Автореферат и диссертация по медицине (14.01.02) на тему:Сахарный диабет 1 типа и латентный аутоиммунный диабет взрослых (LADA): клинические, иммуно-генетические и гормонально-метаболические аспекты

005003281

Никонова Татьяна Васильевна

Сахарный диабет 1 типа и латентный аутоиммунный

диабет взрослых (LADA): клинические, иммуно-генетические и гормонально-метаболические аспекты

(14.01.02 -эндокринология)

- 1 ДЕК 2011

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 2011 г.

005003281

Работа выполнена в ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздравсоцразвития РФ (директор - академик РАН и РАМН, профессор Иван Иванович Дедов).

Научный консультант:

Академик РАН и РАМН, профессор, доктор медицинских наук Дедов Иван Иванович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, Галстян Гагик Радиков ич Доктор медицинских наук, профессор Петунина Нина Александровна Доктор медицинских наук, профессор Бирюкова Елена Валерьевна

Ведущее учреждение

ГОУ ДПО «Российская Медицинская Академия Последипломного Образования Росздрава»

Защита диссертации состоится « 21 » декабря 2011 г. в 14 часов на заседании специализированного совета Д 208.126.01 при ФГУ «Эндокринологический научный центр» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 117036 Москва, ул. Дм. Ульянова, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ ЭНЦ Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат разослан «_» ноября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, Доктор медицинских наук

Е.А. Трошина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

По определению экспертов Всемирной Организации Здравоохранения: «Сахарный диабет является проблемой всех возрастов и всех стран». В связи с ранней инвалидизацией и высокой смертностью больных решение вопросов, связанных с этим заболеванием, поставлено во многих странах мира на государственный, федеральный уровень.

Сахарный диабет 1 типа (СД1) составляет 10% всех случаев диабета. Он ассоциирован как с хроническими осложнениями, так и острыми, угрожающими жизни состояниями, такими как кетоацидоз и гипогликемия. В медицинской практике диагностика различных типов сахарного диабета (СД) основывается на клинических характеристиках и в типичных случаях не вызывает трудностей. В последние годы появились формы СД, которые не отвечают критериям принятой традиционной классификации ВОЗ (1999). Одним из вариантов течения аутоиммунного СД является латентный аутоиммунный диабет взрослых - «latent autoimmune diabetes in adults» (LADA) [Zimmet P.Z., 1995]. Он характеризуется клинической картиной не типичной для классического СД 1; несмотря на наличие аутоантител, аутоиммунная деструкция развивается медленно, что не сразу приводит к развитию потребности в инсулине. Данная форма СД занимает промежуточное положение между СД 1 и СД 2, и в последней классификации не выделяется в отдельную номенклатурную единицу. Наличие в дебюте заболевания клинической картины СД 2 затрудняет диагностику и своевременное начало инсулинотерапии у пациентов с LADA. В связи с этим разработка дифференциально-диагностических критериев LADA имеет большое практическое значение.

СД 1 является полигенным многофакторным заболеванием, то есть, проявление болезни определяется взаимодействием средовых и генетических факторов. Наибольшее значение из известных генетических маркеров СД 1 имеют гены, расположенные в области главного комплекса гистосовместимости человека (HLA) на хромосоме 6р21.3 (IDDMl) [DaviesJ.L., 1994]. В последние годы, в том числе и на основе полных геномных поисков, обнаружена ассоциация с СД 1 ряда новых локусов. Вторым по значимости генетическим фактором определяющим предрасположенность к СД 1 является локус IDDM2, расположенный на хромосоме 11р15.5 и отождествляемый с

геном инсулина (INS) [Bennett S.T., 1995]. Также, предрасположенность к СД1 ассоциирована с геном PTPN22, кодирующим тирозиновую фосфатазу лимфоидных клеток, и отвечающим за супрессию иммунного ответа, осуществляемого Т-клетками [Bottini N., 2004; Smyth D., 2004]. Исследования ассоциации гена PTPN22 с СД 1 в русской популяции немногочисленны [Носиков В.В., 2010], у пациентов с LADA до настоящего времени не проводились.

Как и классический СД 1, LADA связан с потерей иммунологической толерантности к собственным антигенам и характеризуется селективным разрушением ß-клеток панкреатических островков лимфоцитами CD8+ (цитотоксическими) и CD4+ (эффекторными). В настоящее время основной группой лимфоидных клеток, отвечающих за поддержание аутотолерантности, считают пул CD4+ лимфоцитов, экспрессирующих маркерную молекулу CD25 - a-цепь рецептора IL-2 (IL-2R) [Sakaguchi S., 2001]. Субпопуляцию CD4+CD25+hlBh называют регуляторными Т- клетками (Treg). Treg стремятся ликвидировать активный ответ Т-клеток и предотвратить развитие аутоиммунных реакций, регулируя численность популяции Т-клеток и их дифференциацию, а также функцию эффекторных Т-клеток [TangQ., 2006]. Функциональные свойства Treg опосредованы активностью Fox РЗ (forkhead box) [Zheng Y., 2007] - фактора транскрипции, непосредственно и косвенно регулирующего экспрессию более 300 генов. Супрессорная активность Treg непосредственно зависит от интенсивности экспрессии гена FOXP3 [Pop S.M., 2005]. Снижение количества этих клеток или их супрессорнон активности могут способствовать потере аутотолерантности к антигенам ß-клеток и развитию аутоиммунного процесса. В литературе приводятся достаточно противоречивые данные по характеру изменений количественных и функциональных показателей Treg при различных заболеваниях, в том числе при СД 1. При LADA количественная и функциональная активность Treg, которые могут рассматриваться в качестве центральных регуляторов иммунного ответа и главных носителей феномена иммунологической толерантности, до сих пор остаются практически не изученными.

При СД 1 одной из причин развития аутоиммунитета является нарушение процесса элиминации аутореактивных иммунных лимфоидных клеток. В норме клоны аутореактивных клеток подвергаются апоптозу [Gronski М., 2006]. Взаимодействие поверхностных маркерных молекул CD95(Fas) с лигандом - CD95L (FasL) запускает процесс гибели клеток. Таким образом, уровень экспрессии CD95 на поверхности клетки

4

определяет её готовность к вступлению в апоптоз. Однако маркёры апоптоза лимфоцитов у пациентов с LADA недостаточно изучены.

При СД1 важнейшую роль играет секреторная активность ß-клеток, так как именно снижение секреции инсулина приводит к его абсолютному дефициту в крови. Между тем, определение содержания инсулина в периферической крови не точно отражает эндогенную секрецию инсулина. Инсулин и С-пептид секретируются поджелудочной железой в эквимолярных количествах, но 50% или более инсулина расщепляется при первом же прохождении через печень. Именно поэтому в большинстве исследований о секреции инсулина судят по концентрации С-пептида, измеренной после продолжительного голодания (более 10 часов) и на фоне стимуляции (GST, OGTT, ММТТ). В настоящее время в международных исследованиях в качестве «золотого стандарта» для оценки секреторной функции ß-клеток принято использовать ММТТ с количественным определением концентрации С-пептида в крови [Greenbaum С., 2008]. Использование стандартного количества смешанной пищи считают более физиологичным стимулятором секреции инсулина, чем внутривенное введение глюкагона и пероральный приём раствора глюкозы. В связи с этим, вопросы сравнительного изменения секреторной активности ß-клеток на фоне ММТТ при СД 1, LADA и СД2 представляют большой интерес.

Цель исследования

Изучить гетерогенность аутоиммунного сахарного диабета 1 типа, варианты дебюта и прогрессирования заболевания на основании клинических, гормонально-метаболических и иммуно-генетических особенностей.

Задачи исследования

1. Определить варианты развития и течения аутоиммунного сахарного диабета

1 типа:

• «Классический» иммуноопосредованный СД 1;

• Латентный аутоиммунный диабет взрослых (LADA).

2. Исследовать особенности распределения гаплотипов и генотипов генов HLA, оценить степень аутоиммунной агрессии при различных клинических вариантах течения СД1.

3. Изучить ассоциацию полиморфных маркеров генов кандидатов, определяющих предрасположенность к аутоиммунному поражению ß-клеток (полиморфного маркера R620W гена PTPN22, полиморфного маркера -23HphI гена INS), с различными вариантами течения СД I.

4. Оценить уровень экспрессии маркёров апоптоза на лимфоцитах периферической крови у больных СД1, LADA, а также на фоне ремиссии СД1.

5. Изучить особенности распределения гаплотипов и генотипов генов HLA, показатели субпопуляционного состава лимфоцитов и экспрессию гена FOXP3 у лиц из группы риска развития СД 1.

6. Оценить экспрессию гена FOXP3 и количество регуляторных Т-лимфоцитов у больных СД 1 и LADA, а также на фоне ремиссии СД1.

7. Оценить функциональную возможность ß-клеток и периферическую инсулинорезистентность у больных с СД1, LADA и в группе риска развития СД1.

8. Оценить диагностическую значимость изучаемых маркёров.

Научная новизна

• Впервые определены иммунологические особенности у пациентов с LADA в сравнении с пациентами СД 1, а также у лиц из группы риска развития СД 1: исследована экспрессия маркёров апоптоза лимфоцитов периферической крови; определена интенсивность экспрессии гена FOXP3 и количество регуляторных Т-лимфоцитов типа CD4+CD25+Mgh.

• Впервые исследованы особенности иммунологических ауторегуляторных процессов у пациентов с различной длительностью СД 1 и LADA: определена интенсивность экспрессии гена FOXP3 и количество регуляторных Т-клеток при различной длительности СД 1 и LADA.

• Впервые исследованы особенности иммунологических ауторегуляторных процессов у пациентов с ремиссией СД 1: определена интенсивность экспрессии гена FOXP3 и количество регуляторных Т-клеток, исследована экспрессия маркёров апоптоза лимфоцитов периферической крови.

• Впервые в России проведено сравнительное исследование ассоциации полиморфных генетических маркеров -23HphI гена INS и R620W гена PTPN22 с

б

заболеванием LADA и СД 1.

• Впервые проведена сравнительная оценка функциональных возможностей ß-клеток по их суммарному секреторному ответу в ходе ММТТ у больных с СД 1 и СД 2, LADA и в группе риска развития СД 1.

• Впервые показано сочетание инсулинорезистентности и снижения функции ß-клеток вследствие аутоиммунного процесса у пациентов с впервые выявленным заболеванием LADA (по данным НОМА-модели).

• На основе проведённых исследований впервые предложены критерии для клинико-лабораторной дифференциальной диагностики различных вариантов течения аутоиммунного СД (СД 1 и LADA) и СД 2.

Практическая значимость

Проведённая работа позволила сформулировать критерии для максимально точной клинико-лабораторной дифференциальной диагностики различных вариантов течения аутоиммунного СД и СД 2. Показано, что верификация диагноза должна строиться не только на характерных особенностях клинической картины заболевания, но и на результатах исследования секреторной активности ß-клеток и иммунного статуса, а также с учётом особенностей генотипа.

Показана значимость результатов генетического исследования не только локуса HLA, но и генов INS (маркер -23HphI) и PTPN22 (маркер R620W) для проведения дифференциальной диагностики впервые выявленного СД.

Полученные результаты позволяют рекомендовать оценку функции ß-клеток и инсулинорезистентности периферических тканей с использованием НОМА-модели, определение секреторной функции ß-клеток с использованием ММТТ теста у взрослых пациентов с впервые выявленным СД для проведения дифференциальной диагностики и оптимизации лечения.

Полученные результаты расширяют представление о ключевых особенностях патогенеза различных вариантов течения аутоиммунного СД и могут служить основой для дальнейших исследований в этой области.

Апробация работы

Основные положения исследования доложены на Российских диабетологических и эндокринологических конгрессах в г. Москва (2004, 2010), X конгрессе Международной Диабетологической Федерации (Париж, Франция, 2003), IX региональной конференции по лечению сахарного диабета 2 типа (Берлин, Германия, 2009), 46 сессии Европейской Ассоциации по изучению сахарного диабета (Стокгольм, Швеция, 2010), Европейских конгрессах эндокринологов. Апробация диссертации проведена на межотделенческой научной конференции ФГУ «Эндокринологический научный центр» Минздравсоцразвития РФ 14 июня 2011 года. По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ в отечественных и зарубежных научных изданиях. Вклад соавторов отражен в публикациях по теме.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, указатель литературы, включающий 391 источник. Диссертация изложена на 243 страницах и содержит 41 таблицу и 47 рисунков.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы внедрены в клиническую практику отделения программного обучения и лечения ФГУ ЭНЦ Минздравсоцразвития РФ, используются в лекционном курсе и семинарских занятиях курсантов кафедры детской эндокринологии и диабетологии ФППО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова.

Материалы и методы исследования Клиническая характеристика больных

В исследование были включены 684 человека (382 мужчины, 302 женщины), которые были разделены на 3 основные и 2 контрольные группы.

Три основные группы:

• 1 группа— 387 пациентов (223 мужчины (57,6%), 164 женщины (42,4%)) с «классическим» дебютом СД 1; с различной длительностью заболевания, (149 чел - с впервые выявленным СД (1-й год заболевания); 104- с длительностью СД от 1 года до 5 лег;76- с длительностью СД от 6 до 10 лет;58- с длительностью СД свыше 10 лет).

• 2 группа— 143 пациента (97 мужчин (68,5%), 46 женщин (31,5%)) с латентным аутоиммунным диабетом взрослых (LADA), с различной длительностью заболевания (52 чел - с длительностью до 1 года; 49- с длительностью СД от 1 года до 5 лет;35- с длительностью СД от 6 до 10 лет;7- с длительностью СД свыше 10 лет).

• 3 группа — 33 человека (10 мужчин, 23 женщины), составили лица с положительными аутоантителами, ассоциированными с развитием СД 1 (GADA, IA-2A, ICA, IAA) (случайная выборка), группа была условно названа группой риска.

В качестве контроля были обследованы 2 группы (56 человек— контрольная группа здоровых лиц, 65 человек - контрольная группа пациентов с СД 2).

Диагноз СД устанавливался на основании клинической картины и данных лабораторного обследования в соответствии с критериями Всемирной Организации Здравоохранения [World Health Organization, 1999]. «Классический» вариант СД 1 диагностировался при наличии яркой клинической картины (полидипсия, полиурия, значительная потеря массы тела), кетонурии, низких значений С-пепгида. Диагноз LADA, ставился пациентам с дебютом заболевания в возрасте старше 30 лет, постепенным началом, положительными аутоантителами к аутоантигенам ß-клетки и/или инсулину, отсутствием кетонурии, нормальными значениями базальной концентрации С-пептида в сыворотке крови [P. Zimmet, 1994]. Во 2-ю группу (LADA) были включены 117 пациентов с первичным диагнозом СД 2 (что составило 82,8% от всей группы), с положительными титрами аутоантител, ассоциированных с СД, получавшие в течение не менее чем 6 мес. сахароснижающие пероральные препараты в качестве моно- или комбинированной терапии без значимого клинического эффекта и 26 пациентов, которым был сразу поставлен диагноз LADA.

Критериями исключения из исследования была вакцинация и приём иммуномодулирующих препаратов в течение предшествующего года, и наличие других аутоиммунных заболеваний (тиреовдит, астма и др.) при первичном обследовании.

Основные клинико-лабораторные показатели больных СД в исследуемых группах

9

на момент дебюта представлены в таблице 1.

Таблица 1. Клинико-лабораторные показатели больных СД на момент дебюта

СД 1 (п=149) LADA (п=52)

Возраст дебюта, годы 27,0 [21,0; 33,0] 38,0 [30,2; 43,1]

ИМТ в дебюте, кг/м2 21,9 [20,6; 23,9] 28,8 [23,8; 31,2]

НЬА1с, % 9,3 [7,3; 12,1] 8,3 [6,6; 10,9]

С-пептид, нг/мл 0,8 [0,6; 1,2] 1,8 [1,3; 2,6]

Инсулин, мкЕд/мл 2,7 [2,0; 4,5] 9,8 [3,2; 11,5]

ИРИ у больных СД 1 в дебюте представлен для пациентов, не получавших инсулин на момент обследования.

У 13 человек (8,7%) (8 мужчин и 5женщин) из группы с впервые выявленным СД1 на фоне компенсации было отмечено снижение потребности в экзогенном инсулине (<0,4 Ед/кг/сут), из них у трех (2%) - ремиссия заболевания (восстановление эугликемии без инсулинотерапии на срок более 2 недель) по критериям, утвержденным IDK3. (International Diabetic Immunotherapy Group)

В третью группу (группу риска развития СД 1) вошли лица с положительными результатами повторного определения аутоантител, ассоциированных с развитием СД 1 (GADA, IA-2A, ICA, IAA). Обследуемые были в возрасте 28,5 лет [21,5; 35,5], с индексом массы тела (ИМТ) 26,03 кт/м2 [22,77; 30,15], НЬА]С 5,6 % [5,4; 5,7], базальным уровнем С-пептида в крови 1,7нг/мл [1,2; 4,1], инсулина - 7,2 мкЕд/мл [5,4; 8,6]. У 3 человек из группы риска родственники первой степени родства болели СД 1.

Первую контрольную группу составили 56 практически здоровых лиц (30 мужчин и 26 женщин), в возрасте 34 года [24; 53], ИМТ составил 21,34 кг/мг [18,90; 30,67], HbAk 5,4 % [4,8; 5,5], базальный уровень С-пептида в крови 2,3 нг/мл [1,5; 4,5], инсулина 7,3 мкЕд/мл [4,2; 9,2].

Критериями включения в контрольную группу были: отсутствие нарушений углеводного обмена и отрицательные аутоантитела к антигенам ß-клетки (GADA, IA-2A, ICA, IAA).

Вторую контрольную группу составили 65 больных СД 2 (22 мужчин и 43 женщин), в возрасте 44,0 года [39,5; 51,0], ИМТ пациентов составил 30,68 кг/м2 [25,95; 35,08], HbAic 8,7% [7,3; 10,8], базальный уровень С-пептида в крови 3,1 нг/мл [1,8; 4,0],

инсулина - 17,9 мкЕд/мл [7,2; 22,0]. Иммуногенетическое обследование

Количественное определение ICA, GADA, IAA и IA-2A в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов "Isletest-ICA, GADA, IAA" ("Biomerica", Германия) и "Medizym" ("Medipan GMBH", Германия).

Определение экспрессии поверхностных молекул на лимфоцитах периферической крови проводили на проточном цитометре "FACSCalibur" по стандартной методике с использованием моноклональных антител (одинарной и двойной меткой) к CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD38, HLA-DR ("Becton Dickinson", США) и CD95, CD95L ("Immunotech", Франция). При этом оценивали процентное содержание субпопуляций лимфоидных клеток, экспрессию дифференцировочных антигенов и абсолютное количество указанных субпопуляций лимфоидных клеток.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили с помощью наборов пробоподготовки "DNA prep". В настоящей работе ДНК-типирование выполнялось методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции по аллельным вариантам трех генов HLA класса II: DRB1 (14 специфичностей), DQA1 (8 аллелей) и DQB1 (13 аллелей). Для определения полиморфных аллелей данных генов применялись коммерческие наборы производства ЗАО "НПФ ДНК-Технология" (Россия). Полимеразная цепная реакция проводилась согласно регламенту, указанному производителем. Амплификацию проводили на амплификаторе 'Терцик" (Россия). Гаплотипы составлялись на основе известных таблиц сцепления. Исследования выполнены в лаборатории генетики и клинической иммунологии ФГУ ЭНЦ (заведующий — к.м.н. Прокофьев С.А.).

Амплификацию полиморфного микросателитного маркера R620W гена PTPN 22 и полиморфного участка -23НрЫ гена INS проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме "реального времени" на термоциклере "Dyad" (Bio-Rad). Обозначения полиморфных маркеров даны в соответствии с базой данных dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/). Анализ генотипов полиморфных маркеров ряда генов проводили методом детекции флуоресценции «по конечной точке» на термоциклере "ABI 7500 Fast" (Applied Biosystems) с помощью встроенных средств программного обеспечения SDS версии 1.4. Для исследования ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов у пациентов с заболеванием LADA в сравнении с "классическим" СД 1

использовался подход «случай-контроль». Контрольная группа (206 чел.) представляла собой случайную выборку. Выборки были этнически однородны, составлены из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве и не являющихся родственниками. В нашей работе распределение частот генотипов всех полиморфных маркеров исследуемых генов в группе здоровых индивидов соответствовало распределению Харди-Вайнберга, существенных отличий от частот аллелей и генотипов в европейских популяциях обнаружено не было (данные о частотах в европейской популяции взяты из проекта НарМар, http:// hapmap.org).

Исследования выполнены в ФГУП «ГосНИИ генетика», г. Москва (директор - к.б.н. М.Ю. Бебуров, зав. лабораторией молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии - д.б.н., проф. В.В. Носиков).

Для определения интенсивности экспрессии гена FOXP3 проводилось выделение тотальной РНК из образцов крови данных групп пациентов при помощи набора для выделения РНК Yellow Solve (Клоноген, Санкт-Петербург). Концентрацию выделенной РНК определяли спекгрофотометрически при помощи NanoDrop ND-1000 UV/VIS NanoDrop Technologies USA. Обратную транскрипцию проводили с использованием в качестве затравки случайных гексамеров и набора для обратной транскрипции ImProm -IIIм Reverse Transcription (Promega, США).

Количественное определение экспрессии генов осуществляли с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) на приборе Step One Plus фирмы Applied Biosystems (США). Каждое измерение проводили трехкратно. Для проведения ПЦР-РВ были синтезированы праймеры и отработаны оптимальные условия амплификации. В качестве эндогенного контроля использовали ген GAPDH. Для определения диапазона нормальных показателей интенсивности экспрессии гена FOXP3 было обследовано 85 здоровых доноров.

Исследования выполнены в Медико-генетическом научном центре Российской академии медицинских наук, Москва (директор— академик РАМН Гинтер Е.К., зав. лабораторией молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний - д.б.н. Карпухин A.B.).

Биохимическое обследование

Содержание уровня HbAtc определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) на аппарате D-10 ("Bio-Rad", Франция) по стандартной методике производителя. Исследование выполнено в лаборатории клинической биохимии ФГУ ЭНЦ (заведующий — Ильин A.B.).

Определение концентрации С-пептида и инсулина проводили иммунохемолюминисцентным методом на аппарате "Elecsys 2010" ("Roche", Германия).

Для оценки функциональной возможности ß- клеток был проведен тест ММТТ— (,mixed meal tolerance test) с приёмом стандартного количества жидкой смешанной пищи (Ensure Plus). Определение базальной секреции происходило путём измерения концентрации С-пегггида после длительного голодания (в течение 10 часов); определение выраженности секреторного ответа проводилось путём определения концентрации С-пептида через 30, 60, 90, 120, 180 минут в ходе ММТТ. Оценивался суммарный секреторный ответ в виде площади под кривой значений концентрации С-пептида. Для характеристики общей функциональной активности ß-клеток использовался относительный показатель - HOMA-F-индекс.

НОМА (homeostasis model assessment) - эмпирическая, математически обработанная модель, предназначенная для характеристики общей функциональной активности ß-клеток и инсулинорезистентности на основании только базальных показателей глюкозы плазмы и инсулина, что доступно для выполнения и широко используется в исследованиях. Условно в норме функция ß-клеток составляет 100%. Общая функциональная активность ß-клеток = 20хИРИ0 (мкЕд/мл) / (ГПН (ммоль/л)-3,5). HOMA-IR-индекс - относительный параметр, характеризующий общую периферическую инсулинорезистентность. Индекс инсулинорезистентности ИРИ0 (мкЕд/мл)хГПН (ммоль/л) / 22,5. По НОМА-модели условно инсулинорезистентность у здорового человека соответствует 1 баллу.

Исследования выполнены в гормональной лаборатории ФГУ ЭНЦ (заведующий — проф., д.м.н. Гончаров Н.П.).

Статистическая обработка полученных данных

Проведена с использованием пакета прикладных программ statistica (StatSoft Inc. США, версия 6.0). Для анализа вида распределений применялись критерии Шапиро-Уилка и Лиллиефорса, дисперсии распределений признаков оценивались с помощью F-критерия в процедуре дисперсионного анализа ANOVA. Сравнение групп по количественным признакам осуществлялось непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна-Уитни. Сравнение групп по качественным признакам осуществлялось непараметрическим методом путем анализа таблиц сопряженности с использованием двухстороннего точного критерия Фишера для несвязанных групп и критерия МакНемара для связанных групп. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05. Анализ связи (корреляции) двух количественных признаков осуществлялся непараметрическим методом ранговой корреляции по Спирмену. Для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркеров в группах с наличием и отсутствием заболевания нами использовался критерий Значимыми считали различия при р < 0,05.

Результаты исследований, обработанные статистически и представленные в виде таблиц или диаграмм, дают возможность судить о динамике медианы параметра, достоверности и интерквартильном отрезке, а также связи с изменениями других параметров в соответствии с современными требованиями.

Результаты исследования и их обсуждение

Учитывая аутоиммунный характер СД и выраженную генетическую ассоциацию заболевания с генами (DRB1, DQA1, DQB1) локуса HLA класса II нами были определены и проанализированы ряд генетических и иммунологических характеристик при СД 1 и LADA.

HLA-генотипирование было проведено всем обследуемым. Контрольная группа (149 чел.) представляла собой случайную выборку. Выборка была этнически однородна, составлена из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве и не являющихся родственниками. Анализировали частоту встречаемости различных генотипов и комбинаций гаплотипов HLA у пациентов с СД 1, LADA и в контрольной группе (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение HLA генотипов в группах с СД 1 и у пациентов с LADA

Генотип СД1 (п=387) LADA (п=143) Контроль (п=149) Различие меазду группами (р)

Генотип с высоко предрасполагающими гаплотипами

DRB1 *04 -DQA1 *0301-DQB1*0302/DRB1*04• DQA1*030I-DQB1*0302 9% 1,4% 0% Pi-2 =0,002 ри <0,001 р2.3 =0,148

DRB1*03-DQA1* 0501-DQB1 *0201/DRB1 *03-DQA1 *0501-DQB1 *0201 8% 6,3% 1.3% р,.2 =0,507 pi_3 =0,004 р2.з =0,026

DRB1 *04 -DQA 1 *030I -DQB1*0302/ DRB 1*03-DOA1*0501-DOB1*0201 28,9% 9,8 % 2.7% ри <0,001 р,.з <0,001 Р2-з =0,012

Генотип с комбинацией предрасполагающих гаплотипов

DRB1 *03-DQAl * 0501-DQB1 *0201/DRB1 *01-DQA 1*0501 -DQB1*0101 3,9% 7,0% 2.7% р,.2 =0,133 pi-з =0,504 р2-з =0,085

DRB 1*04 -DQA 1*0301-DQBI *0302/DRB1 *01-DOA1*0501 -DOBJ*0101 5,9% 4,2% 2.7% р,.2 =0,432 р,.3=0,122 рм =0,478

Генотип с предрасполагающими н протекгивными гаплотнпами

DRB1 *03 -DQA1*0501-DQB1*02011 * Y 4,9% 14% 6.7% р,.2 <0,001 р,.з=0,394 р2-з =0,041

DRBl *04 -DQA1 *0301-DQB1*03021 * У 10,1% 16% 5.4% р,.2 =0,056 рьз =0,084 р2.з =0,003

DRBl *01- DQA 1 *0501 -DOB 1*01011 * Y 2.1% 0% 4.7% р ,.3=0,098

Генотип с предрасполагающими н нейтральными гаплотипами

DRBl *03 -DQA1 *0501-DQB1 *02011 *Х 4,9% 14% 8.0% pi.2 <0,001 р,.з=0,162 р2.з =0,105

DRBl *04 -DQA1 *0301-DQB1*0302/ *Х 8% 7,0% 2.7% pi.2 =0,697 рм =0,025 Р2-з =0,085

DRBl *01- DQA1 *0501 • DOB1*0101I *Х 1.3% 0% 2.7%) риз =0,261

Грнптип с ппптектнвными и нейтральными гаплотипами

Гаплотип Y / гаплотип X 3,2% 9,8% 30.9% Pi.2 =0,002 pt.3 <0,001 Рз.з <0,001

Генотип с протекгивными гаплотипами

ГаплотипУ/гаплотип Y 3,9% 4,2% 18.1% р,.2 =0,867 р,.з <0,001 р2.з <0,001

Генотип с нейтральными гаплотипами

Гаплотип X / гаплотип X 5,9% 6,3% 11.4% pi.2 =0,88 р,.з =0,031 р2-з =0,125

X - нейтральный гаплотип; Y - протективный

При сравнительном анализе распределения генотипов НЬА класса II у пациентов с

СД 1, LADA и в контрольной группе наблюдались выраженные отличия по частоте как высоко предрасполагающих, так и протективных генотипов и гаплотипов.

В группе пациентов с СД 1 частота генотипов с двумя предрасполагающими гаплотипами оказалась значительно выше (55,7%), чем с одним предрасполагающим гаплотипом в сочетании с протективным или нейтральным (31,3%). Напротив, в группе пациентов с LADA, в отличие от СД 1, частота генотипов с двумя предрасполагающими гаплотипами значительно ниже (28,7%) (р<0,001), чем с одним предрасполагающим гаплотипом в сочетании с протективным или нейтральным (51,0%) (р<0,001). В контрольной группе преобладали генотипы с комбинацией протективных и нейтральных гаплотипов, частота генотипов с двумя предрасполагающими гаплотипами была статистически значимо ниже по сравнению с СД 1 и LADA. Таким образом, подтверждена ассоциация HLA класса II с развитием как LADA, так и СД 1. Вероятно, именно наличие только одного предрасполагающего гаплотипа в сочетании с протективным или нейтральным в генотипе больных LADA обуславливает менее агрессивное течение заболевания и может являться одной из характеристик LADA.

При HLA-типировании в группе риска развития СД 1 были получены результаты преобладания частот протективных и нейтральных гаплотипов и генотипов по сравнению с классическими предрасполагающими. Поскольку исследование было проведено на малой выборке, полученные данные требуют дальнейшего анализа.

Область предрасположенности IDDM2 содержит собственно ген ¡NS и

полиморфный минисателлит, расположенный в 5'-концевой части этого гена (5'-VNTR)

в промоторной области. Он состоит из тандемно повторяющихся единиц размером 14-15

п.н. Генетический риск ассоциирован с разным числом повторов минисателлитного

маркера VNTR. В зависимости от их числа аллели VNTR подразделяют на 3 класса.

Аллели класса I содержат от 26 до 63 повторяющихся единиц, тогда как аллели класса III

включают от 141 до 209 звеньев. Промежуточный по длине класс II редко встречается у

европеоидов и состоит из аллелей, содержащих около 80 тандемных повторов. Аллели

класса I гена инсулина были ассоциированы с предрасположенностью к СД1; в то время

как аллели класса III ассоциированы с пониженным риском развития этого заболевания

[Bennett S.T. 1995]. Накоплено достаточно данных о корреляции между аллелями VNTR

гена INS, уровнем синтеза мРНК проинсулина и секрецией продукта этого гена в клетках

поджелудочной железы и тимуса [Vafiadis Р., 1997]. У носителей аллелей класса I

уровень мРНК проинсулина в клетках поджелудочной железы в 1,5 - 2 раза выше, чем у

16

носителей аллелей класса III. Противоположная ситуация наблюдается в клетках тимуса. У носителей аллелей класса Ш уровень мРНК проинсулина в 2 - 3 раза выше, чем у носителей аллелей класса I. Предполагается, что более высокие уровни экспрессии гена INS в тимусе способствуют развитию центральной толерантности, что может объяснять защитную роль этого полиморфного маркера. Во многих исследованиях для идентификации аллелей VNTR использовался сцепленный с ним полиморфный маркер -23HphI (rs689) гена INS. Для русской популяции подобное исследование показало высокий уровень ассоциации этого полиморфного маркера с СД 1 [Лаврикова ЕЮ. и соавт., 2010]. В настоящем исследовании изучалась ассоциация полиморфного маркера-23HphI гена INS у пациентов с заболеванием LADA в сравнении с "классическим" СД 1 с использованием подхода «случай-контроль». Результаты представлены в таблицах 3-5.

Таблица 3. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера -23HphI гена INS в контрольной группе и у пациентов с СД 1

Аллели н генотипы Частота аллелей и генотипов Значение Х2 Уровень значимости Р OR

СД 1 Контроль

п = 177 11 = 206 значение CI95%

Аллель А 289/ 0,816 283/ 0,687 16,88 0,00004 2,03 1,44-2,85

Аллель Т 65/0,184 129/ 0,313 0,49 0,35-0,69

Генотип АА 118/ 0,667 102/ 0,495 15,82 0,0004 2,04 1,35-3,09

Генотип АТ 53/0,299 79/0,383 0,69 0,45-1,05

Генотип TT 6/0,034 25/0,121 0,25 0,10-0,63

Таблица 4. Сравнительный анализ распределения частот аллелей н генотипов полиморфного маркера -23HphJ гена INS в контрольной группе и у пациентов с LADA

Аллели и Частота аллелей и генотипов Значение Уровень значимости OR

генотипы LADA контроль

п = 92 п = 206 значение CI95%

Аллель А 153/ 0,832 283/ 0,687 13,55 0,00024 2,25 1,45 - 3,49

Аллель Т 31/0,168 129/ 0,313 0,44 0,29-0,69

Генотип АА 64/0,696 102/ 0,495 12,20 0,0023 2,33 1,38-3,93

Генотип АТ 25/0,272 79 / 0,383 0,60 0,35 -1,03

Генотип ТТ 3/0,033 25/0,121 0,24 0,07-0,83

Таблица S. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера -23HphI гена INS в группах LADA и СД1

Аллели и Частота аллелей и генотипов Значение Уровень значимости OR

генотипы LADA контроль та

п = 92 п = 177 значение CI95%

Аллель А 153/ 0,832 289/ 0,816 0,19 0,66 1,11 0,69-1,78

Аллель Т 31 /0,168 65/0,184 0,90 0,56-1,44

Генотип Л/1 64 / 0,696 118/ 0,667 0,24 0,89 1,14 0,66-1,97

Генотип АТ 25/0,272 53/0,299 0,87 0,50-1,53

Генотип ТТ 3/0,033 6/0,034 0,96 0,23-3,93

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного

маркера -23НрМ гена INS в группе с СД1 и контрольной группе, а также в группе с LADA и контрольной группе показал наличие достоверных отличий. Достоверное увеличение частоты аллеля А в группе больных СД1 и LADA говорит об ассоциации аллеля А и генотипа АА с повышенным риском развития как СД1, так и LADA. В то же время установлена ассоциация аллеля Г и генотипа ТТ с пониженным риском развития

18

СД1 и LADA. Достоверной разницы в распределении частот в группах LADA и СД1 обнаружено не было. Таким образом, полиморфный маркер -23HphI гена INS достоверно ассоциирован как с СД 1, так и с LADA.

Ген PTPN22, расположенный в хромосомной области 1р13.3-р13.1, входит в число наиболее значимых генов, предрасполагающих не только к СД типа 1, но и к ревматоидному артриту, системной красной волчанке и ряду других аутоиммунных заболеваний [Lee, .2007, Gregersen, 2006, Criswell, 2005]. Тирозиновая фосфатаза лимфоидных клеток (LYP), которая кодируется геном PTPN22, - внутриклеточный белок, специфичный для клеток иммунной системы [Cohen, 1999]. Тирозиновые фосфатазы Т-лимфоцитов осуществляют дефосфорилирование соответствующих белков, передающих сигнал от антигенных рецепторов Т-клеток и рецепторов цитокинов. В 2004 г. обнаружена ассоциация полиморфного маркера С1858Т гена PTPN22 с СД 1 [Bottini N., 2004]. Однонуклеотидному полиморфизму С1858Т соответствует аминокислотный полиморфизм R/W в положении 620 аминокислотной последовательности тирозиновой фосфатазы Т-лимфоцитов (R620W). Так как вклад полиморфного маркера С1858Т гена PTPN22 в формирование предрасположенности к СД 1 подтвердился в нескольких геномных анализах с использованием микрочипов высокой плотности [Todd, 2007, Cooper, 2008], мы изучили ассоциацию этого полиморфного маркера с заболеванием LADA в сравнении с СД 1 (табл. 6-8).

Таблица 6. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Л620УУ гена РТРИ22 в контрольной группе и у пациентов с СД 1

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Значение Уровень значимости Р OR

СД1 контроль

п = 162 п =203 значение CI95%

Аллель С 265/0,818 359/ 0,884 6,39 0,01 0,59 0,39-0,89

Аллель Т 59/0,182 47/0,116 1,7 1,12-2,57

Генотип СС 108/0,667 159/ 0,783 6,43 0,04 0,55 0,35-0,88

Генотип СТ 49/0,302 41/0,202 1,71 1,06-2,77

Генотип ТТ 5/0,031 3/0,015 2,12 0,50 - 9,02

Таблица 7. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера R620W гена PTPN22 в контрольной группе и у пациентов с LADA

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Значение Х2 Уровень значимости Р OR

LADA контроль

п = 92 п = 203 значение CI95%

Аллель С 165/0,897 359/ 0,884 0,20 0,66 1,14 0,65 - 2,00

Аллель Т 19/0,103 47/0,116 0,8В 0,50-1,55

Генотип СС 73 / 0,793 159/ 0,783 1,37 0,50 1,06 0,58 -1,95

Генотип СТ 19 / 0,207 41/0,202 1,03 0,56-1,89

Генотип ТТ 0/0,000 3/0,015 0,31 0,02 - 6,06

Таблица 8. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера R620W гена PTPN22 в группах LADA и СД 1

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Значение Уровень значимости Р OR

LADA СД1

п = 92 п = 162 значение CI95%

Аллель С 165/0,897 265 / 0,818 5,61 0,018 1,93 1,113,36

Аллель Т 19/0,103 59/0,182 0,52 0,300,90

Генотип СС 73 / 0,793 108/ 0,667 0,045 1,92 1,053,50

Генотип СТ 19 / 0,207 49/0,302 6,18 0,60 0,331,10

Генотип ТТ 0 / 0,000 5/0,031 0,15 0,01 -2,83

При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов

полиморфного маркера R620W гена PTPN22 в группах с СД1 и контрольной группой, а также в группе LADA и СД1 получены достоверные отличия, в то время как между группой LADA и контрольной группой достоверной разницы обнаружено не было.

Достоверное увеличение частоты аллеля Т (OR=l,7 р=0,01) и генотипа CT (OR=l,7 р=0,04) в фуппе больных СД1 говорит об их ассоциации с повышенным риском развития данной патологии. В то же время была установлена ассоциация аллеля С (СЖ=0,59 р=0,01) и генотипа СС (OR=0,55 р=0,04) с пониженным риском развития СД1. Таким образом, обнаружена ассоциация полиморфного маркера R620W гена РТРN22 с развитием СД1, однако, ассоциации с развитием LADA в нашей выборке не установлено. Поскольку исследование было проведено на малой выборке больных, полученные данные требуют дальнейшего анализа.

Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов, естественных регуляторных Т-клеток и их молекулярного маркера - гена FOXP3

Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов, естественных регуляторных Т-клеток и их молекулярного маркера- гена FOXP3 проводилось в выборке из 116 больных (67 мужчин, 49 женщин) СД1, выборке из 74 больных LADA (51 мужчина,23 женщины), а также у лиц исследуемой группы риска развития СД1 в сравнении с контрольной группой здоровых лиц.

Больные СД 1 были разделены на подгруппы в зависимости от длительности заболевания: первые 6 мес. заболевания — 21 человек, 6-12 мес. - 38 человек, со стажем СД от 1 года до 5 лет— 16, от 5 до 10 лет— 15, свыше 10 лет — 26 (табл. 9).

Таблица 9. Клинико-лабораторная характеристика пациентов с СД 1 (п=116)

до 6 мес. (п=21) 6-12 мес. (п=38) 1-5 лет (п=16) 5-10 лет (п=15) более 10 лет (п=26)

HbAic, % 10,1 [8,2; 14,1] 9,1 [6,4; Н,1] 7,2 [6,4; 9,8] 8,6 [7,4; 9,8] 9,2 [6,8; 11,9]

С-пептид, нг/мл 0,6 [0,3; 1,0] 0,7 [0,5; 0,8] 1,2 [0,6; 1,8] 0,5 [0,3; 0,8] 0,3 [0,1; 0,8]

ретинопатия нет нет 11,5% 38,2% 53,5%

нефропатия нет нет 3,8% 25,0% 46,6%

нейропатия нет нет 4,8% 18,4% 48,3%

Больные LADA были разделены на подгруппы в зависимости от длительности заболевания: первые 6 мес. заболевания — 14 человек, 6-12 мес. - 20 человек, со стажем СД от 1 года до 5лет— 26, от 5до Шлет— 14 (табл.10). Пациенты со стажем заболевания свыше 10 лет в данную выборку не вошли, в связи с малочисленностью.

Таблица 10. Клинико-лабораторная характеристика пациентов с LADA (п=74)

до 6 мес. (п=14) 6-12 мес. (п=20) 1-5 лет (п=26) 5-10 лет (п=14)

HbAu, % 8,9 [6,4; 11,1] 6,0 [5,3; 6,6] 6,6 [6,0; 7,2] 7,5 [6,3; 8,8]

С-пептид, нг/мл 1,8 [1,6; 2,6] 2,6 [2,4; 2,9] 2,1 [1,5; 2,3] 1,4 [0,8; 2,1]

ретинопатия нет нет 8,2% 25,7%

нефропатия нет нет 14,3% 31,4%

нейропатия нет нет 6,1% 20,0%

При сравнении частоты встречаемости и вида аутоантител у пациентов с СД 1 и LADA наиболее часто определялись антитела к GAD, причём чаще они выявлялись у пациентов с LADA: 53,1% по сравнению с 22,1% при СД 1 {р <0,05). Также отмечена большая частота встречаемости комбинации GADA+IA-2A при СД 1 (19% - в срок до 6 месяцев, 26,3% - до 12 месяцев) по сравнению с LADA (отсутствие - в срок до 6 месяцев, 10% - до 12 месяцев) (р<0,01), и большая частота встречаемости комбинации GADA+ICA при LADA (21,4% - в срок до б месяцев, 25,% - до 12 месяцев) по сравнению с СД 1 (9,5% - в срок до 6 месяцев, 5,3% - до 12 месяцев) (р<0,01).

В группе больных с СД 1, как с впервые выявленным, так и при продолжительном течении заболевания, количество регуляторных Т-лимфоцитов не отличалось от такового в группе контроля (р >0,05).(рис.1.)

Рис. 1. Количество клеток С04+С025+МдИ у пациентов с СД 1 при различной длительности заболевания.

Однако их функциональная активность (интенсивность экспрессии гена РОХРЗ) была достоверно ниже, чем в контроле. Низкая интенсивность экспрессии гена ИОХРЗ в сравнении с контролем отмечалась при любой продолжительности заболевания (рис. 2):

Рис. 2. Экспрессия гена FOXP3 у пациентов с СД1 при различной длительности заболевания.

Изменение экспрессии гена FOXPS у пациентов с LADA носило волнообразный характер, что не наблюдалось у пациентов с СД1 (рис.3). Начало заболевания характеризовалось показателями экспрессии, не отличающимися от контрольных значений, при этом наблюдалось достоверное повышение относительного количества Т-лимфоцитов подтипа CD4+25+h,8h (р=0,031) (рис. 4).

1,57

контроль до 6 мес 6-12мес 1-5лет 5-10лет

Рис. 3. Экспрессия гена FOXP3 у больных LADA с различной длительностью заболевания.

2,5 2

1,5 1

0,5 0

Рис. 4. Изменение количества клеток CD4+CD25+high у больных LADA с различной длительностью заболевания.

Снижение экспрессии гена FOXP3 у пациентов с LADA, в отличие от СД 1, наблюдалось через 6-12 месяцев от начала заболевания, при этом количество Т-лимфоцитов подтипа CD4+25+h'8h нормализовалось и при дальнейшем течении заболевания не отличалось от контрольных значений. В период от года до пяти лет вновь наблюдалась нормализация уровня экспрессии гена FOXP3, при длительности болезни более пяти лет - достоверное снижение.

Нарастание процентного содержания Treg в период до 6 мес. может отражать их регулирующую роль при подавлении аутоиммунного ответа. Возможно, увеличение численности Treg компенсирует их функциональный дефицит. Таким образом, при заболевании LADA функциональный дефицит Treg возникает отсрочено, что, очевидно, обусловливает медленное прогрессирование аутоиммунной деструкции ß-клеток. Прогрессирование индуцированной аутоиммунной реакции при длительности заболевания от года до пяти лет по неизвестным пока причинам замедляется, несмотря на наличие антител. Возможно, индукция аутоиммунного процесса происходит на фоне имеющейся периферической инсулинорезистентности, характерной для больных LADA.

Низкая интенсивность экспрессии гена FOXP3 (несмотря на отсутствие существенной разницы в содержании Treg в крови) в сравнении с контролем при любой продолжительности СД 1 говорит о потере иммунологической толерантности и дефекте подавления аутоиммунного ответа при любом сроке заболевания.

В группе риска развития СД 1 отмечена тенденция повышения относительного

24

количества клеток с подтипами CD25+ и CD4+CD25"hlgh по сравнению с контролем (р >0,05) и достоверное снижение экспрессии гена FOXP3 (0,49 rq [0,24;0,81] (р <0,05). Результаты, полученные в группе риска развития СД 1, могут свидетельствовать о постепенно снижающейся способности Treg подавлять Т-клеточную пролиферацию. Можно предположить, что у пациентов этой группы для компенсации функционального дефицита Treg возникает увеличение их численности, которое, однако, нельзя рассматривать как показатель роста активности этих клеток.

При оценке количества регуляторных Т-клеток в группе со сниженной потребностью в экзогенном инсулине и с ремиссией было отмечено их повышенное число (2,4% [1,9; 2,8]), по сравнению с контрольными значениями у здоровых лиц (0,8% [0,6; 0,9]) 0? <0,01) и при дебюте (0,9% [0,4; 2,1]) (р = 0,021). В группе без ремиссии, с "обычной" потребностью в экзогенном инсулине количество регуляторных Т-клеток не отличалось от контрольных значений (р=0.67). Экспрессия гена FOXP3 была снижена в том числе и в группе со сниженной потребностью в экзогенном инсулине и ремиссией (р = 0,044).

Исследование маркеров апоптоза

Исследование маркеров апоптоза проведено в той же выборке пациентов, что и исследование регуляторных Т-лимфоцитов и экспрессии гена FOX РЗ.

Были определены уровни экспрессии CD95 и CD95L на поверхности периферических лимфоцитов и концентрация их растворимых форм в сыворотке крови. В дебюте СД 1 отмечено достоверное снижение уровня синтеза CD95 лимфоцитами по сравнению с контрольной группой — 27% и 33%, соответственно (р <0,01). У пациентов с LADA этот показатель составил 31% и при попарном сравнении достоверно не отличался от 1-ой группы и контрольной группы (о >0,05). Результаты представлены на рис. 5.

*р<0,01

04—---,-

Контроль СД1 LADA

Рис. 5. Процентное содержание лимфоцитов, экспрессирующих антиген CD95, в исследуемых группах с впервые выявленным диабетом.

Более высокий уровень экспрессии CD95L на лимфоцитах периферической крови был выявлен у пациентов с СД 1— 3,1%, чем у пациентов с LADA— 1,6% и практически здоровых лиц — 1,9% (рис. 6). Однако различия между группами оказались статистически недостоверны (р,_2 = 0,19,pi-K= 0Э,Р2-к~ 0,27).

К СД1 LADA

Рис. 6. Процентное содержание лимфоцитов, экспрессирующих CD95L, в исследуемых группах.

Нами отмечено изменение уровня экспрессии маркерных молекул апоптоза (С095, С095Ь) на поверхности лимфоцитов периферической крови в разные сроки заболевания. Количество лимфоидных клеток, экспрессирующих антиген С095 на поверхности, увеличилось при длительности заболевания до 6 мес. составило 27%, через 6 - 12 мес. — 32%, а через 1 - 5лет— 33% [р = 0,04). При парном сравнении показателей были также получены статистически достоверные различия: до 6 мес. уэ 6 - 12 мес. {р < 0,05); до 6

мес vs 1 - 5 лет (р < 0,01).

При большей длительности заболевания достоверных изменений в уровне экспрессии маркерной молекулы апоптоза CD95 отмечено не было.

Количество лимфоцитов подтипа CD95L* в течение первого года наблюдения, наоборот, снизилось с 3,1% до 2,2%, однако, различия оказались статистически не достоверны (р = 0,81). Дальнейшее изменение количества лимфоцитов подтипа CD 95L+ при большей длительности заболевания оказалось также статистически не достоверно (р = 0,7).

В отличие от пациентов с СД 1 при сравнительном анализе уровня экспрессии маркерных молекул апоптоза на лимфоцитах в группе пациентов с LADA мы не отметили различий ни одного из показателей в течение первого года. Корреляционных связей между маркёрами апоптоза у пациентов с LADA также выявлено не было.

Показатели экспрессии CD95L на лимфоцитах в течение первого года у пациентов с LADA были сопоставимы с контролем и не отличались между собой (р >0,05). Уровень экспрессии CD95 на поверхности лимфоцитов у пациентов с LADA во всех группах был сопоставим с контролем.

Снижение экспрессии CD95 на поверхности клеток может свидетельствовать об устойчивости лимфоцитов к апоптозу и способствовать пролонгации иммунного ответа.

В группе риска содержание относительного количества лимфоцитов подтипов CD95* и CD95L* статистически не отличалось от контрольных значений (р >0,05). При проведении корреляционного анализа мы обнаружили сильную отрицательную связь между относительным количеством лимфоцитов, экспрессирующих CD95L на поверхности, и базальной концентрацией С-пептида (г = -0,94; р = 0,05), что может быть связано с начальными явлениями апоптоза ß-клеток.

В группе пациентов со сниженной потребностью в экзогенном инсулине и в ремиссии уровень экспрессии CD95 и CD95L на поверхности лимфоцитов был выше, чем в дебюте заболевания. Статистически достоверные различия отмечались только в изменении уровня экспрессии CD95 на поверхности лимфоцитов (р= 0,02).

Исследование показателей секреторной функции ß-клеток натощак, общей функциональной активности ß-клеток и периферической инеулинорезистентности

В рамках данной работы были проанализированы показатели секреторной функции ß-клеток натощак, общая функциональная активность ß-клеток и периферическая инсулинорезистентность у больных LADA, СД1, группы риска в сравнении с контрольной группой практически здоровых лиц и СД2 по данным базального уровня ИРИ и С-пептида, а также по данным НОМА. У пациентов с впервые выявленным СД1 (n=28), LADA (п=23) и СД2 (п=31) до назначения терапии была взята кровь для определения ИРИ и С-пептида. Был произведен расчет функции ß-клеток и инеулинорезистентности периферических тканей с использованием НОМА-модели.

В группе больных LADA средние показатели концентрации инсулина и С-пептида были достоверно ниже, чем у больных СД2 9,8 [3,2; 11,5] и 17,9 [7,2; 22,0] мкЕд/мл; 1,8 [1,6; 2,6] и 3,1 [1,8; 4,0] нг/мл, р<0,001), но выше, чем у больных СД1 (0,7 [0,5; 1,2] нг/мл), р<0,001). При оценке функции ß-клеток и инеулинорезистентности периферических тканей с использованием НОМА-модели также были получены достоверные различия между группами. Показатели функции ß-клеток и инеулинорезистентности при LADA были достоверно ниже, чем при СД 2 (табл. 11).

Таблица 11. Секреторная функция ß-клеток натощак, общая функциональная активность ß-клеток я периферическая инсулинорезистентность у больных LADA и СД 1 и 2 типа, группе риска

Группы больных Инсулин мкЕд/мл С-пептид нг/мл HOMA-F % HOMA-IR

СД 1 (п=28) 2,7 [2,0; 4,5]* 0,7 [0,5; 1,2]* 8,9 [8,0; 21,2] 1,2 [1,0; 2,4]

LADA (п=23) 9,8 [3,2; 11,5] 1,8 [1,6; 2,6] 39,2 [18,5; 58,2]* 3,7 [2,4; 6,4]*

Группа риска (п=30) 7,2 [5,4; 8,6] 1,7 [1,2; 4,1] 112 [80; 118] 1,6 [1,0; 3,6]

СД 2 (п=31) 17,9 [7,2; 22,0] 3,1 [1,8; 4.0] 63,9 [52,7; 112,5] 7,2 [5,3; 13,1]

Контрольная группа (п=54) 7,3 [4,2; 9,2] 2,3 [1,5; 4,5] 96 [92; 112] 1,6 [1,0; 2,7]

♦ р<0,05 по сравнению с СД 1. СД 2 и контрольной группой.

Таким образом, для дебюта LADA характерно как сниженная функциональная активность ß-клеток (HOMA-F - 39,2%, в контрольной группе - 96%)( р=0,008), так и

28

наличие инсулинорезистетности (НОМA-IR - 3,7, в контрольной группе - 1,6) (р<0,001). При этом начало СД2, по сравнению с LADA характеризуется как большим показателем функциональной активности ß-клеток (HOMA-F - 63,9%), так и большим показателем периферической инсулинорезистентности (НОМА-IR - 7,2) (р<0,05). Вероятно, высокие потребности в инсулине у инсулинрезистентных пациентов приводят их к диабету при меньшем повреждении ß-клеток (у худых, с хорошей чувствительностью к инсулину требуются более серьёзные повреждения ß-клеток для развития клинической манифестации диабета).

Оценка секреторной функции ß-клеток в ходе ММТТ в исследуемых группах

В рамках данного исследования был проведен анализ секреторной функции ß-клеток в ходе ММТТ в исследуемых группах (табл. 12, 13). Тест проводился в выборке больных на фоне компенсации углеводного обмена. Оценивался суммарный секреторный ответ в виде площади под кривой значений концентраций С-пептида.

Таблица 12. Клиническая характеристика обследуемых при ММТТ

СД 1 (п=18) LADA (а=14) Группа риска (п=29) СД2(п=16)

ИМТ, кг/м2 21,6 [20,7; 23,7] 28,6 [23,8; 31,2] 26,0 [22,8; 30,2] 30,1 [25,5; 35,2]

НЬА,„ % 6,8 [6,4; 7,0] 6,0 [5,3; 6,6] 5,6 [5,4; 5,7] 7,0 [6,8; 7,2]

С-пептид базал., нг/мл 1,2 [0,8; 1,8] 2,6 [2,4; 2,9] 1,7 [1,2; 4,1] 3,7 [3,1; 5,7]

ИРИ базял, мкЕд/мл 6,4 [2,7; 11,0] 11,5 [7,8; 19,4] 7,2 [5,4; 8,6] 13,1 [10,1; 26,8]

Суммарный секреторный ответ у пациентов СД1 и LADA достоверно между собой не отличался (р=0,082). При этом было отмечено достоверное отличие этих показателей от суммарного секреторного ответа пациентов в группе с СД2 (р<0,001). Максимальные пики секреции у пациентов в группах с СД1 и LADA также достоверно между собой не отличались, при этом отмечено их достоверное отличие от максимального пика секреции С-пептида у пациентов в группе с СД2 (р<0,05). Секреция инсулина в ответ на смешанную пищу у пациентов с СД 1 в начале болезни на фоне компенсации (без ремиссии) в среднем составила 67,7% от ответа обследованных в контрольной группе, а у пациентов с LADA - 88,1%. В группе пациентов с ремиссией (п=11) суммарный секреторный ответ составил 94,7%, максимальный пик секреции в 3,6 раз превышал

29

базальную концентрацию С-пептида и в 1,6 раз превышал максимальный пик секреции в группе пациентов с СД1 без ремиссии. Полученные данные могут свидетельствовать как о значении глюкозотоксичности в подавлении секреторной активности Р-клеток в дебюте заболевания, так и об эндогенно-регенеративном потенциале Р-клеток.

Таблица 13. Показатели секреции инсулина в ходе ММТТ

СД 1 LADA Группа риска СД2 Контроль

Гликемия натощак, 5,8 6,5 4,6 6,2 5,0

ммоль/л [5,0;б,3] [5,5;б,7] [4,2;5,5] [5,4;6,5] [4,1:5.2]

Время шах пика 90-120 60-120 30-60 60-90 30-60

секреции С-пептида в

ходе ММТТ, мин

Мах пик секреции 3,9* 4,9 6,6 10,2 6,5

С-пептида в ходе [3,3;5,5] [3,9;6,0] [5,0;8,5] [8,3;13,6] [5,2 ;7,9]

ММТТ, нг/мл

Площадь под кривой в 539,0» 702,0** 727,5 1354,0 796,5

ходе ММТТ, нг/мин х 3 [518,0; [590,5; [699,0; [982,0; [764,5;

час. 672,0] 753,0] 925,5] 1749,0] 916,0]

*р<0,05 по сравнению с СД 2 и контрольной группой, **р<0,05 по сравнению с СД 2.

В результате выполненной работы были сформулированы дифференциально-диагностические критерии аутоиммунного сахарного диабета и СД 2 (табл. 14).

Таким образом, несмотря на сходство клинической картины LADA в дебюте заболевания с СД2, отмечено достоверное снижение общей функциональной активности ß-клеток у пациентов с LADA (до 39%) по сравнению с пациентами с СД2 (до 64%) (р<0,05), а также достоверно больший индекс инсулинорезистентности у пациентов с СД2 по сравнению с пациентами с LADA (7,2 и 3,7 баллов соответственно) (р < 0,05). Отмечено генетическое сходство СД 1 и LADA в контексте ассоциаций с локусами IDDM1 и JDDM2. Подтверждена ассоциация генов HLA класса II с развитием как LADA, так и СД1. При этом, наличие в генотипе больных LADA только одного высоко предрасполагающего гаплотипа в комбинации с протеютвным или нейтральным гаплотипом, вероятно, обуславливает более позднее начало и менее агрессивное течение заболевания. В дебюте СД1 (при «классическом» варианте) отмечено снижение экспрессии ключевого маркера апоптоза (CD95) лимфоцитов сравнительно с

контрольной группой (р<0,01) и с группой больных LADA (р >0,05), что является косвенным признаком подавления программированной гибели аутореакгавных лимфоидных клеток, и, в свою очередь, объясняет большую выраженность аутоиммунного ответа при СД1, по сравнению с LADA. В начале заболевания у пациентов с LADA показатели экспрессии гена FOXP3 не отличались от контрольных значений, что говорит об отсроченном функциональном дефиците регуляторных Т-лимфоцитов. в отличие от пациентов с СД1, у которых отмечается низкая интенсивность экспрессии гена FOXP3 при любой продолжительности заболевания, что говорит о потере иммунологической толерантности и дефекте подавления аутоиммунного ответа при любом сроке заболевания. Суммарный секреторный ответ у пациентов с СД1 и LADA достоверно между собой не отличался. При этом было отмечено достоверное отличие этих показателей от суммарного секреторного ответа пациентов в группе с СД 2.

В настоящее время не существует специальных алгоритмов по лечению LADA. Большинство исследователей склоняется к ранней инсулинотерапии у этих пациентов. Полученные нами данные о сниженной функциональной активности ß-клеток в дебюте LADA свидетельствуют в пользу данной точки зрения.

Таблица 14. Клинико-лабораторные критерии дифференциальной диагностики аутоиммунного сахарного диабета (СД 1 и LADA)и СД 2

Признак СД 1 LADA СД2

Манифестация заболевания острая постепенная постепенная

Возраст в дебюте Чаще до 30 лет Чаще 30-40 лет Чаще после 40 лет

ИМТ, кг/и2 менее 23 24-30 более 25

Кетоз, кегоацидоз в дебюте часто редко крайне редко

Наличие ипсулинорезистеятности (НОМА-Ш) (норма усл. 1 балл) отсутствует (1,2 балла) Выражена (3,7 балла) Значительно выражена (7,2 балла)

Общая функциональная активность р-клеток в дебюте (НОМА-П (норма усл. 100%) Низкая (9%) Снижена значительно (39%) Снижена незначительно (64%)

Гаплотипы генов НЬА класса II Преобладание двух высоко предрасполагающих галлотипов Сочетание одного высоко предрасполагающего галлотипа с одним протективным или нейтральным Популяционная частота выявления предрасполагающих галлотипов

Ассоциация полиморфного маркёра -23Нрк1 тгпл ¡т ассоциирован ассоциирован -

Ассоциация полиморфного маркёра Я620\У гепя РТРЛ'22 ассоциирован не ассоциирован -

Аутоантитела чаще GADA, IA-2A чаще GADA, ICA нет

С-пептид базальный в дебюте низкий в пределах нормы в пределах нормы или повышенный

Количество регуляторных Т- лимфоцитов в дебюте в пределах нормы повышено в пределах нормы

Экспрессия гена ЕохРЗ в дебюте низкая в пределах нормы в пределах нормы

Экспрессия маркера апоптоза СБ95 на лимфоцитах в дебюте снижена в пределах нормы или незначительно снижена в пределах нормы

Экспрессия маркера апоптоза СБ95Ь на лимфоцитах в дебюте повышена в пределах нормы в пределах нормы

Время максимального пика секреции С-пептида в ходе ММТТ, мин 90-120 60-120 60-90

Максимальный пик секреции С-пептида в ходе ММТТ, иг/мл Снижен (3,9) незначительно снижен (4,9) Повышен (10,2)

Выводы

1. Гетерогенность клинической картины аутоиммунного СД1 обусловлена значительными различиями гормонально-метаболических и иммуно-генетических характеристик пациентов.

2. Особенностью LADA является сочетание аутоиммунного процесса с инсулинорезистентностью, что приводит к манифестации сахарного диабета при меньшем уровне разрушения ß-клеток. LADA развивается как на фоне сниженной функциональной активности ß-клеток, так и на фоне инеулинорезистентности.

3. У пациентов с LADA в генотипе значимо чаще встречается только один из высоко предрасполагающих гаплотипов HLA (DR3-DQ2;DR4-DQ8) в комбинации с протективным или нейтральным гаплотипом, что может определять более позднюю манифестацию заболевания и менее агрессивное течение.

4. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера -HHphl (rs6S9) гена INS с развитием как СД1, так и LADA. Установлено, что носители аллеля А данного полиморфного маркера имеют повышенный риск развития как СД1, так и LADA, тогда как носители аллеля Г имеют пониженный риск развития как СД1, так и LADA.

5. Ассоциация полиморфного маркера R620iV тепа PTPN22 с развитием LADA в нашей выборке не выявлена, в то время как при СД1 обнаружена данная ассоциация. Установлено, что носители аллеля Т данного полиморфного маркера имеют повышенный риск развития СД1, тогда как носители аллеля С имеют пониженный риск развития СД1.

6. Сниженная экспрессия ключевого маркёра апоптоза лимфоцитов (CD95), наблюдаемая при СД1, является косвенным признаком подавления программированной гибели аутореактивных лимфоидных клеток. При LADA данные изменения наблюдаются в меньшей степени, чем при классическом варианте клинической картины СД1. Повышение количества лимфоцитов подтипа CD95+ на фоне компенсации углеводного обмена в течение первого года заболевания свидетельствует о частичном восстановлении иммунорегуляторных механизмов.

7. Развитие СД 1 связано с нарушением иммунорегуляторных механизмов, включая изменения количества регуляторных Т-лимфоцитов и их активности. При СД1 экспрессия гена FOXP3 остаётся сниженной на всём протяжении заболевания (несмотря

на отсутствие существенной разницы в содержании Treg в крови), что обусловливает низкую супрессорную активность Treg в отношении аутореактивных цитотоксических Т-лимфоцитов. При LADA функциональный дефицит Treg возникает отсрочено, что, очевидно, обусловливает медленное прогрессирование аутоиммунной деструкции ß-клеток, несмотря на наличие аутоантител.

8. У лиц из группы риска развития аутоиммунного СД 1 увеличивается популяция Treg подтипа CD4+CD25+hii\ что может отражать подавление аутоиммунной реакции в отношении ß-клеток.

9. Фаза клинической ремиссии характеризуется нормализацией базальной концентрации С-пептида в крови, снижением титров аутоантител к компонентам ß-клегок, повышением уровня экспрессии CD95 и снижением уровня экспрессии CD95L на поверхности лимфоцитов. В период ремиссии сохраняется низкая функциональная активность Treg (низкий уровень экспрессии гена FOXP3), однако повышается численность этой популяции лимфоцитов. Суммарный секреторный ответ на смешанную пищу в ходе теста ММТТ составляет 94,7% от такового у обследованных из контрольной группы здоровых лиц.

10. У пациентов с впервые выявленным СД1 в состоянии метаболической компенсации секреторный ответ на смешанную пищу в ходе теста ММТТ составляет, в среднем, 67,7% от такового у обследованных из контрольной группы, а у пациентов с LADA - 88,1%. Данные показатели отражают роль глюкозотоксичности в подавлении секреторной активности ß-клеток в дебюте заболевания, а также могут свидетельствовать об их высоком эндогенно-регенеративном потенциале.

Практические рекомендации

1. Сниженная функциональная активность ß-клеток в дебюте LADA и сниженный суммарный секреторный ответ у пациентов с LADA, даже на фоне компенсации заболевания, позволяет рекомендовать назначение ранней инсулинотерапии.

2. Исследование секреторной функции ß-клеток с использованием ММТТ теста у взрослых пациентов с впервые выявленным СД в состоянии метаболической компенсации рекомендуется для уточнения дальнейшей лечебной тактики.

3. Одной из характеристик LADA при генотипировании HLA класса II в

комплексе с другими диагностическими маркерами является наличие в генотипе только одного предрасполагающего гаплотипа в сочетании с протекгивным или нейтральным.

4. При проведении дифференциальной диагностики СД, помимо определения HLA генотипа, рекомендовано дополнительно определять генотипы полиморфных маркеров -23HphI (rs689) гена INS и R620W гена PTPN22.

5. Лица, имеющие положительные тигры аутоантител, ассоциированных с развитием СД 1, с базальным уровнем С-пептида на нижней границе референсного интервала должны быть включены в группу динамического наблюдения (НЬА]С каждые 3 мес).

6. Для верификации аутоиммунного процесса, пациентам с впервые выявленным СД, рекомендуется, помимо определения аутоантител, ассоциированных с развитием СД1, исследовать количество регуляторных Т-лимфоцитов подтипа CD4+CD25+hieh и их функциональную активность (экспрессию гена FOXP3).

7. Проведение расширенной клинико-лабораторной диагностики позволяет с высокой достоверностью дифференцировать различные подтипы и варианты течения аутоиммунного СД, что крайне важно для выбора адекватной лечебной тактики.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Никонова Т.В. Гормонально-иммунологические критерии тяжести течения инсулинзависимого сахарного диабета / Т.В. Никонова, В.В. Потёмкин // III Всесоюзный съезд эндокринологов. Тезисы докладов. - Ташкент «Медицина», 1989. - С. 289-290.

2. Алиханов Х.А. Количественные и функциональные показатели иммунной системы у больных с диабетическими ангиопатиями и обоснование иммунокоррегирующей терапии в комплексном лечении / Х.А. Алиханов, А.П. Чадаев, Т.В. Никонова // Хирургические заболевания и сахарный диабет. Сборник научных трудов. - М., 1989.-С. 57-59.

3. Злобина E.H. Иммунологические аспекты сахарного диабета 1 типа с длительным и осложненным течением / E.H. Злобина, В.В. Потёмкин, Т.В. Никонова, C.B. Брыкова // Сахарный диабет. Сборник научных трудов. - Саратов, 1990,-С. 20-22.

4. Потёмкин В.В. Клинико-диагностическое значение определения аутоантител к

35

поверхности островковых клеток поджелудочной железы у больных сахарным диабетом II В.В.Потёмкин, Т.В. Никонова, E.H. Злобина, С.В.Брыкова, Г.Н. Гудукина, Н.И. Коптева // Вопросы эндокринологии. - М., 1990. - С. 169-170.

5. АлихановХ-А. Диагностическая значимость гормонально-иммунологических показателей при 2 типе сахарного диабета / Х.А. Алиханов, Т.В. Никонова Н Материалы III Всероссийского съезда эндокринологов. - Челябинск, 1991. - С. 5253.

6. БрыковаС.В. Динамика нарушений показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных инсулинзависимым сахарным диабетом / C.B. Брыкова,

B.Н.Андреев, E.H. Злобина, О.М.Смирнова, Т.В. Никонова, В.И.Есенин Н Первая научно-практическая конференция «Многопрофильная больница сегодня и завтра». Сборник трудов. - М., 1991. - С. 38-41.

7. Никонова Т.В. Изменения соотношения регуляторных субпопуляций у больных сахарным диабетом 1 типа / Т.В. Никонова // Сборник научных трудов МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского «Вопросы эндокринологии». - Москва, 1992. - С. 29.

8. Хаитов P.M. Динамика нарушений показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных инсулинзависимым сахарным диабетом / P.M. Хаитов, И.И. Дедов, C.B. Брыкова, О.М.Смирнова, Т.В.Никонова И Проблемы эндокринологии. - 1992. - №2. - С. 8-12.

9. Потемкин В.В. Динамика ряда показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных сахарным диабетом 1 типа / В.В. Потёмкин,

C.B. Брыкова, Т.В. Никонова II Проблемы эндокринологии. -1994. -№6. - С. 5-7.

10. Зилов A.B. HLA генотипы в русской популяции при инсулинзависимом сахарном диабете / A.B. Зилов, Л.П. Алексеев, М.Н.Болдырева, И.Ю.Демидова, Т.В.Никонова, Д.Ю.Трофимов, И.И.Дедов // Тезисы докладов I Российского диабетологического конгресса. - 1998. -С. 131.

11. Зилов A.B. Внедрение современных методов доклинической диагностики инсулинзависимого сахарного диабета в клиническую практику / A.B. Зилов, Л.П.Алексеев, М.Н.Болдырева, Т.В.Никонова, О.М.Смирнова, И.И.Дедов II Тезисы докладов I Российского диабетологического конгресса. - 1998. - С. 132.

12. Никонова Т.В. Доклиническая диагностика инсулинзависимого сахарного диабета

в группах высокого риска / Т.В.Никонова, М.Н.Болдырева, Т.Р.Бахтадзе,

36

Л.П. Алексеев, О.М. Смирнова, И.И. Дедов Тезисы докладов 1 Российского диабетологического конгресса. - 1998. - С. 233.

13. Соловьёва O.E. Характеристика сахарного диабета с поздним аутоиммунным началом (LADA) у больных в возрасте от 30 до 55 лег / O.E. Соловьёва, В.А. Горелышева, Т.В. Никонова, О.М. Смирнова // Тезисы докладов I Российского диабетологического конгресса. - 1998. - С. 296.

14. Алиханов Х.А. Состояние иммунной системы у больных с диабетическими ангиопатиями и обоснование иммунокоррекции в комплексном лечении I Х.А. Алиханов, В.В. Потемкин, Т.В. Никонова // Хирургия. - 1998. - №10. - С. 152153.

15. Никонова Т.В. Прогнозирование СД 1 типа в группах высокого риска / Т.В. Никопова, И.И. Дедов, Л.П. Алексеев, М.Н. Болдырева, О.М. Смирнова И.В. Дубинкин // Сахарный диабет. - 2000. - №2. - С. 2-6.

16. Случай семейной формы сахарного диабета 2 типа у молодых. (Статья) Журнал «Сахарный диабет» - 2000 №3 с 37-42 Гарибашвили А. Ю. Смирнова О. М. . Никонова Т.В.

17. Nikonova T.V. Se and oxidative stress in new-onset type 1 diabetes patients and in offsprings of type 1 diabetes parents / T.V. Nikonova, O.M. Smirnova, I.I. Dedov // Diabetes Metab. -2003. - Vol. 29. - P. 4S47.

18.ТабееваК.И. Аутоиммунный полигладулярный синдром III типа (ДТЗ, сахарный диабет 1 типа, аутоиммунный гломерулонефрит) / К.И. Табеева, Т.В. Никонова, О.М. Смирнова // Сахарный диабет. - 2004. - №4. - С. 30-32.

19. Смирнова О.М. Современные принципы лечения сахарного диабета 1 типа. (Пособие для врачей) / О.М. Смирнова, Т.В. Никонова // М.: ГУП «Медицина для Вас», 2004. - 64 с.

20. Дедов И.И. Роль цитокинов в регуляции иммунного ответа и механизмы гибели ß-клеток при различных вариантах течения сахарного диабета типа 1 / И.И. Дедов, Т.В. Никонова, О.М. Смирнова, С.А. Прокофьев // Проблемы эндокринологии. -2005. -№3.- С. 3-7.

21. Дедов И.И. Идиопатический сахарный диабет / И.И. Дедов, Т.В. Никонова, О.М. Смирнова // Проблемы эндокринологии. - 2005. - №4. - С. 41-43.

22.NikonovaT.V. Association of the metabolic syndrome and profile of inflammatory cytokines in LADA diabetes / T.V. Nikonova, O.M. Smirnova, I.I. Dedov // 2nd Intern. Symposium on Triglycerides and HDL: role in Cardiovascular disease and the Metabolic syndrome. Abstract book. - 2005. - P. 38.

23. Nikonova T. Metabolic syndrome and inflammatory cytokines in LADA diabetes / T. Nikonova, O. Smirnova, I. Dedov // ECE 2005. Abstract book. - 2005. - P. 309.

24. Смирнова O.M. Впервые выявленный сахарный диабет 1 типа: механизмы развития, клиника, лечение. (Пособие для врачей) / О.М. Смирнова, Т.В. Никонова // М.: ГУЛ «Медицина для Вас», 2005. - 48 с.

25. Прокофьев С.А. Апоптоз в развитии ремиссии сахарного диабета 1 типа / С.А. Прокофьев, Т.В. Никонова, В.А. Горелышева, О.М. Смирнова, С.М. Степанова, Л.П. Алексеев // Сахарный диабет. - 2006. - №4. - С. 47-50.

26. Nikonova Т. Apoptosis in the remission of type 1 diabetes / T.Nikonova, V. Gorelysheva, O. Smirnova, S. Prokofiev, I. Dedov // Diabetic Medicine. - 2006. - Vol. 23 (Suppl. 4). -P. 658.

27. Никонова T.B. Современные аспекты патогенеза сахарного диабета 1 типа / Т.В. Никонова // Сахарный диабет. - 2006. - №3. - С. 59-64.

28. Никонова Т.В. Экспрессия гена FoxP3 при различной длительности течения сахарного диабета 1 типа / Т.В Никонова, А.В. Карпухин, П.В. Апанович, С.А. Прокофьев, И.И. Дедов // IV Всероссийский диабетологический конгресс. Тезисы докладов. - М., 2008. - С. 12.

29. Никонова Т.В. Апоптоз при сахарном диабете 2 типа / Т.В. Никонова, С.А. Прокофьев, В.А. Горелышева, Е.В. Пекарева, О.М. Смирнова Н IV Всероссийский диабетологический конгресс. Тезисы докладов. - М., 2008. - С. 13.

30. Apanovich P.V. The expression of FoxP3, IFNy and IL4 on different stages of type 1 diabetes mellitus / P.V. Apanovich, T.V. Nikonova, N.V. Apanovich, M.V. Shestakova, A.V. Karpukhin // European Journal of Human Genetics. - 2008. - Vol. 16 (Suppl 2).

31. Никонова T.B. Возможности клеточных технологий в лечении сахарного диабета / Т.В. Никонова, Е.В. Пекарева, Ю.И. Филиппов // Сахарный диабет. - 2008. -№4.-С. 93-95.

32. Смирнова О.М. Лечение сахарного диабета 1 типа. (Пособие для врачей) /

О.М. Смирнова, T.B. Никонова // М.: ГУП «Медицина для Вас», 2008. - 76 с.

33.DedovI. The components of metabolic syndrome in ketosis prone type 2 diabetes mellitus /1. Dedov, T. Nikonova, E. Pekareva, V. Gorelysheva // Journal of Diabetes. -2009. - Vol. 1 (Suppl 1). - A 204.

34. Никонова Т. Строгий метаболический контроль - ключевой фактор развития ремиссии при сахарном диабете типа 1 / Т. Никонова, Е. Пекарева // Врач. -2009.-№ 11.-С. 30-32.

35. Пекарева Е.В. Маркёры апоптоза у больных сахарным диабетом 1 типа в дебюте заболевания / Е.В. Пекарева, Т.В. Никонова, В.А. Горелышева, С.А. Прокофьев, Я.С. Зверева, С.М. Степанова, О.М. Смирнова И Сахарный диабет. - 2009. - № 4. -С. 86-89.

36. Pekareva E.V. CD 95 and CD95L expression in patients with onset autoimmune diabetes mellitus / E.V. Pekareva, T.V. Nikonova, V.A. Gorelysheva, S.A. Prokofyev, O.M. Smirnova // 9th Regional medical conference on the treatment of type 2 diabetes mellitus. Conference materials. - Berlin, 2009. - P. 33.

37. Молитвословова H. Сахарный диабет 2 типа, склонный к кетозу / Н. Молитвословова, Т. Никонова // Сахарный диабет. - 2009. - №3. - С. 70-76.

38. Никонова Т. Сложноклассифицируемые случаи сахарного диабета / Т. Никонова, Н. Молитвословова // Врач. - 2009. - №8. - С. 46-48.

39. Репина Е.А. Роль иммунологической памяти в патогенезе сахарного диабета 1 типа / Е.А. Репина, Т.В. Никонова, С.М. Степанова, С.А. Прокофьев И Международный журнал по иммунореабилитации. - 2009. - №1 (том 11). - С. 107.

40. Никонова Т.В. Нетипичные случаи сахарного диабета / Т.В. Никонова, H.A. Молитвословова //Диабетография. -2010. -№10 (30). - С. 9-13.

41. Пекарева Е.В. Роль апоптоза в патогенезе сахарного диабета 1 типа / Е.В.Пекарева, Т.В. Никонова, О.М.Смирнова // Сахарный диабет,- 2010. — № 1. - С. 45-49.

42. Харлашина Е.А. Дебют сахарного диабета 1 типа на фоне инфекционного мононуклеоза / Е.А. Харлашина, О.С. Шаповальянц, Е.В. Пекарева, Т.В. Никонова // Сахарный диабет. - 2010. - № 1. - С. 126-128.

43. Никонова Т. Роль вирусной инфекции в патогенезе сахарного диабета /

Т. Никонова, О. Шаповальянц, Е. Пекарева // Врач. - 2010. - № 2. - С. 35-37.

44.Nikotiova Т. Role of regulatory T-cells in the development of the partial remission period in patients with type 1 diabetes / T. Nikonova, V. Gorelysheva, S. Prokofiev, E. Pekareva, I. Dedov // 12th European Congress of Endocrinology. Endocrine Abstract.-2010.-Vol. 22.-P. 341.

45.ПекареваE.B. Динамика показателей иммунного статуса у больных с впервые выявленным сахарным диабетом 1 типа / Е.В. Пекарева, Т.В. Никонова,

B.А. Горелышева, С.А. Прокофьев, С.М. Степанова, О.М. Смирнова // V Всероссийский диабетологический конгресс. Сборник тезисов. - М., 2010. - С. 83.

46. Никонова Т.В. Роль регуляторных CD4+CD25+ Т-лимфоцитов и их функциональной активности (уровень экспрессии гена FoxP3) в развитии и прогрессировании сахарного диабета 1 типа / Т.В. Никонова, П.В. Апанович, В .А. Горелышева, Н.В. Апанович, С .А, Прокофьев, А.В. Карпухин, И.И. Дедов // V Всероссийский диабетологический конгресс. Сборкик тезисов.- М., 2010. —

C. 79-80.

47. Репина Е.А. Роль иммунологической памяти в патогенезе аутоиммунного сахарного диабета / Е.А. Репина, Т.В. Никонова, С.М. Степанова, М.В. Шестакова, И.И. Дедов // V Всероссийский диабетологический конгресс. Сборник тезисов. - М., 2010. - С.86,

48. Пекарева Е. Медленнопрогрессирующий аутоиммунный сахарный диабет взрослых / Е. Пекарева, Т. Никонова // Врач. - 2010. - № 5. - С. 5-7.

49. Nikonova Т.V. The role of regulatory CD4+CD25+ T lymphocytes and FoxP3 expression in evolution and progression of type 1 diabetes / T.V. Nikonova, E.V. Pekareva, V.A. Gorelysheva, P.V. Apanovich, S.A. Prokofyev, I.I. Dedov // Diabetologia. - 2010. - Vol. 53 (Suppl 1). - P. S181-S182.

50. Pekareva E.V. Dynamic changes of CD 95 and CD 95L expression on lymphocytes in patients with new-onset type 1 diabetes mellitus / E.V. Pekareva, T.V. Nikonova, V.A. Gorelysheva, S.M. Stepanova, S.A. Prokofyev, O.M. Smirnova, I.I. Dedov // Diabetologia. - 2010. - Vol. 53 (Suppl 1). - P. S183.

51. Никонова Т.В. Роль регуляторных CD4+CD25+hl8h Т-лимфоцитов и их

функциональной активности в развитии и прогрессировании сахарного диабета 1

типа / Т.В. Никонова, П.В. Апанович, Е.В.Пекарева, В.А. Горелышева,

40

С.А. Прокофьев, А.В. Карпухин, И.И. Дедов И Сахарный диабет. - 2010. - № 3. -С. 25-29.

52. Никонова Т. Перспективы клеточных технологий в лечении сахарного диабета / Т. Никонова, Е. Пекарева, Ю. Филиппов // Врач. - 2010. - № 12. - С. 10-13.

53. Никонова Т.В. Иммуногенетические особенности (LADA) / Т.В. Никонова, П.В. Апанович, Е.В. Пекарева, В.А. Горелышева, С.А. Прокофьев, С.М. Степанова, Ю. Тишина, А.В. Карпухин // Сахарный диабет. - 2011. - № 1. -С. 28-35.

54.Nikonova T.V. Metabolic syndrome in adult patients with type 1 diabetes mellitus / T.V. Nikonova, E.V. Pekareva, O.M. Smirnova, I.I. Dedov II Journal of Diabetes. - 2011. -Vol. 3 (Suppl. 1).-P. 151-152.

55. Nikonova T.V. Immune and metabolic parameters in high-risk type 1 diabetes subjects / T.V. Nikonova, E.V. Pekareva, V.A. Gorelysheva, P.V. Apanovich, O.S. Shapovalyants, S.A. Prokofyev, I.I. Dedov // Journal of Diabetes. - 2011,- Vol.3 (Suppl. 1). - P. 274.

56. Шаповапьянц O.C. Диагностическая и прогностическая значимость аутоантител при сахарном диабете. Новый маркер аутоиммунного процесса - антитела к ZnT8 / O.C. Шаповапьянц, Т.В. Никонова // Сахарный диабет. - 2011. - №2. - С. 18-22.

Список сокращений, использованных в работе

GADA - аутоантитела к ферменту глютаматдекарбоксилаза (autoantibodies to glutamic acid decarboxylase)

GST - тест стимуляции с глюкагоном (glucagon stimulation test) НОМА - модель оценки гомеостаза (homeostasis model assessment)

IA-2A - аутоантитела к тирозинфосфатаза-подобному белку (protein tyrosinephosphatase-like islet antigen 2)

IAA - аутоантитела к инсулину (insulin auto-antibodies)

ICA - аутоантитела к островковым клеткам (islet cell antibodies)

LADA - латентный аутоиммунный диабет взрослых (latent autoimmune diabetes in adult) OGTT - оральный глюкозотолерантный тест (oral glucose tolerance test) PTPN22 - нерецепторная протеин-тирозин фосфатаза 22 типа (protein tyrosine phosphatase nonreceptor 22)

VNTR- различное число тандемных повторов (variable numbers of tandem repeat) ИМТ - индекс массы тела

MMTT - тест со смешанной пищей (mixed meal tolerance test)

ПССП - пероральные сахароснижающие препараты

СД - сахарный диабет

Treg - регуляторные Т-лимфоциты

Подписано в печать: 17.11.11

Объем: 2,0 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 782 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363*78-90; www.reglet.ru

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По определению экспертов Всемирной Организации Здравоохранения: «Сахарный диабет является проблемой всех возрастов и всех стран». В связи с ранней инвалидизацией и высокой смертностью больных решение многих вопросов, связанных с этим заболеванием, поставлено во многих странах мира на государственный, федеральный уровень.

Сахарный диабет 1 типа (СД1) составляет 10% всех случаев диабета. Он ассоциирован как с хроническими осложнениями, так и острыми, угрожающими жизни состояниями, такими как кетоацидоз и гипогликемия. Диагностика различных типов сахарного диабета (СД) основывается на клинических характеристиках и в типичных случаях не вызывает трудностей. В последние годы появились формы сахарного диабета, которые не отвечают критериям принятой традиционной классификации ВОЗ (1999). Одним из вариантов течения аутоиммунного сахарного диабета является латентный аутоиммунный диабет взрослых — 'latent autoimmune diabetes in adults' (LADA) [Zimmet P.Z, 1995]. Он характеризуется клинической картиной не типичной для классического СД1, несмотря на наличие аутоантител, аутоиммунная деструкция развивается медленно, что не сразу приводит к развитию потребности в инсулине. Эпидемиологические исследования показали, что LADA встречается в 2-12% всех случаев СД [Borg Н., Gottsäter А. 2002]. Данная форма СД занимает промежуточное положение между СД1 и СД2 и в последней классификации не выделяется в отдельную номенклатурную единицу. Наличие в дебюте заболевания клинической картины СД2 затрудняет диагностику и своевременное начало инсулинотерапии у пациентов с LADA. В связи с этим разработка дифференциально-диагностических критериев LADA имеет большое практическое значение.

Сахарный диабет СД1 является полигенным многофакторным заболеванием, то есть, проявление болезни определяется взаимодействием средовых и генетических факторов. Наибольшее значение из известных генетических маркеров СД1 имеют гены, расположенные в области главного комплекса гистосовместимости человека (HLA) на хромосоме 6р21.3 (IDDM1) [Davies J.L., 1994]. В последние годы, в том числе и на основе полных геномных поисков, обнаружена ассоциация с СД1 ряда новых локусов. Вторым по значимости генетическим фактором, определяющим предрасположенность к СД1 является локус IDDM2, расположенный на хромосоме 11р15.5 и отождествляемый с геном инсулина (INS) [Bennett S.Т., 1995]. В различных популяциях IDDM2 определяет от 5 до 15% семейного риска развития СД1. Также, предрасположенность к СД1 ассоциирована с геном PTPN22, кодирующим тирозиновую фосфатазу лимфоидных клеток, и отвечающим за супрессию иммунного ответа, осуществляемого Т-клетками [Bottini N., 2004; Smyth D., 2004]. Исследования ассоциации гена PTPN22 с СД1 в русской популяции немногочисленны [Носиков В.В., 2010], у пациентов с LADA до настоящего времени не проводились.

Как и классический СД1, LADA связан с потерей иммунологической толерантности к собственным антигенам и характеризуется селективным разрушением ß-клеток панкреатических островков лимфоцитами CD8+ (цитотоксическими) и CD4+ (эффекторными). В настоящее время основной группой лимфоидных клеток, отвечающих за поддержание аутотолерантности, считают пул CD4+ лимфоцитов, экспрессирующих маркерную молекулу CD25— a-цепь рецептора IL-2 (IL-2R) [Sakaguchi S., 2001]. Субпопуляцию CD4+CD25+ называют регуляторными Т- клетками (Treg). Клетки Treg стремятся ликвидировать активный ответ Т-клеток и предотвратить развитие аутоиммунных реакций, регулируя распространение популяции Т-клеток и их дифференциацию, а также функцию эффекторных Т-клеток [Tang Q., 2006]. Функциональные свойства Treg опосредованы активностью Fox РЗ (forkhead box) [Zheng Y., 2007] — фактора транскрипции, непосредственно и косвенно регулирующего экспрессию более 300 генов. Супрессорная активность клеток Treg непосредственно зависит от интенсивности экспрессии Fox РЗ [Pop S.M., 2005]. Снижение количества этих клеток или их супрессорной активности могут способствовать потере аутотолерантности к антигенам ß-клеток и развитию аутоиммунного процесса. В литературе приводятся достаточно противоречивые данные по характеру изменений количественных и функциональных показателей клеток Treg при различных заболеваниях, в том числе при СД1. При LADA количественная и функциональная активность клеток Treg, которые могут рассматриваться в качестве центральных регуляторов иммунного ответа и главных носителей феномена иммунологической толерантности, до сих пор остаются не изученными.

При СД1 одной из причин развития аутоиммунитета является нарушение процесса элиминации аутореактивных иммунных лимфоидных клеток. В норме клоны аутореактивных клеток подвергаются апоптозу [Gronski М., 2006]. Взаимодействие поверхностных маркерных молекул CD95(Fas) с лигандом — CD95L(FasL) запускает процесс гибели клеток. Таким образом, уровень экспрессии CD95 на поверхности клетки определяет её готовность к вступлению в апоптоз. Однако маркёры апоптоза лимфоцитов у пациентов с LADA недостаточно изучены.

При СД1 важнейшую роль играет секреторная активность ß-клеток, так как именно снижение секреции инсулина приводит к его абсолютному дефициту в крови. Между тем, определение содержания инсулина в периферической крови не точно отражает эндогенную секрецию инсулина. Инсулин и С-пептид секретируются поджелудочной железой в эквимолярных количествах, но 50% или более инсулина расщепляется при первом же прохождении через печень. Именно поэтому в большинстве исследований о секреции инсулина судят по концентрации С-пептида, измеренной после продолжительного голодания (более 10 часов) и на фоне стимуляции (GST,

OGTT, MMTT). В настоящее время в международных исследованиях в качестве «золотого стандарта» для оценки секреторной функции ß-клеток принято использовать ММТТ с количественным определением концентрации С-пептида в крови [Greenbaum С., 2008]. Использование стандартного количества смешанной пищи считают более физиологичным стимулятором секреции инсулина, чем внутривенное введение глюкагона и пероральный приём раствора глюкозы. В связи с этим, вопросы сравнительного изменения секреторной активности ß-клеток при СД1, LADA и СД2 представляют большой интерес.

После манифестации СД1 у ряда пациентов в первые месяцы после установления диагноза отмечается преходящее снижение потребности в инсулине, связанное с улучшением функции оставшихся ß-клеток. Этот период наиболее благоприятного течения СД1, характеризующийся снижением потребности в экзогенном инсулине, вплоть до его отмены называется "медовым месяцем" или клинической ремиссией. Несмотря на значимость ремиссии, которая свидетельствует о сохранной функции оставшихся ß-клеток, что позволяет отсрочить осложнения сахарного диабета, имеются немногочисленные работы, посвященные роли ауторегуляторных процессов в её развитии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить гетерогенность аутоиммунного СД1, варианты дебюта и прогрессирования заболевания на основании клинических, гормонально-метаболических и иммуно-генетических особенностей.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить варианты развития и течения СД1:

• «Классический» иммуноопосредованный СД1;

• Латентный аутоиммунный диабет взрослых (LADA).

2. Исследовать особенности распределения гаплотипов и генотипов генов HLA, оценить степень аутоиммунной агрессии при различных клинических вариантах течения СД1.

3. Изучить ассоциацию полиморфных маркеров генов кандидатов, определяющих предрасположенность к аутоиммунному поражению ß-клеток (полиморфного маркера R620W гена PTPN22, полиморфного маркера -23HphI гена INS) с различными вариантами развития СД1.

4. Оценить уровень экспрессии маркёров апоптоза на лимфоцитах периферической крови у больных СД1 и LADA, а также на фоне ремиссии СД1.

5. Изучить особенности распределения гаплотипов и генотипов генов HLA, показатели субпопуляционного состава лимфоцитов и экспрессию гена FOXP3 у лиц из группы риска развития СД1.

6. Оценить экспрессию гена FOXP3 и количество регуляторных Т-лимфоцитов у больных СД1 и LADA, а также на фоне ремиссии СД1.

7. Оценить функциональную возможность ß-клеток и периферическую инсулинорезистентность у больных с СД1, LADA и в группе риска развития СД1.

8. Оценить диагностическую значимость изучаемых маркёров.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

• Впервые определены иммунологические особенности у пациентов с LADA в сравнении с пациентами СД1, а также у лиц из группы риска развития СД1: исследована экспрессия маркёров апоптоза лимфоцитов периферической крови, определена интенсивность экспрессии гена FOXP3 и количество регуляторных Т-лимфоцитов типа CD4+CD25+high.

• Впервые исследованы особенности иммунологических ауторегуляторных процессов у пациентов с различной длительностью СД1 и LADA: определена интенсивность экспрессии гена FOXP3 и количество регуляторных Т-клеток при различной длительности СД1 и LADA.

• Впервые исследованы особенности иммунологических ауторегуляторных процессов у пациентов с ремиссией СД1: определена интенсивность экспрессии гена FOXP3 и количество регуляторных Т-клеток, исследована экспрессия маркёров апоптоза лимфоцитов периферической крови.

• Впервые в России проведено сравнительное исследование ассоциации полиморфных генетических маркеров -23HphI гена INS и R620W гена PTPN22 с заболеванием LADA и СД1.

• Впервые проведена сравнительная оценка функциональных возможностей ß-клеток по их суммарному секреторному ответу в ходе ММТТ на фоне компенсации углеводного обмена у больных с СД1 и СД2, LADA и в группе риска развития СД1.

• Впервые показано сочетание инсулинорезистентности и снижения функции ß-клеток вследствие аутоиммунного процесса у пациентов с впервые выявленным заболеванием LADA (по данным НОМА-модели).

• На основе проведённых исследований впервые предложены критерии для клинико-лабораторной дифференциальной диагностики различных вариантов течения аутоиммунного СД (СД1 и LADA) и СД2.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Проведённая работа позволила сформулировать критерии для максимально точной клинико-лабораторной дифференциальной диагностики различных вариантов течения аутоиммунного СД и СД2. Показано, что верификация диагноза должна строиться не только на характерных особенностях клинической картины заболевания, но и на результатах исследования секреторной активности ß-клеток и иммунного статуса, а также с учётом особенностей генотипа.

Показана значимость результатов генетического исследования не только локуса HLA, но и генов INS (маркер-23HphI) и PTPN22 (маркер R620W) для проведения дифференциальной диагностики впервые выявленного СД.

Полученные результаты позволяют рекомендовать оценку функции ß-клеток и инсулинорезистентности периферических тканей с использованием НОМА-модели, определение секреторной функции ß-клеток с использованием ММТТ теста у взрослых пациентов с впервые выявленным СД для проведения дифференциальной диагностики и оптимизации лечения.

Полученные результаты расширяют представление о ключевых особенностях патогенеза различных вариантов течения аутоиммунного СД, особенностях иммунологических ауторегуляторных процессов у пациентов с ремиссией СД1 и могут служить основой для дальнейших исследований в этой области.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения исследования доложены на Российских диабетологических и эндокринологических конгрессах в г. Москве (2004, 2010), X конгрессе Международной Диабетологической Федерации (Париж, Франция, 2003), IX региональной конференции по лечению сахарного диабета 2 типа (СД2) (Берлин, Германия, 2009), 46 сессии Европейской Ассоциации по изучению сахарного диабета (Стокгольм, Швеция, 2010), Европейских конгрессах эндокринологов. Апробация диссертации проведена на межотделенческой научной конференции ФГУ «Эндокринологический научный центр» Минздравсоцразвития РФ 14 июня 2011 года.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ в отечественных и зарубежных научных изданиях. Вклад соавторов отражен в публикациях по теме.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на 243 страницах машинописного текста и включает оглавление, введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 391 название (41 работа отечественных авторов и 350 работ зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 41 таблицей и 47 рисунками.

Выводы

1. Гетерогенность клинической картины аутоиммунного СД1 обусловлена значительными различиями гормонально-метаболических и иммуно-генетических характеристик пациентов.

2. Особенностью LADA является сочетание аутоиммунного процесса с инсулинорезистентностью, что приводит к манифестации сахарного диабета при меньшем уровне разрушения ß-клеток. LADA развивается как на фоне сниженной функциональной активности ß-клеток, так и на фоне инсулинорезистентности.

3. У пациентов с LADA в генотипе значимо чаще встречается только один из высокопредрасполагающих гаплотипов HLA (DR3-DQ2;DR4-DQ8) в комбинации с протективным или нейтральным гаплотипом, что может определять более позднюю манифестацию заболевания и менее агрессивное течение.

4. Обнаружена ассоциация полиморфного маркера -23HphI (rs689) гена INS с развитием как СД1, так и LADA. Установлено, что носители аллеля А данного полиморфного маркера имеют повышенный риск развития как СД1, так и LADA, тогда как носители аллеля Т имеют пониженный риск развития как СД1, так и LADA.

5. Ассоциация полиморфного маркера R620W гена PTPN22 с развитием LADA в нашей выборке не выявлена, в то время как при СД1 обнаружена данная ассоциация. Установлено, что носители аллеля Т данного полиморфного маркера имеют повышенный риск развития СД1, тогда как носители аллеля С имеют пониженный риск развития СД1.

6. Развитие СД1 связано с нарушением иммунорегуляторных механизмов, включая изменения количества регуляторных Т-лимфоцитов и их активности. При СД1 экспрессия FOXP3 остаётся сниженной на всём протяжении заболевания (несмотря на отсутствие существенной разницы в содержании Treg в крови), что обусловливает низкую супрессивную активность Treg в отношении аутореактивных цитотоксических Тлимфоцитов. При LADA функциональный дефицит Treg возникает отсрочено, что, очевидно, обусловливает медленное прогрессирование аутоиммунной деструкции ß-клеток, несмотря на наличие аутоантител.

7. Сниженная экспрессия ключевого маркёра апоптоза лимфоцитов (CD95+), наблюдаемая при СД1, является косвенным признаком подавления программированной гибели аутореактивных лимфоидных клеток. При LADA данные изменения наблюдаются в меньшей степени, чем при классическом варианте клинической картины СД1. Повышение количества С095+-лимфоцитов на фоне компенсации углеводного обмена в течение первого года заболевания свидетельствует о частичном восстановлении иммунорегуляторных механизмов.

8. У лиц из группы риска развития аутоиммунного СД1 увеличивается популяция CD4+CD25+hlgh- Treg что может отражать подавление аутоиммунной реакции в отношении ß-клеток.

9. Фаза клинической ремиссии характеризуется нормализацией базальной концентрации С-пептида в крови, снижением титров аутоантител, ассоциированных с развитием СД1, повышением интенсивности экспрессии CD95 и снижением интенсивности экспрессии CD95L на лимфоцитах. В период ремиссии сохраняется низкая функциональная активность Treg (низкая интенсивность экспрессии FOXP3), однако повышается численность этой популяции лимфоцитов. Суммарный секреторный ответ на смешанную пищу в ходе теста ММТТ составляет, в среднем, 94,7% от такового у обследованных из контрольной группы здоровых лиц.

10.У пациентов с впервые выявленным СД1 в состоянии метаболической компенсации секреторный ответ на смешанную пищу в ходе теста ММТТ составляет, в среднем, 67,7% от такового у обследованных из контрольной группы, а у пациентов с LADA — 88,1%. Данные показатели отражают роль глюкозотоксичности в подавлении секреторной активности ß-клеток в дебюте заболевания, а также могут свидетельствовать об их высоком эндогенно-регенеративном потенциале.

Практические рекомендации

1. Сниженная функциональная активность ß-клеток в дебюте LADA і и сниженный суммарный секреторный ответ у пациентов с LADA, даже на фоне компенсации заболевания, позволяет рекомендовать раннее назначение инсулинотерапии.

2. Исследование секреторной функции ß-клеток с использованием ММТТ теста у взрослых пациентов с впервые выявленным СД в состоянии метаболической компенсации может быть рекомендован для уточнения типа СД и дальнейшей лечебной тактики.

3. Одной из характеристик LADA при генотипировании HLA класса II в комплексе с другими диагностическими маркерами является наличие в генотипе только одного предрасполагающего гаплотипа в сочетании с протективным или нейтральным.

4. При проведении дифференциальной диагностики СД, помимо определения HLA генотипа, рекомендовано дополнительно исследовать полиморфные маркеры -23HphI (rs689) гена INS и R620Wгена PTPN22.

5. Лица, имеющие положительные титры аутоантител, ассоциированных с развитием СД1, с базальным уровнем С-пептида на нижней границе референсного интервала должны быть включены в группу динамического наблюдения (HbAic каждые 3 мес).

6. Для верификации аутоиммунного процесса, пациентам с впервые выявленным СД и лицам группы риска развития СД1 рекомендуется, помимо определения аутоантител, ассоциированных с развитием СД1, определять количество регуляторных CD4+CD25+hlgh Т-лимфоцитов и их функциональную активность (экспрессию FOXP3).

7. Проведение расширенной клинико-лабораторной диагностики позволяет с высокой достоверностью дифференцировать различные подтипы и варианты течения аутоиммунного СД, что крайне важно для выбора адекватной лечебной тактики.