Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение естественных регуляторных Т-клеток и их молекулярного маркера FOXP3 и их молекулярного маркера FOXP3 в норме и при аллергии у детей



На правах рукописи

Донецкова Альмира Дмитриевна

ИЗУЧЕНИЕ ЕСТЕСТВЕННЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК И ИХ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКЕРА РОХРЗ В НОРМЕ И ПРИ АЛЛЕРГИИ У ДЕТЕЙ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

А втореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

хььи19

Москва, 2007

003165019

Работа выполнена в ГП ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России»

Научные руководители доктф медицинских наук, профессор

Александр Александрович Яршт

доктор медицинских наук, профессор Михаил Николаевич Ярцев

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Леонид Васильевич Ковалъчук

доктор медицинских наук, профессор Заира Григорьевна Кадагидзе

Ведущая организация ГУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени НФ Гамалеи РАМН»

Защита состоится « »2008 г в {¿¿^часов на

заседании совета по защите докторских' и "кандидатских диссертаций Д 208 017 01 в ГП ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу 115478, г Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп 2 Факс +7(499)617-10-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГП ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Автореферат разослан « >>01^/^7^^2008 г

Ученый секретарь совета

по защите докторских и кандидатских

диссертаций, доктор медицинских на>к

Л С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важную роль в предотвращении патологического иммунного ответа на собственные антигены организма и ограничении нежелательных форм иммунного ответа (на антигены тола, пищи и тд), играют регуляторные Т-клетки Наиболее полно изучены естественные регуляторные Т-клетки (Т^), маркерами которых служат мембранные молекулы С04. СБ25, СТЬА-4 и внутриклеточный транскрипционный фактор БОХРЗ Основной мишенью Тге§ служат хелперные Т-лимфоциты

Со времени открытия естественных регуляторных Т-клеток в 1995 г [5ака£исЬ1 Б а1, 1995] они неизменно находятся в центре внимания исследователей На международных иммунологических форумах им посвящается значительное число сообщений Они явтяготея предметом рассмотрения в многочисленных обзорных статьях Столь пристальное внимание исследователей к проблеме естественных регуляторных Т-клеток обусловлено не только важностью их функций, но и широким кругом практически значимых проблем, с которыми так или иначе связаны эти клетки Основным проявлением тотального дефицита регуляторных Т-ктеток является формирование полиспецифических аутоиммунных процессов с преимущественным поражением эндокринных органов и кишечника (1РЕХ-синдром) Еще одним следствием их дефицита является нарушение нормального течения беременности и невынашивание плода С другой стороны, избыточная активность регуляторных Т-клеток чревата повышением риска онкологических заболеваний и ослаблением противоинфекционной защиты

Изучение Тге§ ведется чрезвычайно интенсивно во всех основных иммунологических центрах мира. Это в равной степени относится к фундаментальной и прикладной составляющей исследований В последние годы четко определи тась направленность этих исследований на применение Treg с целью иммунотерапии аутоиммунных заболеваний, а также

3

предотвращения реакции трансплантат-против-хозяина при пересадках костного мозга (начаты клинические испытания). Исследование роли Тге§ в патогенезе аллергических заболеваний осуществляется в более ограниченном масштабе

Таким образом, актуальность тематики работы обусловлена важной и разносторонней ролью, которую играют Treg в физиологии и патологии иммунной системы, их ключевым местом в патогенезе многих заболеваний и возможностью их использования как средства иммунотерапии этих заболеваний

Цель работы: изучить содержание естественных регуляторных Т-клеток и закономерности экспрессии их молекулярного маркера БОХРЗ, а также ряда цитокинов, влияющих на экспрессию БОХРЗ или зависящих от этого фактора, в лимфоцитах крови в норме и при аллергии у детей

Задачи исследования.

1 Исследовать содержание естественных регуляторных Т-клеток и БОХРЗ в норме и при аллергии у детей в периоды обострения и ремиссии, определить их функциональную активность

2. Изучить влияние медикаментозного лечения (ингаляционных глюкокортикостероидов - ИГКС) на содержание Тге§

3. Оценить уровни цитокинов (1Ь-6, 1Ь-10, 1Ь-17 и ТСРР), влияющих на экспрессию БОХРЗ или зависящих от этого фактора

4 Изучить онтогенез естественных регуляторных Т-клеток и их молекулярного маркера БОХРЗ в норме и при формировании аллергии

5 Усовершенствовать методы культивирования Тге§, изучить возможность дифференцировки Tгeg из кроветворных и лимфоидных клеток-предшественников под влиянием эпителия тимуса

Научная новизна. Работа содержит новые данные о дефекте субпопуляции Treg у детей с аллергией Установлено, что при аллергических заболеваниях независимо от их конкретной нозологии, тяжести,

4

сенсибилизации и уровня общего IgE в крови повышено процентное содержание Treg при значительном снижении их функциональной активности Показано, что у детей без аллергии содержание Treg постепенно снижается с возрастом, тогда как при аллергии численность этих клеток снижается лишь до 6 лет, а затем стабилизируется Изучен уровень экспрессии гена FOXP3 у детей с аллергией Показано, что ингаляционное применение кортикостероидов при астме приводит к повышению экспрессии гена FOXP3, что может рассматриваться как один из механизмов и\ терапевтического действия Впервые установлены взаимоотношения экспрессии гена FOXP3 и цитокинов, участвующих в реализации действия регучяторных Т-клеток и препятствующих ему

Высказана гипотеза, что первичное изменение Treg при аллергии состоит в ослаблении их функции, в тех случаях, когда этот дефект полностью или частично компенсируется за счет повышения численности клеток, развивается ремиссия, отсутствие компенсации обусловливает развитие обострений аллергических заболеваний

Впервые воспроизведена дифференцировка естественных регуляторных Т-клеток из лимфоидных предшественников, присутствующих в органах гемопоэза человеческого плода, которые сами по себе лишены маркеров Treg, под влиянием сокультивирования с эпителием тимуса С этой целью отработаны условия длительного культивирования функционально полноценных эпителиальных клеток тимуса человека

Практическая значимость работы. В данной работе затронуто два аспекта исследования Treg, нацеленных на решение практически значимых научных задач Первый аспект закладывает основы для создания новой методологии получения Treg Второй аспект относится к обоснованию использования Treg как возможного средства адоптивной иммуноцитотерапии тяжелых форм аллергических заболеваний

Разработанные методы выявления экспрессии гена FOXP3 и цитокинов, влияющих на экспрессию FOXP3 или зависящих от этого фактора (IL-6, IL-

5

10, IL-17 и TGFP), предполагается рекомендовать к использованию в клинической практике в случаях необходимости уточнения патогенетической роли изменений Treg и оценке эффекта лечения

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ Материалы диссертации доложены на научной конференции молодых специалистов Института иммунологии (Москва, 2005), XI Всероссийском Форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), У1П конгрессе РААКИ (Москва, 2007), II международном конгрессе «Immune-mediated diseases from theory to therapy» (Москва, 2007), Российском Медицинском Форуме (Москва, 2007)

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 199 источников (7 отечественных и 192 зарубежных) Работа содержит 13 таблиц и 31 рисунок

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нами обследован 121 ребенок (68 мальчиков и 53 девочки) в возрасте от 1 месяца до 18 лет Дети находились на амбулаторном и стационарном лечении в ГНЦ «Институте Иммунологии ФМБА России» Распределение обследованных детей по возрасту, особенностям патологии и лечения (применение ИГКС) отражены на схеме Выделение подгруппы детей до 5 лет в отдельную группу обусловлено наличием у них возрастного лимфоцитоза Группа детей с аллергией старше 5 лет (75 детей) включала 53 ребенка с атопической бронхиальной астмой, 13 детей с аллергическим риноконъюнктивитом и 9 детей с атопическим дерматитом, 13 детей с тяжелым течением заболевания, 41 - со среднетяжелым, 21 - с легким В группу сравнения вошли 32 условно-здоровых ребенка, у которых диагноз аллергического заболевания был исключен

Периферическую кровь забирали в стерильные пробирки, содержащие антикоагулянт (K3EDTA в концентрации 2 мг/мл) Количество лейкоцитов и лимфоцитов в цельной крови, окрашенных в растворе Тюрка, подсчитывали в счетной камере Горяева Разделение клеточных элементов крови проводили путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколла-верографина (плотность 1,077 г/мл) по методу Boyum А

Другим источником клеток служили фрагменты органов (тимус, печень, селезенка и костный мозг) плодов 14-28 недель развития (материал предоставлен Всероссийским центром акушерства, гинекологии и перинатотогии РАМН), а также фрагменты тимуса детей в возрасте до 1 года, удаляемые во время операций на сердце в соответствии с существующей хирургической практикой Суспензию клеток получали из измельченных фрагментов органов Фрагменты тимуса служили также источником тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) Фрагменты культивировали в течение 7 суток в пластиковых чашках Петри («Lmbro») в присутствии эпидерма тьного фактора роста («Sigma») ТЭК, мигрировавшие из фрагментов, отделяли от поверхности пластика с помощью 0,1% раствора Версена с 0,05% трипсином («Sigma»), отмывали и переносили в свежую питательную среду с эпидермальным фактором роста, перед использованием в опыте клетки пассировали не менее трех раз По данным окрашивания на цитокератины 8/18 («Becton Dickinson») содержание эпителиальных клеток в

опытных суспензиях составляло около 90% Клетки, извлеченные из органов плодов, отмывали и культивировали в течение 24 ч в монокультуре или на монослое первичной культуры ТЭК при 37°С в атмосфере с 5% С02 в полной культуральной среде Исходная концентрация клеток в культурах составляла 106 клеток/мл, соотношение кроветворные клетки ТЭК =10 1

Экспрессию молекул на поверхности клеток оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител (МАТ) В работе использовали МАТ к CD4 и CD8, меченные FITC, а также к CD3 («Сорбент») и CD25, меченные PE («Becton Dickinson»)

Фракционирование лимфоцитов с целью обогащения субпопуляции регуляторных клеток CD4+CD25+ производили при помощи магнитных бус -Dynal CD4+CD25+ Treg Kit («Dynal Biotech ASA») в соответствии с прилагаемым протоколом

С целью активации клеток использовали МАТ к CD3 (нанесенные на пластик) и CD28 (растворимые), рекомбинантный IL-2 (rIL-2) («Becton Dickinson») Культивирование CD4+CD25~, CD4+CD25+, а также их совместное культивирование в концентрации 5*104/лунку (соотношение 1 1) проводили в течение 72 часов при 37°С и 5% СОг В качестве антигенпредставляющих клеток использовали лимфоциты, обработанные митомицином («Sigma») в концентрации 5*103/лунку За 18 часов до окончания культивирования во все лунки добавляли по 40 кБК 3Н -тимидина Уровень 3Н-тимидина определяли на счетчике «Wallac 1409»

Уровень экспрессии гена FOXP3 и ряда цитокинов (IL-6, 10, 17, TGFP) определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с предварительной обратной транскрипцией Использовали качественный и количественный варианты ПЦР Выделение лимфоцитов проводили из 500 мкл цельной крови Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК» («ДНК-Технология») Метод основан на лизисе образцов в растворе гуанидинтиоционата, осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом, с последующим отмыванием этанолом и ацетоном

Реакцию обратной транскрипции (ОТ) ставипи в объеме 20 мкл В

качестве праймеров для ОТ использовали специфические олигонуклеотиды

Реакцию проводили при температуре 40°С в течение 1 часа, с последующей

инактивацией обратной транскриптазы при 95СС в течение 15 минут

Амплификацию проводили в объеме 25 мкл на термоциклере «Терцик»

(«ДНК-технотогия») с использованием «горячего старта» Первоначальную

денатурацию ДНК проводили при 94°С в течение 5 мин, затем

последовательно повторите следующие стадии денатурация - 94°С 30 сек,

отжиг - 53°С 1 мин, синтез - 72°С 30 сек (всего 36 циклов) Амплификацию в

режиме «реального времени» осуществляли в объеме 35 мкл по следующей

программе 1 цикл - 80°С 30 сек, 94°С 1 мин, 50 циклов - 94°С 10 сек, 64°С 20

сек, использовали прибор "ДТ-322" («ДНК-Технология»), измерение уровня

флуоресценции проводили на каждом цикте при температуре 64°С

Анализ продуктов реакции амплификации, а также дополнительный

контроль прохождения ПЦР в режиме «реального времени» осуществляли

методом электрофореза в 2% агарозном геле Уровень экспрессии мРНК

FOXP3 в ПЦР в режиме «реального времени» определяли относительно

экспрессии мРНК гена «домашнего хозяйства» HPRT1 - hypoxanthme

phosphonbosyl transferase 1 по формуле

[FOXP3]/[ HPRT1] = Еш.кт1Ср1/ЕгохрзСр2 , где E - эффективность амплификации, Cpl - значение порогового цикла в образце дня HPRT1, Ср2 - значение порогового цикла в образце для FOXP3

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием методов непараметрического анализа Исследованные количественные показатели представляли в виде Me (L-H), где Me - медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний квартиль Для сопоставления двух групп по количественным признакам использован U-критерий Манна-Уитни, для нескольких групп - метод сравнения Краскета-Уоллиса с последующим (в случае Р<0,05) парным сравнением групп с испотьзованием теста Манна-Уитни с поправкой Бонферрони при оценке значения Р Дтя выявления

взаимосвязи переменных проводили расчет коэффициента ранговой корреляции по Спирмену Характеристика относительных частот представлена с использованием 95% доверительных интервалов («точный» метод Клоппер-Пирсона), в виде X [XI, Х2], где X - относительная частота события, XI, Х2 - нижняя и верхняя границы доверительного интервала X, соответственно Для оценки различия групп по качественному признаку использован критерий х2 с поправкой Йетса, а при нарушении условий его применимости - двухсторонний критерий Фишера (PF) Различие групп полагали статистически значимым при Р<0,05. Обработку проводили в программном пакете StatSoft Statistica

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование естественныхрегуляторных Т-клеток и их мочекулярного маркера FOXP3 в норме и при аллергии При сравнении детей внутри группы с аллергическими заболеваниями выявлено, что показатели, характеризующие субпопуляцию Treg (численность CD4+CD25hl, экспрессия гена FOXP3), не различаются при разных проявлениях (бронхиальная астма, аллергический риноконъюнктивит, атопический дерматит) и разной степени тяжести аллергических заболеваний (Р>0,05 для критериев Краскела-Уоллиса) Поэтому все дети с аллергическими заболеваниями, независимо о г нозологии и тяжести течения процесса, объединены в одну группу

При сравнении групп детей с аллергическими заболеваниями и условно-здоровых выявлено, что процентное содержание Treg в группе детей с аллергией статистически значимо выше, чем в группе сравнения (Р=0,03) в 1 группе относительное количество CD4+CD25m составляет 3,4%, во 2-й - 2,6% (рис 1, табд 1) При оценке рассматриваемых показателей у детей с различной активностью процесса обнаружено, что повышение содержания Treg статистически значимо только в период ремиссии (Р=0,02) (табл. 1) Группы условно-здоровых и больных аллергией (как в приступном, так и межприступном периодах) не различаются по абсолютному содержанию

Treg, а также по уровню экспрессии гена FOXP3. Экспрессия гена FOXP3 в носовом секрете в 1,9-2,5 раза ниже, чем в крови. Вероятно, это обусловлено низким содержанием клеток, в том числе Treg, в носовой слизи. Прямая корреляционная связь между количеством Treg и геном FOXP3 выявляется только в группе сравнения (коэффициенты корреляции по Спирмену R=0,75; Р=0,0008 и R=0,65; Р=0,007 для корреляции экспрессии мРНК FOXP3 с абсолютным и относительным содержанием CD4+CD25,M, соответственно). Корреляционные связи между количественным содержанием Treg (как абсолютным, так и относительным), экспрессией мРНК гена FOXP3 и уровнем общего IgE не выявляются (коэффициенты корреляции по Спирмену R=-0,09, R=-0,08 и R=-0,03 соответственно; Р>0,05). а б

1 з%

11.4°/.

з.е%

5.6%

о ' о-

10' Юг 10а CD4-FITC

CD4+CD25hi

2.2%

R2

'.' JäL

103 10' CD4-FITC 32.6%

Рис. 1. Цитофлуориметрическое определение Treg. а - ребенок с бронхиальной астмой; б - ребенок из группы сравнения.

У части детей с аллергией (16 детей) уровень общего IgE составил более 1000 МЕ/мл, и выявлена полисенсибилизация (бытовая, эпидермальная, пыльцевая, у некоторых - пищевая и грибковая). Однако у данных детей, в сравнении с группой условно-здоровых, не обнаружено статистически значимых различий показателей, характеризующих Treg (табл. 1).

Лечение ИГКС приводит к статистически значимому повышению экспрессии мРНК гена FOXP3 (табл. 2). Наиболее высокий уровень экспрессии гена FOXP3 - 0,087 отмечается в период ремиссии на фоне терапии ИГКС, что статистически значимо превышает уровень этого показателя в группе сравнения - 0,055 (Р=0,003).

Таблица 1 Показатели, характеризующие субпопуляцию Тгек, у детей с аллергическими заболеваниями и условно-здоровых

Параметр Дети с аллергией, п=75 Обострение, п=27 Ремиссия, п=48 IgE>1000 МЕ/мл, полисенсибилизация, п=16 IgE<1000 МЕ/мл, моносснсиби-лизация, п=59 Группа сравнения, п=32

С04+С1)25Ь1, % 3,4* (2,5-4,6) 3,4(23-4,5) 3,4* (2,6-4,6) 3,6 (2,3-5,1) 3,4* (2,6-4,5) 2,6 (2,2-3,5)

С04+С025ы, кл/мкл 71,3 (46,5-89,3) 67,0 (40,1-86,5) 74,4 (46,5-92,4) 71,2 (44,8-89,3) 71,3 (46,5-94,8) 59,5 (33,9-98,7)

ЮХРЗДМт (мононуклеары) 0,056 (0,044-0,079) 0,055 (0,040-0,069) 0,059 (0,047-0,080) 0,058 (0,047-0,071) 0,056 (0,044-0,083) 0,055 (0,041-0,073)

ГОХРЗ/НР1ГГ1 (клетки назального секрета) 0,030 (0,014-0,081) Нд Нд Нд Нд 0,022 (0,011-0,036)

Таблица 2 Показатели, характеризующие субпопуляцию Тгсв, у детей, леченных ИГКС, и условно-здоровых

Дети, леченные ИГКС Дети, нелеченные ИГКС Группа

Параметр Все дети, Обострение, Ремиссия, Все дети, Обострение, Ремиссия, сравнения,

п=24 п=12 п=12 п=51 п=15 п=36 п=32

CD4+CD25W, % 3,1 2,8 3,4 3,5** 3,4 3,6* 2,6

(2,0-4,3) (1,3-3,7) (2,3-5,2) (2,6-4,6) (2,3-4,7) (2,8-4,6) (2,2-3,5)

CD4+CD25lu, 63,4 52,0 78,1 72,8 68,2 72,8 59,5

кл/мкл (35,2-80,1) (23,5-63,4)_ (71,2-102,1) (49,2-90,6) (46,4-86,5) (49,6-92,1) (33,9-98,7)

FOXP3/HPRT 0,077** 0,068 0,087** 0,050°°° 0,051°° 0,050°°° 0,055

(МНПК) (0,065-0,095) (0,054-0,082) (0,070-0,098) (0,041-0,060) (0,025-0,060) (0,042-0,064) (0,041-0,073)

* - Р<0,05 (относительно группы сравнения), ** - Р<0,01 (относительно группы сравнения),

00 . р<0,01 (относительно аналогичной группы детей, леченных ИГКС), °°° - Р<0,001 (огносигельно анало1ичной группы детей, леченных И1 КС)

При оценке функционального состояния естественных регуляторных Т-клеток в единичных тестах обнаруживается резкое снижение их супрессорной функции у больных аллергическими заболеваниями. На рис. 2 приводится пример пролиферативного ответа на альтернативную стимуляцию МАТ к CD3 и CD28 у больного поллинозом, у которого изначальное содержание Tieg повышено (3,8%); у больного выявляется снижение индекса подавления пролиферации (1,8 против 13,2 в контроле).

Спонтанная пролиферация Индуцированная пролиферация

Рис. 2. Функциональная (суирессорная) активность Treg.

Подавление аутологичными Treg индуцированной пролиферации Т-клеток донора (передние столбики) и больного поллинозом (задние столбики).

Таким образом, аллергическому процессу свойственно повышение процентного содержания CD4 CD25hl независимо от нозологии заболевания, его тяжести, особенностей сенсибилизации и уровня общего IgE в крови. Повышение проявляется особенно четко в ремиссию заболеваний. При этом экспрессия гена FOXP3 в клетках мононуклеарной фракции крови не изменяется. Повышение содержания Treg при аллергии описано и другими авторами, причем, как правило, оно сопровождается ослаблением функции этих клеток [Ling Е.М. et al., 2004; Ou L. S. et al., 2004]. Мы также наблюдали выраженное снижение супрессорной функции Treg при аллергических заболеваниях. Возможно, что повышение содержания Treg представляет собой компенсаторную реакцию на снижение их функции, которая

13

обеспечивает нормальный уровень суммарной экспрессии РОХРЗ и частично восполняет функциональную недостаточность Отсутствие увеличения численности Treg, наблюдаемое при рецидивах аллергических процессов, можно рассматривать как фактор, способствующий обострению (отсутствие или недостаточность компенсации)

Все это может служить основой предположения, что первичное изменение Тге§ при аллергии состоит в ослаблении их функции; в тех случаях, когда этот дефект полностью или частично компенсируется за счет повышения численности клеток, развивается ремиссия, отсутствие компенсации обусловливает развитие обострений аллергических заболеваний Следовательно, увеличение численности Тге§, проявляющееся при благоприятном течении процесса (ремиссия), нельзя рассматривать как показатель истинного роста активности этих клеток

Ингаляционное применение кортикостероидов при астме повышает экспрессию гена РОХРЗ. Это может рассматриваться как один из механизмов их терапевтического действия Однако данные о влиянии ИГКС на функцию Т^ отсутствуют, и это затрудняет более интегральную оценку эффектов ИГКС с точки зрения их влияния на проявления действия Тге§ при аллергических заболеваниях

Онтогенез Тге^ и их чочекулярного маркера РОХРЗ в норме и при аллергии Обследование показало, что содержание Т^ в крови детей в группе сравнения постепенно снижается с возрастом (рис За) Экспрессия гена РОХРЗ практически не изменяется с возрастом, составляя 0,049-0,063 (относительно экспрессии гена НР11Т1)

При аллергических заболеваниях в возрасте до 6-8 лет наблюдается снижение содержания Тге§, аналогичное таковому в группе сравнения Однако снижения численности этих клеток после 11 лет не происходит, и в возрасте 12 лет и старше их абсолютное содержание статистически значимо выше, чем у детей без аллергии (рис За) (Р=0,01) Аналогичных изменений экспрессии гена БОХРЗ не отмечается При изучении особенностей

возрастной динамики Тге§ в циркуляции при обострении и ремиссии, выявляется снижение Т^ в обострении у детей младше 12 лет и повышение их в этой возрастной группе во время ремиссии (рис. 36). а б

Рис. 3. Особенности возрастной динамики Treg. а - в группах детей с аллергией и условно-здоровых; б - в группах детей с разной стадией аллергии, не леченных ИГКС, и условно-здоровых детей (каждой точке соответствует от 3 до 30 измерений, * - Р<Ю,05 относительно группы сравнения).

Следовательно, изменение содержания Тге§ в возрастном аспекте показывает, что в норме содержание Тгед постепенно снижается с возрастом, тогда как при аллергии проявляется лишь начальный этап этого снижения (от рождения - до 6 лет), который в дальнейшем остается незавершенным. Оценить значимость этой особенности онтогенеза Тге§ для развития аллергопатологии пока не представляется возможным.

Исследование цитокинов, влияющих на экспрессию ГОХРЗ или зависящих от этого фактора. При сравнении уровней цитокинов, влияющих на экспрессию гена БОХРЗ или зависящих от этого фактора (1Ь-6,1Ь-10,1Ь-17, ТОР(3), внутри группы детей с аллергическими заболеваниями выявлено, что они не различается при разных проявлениях аллергических заболеваний и разной степени их тяжести (Р>0,05 для критериев Краскела-Уоллиса). Поэтому для исследования вышеназванных цитокинов все дети с аллергией, независимо от нозологии заболевания и тяжести течения процесса, объединены в одну группу.

Уровни экспрессии мРНК генов провоспалительных цитокинов 1Ь-6 и

IL-17, также как и супреееорных цитокинов IL-10 и TGFß, в носовом секрете в 10-150 раз выше, чем в крови Группы детей с аллергией и условно-здоровых детей отличаются по уровню экспрессии мРНК генов IL-6 и TGFß клетками носового секрета, которые выше у детей с аллергией (критерий Манна-Уитни -2,5 и -2,7 соответственно, Р<0,05) Повышение экспрессии генов как провоспалительных, так и супрессорных цитокинов в носовом секрете может свидетельствовать о большей активности локального аллергического воспаления, причем при вовлечении в аллергический процесс не только слизистой оболочки носовых ходов (аллергический ринит), но и других органов и тканей (бронхи, кожа)

При обострении аллергических процессов повышается экспрессия генов супрессорных цитокинов - маркеров Tri и ТЬЗ-клсток (IL-10 и TGFß) в клетках крови в подгруппе детей с обострением экспрессия генов составляет соответственно 0,007 против 0,004 в ремиссии и 10,3 против 8,0 (критерий Манна-Уитни 2,2 и 2,5, Р<0,05) (табл 3) Следовательно, у детей с аллергией изменяется содержание как естественных (CD4+CD25hlFOXP3+), так и адаптивных (Tri и Th3) регуляторных Т-клеток

Лечение ИГКС не приводит к статистически значимым изменениям экспрессии генов исследуемых цитокинов у детей с аллергическими заболеваниями в сравнении с группой условно-здоровых детей (критерий Манна-Уитни 2,6, Р=0,008) (табл 4) Однако, при сравнении групп детей, леченных и не леченных ИГКС, выявлено, что они отличаются по экспрессии гена супрессорного цитокина TGFß У детей обострением аллергии, не получающих терапию ИГКС, его уровень повышен как в сравнении с аналогичной группой детей, леченных ИГКС, так и в сравнении с условно-здоровыми детьми (критерии Манна-Уитни 2,7 и 2,6, соответственно, Р<0,01) Также оказалось, что терапия ИГКС приводит к снижению экспрессии гена IL-17 (ТЫ7-клетки) - антагониста молекулярного маркера Treg FOXP3, при ремиссии аллергических заболеваний (критерий Манна-Уитни -2,0, Р=0,04)

Таблица 3 Уровни экспрессии генов цитокинов в клетках крови детей с различными проявлениями аллергии и условно-здоровых

Параметр Дети с аллергией, п=75 Обострение, п=27 Ремиссия, п=48 IgE> 1000 МЕ/мл, полисенсибилизация, п=16 IgE<l 000 МЕ/мл, моносенсибилизация, п=59 Группа сравнения, п=32

IL-17/HPRT1 0,00008 (0,000050,00015) 0,00009 (0,000040,00015) 0,00008 (0,000050,00015) 0,00013 (0,000050,00017) 0,00008 (0,000050,00015) 0,00010 (0,000070,00013)

1Ь-6ДЛЧ*Т1 0,005 (0,003-0,009) 0,005 (0,003-0,009) 0,005 (0,004-0,009) 0,006 (0,003-0,008) 0,005 (0,004-0,009) 0,006 (0,003-0,010)

IL-10/HPRT1 0,005 (0,003-0,010) 0,007° (0,003-0,011) 0,004 (0,003-0,006) 0,007 (0,004-0,008) 0,004 (0,003-0,010) 0,005 (0,002-0,019)

TGFßAIPRTl 8,3 (6,3-11,3) 10,3' (7,0-11,9) 8,0 (6,3-10,3) 8,3 (7.5-11,2) 8,0 (5,9-11,3) 7,2 (6,4-8,9)

Таблица 4 Уровни экспрессии 1 енов щггокинов в клеч ках крови детей, леченных ИГКС, и условно-здоровых

Дети, леченные ИГКС Дети, не леченные ИГКС Группа

Параметр Все дети, Обострение, Ремиссия, Все дети, Обострение, Ремиссия, сравнения,

п=24 п=12 п=12 п=51 п=15 п=36 п=32

IL-17/HPRT1 0,00006 0,00009 0,00006 0,00008 0,00008 0,00006* 0,0010

(0,00004- (0,00004- (0,00005- (0,00005- (0,00004- (0,00004- (0,00007-

0,00011) 0,00015) 0,00009) 0,00016) 0,00013) 0,00009) 0,00013)

IL-6/HPRT1 0,007 0,006 0,007 0,005 0,004 0,007 0,006

(0,004-0,010) (0,003-0,024) (0,003-0,010) (0,003-0,008) (0,002-0,006) (0,005-0,009) (0,003-0,010)

IL-10/HPRTI 0,004 0,005 0,004 0,005 0,006 0,004 0,005

(0,003-0,010) (0,003-0,018) (0,002-0,019) (0,003-0,008)_ (0,004-0,011) (0,003-0,006) (0,002-0,019)

TGFß/HPRTl 7,0 6,5 7,8 8,9°° Г ЦД**°° 7,8 7,2

(5,4-9,1) (5,1-8,9) (6,4-8,9) (7,2-11,8) (9,3-13,3) (6,0-9,1) (6,4-8,9)

* - Р<0,05 (относительно группы сравнения), ** - Р<0,01 (относительно группы сравнения), + - Р<0,05 (относительно группы детей в ремиссии аллергических заболевании), 00 - Р<0,01 (относительно аналмичиой группы детей, леченных ИГКС)

17

У условно-здоровых детей выявлена прямая корреляционная связь между экспрессией генов 1Ь-6 и 11.-10 (коэффициент корреляции по Спирмену 11=0,89, Р=0,007) При обострении аллергии появляется обратная корреляционная связь между экспрессией генов БОХРЗ и 1Ь-17 (коэффициент корреляции по Спирмену 11—0,66, Р=0,02), в то же время корреляционная связь между 1Ь-6 и 1Ь-10 исчезает Следовательно, при обострении аллергических процессов выявляется дисбаланс Тгец/'ТЫ7 в сторону преобладания провоспалительного цитокина ТЬ-17, что не удивительно, поскольку 1Ь-17 через посредство промежуточных механизмов подавляет экспрессию РОХРЗ Терапия ИГКС приводит к появлению прямых корреляционных связей между экспрессией генов супрессорных цитокинов ТОРр и 1Ь-10 (коэффициент корреляции по Спирмену 11=0,88, Р=0,0004), а также между ТОБР и 1Ь-17, РОХРЗ и 1Ь-6 (коэффициенты корреляции по Спирмену 11=0,63 и 0,65, Р<0,05) Появление прямой корреляционной связи между экспрессией генов 1Ь-6 и РОХРЗ пока трудно объяснить, поскольку известно, что 1Ь-6 подавляет экспрессию РОХРЗ и дифференцировку Т^ [Оо£апс1 А е1 а1, 2005] В остальных подгруппах статистически значимые корреляционные связи не определяются.

Выявление Treg в органах плодов человека В задачи нашего исследования входило усовершенствование методов культивирования Tгeg и изучение возможности их дифференцировки из кроветворных и лимфоидных клеток-предшественников под влиянием эпителия тимуса Предварительно мы должны были убедиться в наличии или отсутствии СВ4^СБ25+-клеток в кроветворных и лимфоидных органах плодов человека Для определения содержания СВ4+СБ25+-клеток суспензии клеток тимуса, печени, селезенки и костного мозга плодов человека 14-28 недель гестации подвергали исследованию методом проточной цитофлуориметрии Результаты оценки отражены в таблице 5 Из нее следует, что С04+СБ25+-клстки определяются в фетальном тимусе Однако известно, что у человека функции Treg выполняют не все СБ4+СВ25+-лимфоциты, а только их фракция с высоким

уровнем экспрессии СБ25 (СВ4+СВ25ь'-клетки) Данные клетки в фетальных тимусах определить не удается

Таблица 5 Проявление признаков, характеризующих Treg, _в органах плодов четовека 14-28 нед развития

Клеточные суспензии CD4+CD25+-icieTKH, % ! Экспрессия FOXP3,

Me (L-H) Разброс данных П 1 доля положительных | результатов*

Тимус 1,2 (1,0-1,4) 0,7 - 2,7 21 | 18/18

Печень 0,1 (0-0,4) 0-3,7 14 ! o/Ii

Селезенка 0,2(0,05-0,4) 0-2,6 12 1 0/10

Костный мозг 0,2 (0-0,6) 0,1-3,3 12 0/10

* В числителе - число случаев выявления экспрессии мРНК Ь'ОХРЗ методом ОТ-ПЦР (качественный вариант), в знаменателе - общее чисто изученных суспензий

С другой стороны, С04+СБ25+-клетки практически отсутствуют во всех изученных суспензиях печени, селезенки и костного мозга плодов Представляется сомнительным, что обнаружение до 3,0-3,5% клеток указанного фенотипа в единичных пробах клеток печени и костного мозга свидетельствует о наличии в них Тге£

Во всех изученных пробах тимоцитов выявлена экспрессия гена БОХРЗ Наиболее высокая его экспрессия отмечается в возрасте 18 недель гестации -0,077 (0,038-0,117), затем экспрессия мРНК БОХРЗ постепенно снижается, достигая 0,029 (0,022-0,036) после рождения Экспрессия БОХРЗ не обнаружена ни в одной пробе клеток печени, костного мозга и селезенки плодов Как уже отмечалось, именно экспрессия РОХРЗ признается наиболее специфичным показателем дифференцировки Treg Таким образом, можно констатировать, что присутствие Тге§ в тимоцитах птодов удается выявить по экспрессии гена РОХРЗ, но не по наличию характерного мембранного фенотипа этих клеток Вероятно, эти клетки не являются вполне зрелыми В связи с этим представляет интерес в дальнейшем определить функциональную активность Тге§, выделенных из тимуса на разных стадиях внутриутробного развития

Таким образом, можно заключить, что в кроветворных и лимфоидных органах 14-28-недельных плодов человека отсутствуют клетки с

характерным мембранным фенотипом - СБ4+СВ251", в то же время в их тимусе определяются СБ4+С025+-клетки, экспрессирующие основной маркер Тге§ - РОХРЗ

Индукция фенотипа Treg в культурах клеток кроветворных органов плода Культивирование клеток печени и костного мозга плодов 14-28 нед гестации на монослое ТЭК увеличивает содержание СЭ4+ и СВ8+-клеток, т е индуцирует дифференцировку тимоцитов, что свидетельствует о функциональной полноценности ТЭК При этом, однако, не наблюдается появления СБ4+СВ25+-клеток Сказанное характерно для 7 из 8 изученных совместных культур кроветворных клеток (из печени и костного мозга плодов) и ТЭК

Однако в одном случае наблюдаются четко выраженные признаки дифференцировки СВ4+СБ25+-клеток в ко-культурах кроветворных клеток -как печени (рис 4, верхний ряд), так и костного мозга - и ТЭК, полученных из одного источника В культуре клеток печени индукция выражена особенно сильно при практически полном отсутствии С04+СБ25+-клеток в монокультуре, число таких клеток возрастает до 11% в ко-культуре с ТЭК Эта величина двукратно превышает содержание С04+СБ25+-клеток как в тимусе взрослых, так и в тимусе плодов того же срока развития Степень индукции фенотипа С04+СБ25+ в культуре клеток костного мозга выражена значительно слабее - содержание клеток с таким фенотипом возрастает примерно в 3 раза и достигает как раз тех 5%, которые характеризуют численность Т^ в различных лимфоидных органах плодов и взрослых людей В то же время фенотип С04+С025+, индуцированный в ко-культуре с ТЭК, не вполне соответствует классическому фенотипу Treg человека поскольку уровень экспрессии С025 достаточно слабый Вероятно, это также следует рассматривать как показатель неполноты созревания этих клеток, функциональная активность которых и в этом случае нуждаются в дополнительном подтверждении

0.2%

11.0%

CD4-f>:D25»

iü? эЯШ ■

10' 10 10' CD25-FITC о 1%

CD4+CD25+

10е 10' 10'' 10' 10* CD25-FITC 0.5%

CD4+CD25» 1? '

о

10" 10' I0-' 10" 10'

CD25-FITC 4.0%

CD4+CD25 +

10" 10' 10! 10" 10'

CD25-FITC 0.9%

Рис. 4. Цитометрические показатели результатов сокультивирования двух образцов клеток печени плодов с ТЭК. Наличие (верхний ряд) и отсутствие (нижний ряд) дифференцировки Treg. а, в - монокультуры клеток печени от двух разных плодов; б, г — ко-культуры клеток печени и ТЭК.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 5. Экспрессия мРНК РОХР31 клетками печени и костного мозга при их сокультивировании с ТЭК. 1,4 — положительные контроли: экспрессия мРНК йАРО - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (длина фрагмента - 452 п.н.),

2 - отсутствие экспрессии мРНК БОХРЗ_1 клетками печени,

3 - экспрессия мРНК РОХР31 клетками печени в ко-культуре с ТЭК (длина фрагмента - 100 п.н.),

5 - отсутствие экспрессии мРНК РОХРЗ_1 клетками костного мозга,

6 - экспрессия мРНК РОХРЗ_1 клетками печени в ко-культуре с ТЭК (длина фрагмента - 100 п.н.),

7 - отрицательный контроль (бидистиллированная вода),

8 - молекулярный маркер длины фрагментов (сверху вниз: 489-404-331; 242-190147-110 п.н.).

Индукция фенотипа CD4+CD25+ сопровождается экспрессией гена FOXP3 (рис 5) Следует отметить, что в 1 из 7 проб кроветворных органов после их сокультивирования с ТЭК выявляется экспрессия мРНК FOXP3 при отсутствии индукции фенотипа, что требует специального анализа

Сокультивирование с теми же ТЭК клеток печени и костного мозга другого плода того же срока гестации приводит к примерно 2-кратному повышению процента CD4+CD25+-iaeTOK, который составляет 2,5% для печени (рис. 4, нижний ряд) и 1,7% для костного мозга. Этот результат рассматривается нами как отрицательный Таким образом, эффективность индукции CD4+CD25+ определяется не дифференцирующим фактором (ТЭК), а особенностями клеток кроветворных органов, поскольку положительный результат был параллельно получен в культурах печени и костного мозга одного и того нее плода, в то время как одни и те же ТЭК в одних культурах индуцировали, а в других не индуцировали дифференцировку

Таким образом, в опытах in vitro нами обнаружено, что в отдельных случаях под влиянием факторов микроокр>жения тимуса (ТЭК) удается индуцировать мембранный фенотип Treg и экспрессию гена FOXP3 в клетках печени и костного мозга плодов, в которых эти клетки на данном этапе внутриутробного развития отсутствуют Индуцированные РОХРЗ+-клетки отличаются от классических Treg человека слабой экспрессией CD25, что делает необходимым подтверждение их функциональной активности в качестве супрессорных клеток Тем не менее, полученные данные свидетельствуют о принципиальной возможности воспроизведения дифференцировки Treg из кроветворных клеток-предшественников вне организма в условиях контактных взаимодействий с эпителием тимуса, Процент индуцируемых при культивировании Treg невелик, что соответствует небольшой доле этих клеток, в норме образующихся в тимусе Можно предполагать, что выход Treg может быть повышен путем обогащения соответствующих клеток-предшественников и модификации усчовий культивирования

выводы

1 При аллергических заболеваниях независимо от их конкретной нозологии (атопическая бронхиальная астма, аллергический риноконъюнктивит, атопический дерматит), тяжести, характера сенсибилизации и уровня общего IgE в крови повышено процентное содержание CD4+CD25lu, однако их супрессорная функция снижена. Экспрессия гена FOXP3 у больных аллергией практически не изменяется

2 У детей без аллергии содержание Treg постепенно снижается с возрастом, тогда как при аллергии проявляется лишь начальный этап этого снижения (до

6 лет), после чего уровень Treg стабилизируется

3. При обострении аллергических заболеваний повышаются уровни экспрессии генов супрессорных цитокинов IL-10 и TGFß, маркеров адаптивных регуляторных Т-клеток - Tri и Th3

4 Ингаляционное применение кортикостероидов при астме приводит к повышению экспрессии мРНК гена FOXP3, что может рассматриваться как один из механизмов их терапевтического действия Ремиссия при лечении ингаляционными кортикостероидами сопровождается увеличением экспрессии гена FOXP3 и снижением экспрессии гена его антагониста -провоспалительного цитокина IL-17.

5 Прямая корреляционная связь между количеством CD4+CD25hl-iüieTOK и экспрессией гена FOXP3 выявлена только в группе условно-здоровых детей При обострении аллергии выявлена обратная корреляционная связь между экспрессией генов FOXP3 и IL-17, что свидетельствует о сдвиге баланса Treg/Thl7 в сторону преобладания провоспалительных цитокинов

б. Лимфоциты, имеющие фенотип CD4+CD25+FOXP3+, определяются в тимусе плодов человека 14 недель развития. В этот срок данные клетки отсутствуют в печени, селезенке и костном мозгу плодов

7 Дифференцировка Treg из клеток-предшественников кроветворных органов плода человека может быть воспроизведена in vitro в условиях контактных взаимодействий с эпителием тимуса

23

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Донецкова А Д, Пичугина J1В , Никонова М Ф , Шарова Н И , Ярилин А А Определение FOXP3 - молекулярного маркера регуляторных клеток // Медицинская иммунология - 2005 - Т 7, №2-3 - С 112

2 Ярилин А А, Донецкова А.Д Регуляторные Т-клетки, зависимые от фактора FOXP3, и перспективы их изучения при беременности // Russian journal of immunology - 2005. - Vol 9 - P 149-152

3 Ярилин A A, Донецкова А Д Регуляторные РохрЗ+-Т-клетки и их роль при аллергии // Российский аллергологический журнал - 2005 - №2 - С 2226

4 Ярилин А А, Донецкова АД Естественные регуляторные Т-клетки и фактор FOXP3 // Иммунология - 2006 - Т 27, №3 - С 176-188

5. Шарова Н И , Донецкова А Д , Дубровина И В , Сухих Г Т , Ярилин А А. Экспрессия фенотипа регуляторных Т-лимфоцитов в культуре клеток кроветворных и лимфоидных органов плода человека // Клеточные технологии в биологии и медицине -2006 -№2 -С 96-102

6 Донецкова А Д, Бурменская О В , Ярцев М Н, Трофимов Д Ю , Ярилин А А Анализ экспрессии молекулярного маркера регуляторных клеток FOXP3 в норме и при аллергопатологии у детей // Медицинская иммунология -2007. - Т 9, №2-3 - С 180

7 Донецкова А Д, Бурменская О В , Ярцев М Н, Трофимов Д Ю , Алексеев ЛП, Ярилин А А Регуляторные Т-клетки при аллергии у детей // Российский аллергологический журнал - 2007 - №3, прилож 1 - С 17

8 Донецкова А Д, Шарова Н И, Бурменская О В , Топтыгина А П , Трофимов Д Ю, Алексеев Л П, Ярилин А А Выработка цитокинов эпителиальными клетками тимуса человека // Российский аллергологический журнал -2007.-№3, прилож 1 -С 70

9 Донецкова А Д, Ярилин А А Регуляторные Т-клетки при аллергических заболеваниях // Российский Медицинский Форум - 2007 - М , 2007 - С 121122

Подписано в печать 42.0 2 08 г Формат 60x84/16 Тираж ЮОэкз Заказ 104 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им Н Н Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш, 24

Актуальность темы исследования

Важную роль в предотвращении патологического иммунного ответа на собственные антигены организма и ограничении нежелательных форм иммунного ответа (на антигены плода, пищи и т.д.), играют регуляторные Т-клетки. Наиболее полно изучены естественные регуляторные Т-клетки (Treg), маркерами которых служат мембранные молекулы CD4, CD25, CTLA-4 и внутриклеточный транскрипционный фактор FOXP3. Основной мишенью Treg служат хелперные Т-лимфоциты.

Со времени открытия естественных регуляторных Т-клеток в. 1995 г. [144] они неизменно находятся в центре внимания исследователей. На международных иммунологических форумах им посвящается наибольшее число сообщений. Они являются предметом рассмотрения в. многочисленных обзорных статьях. Столь пристальное внимание исследователей к проблеме естественных регуляторных Т-клеток обусловлено не только важностью их функций, но и широким кругом практически значимых проблем, с которыми так или иначе связаны эти клетки. Основным проявлением тотального дефицита регуляторных Т-клеток является формирование полиспецифических аутоиммунных процессов с преимущественным поражением эндокринных органов и кишечника (IPEX-синдром). Еще одним следствием их дефицита является нарушение нормального течения беременности и невынашивание плода. С другой стороны, избыточная активность регуляторных Т-клеток чревата повышением риска онкологических заболеваний и ослаблением противоинфекционной защиты.

Изучение Treg ведется чрезвычайно интенсивно во всех основных иммунологических центрах мира. Это в равной степени относится к фундаментальной и прикладной составляющей исследований. В последние годы четко определилась направленность этих исследований на применение Treg с целью иммунотерапии аутоиммунных заболеваний, а также предотвращения реакции трансплантат-против-хозяина при пересадках костного мозга (начаты клинические испытания). Исследование роли Treg в патогенезе аллергических заболеваний осуществляется в более ограниченном масштабе.

Таким образом, актуальность тематики работы обусловлена исключительно важной и разносторонней ролью, которую играют Treg в физиологии и патологии иммунной системы, их ключевым местом в патогенезе многих заболеваний и возможностью их использования как средства иммунотерапии этих заболеваний.

Цель исследования

Изучить содержание естественных регуляторных Т-клеток и закономерности экспрессии их молекулярного маркера FOXP3 и ряда цитокинов, влияющих на экспрессию FOXP3 или зависящих от этого фактора, в лимфоцитах крови в норме и при аллергии у детей.

Задачи исследования

1. Исследовать содержание естественных регуляторных Т-клеток и FOXP3 в норме и при аллергии у детей в периоды обострения и ремиссии, определить их функциональную активность.

2. Изучить влияние медикаментозного лечения (ингаляционных глюкокортикоидов) на содержание Treg.

3. Исследовать уровни цитокинов (IL-6, IL-10, IL-17 и TGFP), влияющих на экспрессию FOXP3 или зависящих от этого фактора.

4. Изучить онтогенез естественных регуляторных Т-клеток и их молекулярного маркера FOXP3 в норме и при формировании аллергии.

5. Усовершенствовать методы культивирования Treg; изучить возможность дифференцировки Treg из кроветворных и лимфоидных клеток-предшественников под влиянием эпителия тимуса.

Научная новизна работы

Работа содержит новые данные о дефекте субпопуляции Treg у детей с аллергией. Установлено, что при аллергических заболеваниях независимо от их конкретной нозологии, тяжести, сенсибилизации и уровня общего IgE в крови повышено процентное содержание естественных регуляторных Т-клеток при значительном снижении их функциональной активности. Показано, что у детей без аллергии содержание Treg постепенно снижается с возрастом, тогда как при аллергии численность этих клеток снижается лишь до 6 лет, а затем стабилизируется. Впервые изучен уровень экспрессии гена FOXP3 у детей с аллергией.

Показано, что ингаляционное применение кортикостероидов при астме приводит к повышению экспрессии FOXP3, что может рассматриваться как один из механизмов их терапевтического действия.

Впервые установлены взаимоотношения экспрессии FOXP3 и генов цитокинов, участствующих в реализации действия регуляторных Т-клеток и препятствующих ему.

Высказана гипотеза, что первичное изменение Treg при аллергии состоит в ослаблении их функции; в тех случаях, когда этот дефект полностью или частично компенсируется за счет повышения численности клеток, развивается ремиссия; отсутствие компенсации обусловливает развитие обострений аллергических заболеваний.

Впервые воспроизведена дифференцировка естественных регуляторных Т-клеток из лимфоидных предшественников, присутствующих в органах гемопоэза человеческого плода, которые сами по себе лишены маркеров Treg, под влиянием сокультивирования с эпителием тимуса. С этой целью отработаны условия длительного культивирования функционально полноценных эпителиальных клеток тимуса человека.

Практическая значимость диссертации

В данной работе затронуто два аспекта исследования Treg, нацеленных на решение практически значимых научных задач. Первый аспект закладывает основы для создания новой методологии получения Treg для целей адоптивной иммуноцитотерапии. Второй аспект относится к обоснованию использования Treg как средства адоптивной иммуноцитотерапии аллергических заболеваний.

Разработанные методы выявления экспрессии FOXP3 и цитокинов, влияющих на экспрессию FOXP3 или зависящих от этого фактора (IL-6, IL-10, IL-17 и TGFP), предполагается рекомендовать к использованию в клинической практике в случаях необходимости уточнения патогенетической роли изменений Treg и оценке эффекта лечения.

Апробация результатов диссертационной работы

Материалы диссертации доложены на научной конференции молодых специалистов Института иммунологии (Москва, 2005), XI Всероссийском Форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), VIII конгрессе РААКИ (Москва, 2007), II международном конгрессе «Immune-mediated diseases: from theory to therapy» (Москва, 2007), Российском Медицинском Форуме - 2007 (Москва, 2007).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 199 источников (7 отечественных и 192 зарубежных). Работа содержит 13 таблиц и 31 рисунок.

выводы

1. При аллергических заболеваниях независимо от их конкретной* нозологии (атопическая бронхиальная астма, аллергический риноконъюнктивит, атопический дерматит), тяжести, сенсибилизации и уровня общего IgE в крови hi повышено процентное содержание CD4 CD25 , однако их супрессорная функция снижена. Экспрессия гена FOXP3 у больных с аллергией практически не изменяется.

2. У детей без аллергии содержание Treg постепенно снижается с возрастом, тогда как при аллергии проявляется лишь начальный этап этого снижения (до 6 лет), после чего уровень Treg стабилизируется.

3. При обострении аллергических заболеваний повышаются уровни экспрессии мРНК генов супрессорных цитокинов IL-10 и TGFp, маркеров адаптивных регуляторных Т-клеток - Trl и Th3.

4. Ингаляционное применение кортикостероидов при астме приводит к повышению экспрессии мРНК FOXP3, что может рассматриваться как один из механизмов их терапевтического действия. Ремиссия при лечении ингаляционными кортикостероидами сопровождается увеличением экспрессии FOXP3 и снижением экспрессии его антагониста - провоспалительного цитокина IL-17.

5. Прямая корреляционная связь между количеством Treg и экспрессией гена FOXP3 выявлена только в группе условно-здоровых детей. При обострении аллергии выявлена обратная корреляционная связь между экспрессией генов FOXP3 и IL-17, что свидетельствуют о сдвиге баланса Treg/Thl7 в сторону преобладания провоспалительных цитокинов.

6. Лимфоциты, имеющие фенотип CD4+CD25+FOXP3+, определяются в тимусе плодов человека 14 недель развития. В этот срок данные клетки отсутствуют в печени, селезенке и костном мозгу плодов.

7. Дифференцировка естественных регуляторных Т-клеток из клеток-предшественников кроветворных органов плода человека может быть воспроизведена in vitro в условиях контактных взаимодействий с эпителием тимуса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе затронуто два аспекта исследования Treg. Во-первых, охарактеризована субпопуляция регуляторных Т-клеток у детей с аллергическими заболеваниями (атопической бронхиальной астмой, аллергическим риноконъюнктивитом, атопическим дерматитом). Во-вторых, обоснована возможность получения этих клеток путем индукции их дифференцировки in vitro для последующего использования с целью адоптивной иммуноцитотерапии, в частности, аллергических заболеваний.

Обследование детей с аллергией подтвердило, что факторами риска развития алллергических заболеваний у детей являются: наследственная отягощенность (аллергические заболевания у родителей и родственников), особенно по материнской линии, и аллергические проявления в раннем возрасте. Заболевание сопровождается эозинофилией и увеличением уровня общего IgE в крови. У детей с аллергическими заболеваниями часто отмечается полисенсибилизация> (к бытовым, пыльцевым, эпидермальным аллергенам). У них определяется дисбаланс ТЫ'- и ТЬ2-субпопуляций лимфоцитов с преобладанием клеток, продуцирующих IL-4 (ТЬ2-лимфоцитов), что соответствует сложившемуся- представлению о соотношении этих клеток при аллергии. Содержание Т-лимфоцитов и, их субпопуляций (Т-хелперы, Т-цитотоксические лимфоциты) в крови статистически значимо не различаются при сравнении групп детей с аллергическими заболеваниями и условно-здоровых детей.

Аллергическому процессу свойственно повышение процентного содержания CD4 CD25 независимо от нозологии заболевания (бронхиальная астма, аллергический риноконъюнктивит, атопический дерматит), его тяжести, особенностей сенсибилизации и уровня общего IgE в крови. Повышение проявляется особенно четко при ремиссии заболеваний. При этом экспрессия FOXP3 в клетках мононуклеарной фракции крови не изменяется. Повышение содержания Treg при аллергии описано и другими авторами, причем, как правило, оно сопровождалось ослаблением функции этих клеток [95,118,157]. Мы также наблюдали выраженное снижение супрессорной функции Treg при аллергических заболеваниях. Возможно, что повышение содержания Treg представляет собой компенсаторную реакцию на снижение их функции, которая обеспечивает нормальный уровень суммарной экспрессии FOXP3 и частично восполняет функциональную недостаточность. Отсутствие увеличения численности Treg, наблюдаемое при рецидивах аллергических процессов, можно рассматривать как фактор, способствующий обострению (отсутствие или недостаточность компенсации). Все это может служить основой предположения, что первичное изменение Treg при аллергии состоит в ослаблении их функции; в тех случаях, когда этот дефект полностью или частично компенсируется за счет повышения численности клеток, развивается ремиссия; отсутствие компенсации обусловливает развитие обострений аллергических заболеваний.

Изменение содержания Treg в возрастном аспекте показывает, что в норме содержание Treg постепенно снижается, с возрастом, тогда как при аллергии проявляется лишь начальный этап этого снижения (от рождения - до 6- лет), который в дальнейшем остается незавершенным. Оценить значимость этой особенности онтогенеза Treg для развития аллергопатологии пока не представляется возможным.

У детей с аллергией изменяется не только содержание естественных (CD4+CD25hiFOXP3+), но и адаптивных регуляторных Т-клеток: при обострении аллергических заболеваний повышаются уровни экспрессии мРНК генов супрессорных цитокинов IL-10 и TGFp - маркеров Trl и Th3-клеток, соответственно.

В носовом секрете при аллергии повышена экспрессия генов как провоспалительных IL-6 и IL-17, так и супрессорных цитокинов IL-10 и TGFP, что может свидетельствовать о большей активности локального аллергического воспаления, причем при вовлечении в аллергический процесс не только слизистой оболочки носовых ходов (аллергичекий ринит), но и других органов и тканей (бронхов при бронхиальной астме или кожи при атопическом дерматите). Экспрессия FOXP3 в носовой слизи в 2-2,5 раза ниже, чем в клетках крови, что, по-видимому, обусловлено низким содержанием клеток, в том числе Treg, в носовой слизи.

Ингаляционное применение кортикостероидов при бронхиальной астме повышает экспрессию FOXP3, что может рассматриваться как один из механизмов их терапевтического действия. Однако данные о влиянии ИГКС на функцию Treg отсутствуют, и это затрудняет более интегральную оценку их эффектов с точки зрения влияния ИГКС на проявления действия Treg при аллергических заболеваниях. Ремиссия при лечении ИГКС сопровождается увеличением экспрессии FOXP3 и снижением экспрессии его антагониста - провоспалительного цитокина IL-17.

Прямая корреляционная связь между количеством Treg и экспрессией гена FOXP3 выявлена только в группе условно-здоровых детей. При обострении аллергических процессов выявлен дисбаланс FOXP3/IL-17 в сторону преобладания провоспалительного цитокина IL-17, что не удивительно, поскольку IL-17 через посредство промежуточных механизмов подавляет экспрессию FOXP3 [25]. Пока не представляется возможным объяснить появление прямой корреляционной связи между экспрессией IL-6 и FOXP3 при,терапии ИГКС, поскольку известно, что IL-6 также подавляет экспрессию FOXP3 и дифференцировку Treg [50].