Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение фармакокинетики противоопухолевых препаратов с помощью методов ВЭЖХ-МС и ГХ-МС

л

КОМАРОВ Тимофей Николаевич

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ ВЭЖХ-МС И ГХ-МС

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

13 МАЙ 2015

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

т иуы е I

Москва-2015

005568368

005568368

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Раменская Галина Владиславовна - доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Каленикова Елена Игоревна - доктор фармацевтических наук, заведующая кафедрой фармацевтической химии, фармакогнозии и организации фармацевтического дела факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВО Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова Чистяков Виктор Владимирович - доктор фармацевтических наук, директор центра доклинических и клинических исследований Российского университета дружбы народов

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет Минздрава России

Защита состоится: «17» июня 2015 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д.13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова по адресу 117997, г. Москва, Нахимовский пр-т, д. 49 и на сайте университета http://www.mma.ru/

Автореферат разослан « » 2015 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 208.040.09 доктор фармацевтических наук, профессор

Демина Наталья Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Онкологические заболевания занимают второе место по распространённости в мире по статистике смертности (в т.ч. и в Российской Федерации) после сердечно-сосудистых заболеваний (статистика ВОЗ, 2013 г.). В настоящее время онкологические заболевания при правильной своевременной диагностике, а также грамотно подобранной схеме лекарственной терапии поддаются излечению с хорошим результатом (R. Fisher, S. David, 2003). Противоопухолевые химиотерапевтические препараты занимают значительное место на российском рынке, многие из которых -оригинальные препараты, разработанные за рубежом, срок действия патентной защиты на которые истёк недавно или истекает в ближайшее время. Данные факты приводит к появлению на рынке новых воспроизведённых лекарственных средств, что делает необходимым разработку правильного подхода к проведению биоаналитических исследований данных препаратов с целью проведения клинических исследований в рамках процедуры оценки их качества и регистрации.

Разработка и валидация биоаналитических методик для количественного определения противоопухолевых препаратов в биологических жидкостях позволит разработать современные подходы к проведению клинических исследований уже существующих препаратов данной фармакотерапевтической группы (в рамках проведения исследований сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности лекарственных средств, в том числе на фоне проведения химиотерапии злокачественных новообразований данными препаратами).

Все вышеизложенное определяет актуальность темы настоящего исследования.

Степень разработанности темы исследования

В настоящее время опубликовано достаточное количество методик

определения изучаемых препаратов в плазме крови человека с помощью

различных методов хроматографического анализа. Вместе с тем, ни в одном

исследовании не проводится сопоставление различных методов хроматографии

3

для определения конкретных препаратов в плазме крови, что позволило бы сформулировать подход к проведению фармакокинетических исследований изучаемых препаратов в целом.

Цель исследования - провести фармакокинетические исследования препаратов из группы противоопухолевых лекарственных средств. Задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку особенностей проведения исследований фармакокинетики для противоопухолевых препаратов в России и за рубежом, обосновать актуальность выбора объектов исследования, рассмотреть подходы к количественному определению изучаемых препаратов в биологических жидкостях.

2. Разработать и валидировать методики количественного определения капецитабина и 5-фторурацила, темозоломида и иматиниба в плазме крови человека с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-спектрофотометрическим (диодноматричным) детектированием (ВЭЖХ-УФ).

3. Разработать и валидировать методики количественного определения анастрозола в плазме крови с помощью метода газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ-МС).

4. Разработать и валидировать методики количественного определения капецитабина и 5-фторурацила, темозоломида, иматиниба и анастрозола в плазме крови человека с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием (ВЭЖХ-МС).

5. Провести сравнительный статистический анализ валидационных характеристик разработанных методик, дать им оценку и обосновать выбор методик для дальнейшего исследования.

6. Изучить фармакокинетику исследуемых препаратов с применением разработанных методик.

Научная новизна. Впервые разработаны и вапндированы методики количественного определения изучаемых препаратов в плазме крови человека. Проведён статистический сравнительный анализ биоаналитических методик для определения четырёх противоопухолевых препаратов: капецитабина и его активного метаболита 5-фторурацила, иматиниба, темозоломида и анастрозола в плазме крови человека методами ВЭЖХ-УФ, ГХ-МС и ВЭЖХ-МС. Предложены подходы к выбору разработанных биоаналитических методик для исследования фармакокинетики изучаемых препаратов.

Теоретическая значимость результатов исследования На основании результатов исследования определён аналитический подход к проведению фармакокинетических изучаемых препаратов с помощью хроматографического анализа.

Практическая значимость результатов исследования. Разработанные биоаналитические методики внедрены в практическую деятельность лаборатории фармакокинетики отдела разработки лекарственных средств научно-исследовательского института фармации Первого МГМУ им. И. М. Сеченова и лаборатории фармакокинетики и лекарственных форм ФГБУН НЦ БМТ ФМБА России. Данные о разработке и валидации методик были использованы при подготовке отчётов об исследованиях сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности отечественных препаратов, разрабатываемых в рамках государственной программы "Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу", утверждённой распоряжением Правительства Российской Федерации от 1 октября 2010 г. № 1660-р. Также разработанные методики были включены в международную базу данных аналитических решений компании Agilent Technologies (5991-2996RURU - темозоломид, 5991-4225RURU - иматиниб, 5991-3524RURU -капецитабин и 5-фторурацил).

Методология и методы исследования. Методология исследования

заключалась в изучении химических свойств изучаемых препаратов, подборе

5

оптимальных условий хроматографического разделения с использованием модельных образцов плазмы крови человека, оценки пригодности разработанных методик и последующего анализа образцов плазмы крови, полученных после приёма исследуемых препаратов, с целью изучения фармакокинетики препаратов с помощью выбранных методик анализа.

В ходе выполнения работы были применены методы высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-спектрофотометрическим и масс-селективным детектированием (одноквадрупольный масс-детектор) и газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (одноквадрупольный масс-детектор).

Положения, выносимые на защиту

- Обоснование условий количественного определения капецитабина и его активного метаболита 5-фторурацила, темозоломида, иматиниба и анастрозола в плазме крови с помощью методов ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-УФ и ГХ-МС.

Результаты валидации разработанных методик количественного определения капецитабина (совместно с 5-фторурацилом), темозоломида и иматиниба в плазме крови методами ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС и анастрозола методами ГХ-МС и ВЭЖХ-МС с учётом предполагаемого терапевтического диапазона концентраций.

- Обоснование выбора методики для проведения фармакокинетических исследований изучаемых препаратов на основе результатов сравнительного статистического анализа.

- Основные фармакокинетические параметры препаратов (капецитабина и его основного метаболита 5-фторурацила, темозоломида, иматиниба, анастрозола), полученные с помощью выбранных методик.

Степень достоверности результатов исследования. Первичные данные, полученные в результате проведения настоящего исследования, получены при помощи современных методов анализа, являются достоверными и точными, что подтверждено в ходе проведения процедуры валидации. Использованное в

6

работе оборудование имело действующие свидетельства о поверке и зарегистрировано в Реестре средств измерений, что позволяет считать результаты исследования достоверными.

Апробация диссертации. Основные положения работы и результаты исследования доложены на научно-практической конференции с международным участием «Разработка и регистрация лекарственных средств: прикладные аспекты» (Москва, 2013 г.), V научно-практической конференции «Актуальные проблемы оценки безопасности лекарственных средств» (Москва, 2014 г.), Второй международной научной конференции молодых ученых и студентов "Перспективы развития биологии, медицины и фармации" (г. Шымкент, Казахстан, 2014 г.).

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Автором лично проведена разработка, валидация методик определения капецитабина (совместно с активным метаболитом - 5-фторурацилом), темозоломида, иматиниба в плазме крови человека методами ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС, анастрозола - методами ГХ-МС и ВЭЖХ-МС, статистическая обработка результатов, проведен анализ фармакокинетики изучаемых препаратов. Вклад автора является определяющим на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально - теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 4 паспорта специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Связь темы исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (№ государственной регистрации 01.2.006.06352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической и токсикологической химии «Основные направления создания и оценки качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01.2.009.07145).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, общих выводов и списка литературы. Диссертация включает 40 таблиц и 46 рисунков. Библиографический список содержит 115 источников, из них 78 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты исследования, приборы и реактивы Объекты исследования:

• Субстанции: темозоломид, капецитабин, иматиниба мезилат, анастрозол отечественных производителей (чистота более 99%), 5-фторурацил (Sigma Aldrich, чистота более 99%), соответствующие требованиям установленной нормативной документации.

• Оригинальные препараты капецитабина (Кселода, таблетки, покрытые плёночной оболочкой, 500 мг), темозоломида (Темодал, капсулы, 250 мг), иматиниба (Гливек, таблетки, 400 мг) и анастрозола (Аримидекс, таблетки, 1 мг) и соответствующие воспроизведённые препараты отечественного производства.

• Образцы холостой плазмы крови и плазмы крови после приёма исследуемых препаратов.

Реактивы: метанол для ВЭЖХ, ацетонитрил для ВЭЖХ, трифторуксусная кислота, ортофосфорная кислота, хлороводородная кислота, кислота муравьиная, натрия дигидрофосфат дигидрат, формиат аммония, этилацетат категории х.ч., гелий для хроматографии, вода Milli-Q.

Оборудование: жидкостной хроматограф Agilent Infinity 1290 с диодноматричным детектором, жидкостной хроматограф Waters Acquity с масс-селективным детектором, газовый хроматограф Agilent с масс-селективным детектором, весы аналитические A&D GR-200, ультрацентрифуга Thermo Scientific SL16, рН/мВ-метр рН 330i, дозаторы переменного объёма Ленпипет Лайт 10-100 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл, шейкер типа "вортекс" Heidorph Reax Тор, испаритель под током азота Thermo Scientific. Обработка данных хроматографического анализа проводилась с помощью специализированных программ ChemStation (метод ВЭЖХ-УФ, метод ГХ-МС) и MassLynx (метод ВЭЖХ-МС). Статистическая обработка данных проводилась при помощи MS Excel 2007.

В качестве модельного препарата был выбран препарат капецитабин, как единственный, для которого при проведении клинических испытаний регламентировано проведение определения нативного препарата совместно с активным метаболитом (5-фторурацилом), что делает необходимым проведение валидации методики для двух определяемых веществ. Кроме того, препарат капецитабин обладает достаточно высокой вариабельностью основных фармакокинетических параметров (CV > 30%), что делает необходимым выбор методики, наиболее подходящей для проведения исследований биоэквивалентности.

Для пробоподготовки для образцов плазмы использовались методы жидкость-жидкостной экстракции и осаждения белков раствором трифторуксусной кислоты или ацетонитрилом. Вапидация разработанных методик проводилась в соответствии с рекомендациями согласно действующим российским и зарубежным руководствам (руководства FDA и ЕМА и «Руководства по экспертизе лекарственных средств», М., 2013).

9

Разработка и валидация методик количественного определения капецитабина и 5-фторурацила, темозоломида, иматиниба в плазме крови человека с помощью метода ВЭЖХ-УФ

1. Капецитабин и 5-фторурацил

Пробоподготовка и анализ На основании литературных и экспериментальных данных были подобраны условия пробоподготовки для образцов плазмы, содержащих исследуемые препараты. Поскольку препараты обладают слабыми кислотными свойствами, пробоподготовку проводили способом жидкость-жидкостной экстракции в гексан при подкислении образцов.

Хроматографическое разделение проводили на колонке колонка Zorbax Eclipse Plus С18 250*4,6мм 5 мкм с предколонкой Zorbax Eclipse Plus С18 12,5*4,6мм 5 мкм, в качестве подвижной фазы использовались: 50 мМ фосфатный буфер с рН 2,5 (компонент А) / ацетонитрил (компонент В) (градиентное элюирование, скорость потока - 1 мл/мин). Детектирование проводилось при длине волны 265 нм, время анализа - 15 минут. Время удерживания 5-фторурацила около 3,5 мин; капецитабина - 11,5 мин.

Валидация методики

- Селективность На хроматограммах образцов чистой плазмы, введённых в инжектор хроматографа после последовательного ввода образцов, содержащих 5-фторурацил (в диапазоне концентраций 0,05 - 5 мкг/мл) и капецитабин (в диапазоне концентраций 0,1 мкг/мл - 10 мкг/мл) не наблюдалось пиков со временам удерживания, соответствующим времени удерживания лекарственных веществ, что подтверждает селективность методики.

□АР1А 8М-2М 4 вемт

■ми"

100- 0 1 5 ц.

8060- в * ^ ) 1 * >' 1 Сарес1аЬпе

40 | 11 VI 11 719-

20- 11 1 | 4—__^Ч -Ал

0- Л- . V.

1 1 I 1 1 4 1 I 1 6 1 1 > 8 10 1 1 1 1 1 1 12 тг

Рисунок 1. Хроматограмма образца плазмы крови с прибавлением стандартных растворов 5-фторурацила и капецитабина - Линейность Был проведён анализ 7 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартных растворов капецитабина и 5-фторурацила до получения концентраций 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 и 10 мкг/мл — для капецитабина и 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 - для 5-фторурацила. По полученным значениям был построен калибровочный график (для 5-фторурацила г2 = 0,99881, для капецитабина - г2 = 0,99952) (рис. 2.)

Агво /

5000- 4

4000- /

3000- у'

2000- +

1000- 5 / 4

0 | > • < | 2 4 Ат&ип11мЬ£. ш11

Агва-800- У

700-

600-

500- ¿Г

400300- X

200100- 5 у

) I 5 _Апкшп11тЬ£ т!1_ 1 10

Рисунок 2. Калибровочные графики зависимости площади пиков 5-фторурацила и капецитабина от концентрации в плазме соответственно По полученным значениям концентраций и уравнению линейной зависимости были рассчитаны отклонения концентраций калибровочных

11

растворов от фактических значений. Полученные величины соответствуют нормам FDA и ЕМА (не более 20 % для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных концентраций).

- Правильность и прецизионность Для оценки правильности и прецизионности был проведён анализ 4-х образцов чистой плазмы с прибавлением стандартных растворов 5-фторурацила и капецитабина, каждый образец хроматографировали по 5 раз. Исследование проводили в течение 1-го дня (уровень intra - day) и 2-го дня (уровень inter-day). Для полученных значений концентраций были рассчитаны величины стандартного отклонения (SD), относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (е, %), приведенные в Таблицах 1 и 2.

Полученные величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (е, %) соответствуют нормам (не более 20 % для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных двух концентраций).

Таблица 1 Таблица 2

Правильность и прецизионность Правильность и прецизионность

методики (intra-day) методики (inter-day)

Уровень концентрации, мкг/мл RSD, % (п=5)

5-фторурацид

0,05 10,29 4,40

0,1 7,57 0,40

0,5 5,28 8,80

5,0 2,03 0,16

Капецитабин

0,1 7,56 0,40

0,5 5,28 8,80

1,0 4,43 3,40

10,0 3,96 0,84

Уровень концентрации, мкг/мл RSD, % (п=10)

5-фторурацил

0,05 7,62 6,60

0,1 7,23 1,50

0,5 6,92 4,60

5,0 3,08 2,46

Капецитабин

0,10 7,23 1,50

0,50 6,92 4,60

1,0 4,22 1,30

10,0 3,05 2,09

Предел количественного определения Предел количественного определения (ПКО) методики был определён на основании расчётных данных линейности, правильности и прецизионности. За ПКО методики были приняты минимальные концентрации 5-фторурацила и капецитабина в плазме, для которых возможно определение 5-фторурацила и капецитабина со значениями RSD и е не более 20 % в диапазоне линейной зависимости. Предел количественного определения методики составил 0,05 мкг/мл и 0,1 мкг/мл 5-фторурацила и капецитабина соответственно.

2. Темозоломид

Валидащия методики Разработанная методика была валидирована по параметрам: селективность, линейность (в диапазоне концентраций 0,1- 10 мкг/мл, г2=0,99997), правильность (относительная погрешность составила 9,00; 3,20; 2,49 - для уровня intra day и 6,17; 1,27; 1,38- для уровня inter day на уровнях концентраций 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл соответственно), прецизионность (относительное стандартное отклонение составило 6,62; 0,18; 2,27 - для уровня intra day и 5,41; 3,11; 1,91 - для уровня inter day на уровнях концентраций 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл соответственно), стабильность, перенос пробы и предел количественного определения (0,1 мкг/мл).

3. Иматиниб

Валидация методики Разработанная методика была валидирована по параметрам: селективность, линейность (в диапазоне концентраций 50-2000 нг/мл, г2 =0,99799), правильность (относительная погрешность составила 16,24; 1,97; 8,49; 4,23 - для уровня intra day и 6,40; 3,35; 3,22;- для уровня inter day на уровнях концентраций 50 нг/мл, 200 нг/мл, 500 нг/мл и 2000 нг/мл соответственно), прецизионность (относительное стандартное отклонение составило 4,37; 0,85; 1,33; 1,31-для уровня intra day и 11,32; 2,04; 5,41; 1,13 -для уровня inter day на уровнях концентраций 50 нг/мл, 200 нг/мл, 500 нг/мл и 2000 нг/мл соответственно), стабильность, перенос пробы и предел количественного определения (50 нг/мл).

Разработка и валидация методики количественного определения анастрозола в плазме крови человека с помощью метода ГХ-МС (одноквадрупольный масс-детектор)

Пробоподготовка и анализ Пробоподготовку образцов плазмы крови, содержащих анастрозол, проводили с помощью осаждения белков ацетонитрилом с последующим упариванием и перерастворением остатка в этилацетате. Хроматографическое разделение проводили на кварцевой капиллярной колонке HP-5MS фирмы Agilent (США) длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной фазы 0,25 мкм, в качестве газа-носителя использовался гелий, детектирование проводили при следующих параметрах детектора: Параметры масс-детектирования: SIM-режим, m/z = 293.

Валидация методики Разработанная методика была валидирована по параметрам: селективность, линейность (в диапазоне концентраций 5-100 нг/мл, г2 =0,99253), правильность (относительная погрешность составила 4,00; 13,00; 3,47 - для уровня intra day и 0,67; 11,75; 9,07- для уровня inter day на уровнях концентраций 5 нг/мл, 20 нг/мл, 100 нг/мл соответственно), прецизионность (относительное стандартное отклонение составило 18,52; 14,26; 11,40- для уровня intra day и 19,37; 11,77; 9,49- для уровня inter day на уровнях концентраций 5 нг/мл, 20 нг/мл, 100 нг/мл соответственно), стабильность, перенос пробы и предел количественного определения (5 нг/мл).

Разработка и валидация методик количественного определения капецитабина и 5-фторурацила, темозоломида, иматиниба и анастрозола в плазме крови человека с помощью метода ВЭЖХ-МС (одноквадрупольный масс-детектор) 1. Капецитабин и 5-фторурацил

Пробоподготовка и анализ Для пробоподготовки использовался метод осаждения белков плазмы крови ацетонитрилом. Хроматографическое разделение проводили на колонке Acquity UPLC ВЕН С18, 50x2,1 мм, 1,7 мкм при t 40 °С, в качестве подвижной фазы использовались: 0,1% водный раствор муравьиной кислоты/ацетонитрил (градиентное элюирование, скорость потока

14

- 0,5 мл/мин), объём ввода пробы - 5 мкл. Параметры масс-детектирования: Режим ионизации: Е8+ ,81М-режим: 360,03 - для капецитабина, 130,90 - для 5-фторурацила, время анализа: 15 мин.

Время удерживания: 5-фторурацила-около 0,35 мин; капецитабин - 0,6 мин.

Валидация методики

- Селективность На хроматограммах образцов чистой плазмы, введённых в инжектор хроматографа после последовательного ввода образцов, содержащих 5-фторурацил и капецитабин в аналитическом диапазоне концентраций не наблюдалось посторонних пиков со временам удерживания, соответствующим времени удерживания препаратов. Исходя из этого был сделан вывод о селективности методики.

А) Б)

Рисунок 3. Хроматограмма плазмы крови, содержащей капецитабин (а) и 5-фторурацил (б)

- Линейность Был проведён анализ 7 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартных растворов капецитабина и 5-фторурацила до получения концентраций 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 и 10 мкг/мл - для капецитабина и 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 - для 5-фторурацила. По полученным значениям был построен калибровочный график (для 5-фторурацила г2 = 0,9982, для капецитабина - г2 = 0,9966) (рис. 2.)

. МИ Si

S «я

мм

ш

А)

Б)

Рисунок 4. Калибровочные графики зависимости площади пиков 5-фторурацила (а) и

По полученным значениям концентраций и уравнению линейной зависимости были рассчитаны отклонения концентраций калибровочных растворов от фактических значений. Полученные величины соответствуют нормам (не более 20 % для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных концентраций).

- Правильность и прецизионность Для оценки правильности и прецизионности был проведён анализ 4-х образцов чистой плазмы с прибавлением стандартных растворов 5-фторурацила и капецитабина, каждый образец хроматографировали по 5 раз. Исследование проводили в течение 1-го дня (уровень intra - day) и 2-го дня (уровень inter-day). Для полученных значений концентраций были рассчитаны величины относительного стандартного отклонения и относительной погрешности (£, %), приведенные в Таблицах 3 и 4.

Полученные величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (s, %) соответствуют нормам (не более 20 % для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных двух концентраций).

капецитабина (б) от концентрации в плазме соответственно

Таблица 3 Таблица 4

Правильность и прецизионность Правильность и прецизионность

методики (intra-day) методики (inter-day)

Уровень концентрации, мкг/мл RSD, % (п=5)

5-фторурацил

0,05 16,09 4,00

0,1 10,14 8,00

0,5 2,36 3,20

5,0 1,35 0,44

Капецитабин

0,10 12,78 2,00

0,50 2,55 2,40

1,0 2,41 0,80

10,0 0,58 0,30

Уровень RSD,

концентрации, %

мкг/мл (п=10)

5-фторурацил

0,05 7,62 6,60

0,1 7,23 1,50

0,5 6,92 4,60

5,0 3,08 2,46

Капецитабин

0,10 12,95 8,00

0,5 10,50 10,00

1,0 3,19 1,20

10,0 0,98 0,68

2. Темозоломид

Валидация методики Разработанная методика была валидирована по параметрам: селективность, линейность (в диапазоне концентраций 0,1-10 мкг/мл, г2=0,99813), правильность (относительная погрешность составила 2,00; 0,83; 0,36- для уровня intra day и 6,17; 1,24; 1,20- для уровня inter day на уровнях концентраций 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл соответственно), прецизионность (относительное стандартное отклонение составило 2,59; 1,66; 1,86- для уровня intra day и 5,41; 3,09; 1,82- для уровня inter day на уровнях концентраций 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл соответственно), стабильность, перенос пробы и предел количественного определения (0,1 мкг/мл).

3. Иматиниб

Валидация методики Разработанная методика была валидирована по параметрам: селективность, линейность (в диапазоне концентраций 50-2000 нг/мл, 1^=0,99254), правильность (относительная погрешность составила 11,184; 2,865; 2,557; 3,657- для уровня intra day и 16,782; 4,948; 3,342; 2,898 - для уровня inter day на уровнях концентраций 50 нг/мл, 200 нг/мл, 500 нг/мл и 5000 нг/мл соответственно), прецизионность (относительное стандартное отклонение

составило 17,469; 11,695; 8,378; 8,278 - для уровня intra day и 16,810; 13,288; 10,101; 10,739 - для уровня inter day на уровнях концентраций 50 нг/мл, 200 нг/мл, 500 нг/мл и 5000 нг/мл соответственно), стабильность, перенос пробы и предел количественного определения (50 нг/мл).

4. Анастрозол

Валидация методики Разработанная методика была валидирована по параметрам: селективность, линейность (в диапазоне концентраций 5-100 нг/мл, 1^=0,99724), правильность (относительная погрешность составила 5,67; 0,83; 2,00 - для уровня intra day и 1,83; 3,75; 3,13- для уровня inter day на уровнях концентраций 5 нг/мл, 20 нг/мл, 100 нг/мл соответственно), прецизионность (относительное стандартное отклонение составило 1,00; 4,68; 3,64 - для уровня intra day и 10,15; 5,75; 2,70 - для уровня inter day на уровнях концентраций 5 нг/мл, 20 нг/мл, 100 нг/мл соответственно), стабильность, перенос пробы и предел количественного определения (5 нг/мл).

Статистическая обработка данных и сравнительный анализ разработанных методик Для статистической оценки достоверности полученных различий по результатам валидации разработанных методик для количественного определения исследуемых препаратов плазме крови человека был проведён сравнительный анализ с помощью расчёта критерия Фишера по результатам двух независимых выборок. Сравнительный анализ проводился для каждого уровня концентраций для двух различных хроматографических методик на уровнях intra day и inter day.

Поскольку аналитический диапазон (в том числе и пределы количественного определения на уровне 1/20 Стах для разработанных методик количественного определения исследуемых препаратов в плазме является одинаковым и был подобран с учётом ожидаемого фармакокинетического диапазона концентраций, выбор конкретной методики для проведения фармакокинетических исследований проводилось сравнение вариабельности вапидационных характеристик.

По результатам сравнения валидационных характеристик разработанных методик, учитывая значения критерия Фишера для каждого уровня концентраций анализируемых препаратов и другие параметры разработанных методик (время анализа, способ пробоподготовки), для количественного определения исследуемых препаратов в плазме крови были выбраны методики определения препаратов с помощью методов ВЭЖХ-МС (для капецитабина и 5-фторурацила, темозоломида, анастрозола) и ВЭЖХ-УФ (для иматиниба).

Изучение фармакокинетики противоопухолевых препаратов с помощью разработанных методик Для изучения фармакокинетики анастрозола и иматиниба была использована плазма крови добровольцев, а для капецитабина и темозоломида - плазма пациентов с наличием в анамнезе соответствующего заболевания, принимавших испытуемые препараты однократно. Для исследуемых препаратов были рассчитаны индивидуальные профили изменения концентраций (С) в плазме крови во времени (X), зарегистрированные после приема препаратов исследуемых препаратов, которые были охарактеризованы максимальной концентрацией лекарственного вещества (Сщ^, наибольшее из измеренных значений) и временем ее достижения (Ттах), а также площадью под кривой «концентрация — время» в пределах от нуля до момента отбора последней пробы крови, рассчитанной методом трапеций (АиСо-т). Сопоставление значений АиС0-т с общим АиС0^ (их отношение составляло больше 80%) свидетельствовало о том, что выбранный регламент фармакокинетического исследования обеспечивает необходимую надежность оценки биодоступности исследуемых препаратов. Для оценки относительной степени всасывания (Г1 - относительная биодоступность) для соответствующих препаратов использовали отношение: Г' = АиС0_т (Т) / АиС0-т(Ю-

Капеиитабин Исследование фармакокинетики препаратов капецитабина проводилось с участием пациентов, имеющих в анамнезе диагноз острый миелобластный лейкоз, после однократного приёма оригинального препарата Кселода® (таблетки, покрытые плёночной оболочкой, 500 мг) и отечественного

19

воспроизведённого препарата капецитабина (таблетки, покрытые плёночной оболочкой, 500 мг). На рис. 5-6 представлены усреднённые фармакокинетические профили для капецитабина и его активного метаболита 5-фторурацила.

бооо -А—— --♦-т КапецитаЬин

| 4000 Г»,------ ------- ---------

Кселода

* 2000 I ^^ — -

о *-------^ии ■ ■-■-■-т—

т ч 0,00 5,00 10,00 15,00

Рисунок 5. Усреднённые фармакокинетические профили капецитабина после приёма исследуемых препаратов капецитабина

Таблица 6

Средние значения основных фармакокинетических параметров капецитабина после однократного приёма препаратов капецитабина

Препарат г ^шах Т 1 шах АиС(о-т) АиС(оо) АиС(о-т)/ АиС(,»)

Капецитабин 8677,688 1,679 7823,629 7931,243 0,99

Кселода® 10314,021 1,757 8484,330 8522,276 0,99

500 400 300

с;

Д 200

I-

Е„ 100

- т КапецитаОин ■ Чя ~ Кселода

1

Т, ч о,оо

2,00

4,00

6,00 8,00 10,00 12,00 14,00

Рисунок 6. Усреднённые фармакокинетические профили 5-фторурацила после приёма исследуемых препаратов капецитабина

Таблица 7

Средние значения основных фармакокинетических параметров 5-фторурацила после однократного приёма препаратов капецитабина

Препарат г тах Т 1 тах АиС(о-т) АиС(„) АиС(о-т)/ АиС(ю)

Капецитабин 778,167 2,58 1158,059 1160,027 1,00

Кселода® 881,812 2,34 1174,297 1175,193 1,00

Темозоломид Таблица 8

Средние значения основных фармакокинетических параметров после однократного приёма препаратов темозоломида (капсулы, 250 мг)

Препарат Стах Ттах АиС(О-Т) АиС(со) АиС(О-Т)/ АиС(оо)

Темозоломид 7751 1,08 20657 22018 0,94

Темодал* 7566 1,22 20343 21424 0,95

Иматиниб Таблица 9

Средние значения основных фармакокинетических параметров после

однократного приёма препаратов иматиниба (таблетки, 400 мг)

Препарат с Т 1 шах АиС(о-т) АиС(00) АиС(0.т)/АиС((Ю)

Иматиниб 2310 4,8 69060 75641 0,91

Гливек* 2762 2,6 62312 68872 0,90

Анастрозол Таблица 10

Средние значения основных фармакокинетических параметров после

однократного приёма препаратов анастрозола (таблетки, 1 мг)

Препарат с ^птах Т 1 тах АиС(о-т) АиС(«,) АиС(о-т/ АиС(оо)

Анастрозол 18,65 2,08 443,39 443,39 1,00

Аримидекс® 17,41 2,08 460,70 460,70 1,00

Таким образом, в результате проведённых экспериментальных исследований была доказана сопоставимость фармакокинетических параметров и профилей соответствующих оригинального и воспроизведённого препаратов.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании анализа действующей нормативной документации, законодательных актов, фармакологических и химических свойств различных противоопухолевых препаратов и статистических данных

обоснован выбор объектов исследования (капецитабин, темозоломид, иматиниб и анастрозол) и подходов к их количественному определению в плазме крови человека. На основании изученных данных сделан вывод об актуальности данного исследования и разработан практический подход к анализу изучаемых препаратов.

2. Разработаны и вапидированы методики определения противоопухолевых препаратов капецитабина совместно с активным метаболитом 5-фторурацилом (аналитический диапазон концентраций 0,05 - 5 мкг/мл -для капецитабина и 0,1 - 10 мкг/мл для 5-фторурацила), темозоломида (аналитический диапазон концентраций 0,1 - 10 мкг/мл), иматиниба (аналитический диапазон концентраций 50 - 2000 нг/мл) в плазме крови человека с помощью метода ВЭЖХ с УФ-детектированием.

3. Разработана и валидирована методика определения противоопухолевого препарата анастрозола в плазме крови человека (аналитический диапазон концентраций 5-100 нг/мл) с помощью метода ГХ с масс-селективным детектированием (одноквадрупольный масс-детектор).

4. Разработаны и валидированы методики определения противоопухолевых препаратов капецитабина совместно с активным метаболитом 5-фторурацилом (аналитический диапазон концентраций 0,05 - 5 мкг/мл -для капецитабина и 0,1 - 10 мкг/мл для 5-фторурацила), темозоломида (аналитический диапазон концентраций 0,1 - 10 мкг/мл), иматиниба (аналитический диапазон концентраций 50 - 2000 нг/мл) и анастрозола (аналитический диапазон концентраций 5 - 100 нг/мл) в плазме крови человека с помощью метода ВЭЖХ с масс-селективным детектированием (одноквадрупольный масс-детектор).

5. На основе сравнительного статистического анализа разработанных методик с применением расчёта критерия Фишера доказана применимость различных методов жидкостной или газовой хроматографии для анализа препаратов, содержащих изучаемые вещества, в плазме крови человека.

6. По результатам изучения сравнительной фармакокинетики оригинальных и воспроизведённых противоопухолевых препаратов капецитабина, темозоломида, иматиниба и анастрозола показана сопоставимость фармакокинетических параметров и профилей соответствующих оригинального и воспроизведённого препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шохин И.Е. Разработка и валидация методики определения противоопухолевого препарата темозоломида в плазме крови / И. Е. Шохин, Т.Н. Комаров, Ю.В. Медведев, Е.Ю. Мидруев, Т.А. Ярушок // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2013. - №4(5). - С. 132-135.

2. Комаров Т. Н. Некоторые вопросы фармакокинетических исследований противоопухолевых препаратов / Т.Н. Комаров // Разработка и регистрация лекарственных средств. -2013. -№2(7). - С. 158-164.

3. Комаров Т.Н. Разработка и валидация методики определения противоопухолевого препарата капецитабина и его активного метаболита 5-фторурацила в плазме крови с целью проведения фармакокинетических исследований / Т.Н. Комаров, Ю.В. Медведев, Г.В. Раменская, И.Е. Шохин, Т.А. Ярушок, Е.Ю. Мидруев // Биофармацевтический журнал. - 2014. - Т.6.,№5. - С. 62-67.

4. Комаров Т. Н. Определение противоопухолевого препарата иматиниба в плазме крови человека с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии / Т.Н. Комаров, Г.В. Раменская, И.Е. Шохин, Ю.В. Медведев, Е.Ю. Мидруев // Естественные и технические науки. - 2014. -№9-10.-С. 103-110.

5. Комаров Т. Н. Изучение возможностей применения методов газовой хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием для определения некоторых противоопухолевых лекарственных средств в плазме крови / Т.Н.

23

Комаров, Г.В. Раменская, Е.С. Мельников // Вестник ЮКГФА. — 2014. — №3(68),т. II. - С. 38-40.

6. Комаров Т. Н. Определение некоторых противоопухолевых препаратов из списка ЖНВЛП в плазме крови с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием / Т.Н. Комаров, Г.В. Раменская, И.Е. Шохин, Ю.В. Медведев, Е.Ю. Мидруев, A.A. Львова, Ю.Е. Болдина // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2014. -Т.14.№6. - С. 988-995

7. Комаров Т. Н. Аналитические подходы к изучению фармакокинетики противоопухолевых препаратов с помощью газовой и жидкостной хроматографии / Т.Н. Комаров, Г.В.Раменская, И. Е. Шохин, Ю.В. Медведев, Е.Ю. Мидруев, A.A. Львова, Ю.Е. Болдина, В.В. Смирнов, А.Е. Петухов // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2014. -Т.14.№6.-С. 1008-1016

8. Комаров Т. Н. Изучение фармакокинетики темозоломида с помощью метода ВЭЖХ-МС / Т.Н. Комаров, Г.В. Раменская // Вестник ЮКГФА. -2014,- №4(69), прил.2 - С. 136-138.

Подписано в печать 10.04.2015г. Заказ №352 от 10.04.2015г. Типография ООО "Мегаполис-Принт" 119019, г. Москва, Никитский б-р, д.11/12, стр.1 тел. 8-495-737-48-24 Тираж - 80шт.