикладные аспекты. // Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, 14 - 17 апреля 2009 г. Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» С .71-72.

2. Исмагилов Т.Д. Изучение фармакокинетики и эффективности нового отечественного противоопухолего припарата Миланфор //Клиническая фармакология и терапия Материалы Научно -практической конференции с международным участием «Достижения Клинической фармакологии в России ,07-08 сентября 2009 Москва,-№6 2009- С. 12-13.

3. Т.Д. Исмагилов, О.А. Горошко, В.П. Пахомов и др. Сорбенты для тонкослойной хроматографии в фармацевтическом анализе. // Химико фармацевтический журнал - 2010 - Том 44 - С. 53-56.

4. Ismagilov Timur. Quantitative determination Bortezomib in blood plasma by HPLC with mass spectrometry //8 th European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics Summer School / September 30-0ctober 02,2010 Dresden , Germany-page 34.

5. Исмагилов Т.Д. Количественное определение бортезомиба в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрнческим детектором.// 2 -ой Конгресс Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ 20-21 октября 2010- Биомедицина №4-С. 93-94.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ауто-ТКМ трансплантация периферических стволовых клеток

вэжх высокоэффективная жидкостная хроматография

ИЛ-6 интерлейкин-6

мм множественная миелома

МО малый ответ

ккм клетки костного мозга

ОПЛ острый промиелоцитарный лейкоз

ПН почечная недостаточность

ПО полный ответ

ПХТ полихимиотерапия

тд терапевтическая доза

тех тонкослойная хроматография

хмл хронический миелолейкоз

хт химиотерапия

иммуноглобулин

ОТ-кВ ядерный фактор каппа-би

Подписано в печать 21.11.2011

Объем: 1,5 усл. п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 2594 Формат 60 х 90 1/16

Отпечатано в ЗАО "Хорошая типография" Отдел оперативной, круглосуточной печати Москва, ул. Большая Дмитровка, 32, стр.1

Актуальность темы. Множественная миелома (ММ) — это злокачественное лимфопролиферативное заболевание, характеризующееся инфильтрацией костного мозга плазматическими клетками, наличием моноклонального иммуноглобулина в сыворотке крови и/или в моче и остеолитическими поражениями костей. ММ составляет 1% от всех онкологических заболеваний и немногим более 10% среди всех гемобластозов [2; 10; 18].

До середины прошлого века лекарственных средств, эффективных при миеломе, не было. До появления алкилирующих агентов средняя продолжительность жизни больных ММ составляла, от момента первых симптомов, 17 месяцев, а от начала лечения - 7 месяцев [12; 31].

Успехи противоопухолевой терапии ММ исторически связаны с двумя событиями: во-первых, с синтезом в России сарколизина и, одновременно, мелфалана (алкерана) — левовращающего изомера сарколизина — в Англии в 1953 г., во-вторых - циклофосфана в 1958 г. [38;84].

Благодаря значительным успехам в фундаментальных исследованиях, посвященных биологии ММ, на рубеже XXI века появились новые эффективные лекарственные препараты. Целый ряд лекарственных средств разработан на основе воздействия на целенаправленные механизмы, посредством которых регулируется рост миеломных клеток и их апоптотическая смерть, состояние микроокружения костного мозга, межклеточная передача сигналов в миеломные клетки. К наиболее перспективным лекарственным препаратам относится бортезомиб.

Бортезомиб (Р8-341) обратимо ингибирует химотрипсиноподобную активность протеасомы 26Б. Протеасома 268 - крупный белковый комплекс, который катализирует расщепление основных белков и регулирует их внутриклеточные концентрации. Так называемый «убиквитин-протеасомный путь» играет важную роль в регуляции уровня специфических белков, поддерживая таким образом гомеостаз внутри клеток млекопитающих. Ингибируя химотрипсиноподобное действие протеасомы 26S, бортезомиб вызывает торможение протеолиза, приводящего к сложному сигнальному каскаду внутри клетки, нарушение нормального клеточного гомео стаза и, возможно, апоптоз. Эксперименты продемонстрировали, что бортезомиб цитотоксичен для большего числа типов опухолевых in vitro. Он также вызывает задержку роста опухоли in vitro в неклинических моделях опухолей, включая множественную миелому.

Во II фазе клинических испытаний бортезомиба у больных с рецидивами и рефрактерной ММ показана эффективность препарата. У 35% пациентов получен эффект (минимальный эффект + полная ремиссия + частичная ремиссия), и в 59% случаев достигнута стабилизация. В исследование вошли 202 больных, в среднем получивших 6 программ химиотерапии. Медиана выживаемости без прогрессирования составила 12 месяцев, медиана общей выживаемости — 16 месяцев, по сравнению с историческим контролем в аналогичной группе - 6-9 месяцев. Переносимость препарата была удовлетворительной. Наиболее частыми побочными эффектами были утомляемость, тошнота, диарея, тромбоцитопения, периферическая нейропатия, запоры, лихорадка, рвота [89].

ЗАО «Фарм-Синтез» разработало отечественный генерический препарат бортезомиба - Меланфор, который имеет фармацевтическую эквивалентность Велкейду (бортезомиб, Янссен-Силаг). Разработка данного препарата соответствует провозглашенной Правительством РФ лекарственной политике, направленной на импортзамещение, что подтверждается фактом включения бортезомиба в список стратегически важных JIC, производство которых должно быть налажено на территории РФ (Постановление Правительства РФ №1141-р от 6 июля 2010, подписано

Председателем Правительства Российской Федерации В. Путиным). В соответствии с нормами Федерального закона №61-ФЗ, от 12 апреля 2010 года «Об обращении лекарственных средств», перед внедрением воспроизведенного препарата бортезомиба Меланфор должны быть проведены сравнительные фармакокинетические исследования на животных и человеке (т.н. исследования биоэквивалентности), для чего необходимо разработать методику определения концентрации бортезомиба в биологических жидкостях.

Все выше изложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: изучение фармакокинетики воспроизведенного отечественного препарата бортезомиба Меланфор у животных и человека методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести качественную и количественную оценку субстанции бортезомиба.

2. Разработать методику количественного определения бортезомиба в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором.

3. В эксперименте на животных сопоставить влияние на кроветворение препаратов бортезомиба Меланфор (отечественный воспроизведенный препарат) и Велкейд (оригинальный препарат).

4. Определить динамику концентрации бортезомиба в плазме животных и человека после однократного введения препаратов Меланфор (отечественный воспроизведенный препарат) и Велкейд (оригинальный препарат) и рассчитать фармакокинетические параметры модельно-независимым методом статистических моментов.

5. Провести сравнительное изучение экспериментальной и клинической фармакокинетики препарата бортезомиба Меланфор (отечественный воспроизведенный препарат).

Научная новизна: разработаны методики количественного определения бортезомиба в лекарственной форме и в биологических жидкостях; впервые изучена экспериментальная и клиническая фармако кинетика нового отечественного воспроизведенного препарата Меланфор; впервые установлена корреляция концентрации бортезомиба в плазме крови собак и больных.

Практическая значимость работы: разработана методика, позволяющая с высокой точностью определять концентрации бортезомиба в плазме крови, обеспечивающая повышение контроля качества воспроизведенных лекарственных средств, содержащих бортезомиб.

В ходе исследований сравнительной фармакокинетики у животных и добровольцев (пациенты) сопоставлены основные фармакокинетические параметры после однократного введения препаратов Меланфор и Велкейд. Это позволило сделать заключение о фармакокинетической эквивалентности отечественного генерического препарата Меланфор оригинальному препарату Велкейд и выпустить на отечественный фармацевтический рынок новый российский препарат, соответствующий мировым стандартам лечения.

Внедрение в практику. Результаты исследования используются в аналитической и клинической практике в Центре клинической фармакологии и в Филиале «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН, в педагогическом процессе на кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России.

Публикации по работе. По результатам диссертационного исследования опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 1 публикация в зарубежном издании.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции с международным участием «Достижения современной клинической фармакологии в России (Москва, сентябрь 2009 г), в школе клинических фармакологов (Германия, Дрезден, октябрь 2010 г.), на 2-ом Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, октябрь 2010), на совместной научно-практической конференции Филиала «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН, кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России, Центра клинической фармакологии ФГБУ НЦ ЭСМП (Москва, 2011 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Результаты эксперимента обобщены 39 таблицами и проиллюстрированы рисунками. Библиографический указатель включает 27 отечественных и 77 иностранных публикаций.

выводы

Разработан чувствительный, воспроизводимый метод количественного определения бортезомиба в плазме крови добровольцев с помощью ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором: подобраны оптимальные условия экстракции, хроматографического разделения и детектирования. Предел обнаружения бортезомиба в плазме крови составил 0,5 нг/мл.

2. Анализ результатов, полученных при проведении сравнительного исследования биоэквивалентности влияния препарата Меланфор и препарата Велкейд на кроветворение и физиологические показатели крупных лабораторных животных (собаки) в течение одного стандартного курса в терапевтической и двукратно превышающей дозе показывают, что изменения жизненно важных показателей на фоне приема препарата Меланфор не имеют значимых отличий по сравнению с результатами при приеме препарата Велкейд.

3. Изучена фармакокинетика и определены основные фармакокинетические параметры бортезомиба после однократного внутривенного введения препаратов Меланфор и Велкейд у экспериментальных животных. Уровень максимальной концентрации после приема изучаемых препаратов в среднем составляет 69,9±14,0 и 6б,6±12,5 нг/мл для препарата Меланфор и Велкейд соответственно. Площадь под фармакокинетичексой кривой составляет 116,4±21,3 нгхч/мл для препарата Меланфор и 119,2±20,7 нгхч/мл для Велкейда. Период полуэлиминации -10,5±2,9 ч и 9,9±2,4 ч для препаратов соответственно.

4. Оценены основные фармакокинетические параметры (AUC o-t„ AUC о-оо, Tl/2, CI, Kel, Vss) после однократного приема препаратов Меланфор и Велкейд пациентами с ММ. Площадь под фармакокинетической кривой в среднем составляет 242,3±69,7 нгхч/мл для Меланфора и 217,8±44,5 нгхч/мл для Велкейда. Период полуэлиминации - 13,3±3,0 ч и 10,9±2,4 ч соответственно для изучаемых препаратов. Полученные данные свидетелствуют о эквивалентности препаратов.

5. Проведенный нами корреляционный анализ показал, что имеет место высокая статистически достоверная корреляция между значениями концентрации бортезомиба в плазме собак и пациентов с ММ. При этом, выявленные различия в фармакокинетике бортезомиба у собак и человека, по-видимому, обусловлены различиями в метаболизме.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанную нами метод количественного определения бортезомиба в плазме крови добровольцев с помощью ВЭЖХ с массспектрометрическим детектором рекомендуется использовать при проведения исследований сравнительной фармакокинетики новых воспроизведенных препаратов, содержащих бортезомиб.

2. Представляется целесообразным использовать закономерности экспериментальной и клинической фармакокинетики бортезомиба для прогнозирования уровня бортезомиба в плазме больных при разработке новых схем дозирования препарата.