Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Изучение фармакогенетических факторов, влияющих на эффективность и токсичность цисплатина при раке яичников.

На правах рукописи

МОИСЕЕВ Алексей Андреевич

Изучение фармакогенетическнх факторов, влияющих на эффективность и токсичность цисплатина при раке яичников

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

0031В8122

Москва-2008

003168122

Работа выполнена в отделении химиотерапии НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А. доктор биологических наук, профессор Лимборская С.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Горбачева Л.Б доктор медицинских наук, профессор Козаченко В.П.

Ведущая организация:

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Росмедтехнологий

Зашита диссертации состоится « _2008 года

в часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина Российской академии медицинских наук (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан "ff' г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Ю. В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы

Успехи химиотерапии злокачественных новообразований относятся к наиболее выдающимся достижениям внутренней медицины последних 50 лет. С помощью дитостатиков появилась возможность излечивать опухоли яичка, хориокарциному, лимфомы и лейкозы, на многие годы продлевать жизнь при раке молочной железы и яичников. Одновременно изучалась молекулярная биология опухолей, синтезировались новые препараты, расширялся круг нозологий, подлежащих химиотерапии, разрабатывались новые схемы и подходы к лечению, а также методы поддерживающей терапии Это бурное развитие сопровождалось неуклонным улучшением результатов химиотерапии: выживаемость увеличивалась, в то же время переносимость лечения, несмотря на усложнение схем, в целом даже улучшалась.

Однако тенденции последних нескольких лет заставляются задуматься о том, что эффективность химиотерапии постепенно выходит на плато: за редким исключением, новые препараты уже не дают существенного прироста выживаемости. В то же время кратно возрастает стоимость лечения, что сильно затрудняет широкое применение последних разработок на практике.

Основные усилия современной онкофармакологии сосредоточены на изучении молекулярно-генетических особенностей опухолевого роста и поиске препаратов, воздействующих на те или иные молекулярные «мишени». Благодаря такому подходу разработано практически все последнее поколение противоопухолевых средств. С этими препаратами связывались большие надежды — вплоть до полного излечения злокачественных новообразований. При ряде заболеваний с помощью новых препаратов действительно удалось принципиально улучшить результаты лечения (ритуксимаб при некоторых лимфомах, иматиниб при хроническом миелолейкозе и стромальных опухолях ЖКТ, трастузумаб при раке молочной железы с экспрессией НЕК2/пеи). Однако в остальных случаях результаты использования этих препаратов оказались менее впечатляющими.

В результате все большую актуальность для современной химиотерапии приобретает индивидуальный подход к подбору препаратов и их доз, направленный на повышение эффективности и уменьшение токсичности имеющегося арсенала противоопухолевых средств. Поскольку традиционные прогностические факторы не позволяют предсказать, какие препараты окажутся эффективными у данного больного, выбор схем химиотерапии носит в известной мере эмпирический характер, что чревато развитием лекарственной устойчивости и нарастанием побочных эффектов, таких, как нейро- и миело-токсичность.

Расчеты показали, что до 95% индивидуальных различий в эффективности и токсичности цитостатиков могут быть генетически обусловленными. Изучением таких генетически

запрограммированных различий в реакциях организма на лекарственные средства занимается фармакогенетика — дисциплина на стыке фармакологии и медицинской генетики, сложившаяся в 50-х годах и в последнее десятилетие переживающая бурное развитие.

Фармакогенетические исследования в химиотерапии уже дали первые практические результаты, относящиеся к таким препаратам, как меркаптопурин, иринотекан, а также фторурацил и его производные. Однако фармакогенетика препаратов платины изучена недостаточно — несмотря на многочисленные работы, опубликованные за последнее десятилетие, целостная картина пока не сформировалась (в отличие от упомянутых выше цитостатиков). Это связано со сложностью метаболизма и механизма действия цисплатина и его аналогов, что требует одновременного исследования многочисленных генов, а также с многообразием схем, в которые входят эти препараты, — что затрудняет подбор однородных групп больных. В то же время выявление прогностических факторов, позволяющих предсказать эффективность и токсичность препаратов платины, способно существенно улучшить результаты химиотерапии большинства солидных опухолей.

Производные платины — цисплатин, карбоплатин и оксалипла-тин — являются одними из наиболее активных цитостатиков и входят в схемы химиотерапии большинства злокачественных новообразований, прежде всего эпителиального происхождения: таких, как рак яичников, легкого, толстой кишки, опухоли головы и шеи. Однако наряду с высокой активностью эти препараты характеризуются значи-

тельной токсичностью, вызывая в первую очередь тошноту и рвоту, миело-, нейро- и нефротоксическое действие. И если тошнота и рвота достаточно успешно преодолеваются с помощью современных проти-ворвотных препаратов, то другие осложнения в значительной мере ограничивают возможности химиотерапии, приводя к снижению дозы, а зачастую и отмене препарата. Как показывает клинический опыт, одни больные переносят стандартные дозы препаратов платины вполне удовлетворительно, для других же они оказываются слишком токсичными.

Представленная работа посвящена фармакогенетике цисплатина и направлена на поиск генетических маркеров эффективности и токсичности этого столь важного цитостатика. Предпосылкой для нее стал опыт отделения химиотерапии РОНЦ РАМН, указывающий на существенные этнические (то есть генетически обусловленные) различия в переносимости химиотерапии. В частности, проведенный нами сравнительный анализ результатов использования цисплатина при раке яичников у женщин славянского происхождения и якуток показал, что побочные эффекты у якуток возникали достоверно чаще, тогда как частота ремиссий была ниже.

Цель исследования

Поиск генетических маркеров, позволяющих предсказать эффективность и токсичность цисплатина при лечении рака яичников, с целью оптимизации результатов лечения путем индивидуального назначения химиотерапии на основе данных генетического тестирования.

Задачи исследования

1. Изучить корреляцию полиморфизма генов глутатион-Б-грансфераз (вШ!, бЭТМ/, 6ЖШЗ, в£П>1 и 05777) с токсичностью и эффективностью цисплатина у больных раком яичников.

2. Изучить корреляцию полиморфизма генов, кодирующих белки репарации ДНК СЕЛСС1, XR.CC!, ХРП) с токсичностью и эффективностью лечения в той же группе больных.

Научная новизна

Влияние полиморфизма генов, отвечающих за репарацию ДНК, на результаты химиотерапии при раке яичников практически не изучалось. Хотя значение полиморфизма генов глутатион-Б-трансфераз для эффективности цисплатина уже исследовалось в ряде работ, однако все они были ретроспективными и имели ряд недостатков. Настоящее исследование является одной из немногих проспективных работ, посвященных фармакогенетике цисплатина, а также первой попыткой одновременно проанализировать столь обширный спектр полиморфизмов с потенциальным влиянием на результаты химиотерапии. Более того, это первое исследование, в котором систематически изучается связь полиморфизма указанных генов с различными побочными действиями химиотерапии (12 полиморфизмов для 8 генов).

Научно-практическая значимость работы

Настоящее исследование направлено на изучение генетического полиморфизма как фактора, способного в значительной мере обуславливать эффективность и токсичность цисплатина при раке яичников (в составе стандартной схемы СР: цисплатин 100 мг/м2 + цикло-фосфамид 600 мг/м2) Не ставя перед собой задачу выработать конкретные рекомендации для клинического применения, оно призвано очертить круг фармакогенетических маркеров (полиморфных локу-сов), определение которых могло бы в дальнейшем содействовать выработке индивидуального подхода к использованию цисплатина На основании генетического анализа цисплатин не будет назначаться больным, у которых вероятность эффекта слишком низка, а также больным с повышенным риском тяжелых осложнений. В результате можно рассчитывать, что результаты лечения в оставшейся группе окажутся лучше при меньшем риске осложнений. В перспективе полученные данные могут быть перенесены на другие локализации злокачественных новообразований, где используется цисплатин. Кроме того, подобный подход может оказаться плодотворным в отношении других цитостатиков, что позволит осуществлять комплексный подход к выбору схемы химиотерапии на основе генетического тестирования.

Структура и объем работы

Диссертация представлена на 107 страницах, разделена на введение, 4 главы (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), заключение и выводы. Работа дополнена 9 таблицами и проиллюстрирована 26 рисунками. Перечень использованной литературы включает 128 источников на русском и английском языках

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены 23 ноября 2007 г. на совместной научной конференции отделений химиотерапии, клинической фармакологии и химиотерапии, химиотерапии и комбинированного лечения злокачественных опухолей, отделения изучения новых противоопухолевых лекарств, гинекологического отделения, отделения опухолей женской репродуктивной системы и лаборатории клинической онкогенетики РОНЦ РАМН.

По теме диссертации опубликованы 3 печатные работы и сделаны 2 презентации на научных конференциях (Париж, 2005; Барселона, 2007).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клиническая часть исследования проводилась на базе отделения химиотерапии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. Лечение проводили у женщин 18—65 лет с верифицированным раком яичников, независимо от стадии, ранее не получавших химио- или лучевую терапию и не имеющих тяжелых сопутствующих заболеваний. Перед началом лечения больные сдавали кровь для генетического анализа.

Химиотерапию проводили по схеме СР: циклофосфамид 600 мг/м2 + цисплатин 100 мг/м2, внутривенно каждые 3 недели Всем больным планировалось 6 циклов химиотерапии, лечение прекращали раньше в случае прогрессирования или тяжелых побочных действий. В случае неоадъювантной химиотерапии делали перерыв для операции, после чего продолжали химиотерапию по прежней схеме.

Побочные действия химиотерапии были оценены по стандартным критериям ВОЗ/NCI. Регистрации подлежали все побочные явления, однако особо выделялись следующие параметры нейтропения, анемия, тромбоцитопения, нефротоксичность, ототоксичность, рвота.

Эффективность лечения оценивали по 3 параметрам, частоте ремиссий, времени до прогрессирования и общей выживаемости

Больные, у которых достигалась полная ремиссия, после завершения б циклов химиотерапии переходили на этап динамического наблюдения, включавший контрольные обследования каждые 3 мес. При частичной ремиссии или стабилизации тактику определяли индивидуально (большинству больных была рекомендована химиотерапия 2-й линии). В случае прогрессирования дальнейшее лечение проводили вне рамок настоящего исследования. Эффективность 2-й или последующих линий химиотерапии специально не оценивали, регистрировали лишь наличие таксанов. Все больные были прослежены на предмет общей выживаемости.

Генетические исследования проводили в Институте молекулярной генетики РАН. Они включали выделение ДНК из цельной крови и определение полиморфных аллелей генов глутатион-8-транс-фераз: GSTP1 (Не105 Val и Ala114Val), GST Al (-69C/T), GSTM1 и GSTT1 (делеции генов), GSTM3 (делеция 3 нуклеотидов в интроне), и генов, кодирующих белки репарации ДНК: ERCC1 (118С/Т и С8092А), XPD (Asp312Asn и Lys751Gln) и XRCC1 (Arg194Trp и Arg399Gln). Для этого использовали амплификацию ДНК с помощью полимеразной цепной реакции, после чего реакционную смесь обрабатывали рестриктазами и далее оценивали различия длин рестрикционных фрагментов путем электрофореза в 2,5%-ном агарозном геле.

На завершающем этапе клинические данные были сопоставлены с результатами генетического анализа По каждому из изученных полиморфизмов больных распределяли в зависимости от генотипа на 2 группы, которые сравнивали между собой по описанным выше параметрам эффективности и токсичности химиотерапии.

Для статистической обработки данных использовался пакет программ STATISTICA® 6.0. Достоверность различий оценена с помощью критерия %2, в случае малых выборок рассчитывался точный критерий Фишера. Различия считались достоверными при р < 0,05. Кривые выживаемости были построены по методу Каплан—Майера, для сравнения между группами использовался критерий log rank.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клинические данные

Лечение получили 104 больных в возрасте от 23 до 65 лет (медиана — 52 года). Общие сведения о них представлены в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика больных_

Параметр Число больных Доля, %

Стадия болезни

1ст. 13 12,5

Пет. 7 6,7

III ст. 74 71,2

IV ст 10 9,6

Морфология опухоли

Серозная аденокарцинома 82 78,9

Муцинозная аденокарцинома 7 6,7

Аденокарцинома, БДУ 11 10,6

Светлоклеточный рак 2 1,9

Рак, БДУ 2 1,9

Варианты химиотерапии

Неоадъювантная 32 30,8

Адъювантная 21 20,2

Лечебная 51 49

Всего было проведено 506 курсов химиотерапии Побочные действия химиотерапии представлены в таблице 2. У 47 больных они послужили причиной снижения дозы цисплатина или его полной отмены, основными причинами служили ототоксичность и нефротоксичность. Удлинение интервалов между курсами потребовалось у 54 больных, причем у 42 из них — в 2 и более циклах. Лишь 37 больных (36%) переносили лечение достаточно хорошо, и у них не потребовалось ни снижения дозы цисплатина, ни его отмены из-за токсичности, ни удлинения интервалов в 2 и более циклах. 27 из этих 37 больных получили все запланированные 6 циклов химиотерапии.

Для изучения корреляции генотипов с побочными действиями химиотерапии все степени токсичности были разделены на две групп-пы, соответствующие хорошей и плохой переносимости (табл. 3)

Таблица 2

Основные побочные проявления химиотерапии по схеме СР у _больных раком яичников (число случаев и %)*_

Виды токсичности Степени тяжести

0 1 2 3 4

Нейтропения 7 (6,7%) 11 (10,6%) 27 (26%) 41 (39,4%) 16 (15,4%)

Анемия 5 (4,8%) 43 (41,3%) 47 (45,2%) 6 (5,8%) 2 (1,9%)

Тромбоцитопения 87 (83,7%) 11 (10,6%) 3 (2,9%) 1 (1%) 1 (1%)

Рвота 4 (3,8%) 26 (25%) 48 (46,2%) 26 (25%) 0

Нефротоксичность 67 (64,4%) 32 (30,8%) 3 (2,9%) 1 (1%) 0

Ототоксичность 62 (59,6%) 14 (13,5%) 18 (17,3%) 6 (5,8%) 0

Нейропатия 25 (24%) 34 (32,7%) 26 (25%) 2 (1,9%) 0

*У отдельных больных некоторые побочные действия оценить не удалось.

Таблица 3

Деление степеней токсичности на 2 группы_

Побочные действия Степени токсичности, соответствующие хорошей переносимости Степени токсичности, соответствующие плохой переносимости

Нейтропения 0+1+2 3+4

Анемия 0+1 2 + 3 + 4

Тромбоцитопения 0 Все

Рвота 0+1 +2 3 + 4

Нефротоксичность 0 Все

Ототоксичность 0 Все

Нейротоксичность 0 + 1 2 + 3

Непосредственную эффективность лечения оценивали у больных, получавших неоадъювантную и лечебную химиотерапию. В группу для оценки вошли 83 больных Всего было зарегистрировано 37 полных ремиссий (44,6%) и 32 частичных ремиссии (38,6%), в 6 случаев наблюдалась стабилизация опухолевого процесса (7,2%) и в 8 — прогрерсирование (9,6%). Таким образом, общая эффективность (доля полных и частичных ремиссий) составила 83,2%, контроль роста опухоли достигнут у 75 (90,3%) больных

Отдаленные результаты (время до прогрессирования и выживаемость) оценены во всей группе, однако 4 больные выбыли из-под наблюдения менее чем через 6 мес. от начала химиотерапии Медиана времени наблюдения составила 32 месяца. К моменту анализа про-грессирование было зарегистрировано у 63 больных, 27 больных умерли Медиана времени до прогрессирования равнялась 11,6 мес., медиана выживаемости не достигнута. Трехлетняя выживаемость без прогрессирования составила 27%, 3-летняя общая выживаемость — 55% (рис 1).

Данные генетического тестирования

Результаты генотипирования всех 104 больных по перечисленным выше полиморфизмам генов глутатион-Б-трансфераз и белков репарации ДНК представлены в таблице 4.

12 18 24 30 36 42 Время от начала химиотерапии, мес.

18 24 30 36 42 Время от начала химиотерапии, мес.

Рисунок 1. Отдаленные результаты химиотерапии рака яичников по схеме СР во всей группе больных. А — время до прогрессирования, Б — выживаемость.

Таблица 4

Распределение больных по генотипам_

Полиморфизм Генотип Число больных

GSTP1 IleiU5Val Ue/Ile Ile/Val Val/Val 41 (39,4%) 53 (51,0%) 10 (9,6%)

GSTP1 Ala114Val Ala/Ala Ala/Val Val/Val 78 (75,0%) 26 (25,0%) 0

GST Al -69C/T C/C C/T T/T 44 (42,3%) 48 (46,2%) 12(11,5%)

GSTM1 del -/+/-, +/+ 47 (45,2%) 57 (54,8%)

GSTM3 del ins/ins ins/del del/del 84 (80,8%) 15 (14,4%) 5 (4,8%)

GSTT1 del -/+/-, +/+ 18 (17,3%) 86 (82,7%)

ERCC1 118C/T C/C C/T T/T 15 (14,4%) 46 (44,2%) 43 (41,4%)

ERCC1 C8092A C/C C/A A/A 61 (58,6%) 37(35,6%) 6 (5,8%)

XPD Aspjl2Asn Asp/Asp Asp/Asn Asn/Asn 34 (32,7%) 47 (45,2%) 23 (22,1%)

XPD Lys/MGln Lys/Lys Lys/Gln Gln/Gln 28 (26,9%) 54 (51,9%) 22 (21,2%)

XRCC1 ArgmTrp Arg/Arg Arg/Trp Trp/Trp 94 (90,4%) 10 (9,6%) 0

XRCC1 ArgjyyGln Arg/Arg Arg/Gin Gln/Gln 48 (46,2%) 46 (44,2%) 10(9,6%)

Корреляция клинических и генетических данных

Полиморфизм генов глутатион-8-трансфераз оказался сопряжен с рядом клинически значимых параметров эффективности и токсичности цисплатина при раке яичников.

Связь между результатами химиотерапии и генотипом оказалась наиболее сильной для полиморфизма GSTP1 Ile105Val. Время до прогрессировать у женщин с генотипом Ile/Ile было достоверно выше, чем в остальной группе больных (log-rank test, р = 0,00027; рис. 2А). Особенно бросается в глаза расхождение кривых после 8 месяцев. Расчетная медиана времени до прогрессирования в группе Ile/Ile составляет 23,5 месяцев, то есть примерно вдвое больше, чем для группы в целом. В группе Ile/Val она составила 10 месяцев, в группе Val/Val — лишь 7 мес. Медиана общей выживаемости в группе Ile/Val составила 25 месяцев, в других группах она не достигнута. Хотя различия в выживаемости между группами Ile/Ile и Ile/Val статистически достоверны (log-rank test, р = 0,04), при объединении групп Ile/Val и Val/Val значение р возрастает и статистическая значимость утрачивается. В любом случае, очевидна тенденция в пользу женщин с генотипом ИеЛ1е (log-rank test, р = 0,14); расхождение кривых начинается на полгода позже, чем в случае времени для прогрессирования, и становится заметным к 2 годам (рис. 2Б).

В то же время, зависимость между частотой ремиссий и генотипом практически отсутствовала: у больных с генотипом Ile/Ile полные ремиссии встречались в 50% случаев, тогда как в остальной группе больных (генотипы Ile/Ile и Val/Val) полные ремиссии наблюдались в 42% случаев (р = 0,48 для %2).

Частота побочных действий не показала статистически значимой корреляции с полиморфизмом GSTP1 Ile105Vaí. Обращает на себя внимание лишь тенденцию к более выраженной ототоксичности у больных, гомозиготных по аллелю 105Val. снижение слуха развилось у 35% больных с генотипами Ile/Ile и Ile/Val по сравнению с 67% больных с генотипом Val/Val (р = 0,063 для %2, р = 0,08 для двустороннего точного критерия Фишера).

О 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 Время от начала химиотерапии, мес.

Б 1

р = 0,14 2

12

48

54

60

18 24 30 36 42 Время от начала химиотерапии, мес.

Рисунок 2. Отдаленные результаты химиотерапии рака яичников в зависимости от полиморфизма GSTP1 IleI05Val. А — время до прогрессирования, Б — выживаемость. 1 — больные с генотипом Ile/Ile, 2 — больные с генотипами Ile/Val и Val/Val.

Зависимости между эффективностью химиотерапии и полиморфизмом GSTP1 Ala114Val отмечено не было Этот полиморфизм не был сопряжен и с риском возникновения побочных действий, за исключением тенденции к снижению риска тромбоцитопении у больных с генотипом Ala/Val: 4% (1 из 24) по сравнению с 19% (15 из 79) при генотипе Ala/Ala (р = 0,08 для %2, р = 0,11 для двустороннего точного критерия Фишера).

Делеция генов GSTM1 и GSTT1 и изученный полиморфизм гена GSTM3 не были ассоциированы с результатами лечения, однако оказывали существенное влияние на переносимость химиотерапии.

Полиморфизм GSTM1 del показал выраженную корреляцию с риском угнетения кроветворения (рис. 3). Делеция этого гена была сопряжена с резким снижением частоты тромбоцитопении: при наличии одного или двух аллелей этого гена частота тромбоцитопении (все степени) составляла 25% по сравнению с 4% при делеции обоих аллелей (р = 0,0038 для %2, р = 0,0051 для двустороннего точного критерия Фишера). Похожая корреляция наблюдалась в отношении анемии. риск анемии 2-й и более степени у больных с делецией составил 36% по сравнению с 64% при наличии хотя бы одного аллеля GSTM1 (р = 0,0025 для х2, Р = 0,0031 для двустороннего точного критерия Фишера). Кроме того, делеция сопровождалась заметной тенденцией к менее выраженной нейтропении (р = 0,2 для %2) и рвоте (р = 0,09). Корреляция с риском ототоксичности и нефротоксичностью не прослеживалась (р = 0,54 и р = 0,81).

Полиморфизм гена GSTM3 был сопряжен с риском тромбоцитопении: у носителей делеционного аллеля она возникала в 37% случаев (50% у гомозигот, 33% у гетерозигот) по сравнению с 11% в его отсутствие (р = 0,0045 для %2, р = 0,01 для двустороннего точного критерия Фишера). В случае анемии эти показатели составили соответственно 80% (75% у гетерозигот и 100% у гомозигот) и 46% (р = 0,006 для х2, Р = 0,0065 для двустороннего точного критерия Фишера). Похожая тенденция наблюдалась в отношении таких побочных явлений, как ототоксичность, нефротоксичность и тяжелая нейтропения, но различия были далеки от уровня статистической значимости (соответственно, р = 0,22, 0,21 и 0,3). Корреляции с выраженностью рвоты не наблюдалось (р = 0,5).

4 5 6

Побочные действия

■ GSTM1 del (-) □ GSTM1 N (+)

Рисунок 3. Частота клинически значимых побочных действий в зависимости от полиморфизма GSTM1 del. 1 — тромбоцитопения, 2 — анемия, 3 — нейтропения, 4 — рвота, 5 — ототоксичность, б — нефротоксичность.

Наличие делеции гена GSTT1 сопровождалось повышенным риском тяжелой рвоты: она возникла у 9 из 18 (50%) больных с деле-цией по сравнению с 17 из 86 (20%) при наличии хотя бы одного нормального аллеля гена GSTT1 (р = 0,011 для х2, р = 0,014 для двустороннего точного критерия Фишера). Корреляции с другими побочными реакциями не обнаружено.

Полиморфизм гена GSTAJ -69С/Т не был сопряжен с вероятностью полной ремиссии (р = 0,66) и временем до прогрессирования (р = 0,95), однако отмечалась выраженная тенденция к улучшению общей выживаемости у носительниц Т-аллеля (р = 0,08; рис. 4). Различия в выживаемости между гомозиготами (генотипы С/С и Т/Т) достигли уровня статистической значимости (log-rank test, р = 0,044). Этот полиморфизм не коррелировал с большинством изученных параметров токсичности химиотерапии, можно лишь отметить тенденцию к более выраженной нейтропении у носителей генотипа С/Т по сравнению с гомозиготами по аллелям обоих типов (р = 0,09 для х2)-

Время от начала химиотерапии, мес

1,0 0,9 0,8 0,7

S

£ 0,6 Л

I 0.5

I

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

1 vs 3 р = 0,044

12

48

54

60

18 24 30 36 42 Время от начала химиотерапии, мео

Рисунок 4. Отдаленные результаты химиотерапии рака яичников в зависимости от полиморфизма GSTA1 -69С/Т. А — время до прогрес-сирования, Б — выживаемость. 1 — больные с генотипом С/С, 2 — больные с генотипом С/Т, 3 — больные с генотипом Т/Т.

Связь полиморфизма генов, кодирующих белки репарации ДНК, с эффективностью и токсичностью химиотерапии была менее выражена, чем в случае генов глутатион-8-трансфераз.

Изученные полиморфизмы гена XRCC1 (X-ray cross-complementing 1) — Arg I94Trp и Arg399Gln — не были ассоциированы ни с эффективностью, ни с токсичностью химиотерапии.

В случае полиморфизма XPD (Xeroderma pigmentosum D) Asp312Asn отмечалась тенденция к уменьшению частоты полных ремиссий у больных с генотипом Asp/Asp (31% по сравнению с 51% при других генотипах, р = 0,09 для , р = 0,1 для двустороннего точного критерия Фишера; рис. 5). Тем не менее, корреляция между генотипом и временем до прогрессировать или выживаемостью не прослеживалась (рис. 6). Аналогичная тенденция наблюдалась и в случае полиморфизма XPD Lys75IGln: 30% полных ремиссий при генотипе Lys/Lys и 49% — при генотипах Lys/Gln и Gln/Gln (р = 0,13 для х , Р = 0,2 для двустороннего точного критерия Фишера).

Рисунок 5. Эффективность химиотерапии рака яичников по схеме СР в зависимости от полиморфизма ХРО Азр312Азп.

25 П

ШПолные эффекты

□ Другие исходы

Asp/Asp Asp/Asn Asn/Asn Генотипы

12 18 24 30 36 42 48 54 60, Время от начала химиотерапии, мес.

■ Агр/Авр Аэр/Лэп

■ Абл/АЗП

12 18 24 30 36 42 48 Время от начала химиотерапии, мес.

»Авр/Авр 1 Авр/Аэп ■ Авп/Авп

Рисунок 6. Отдаленные результаты химиотерапии рака яичников в за-

висимости от полиморфизма ХРВ А5р3 '2А8п. А — время до прогрессирования, Б — выживаемость.

Кроме того, для полиморфизма XPD Asp312Asn отмечена более выраженная гематологическая токсичность у носителей генотипа Asp/Asn. Тяжелая нейтропения развилась у 69% больных с таким генотипом по сравнению с 50% при генотипе Asp/Asp и 45% при генотипе Asn/Asn (р = 0,036 для %2, р = 0,045 для двустороннего точного критерия Фишера). В случае тромбодитопении различия были еще заметнее: ее частота составила 24% при генотипе Asp/Asn, 6% при Asp/Asp и 10% при Asn/Asn (сравнение гетерозигот с остальными генотипами: р = 0,017 для х2, Р = 0,027 для двустороннего точного критерия Фишера). Похожая картина наблюдалась и в отношении анемии, но различия не достигли уровня статистической значимости (клинически значимая анемия возникала у 63% больных с генотипом Asp/Asn по сравнению с 35% при генотипе Asp/Asp и 55% при генотипе Asn/Asn, р = 0,063). Какой-либо корреляций с негематологической токсичностью (рвотой, ото- и нефротоксичностью) не прослеживалось.

Полиморфизм XPD Lys751Gln не коррелировал ни с одним из изученных параметров токсичности химиотерапии.

Подобным же образом, полиморфизмы гена ERCC1 (Excision repair cross-complementing 1) — 118С/Т и С8092А — не влияли на частоту ремиссий и отдаленные результаты лечения. Связь генотипа с большинством побочных проявлений химиотерапии также была незначительной, за исключением нефротоксичности (рис. 7). При генотипе ERCC1118 С/Т риск этого осложнения составил 47% по сравнению с 26% при генотипе Т/Т и 27% при генотипе С/С; сопоставление больных с генотипом С/Т и остальной группы дает статистически значимые различия (р = 0,029 для критерия %2, р = 0,037 для двустороннего точного критерия Фишера). В случае полиморфизма ERCC1 С8092А различия были еще заметнее, функция почек нарушалась у 53% больных с генотипом С/А по сравнению с 26% при генотипе С/С и 17% при генотипе А/А (р = 0,02; при сравнении гетерозигот с остальной группой р = 0,0054 для %2, р = 0,0088 для двустороннего точного критерия Фишера).

60i

118C/T C8092A Генотипы

Рисунок 7. Частота нефротоксичности на фоне химиотерапии рака яичников по схеме CP в зависимости от полиморфизма гена ERCC1 (118С/ТиС8092А).

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные данные показывают, что среди исследованных генов наибольшее значение для прогноза возможной эффективности цисплатина при раке яичников имеют полиморфизмы GSTP1 Ile10SVal и GSTA1 -69С/Т. Хотя корреляция этих полиморфизмов с вероятностью ремиссии не достигает уровня статистической значимости, тенденция к увеличению частоты полных ремиссий при генотипе Ile/Ile соответствует увеличению времени до прогрессирования (различия статистически значимы) и тенденции к увеличению общей выживаемости.

Интересно, что если для больных с генотипами Ile/Val и Val/Val кривая выживаемости без прогрессирования продолжает снижаться после 2 лет, приближаясь к нулевой отметке, то в случае генотипа Ile/Ile наблюдается выход на плато после полутора—двух лет (рис. 2). Таким образом, наличие последнего генотипа может указывать на относительно благоприятный долгосрочный прогноз. В результате примерно у половины женщин с генотипом GSTP1 Ile/Ile можно рассчитывать на стойкую полную ремиссию, тогда как при генотипах Ile/Val и Val/Val, даже в случае полной ремиссии, практически все больные обречены на рецидив.

Различия в общей выживаемости в пользу генотипа Ile/Ile не достигли уровня статистической значимости, но это может объясняться просто недостаточно длительным периодом наблюдения: медиана выживаемости не достигнута ни в одной из групп. Тем не менее, расхождение кривых достаточно существенно и нарастает со временем.

Приведенные результаты хорошо согласуются с экспериментальными данными о повышенной способности фермента, кодируемого аллелем GSTPlmYal, к инактивации цисплатина. Можно предположить, что у больных, несущих аллель GSTPlwsVai, целесообразно использование в 1-й линии химиотерапии цитостатиков, метаболизм которых не связан с глутатион-Б-трансферазой (таксаны, гемци-табин, топотекан), или препаратов, в отношении которых фермент, кодируемый этим аллелем, проявляет пониженную активность (ан-трациклины, алкилирующие средства).

Заслуживают внимания литературные данные о повышенной чувствительности к оксалиплатину у носителей аллеля

GSTpi iosVaL

Противоречивые данные о влиянии аллелей GSTPJ на результаты химиотерапии цисплатином и оксалиплатином, по-видимому, объясняются различиями в механизме цитотоксичности этих препаратов. В результате оксалиплатин может оказаться удачной альтернативой цисплатину у носителей аллеля GSTP/105Val. Конечно, такая гипотеза требует экспериментальной и клинической проверки.

Несколько неожиданным результатом оказалось близкая к уровню статистической значимости ассоциация между генотипом GSTA1 -69Т/Т и выживаемостью, тогда как корреляции с частотой полных ремиссий и временем до прогрессирования выявлено не было. Впрочем, выявленная ассоциация требует дополнительной проверки, так как за счет множественных сравнений может оказаться статистическим артефактом.

Следует отметить корреляцию изученных полиморфизмов с риском возникновения побочных действий цисплатина. Обращает на себя внимание связь нормального аллеля гена GSTM1 и делеционно-го аллеля гена GSTM3 с ухудшением переносимости химиотерапии, особенно в отношении анемии и тромбоцитопении (рис. 3). Теоретически, можно было бы ожидать меньшей токсичности у больных с более высокой активностью фермента, однако в действительности наблюдалась обратная картина. Без дополнительных лабораторных и клинических исследований сложно найти объяснение этому факту.

Можно лишь предположить, что глутатион-Я-трансферазы семейства ц обладают сравнительной низкой активностью в отношении циспла-тина, и нормальная или усиленная экспрессия соответствующих генов ведет к компенсаторному уменьшению экспрессии генов глута-тион-Б-трансфераз из других семейств (например, бйТРД лучше защищающих клетки от действия цисплатина. Насколько можно судить по доступной литературе, это первое описание связи полиморфизма генов (ЗЖГМ/ и МЗ с угнетением кроветворения.

Интересной находкой является связь выраженности рвоты с де-лецией гена 08ТТ1. Впрочем, клиническое значение этого наблюдения ограничено: 20% риск тяжелой рвоты у больных с нормальным аллелем Сг5Т7У не позволяет отказаться от профилактического назначения противорвотных средств. Впрочем, при делеции этого гена может быть показана более интенсивная поддерживающая терапия.

Найденная корреляция между полиморфизмом гена ХРВ Аэр^Авп и угнетением кроветворения может быть недостоверной (прежде всего в отношении нейтропении и анемии) ввиду множественности сравнений. Кроме того, сложно объяснить усиление токсичности у гетерозигот при лучшей переносимости у гомозигот по обоим аллелям. В любом случае, эта ассоциация намного слабее, чем в случае генов глутатион-Э-трансфераз, и едва ли имеет большое клиническое значение.

Связь между полиморфизмом тежЕВ.СС1 и нефротоксичностью (рис. 7) потенциально может иметь большее клиническое значение ввиду опасности этого осложнения и отсутствия других факторов, позволяющих предсказать его. Однако теоретическое объяснение этого наблюдения также отсутствует, а потому оно требует проверки при анализе других групп больных.

Вопреки ожиданиям, нам не удалось показать корреляцию между эффективностью химиотерапии и полиморфизмом генов, кодирующих белки репарации ДНК. По мнению ряда исследователей, полиморфизм этих генов может оказывать двоякое влияние на результаты химиотерапии. С одной стороны, снижение активности систем репарации будет усиливать повреждение ДНК, и можно ожидать более выраженного противоопухолевого эффекта. Однако в силу того, что реакция опухолевых клеток на эти повреждения ослаблена (в частности, за счет мутаций, препятствующих апоптозу), усиление эффекта может быть незначительным, в то же время в клетках будут

2 S

накапливаться дополнительные мутации, что способно повысить агрессивность выживших клонов. В результате суммарное влияние этих полиморфизмов может оказаться непредсказуемым и зависеть от множества различных факторов. Кроме того, за счет ослабления репарации ДНК в здоровых тканях может возрастать токсичность химиотерапии, что потребует снижения доз и в итоге ослабит воздействие на опухоль.

Возможно, для выявления прогностической значимости генов, кодирующих белки репарации ДНК, необходим одновременный анализ полиморфных аллелей более широкого спектра генов, изучение гаплотипов, а также сочетание фармакогенетических исследований с количественным определением экспрессии генов в опухолевой ткани.

В перспективе, можно рассчитывать, что на основе результатов генетического тестирования будет подбираться индивидуальная схема химиотерапии, включающая оптимальное сочетание цитостатиков и их доз, которая позволит достичь у данного больного максимального лечебного эффекта при вполне переносимых побочных явлениях

Результаты, полученные в представленной работе, позволяют обобщить сведения о фармакогенетике цисплатина при раке яичников и закладывают основу для дальнейших исследований, направленных на выработку индивидуального подхода к назначению химиотерапии

ВЫВОДЫ

1. У больных раком яичников, получающих цисплатин, полиморфизм гена GSTP1 Ile105Val может иметь большое прогностическое значение. Наличие аллеля !05Val сопровождалось снижением медианы времени до прогрессирования: в группе больных с генотипами Val/Val и Ile/Val она составила 9 месяцев, тогда как при генотипе 11еД1е — 24 месяца (log-rank test, р = 0,00027) Аналогичная тенденция наблюдалась в отношении выживаемости: в группе Val/Val и Ile/Val трехлетняя выживаемость составила 49% по сравнению с 66% в группе Ile/Ile (log-rank test, р = 0,14).

2. Полиморфизм гена GSTA1-69С/Т может иметь значение для выживаемости: при генотипе Т/Т трехлетняя выживаемость достигла 86% по сравнению с 57% при генотипе С/Т и 48% при генотипе С/С (р = 0,07); корреляция между этим полиморфизмом и временем до прогрессирования не прослеживалась.

2в

3. Полиморфизм генов GSTM1, GSTM3 и GSTT1 не был ассоциирован с результатами химиотерапии, однако влиял на риск побочных действий Делеция гена GSTMI сопровождалась снижением риска развития клинически значимой анемии (36% при делеции по сравнению с 64% у носителей гена GSTMI, р = 0,0025) и тромбоцитопении (соответственно 4% и 25%, р = 0,0051) В то же время у носителей аллеля GSTM3 del (интронная делеция) эти осложнения встречались чаще, Делеция гена GSTT1 была сопряжена с повышенным риском тяжелой рвоты (50% при делеции по сравнению с 20% при нормальном аллелей =0,011).

4. Изученные полиморфизмы генов, кодирующих белки репарации ДНК (ERCCI, XPD, XRCC1), не показали корреляции с эффективностью химиотерапии цисплатином при раке яичников.

5. Корреляция между полиморфизмом генов, кодирующих белки репарации ДНК, и побочными действиями цисплатина сравнительно невысока. Полиморфизм ERCCI С8092А был сопряжен с риском не-фротоксичности (53% при генотипе С/А по сравнению с 26% при С/С и 17% при А/А, р = 0,02). Полиморфизм XPD Asp312Asn коррелировал с риском тромбоцитопении (24% при генотипе Asp/Asn по сравнению с 6% при Asp/Asp и 10% при Asn/Asn, р = 0,017).

Список работ, опубликованных в соавторстве по теме диссертации

1. Моисеев А. А., Хрунин А. В. Павлюшина Е. М, Пирогова Н. А., Горбунова В. А., Лимборская С. А. Полиморфизм генов глута-тион-Б-трансфераз и результаты химиотерапии рака яичников. Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, т. 19, №1, 2008 г, стр. 59-63.

2. Moisseev A. A., Khrunin А. V., Pirogova N. A., Gorbounova V. А., Limborska S. A. Polymorphisms in glutathione S-transferase genes and outcome of cisplatin-based chemotherapy in ovarian cancer. 14th European Cancer Conference, Barcelona, 2007; abstract 520.

з Moisseev A. A., Gorbounova V. A., Ivanova F. G., Orel N. F., Breder V. V. Comparative efficacy and toxicity of cisplatin and cyclophosphamide chemotherapy in Slavic and Yakut women with ovarian cancer. 16th International Congress on Anticancer Treatment, Paris, 2005; poster presentation.

Подписано в печать11 08 г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз. Заказ Ц 88

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им Н.Н Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш, 24

Успехи химиотерапии злокачественных новообразований относятся к наиболее выдающимся достижениям внутренней медицины последних 50 лет. С помощью цитостатиков появилась возможность излечивать опухоли яичка, хориокарциному, лимфомы и лейкозы, на многие годы продлевать жизнь при раке молочной железы и яичников. Одновременно изучалась молекулярная биология опухолей, синтезировались новые препараты, расширялся круг нозологий, подлежащих химиотерапии, разрабатывались новые схемы и подходы к лечению, а также методы поддерживающей терапии. Это бурное развитие сопровождалось неуклонным улучшением результатов химиотерапии: выживаемость увеличивалась, в то же время переносимость лечения, несмотря на усложнение схем, в целом даже улучшалась [Калабрези, 2006; Переводчикова, 2005].

Однако тенденции последних нескольких лет заставляются задуматься о том, что эффективность химиотерапии постепенно выходит на плато: за редким исключением, новые препараты уже не дают существенного прироста выживаемости. В то же время кратно возрастает стоимость лечения, что сильно затрудняет широкое применение последних разработок на практике [Lyman, 2007; Main, 2006; Tappenden, 2007].

Основные усилия современной онкофармакологии сосредоточены на изучении молекулярно-генетических особенностей опухолевого роста и поиске препаратов, воздействующих на те или иные молекулярные «мишени». Благодаря такому подходу разработано практически все последнее поколение противоопухолевых средств. С этими препаратами связывались большие надежды — вплоть до полного излечения злокачественных новообразований. К сожалению, лишь в отдельных случаях новые препараты принципиально улучшили результаты лечения (ритуксимаб при некоторых лимфомах, има-тиниб при хроническом миелолейкозе и стромальных опухолях ЖКТ, трастузумаб при раке молочной железы с экспрессией HER2/neii) [Калабрези, 2006; Garattini, 2002]. По-видимому, в обозримом будущем сложно рассчитывать на появление универсальных препаратов, позволяющих кардинально улучшить результаты лечения основной массы онкологических больных [Arbiser, 2007].

В результате все большую актуальность для современной химиотерапии приобретает индивидуальный подход к подбору препаратов и их доз, направленный на повышение эффективности и уменьшение токсичности имеющегося арсенала противоопухолевых средств. Поскольку традиционные прогностические факторы не позволяют предсказать, какие препараты окажутся эффективными у данного больного, выбор схем химиотерапии носит в известной мере эмпирический характер, что чревато развитием лекарственной устойчивости и нарастанием побочных эффектов, таких, как нейро- и миелотоксичность. Соответственно, требуется поиск дополнительных критериев, указывающих на чувствительность (или устойчивость) опухоли к тем или иным цитостатикам и повышенный риск тех или иных осложнений.

Расчеты показали, что до 95% индивидуальных различий в эффективности и токсичности цитостатиков могут быть генетически обусловленными [Abraham, 2006; Efferth, 2005]. Такими генетически запрограммированными различиями в реакциях организма на лекарственные средства занимается фармакогенетика — дисциплина на стыке фармакологии и медицинской генетики, сложившаяся в 50-х годах и в последнее десятилетие переживающая бурное развитие [Evans, 2003; Gardiner, 2006; Relling, 2001].

Выводы

1. У больных раком яичников, получающих цисплатин, полиморфизм гена GSTP1 Не105 Val имеет большое прогностическое значение. Наличие аллеля 105Val сопровождалось снижением медианы времени до прогрессирования: при генотипах Val/Val и Ile/Val она составила 9 месяцев, тогда как при генотипе Ile/Ile — 24 месяца (log-rank test, р = 0,00027). Аналогичная тенденция наблюдалась в отношении выживаемости: при генотипах Val/Val и Ile/Val трехлетняя выживаемость составила 49% по сравнению с 66% при генотипе Ile/Ile (log-rank test, р = 0,14).

2. Полиморфизм гена GSTA1 -69С/Т может иметь значение для выживаемости: при генотипе Т/Т трехлетняя выживаемость достигла 86% по сравнению с 57% при генотипе С/Т и 48% при генотипе С/С (р = 0,07); корреляция между этим полиморфизмом и временем до прогрессирования не прослеживалась.

3. Полиморфизм генов GSTM1, GSTM3 и GSTT1 не был ассоциирован с результатами химиотерапии, однако влиял на риск побочных действий. Деле-ция гена GSTM1 сопровождалась снижением риска клинически значимой анемии (36% при делеции по сравнению с 64% у носителей гена GSTM1, р = 0,0025) и тромбоцитопении (соответственно 4% и 25%, р = 0,0051). В то же время у носителей аллеля GSTM3 del (интронная делеция) эти осложнения встречались чаще. Делеция гена GSTT1 была сопряжена с повышенным риском тяжелой рвоты (50% при делеции по сравнению с 20% при нормальном аллеле, р = 0,011).

4. Изученные полиморфизмы генов, кодирующих белки репарации ДНК (ERCC1, XPD, XRCC1), не показали корреляции с эффективностью химиотерапии цисплатином при раке яичников.

5. Корреляция между полиморфизмом генов, кодирующих белки репарации ДНК, и побочными действиями цисплатина сравнительно невысока. Полиморфизм ERCC1 С8092А был сопряжен с риском нефротоксичности (53% при генотипе С/А по сравнению с 26% при С/С и 17% при А/А, р = 0,02). Полиморфизм XPD Asp312Asn коррелировал с риском тромбоцитопении (24% при генотипе Asp/Asn по сравнению с 6% при Asp/Asp и 10% при Asn/Asn, р = 0,017).

Заключение

Исследование полиморфизмов устанавливает исходные генетические особенности организма (и опухоли как его порождения), но ничего не говорит о тех мутациях, которые возникли в процессе канцерогенеза, и поэтому позволяет лишь отчасти охарактеризовать индивидуальную чувствительность к цитостатикам. Другие подходы к индивидуальному выбору химиотерапии направлены на изучение собственно опухоли — это выявление тех или иных мутаций, определение экспрессии генов на уровне мРНК или белка и проч. [Fehrmann, 2007]. Первые работы были весьма многообещающими, но в дальнейшем исследователи столкнулись с рядом концептуальных и методологических трудностей, которые пока далеки от разрешения. В первую очередь это плохая воспроизводимость результатов: гены, повышенная экспрессия которых указывала на чувствительность или устойчивость к цитостатикам, в разных исследованиях оказывались различными: наборы из нескольких десятков и даже сотен генов совершенно не перекрывались. Кроме того, в большинстве случаев выявленные гены не имели прямого отношения к действию изучаемых препаратов [Minna, 2007; Pusztai, 2006; Tinker, 2006].

Существенными недостатками методов, направленных на непосредственное изучение опухоли, служат их трудоемкость и потребность в свежем опухолевом материале, тогда как изучение полиморфизмов — технически более простая задача, и для анализа требуется лишь несколько миллилитров крови. Разрабатываются микрочипы, позволяющие одновременно определять более 100 полиморфизмов, причем их стоимость сравнительно невелика [van den Akker-van Marie, 2006].

Очевидно, наиболее полную характеристику индивидуальной чувствительности опухоли к тем или иным цитостатикам можно получить лишь при сочетании описанных методов — путем одновременного определения как фармакогенетических особенностей организма, так и ключевых мутаций, свойственной конкретной опухоли. Интенсивность проводимых в настоящее время исследований позволяет рассчитывать на получение в обозримом будущем первых результатов, подходящих для клинического применения.

В перспективе, можно рассчитывать, что на основе результатов генетического тестирования будет подбираться индивидуальная схема химиотерапии, включающая оптимальное сочетание цитостатиков и их доз, которая позволит достичь у данного больного максимального противоопухолевого эффекта при вполне переносимых побочных явлениях.

Результаты, полученные в представленной работе, позволяют обобщить сведения о фармакогенетике цисплатина при раке яичников и закладывают основу для дальнейших исследований, направленных на выработку индивидуального подхода к назначению химиотерапии.