Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение экспрессии генов, контролирующих суточные ритмы, в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга

На правах рукописи

003455906

Цынкаловский Олег Ростиславович

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ СУТОЧНЫЕ РИТМЫ, В ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ И КЛЕТКАХ-ПРЕДШЕСТВЕННИКАХ КОСТНОГО МОЗГА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

о 5 ДЕК да

Москва -2008 г.

003455906

Работа выполнена в Центре по исследованию стволовых клеток Института им. Гаде Бергенского университета (г. Берген, Норвегия) и в AHO «Институт иммунофизиологии» (г. Москва).

Научные консультанты:

профессор Лярум Оле Дидрик

доктор медицинских наук, профессор Сепиашвили Реваз Исмаилович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Балмасова Ирина Петровна, доктор медицинских наук, академик РАН и РАМН Петров Рэм Викторович доктор медицинских наук, профессор Кадагидзе Заира Григорьевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита диссертации состоится « 24 » декабря 2008 г. в « 17:00 » часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.26 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 10а.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6).

Автореферат разослан /-¿Су 0 8 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профеоегтп'Л п I лавянская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Циркадные (суточные, с периодом около 24 часов) ритмы сформировались в процессе эволюции для синхронизации большинства важнейших функций организма при адаптации к воздействию факторов внешней среды (Губин Г. Д., 1980). Система формирования ритмов у млекопитающих представляется в иерархическом виде: формирование ритмов происходит в нейронах суирахиазматических ядер вентрального гипоталамуса - центральном пейсмейкере, который координируют ритмы в периферических тканях (Reppert S. М., 2001). Однако все больше новых данных свидетельствует в пользу того, что регуляция ритмов специфична для каждой ткани, и во многом определяется особым набором функций, которые ткань выполняет (Cuninkova L., 2008). Исследования последних лет показали, что клетки периферических тканей и органов способны генерировать собственные самоподдерживающие ритмы и изменять их соответственно локальным потребностям (Моисеева Н. И., 1978; Stratmann М., 2006).

Молекулярной основой формирования клеточных ритмов являются так называемые «clock» гены, активность которых регулируется по принципу обратной связи самими генами и их продуктами (Toh К. L., 2008). Clock гены выявлены не только в нейронах супрахиазматических ядер, но и в клетках большинства периферических тканей и органов. Белки, кодируемые этими генами являются транскрипционными факторами, экспрессия которых координируется в соответствие с клеточными циркадными ритмами. При изменении активности транскрипционных факторов может ритмично меняться и экспрессия подконтрольных им генов (clock-controlled genes) и, соответственно, клеточные процессы, этими генами опосредуемые. Масштабный сравнительный анализ суточной экспрессии более 12000 генов в клетках печени и сердца показал, что активность около 10 % исследуемых генов меняется ритмично (Storch К., 2002). За счет влияние на активность

подконтрольных генов clock гены непосредственно участвуют в регуляции многих процессов в клетках. Координация clock генами основных циркадных ритмов организма с локальными потребностями периферических тканей позволяет клеткам этих тканей и органов оптимально адаптироваться к местным изменениям окружающей среды (Катинас Г. С., 1980). Таким образом, clock гены выполняют важную роль в поддержании клеточного и тканевого гомеостаза (Stokkan К.-А., 2001).

В кроветворной ткани костного мозга циркадные изменения экспрессии clock генов детально не исследовались. Гемопоэз представлет собой высокодинамичный процесс образования и дифференцировки клеток крови, которые после созревания выполняют разные функции, в том числе иммунную (Петров Р. В., 1987; Хаитов Р. М., 2000; Сепиашвили Р. И., 2005). Количество клеток каждого типа и скорость их образования при гемопоэзе контролируется индивидуально, в соответствии с меняющимися потребностями, и должны четко координироваться и регулироваться во времени. Изучение молекулярных механизмов формирования ритмов в клетках кроветворной ткани необходимо для понимания регуляции гемопоэза и может дать возможность управлять этим процессом, а потому представляется актуальным.

Из клеток костного мозга, наибольший интерес представляют кроветворные стволовые клетки, которые в течение многих лет являются объектом интенсивных исследований (Петров Р. В., 1974). Эти клетки, характеризующиеся способностями к самоподдержанию и к дифференцировке (Weissman I. L., 2001), являются наиболее перспективными клетками для использования в терапевтических целях при лечение онкологических заболеваний, дистрофических состояний, и в регенеративной медицине (Cerletti М., 2008). Циркадные ритмы в стволовых клетках до сих пор не изучались.

Отсутствие работ в данной области связано прежде всего с методическими сложностями изучения этих клеток. Стволовые клетки составляют очень небольшой процент (< 0.1 - 0.01 %) клеток костного мозга (Weissman I. L., 2000), и выделить за короткий период времени достаточное

количество клеток без потери качества РНК для детального молекулярного анализа весьма сложно. Поэтому разработка методики, позволяющей изучать изменения clock генов в высокоочищенных популяциях кроветворных стволовых клеток, является одной из актуальных задач.

Цель работы - изучить активность генов, контролирующих суточные ритмы кроветворения, в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга мышей и человека; сравнить особенности формирования ритмов в кроветворных клетках разной степени дифференцировки.

Основные задачи работы

1. Разработать методический подход для исследования экспрессии генов в редких популяциях стволовых клеток лабораторных моделей и человека.

2. Определить экспрессию ключевых генов, контролирующих суточные ритмы (clock генов), в кроветворных стволовых клетках мышей. Сравнить относительные уровни экспрессии clock генов в популяции этих клеток и в общей популяции клеток костного мозга.

3. Изучить изменение активности clock генов в течение суток в общей популяции клеток костного мозга мышей и очищенной популяции стволовых клеток.

4. Провести сравнительный анализ особенностей формирования суточных ритмов в популяциях кроветворных клеток разной степени дифференцировки.

5. Оценить экспрессию ключевых clock генов в изолированной популяции стволовых клеток и клеток-предшественников и в общей популяции клеток костного мозга человека.

6. Изучить изменение активности clock генов в течение суток в изолированных кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека.

Научная новизна

Впервые выявлена активность ключевых clock генов mPerl, тРег2, mCryl, mBmall, mClock и mRev-erb а в кроветворных стволовых клетках

3

костного мозга. Установлено, что изменения активности большинства clock генов в стволовых клетках не координируется циркадными ритмами. Полученные данные расширяют представления о биологии стволовых клеток.

Представлено экспериментальное подтверждение гипотезы о том, что формирование ритмов происходит в процессе дифференцировки клеток. Выявленные достоверные различия в суточных изменениях активности clock генов в популяциях кроветворных клеток разной степени дифференцировки указывают на то, что регуляция ритмов в костном мозге зависит от степени зрелости клеток.

Показано, что регуляция ритмов в кроветворной ткани характеризуется особенностями, отличными от других тканей и органов. Установлено, что в кроветворных клетках отсутствует циркадные ритмы в изменениях активности Bmall, одного из ключевых регуляторов циркадных ритмов в периферических тканях. Получененные данные свидетельствуют об особом механизме формирования ритмов гемопоза и обосновывают необходимость его дальнейшего изучения.

Впервые определена экспрессия ключевых clock генов в кроветворных клетках костного мозга человека и изучены изменения активности этих генов в изолированных стволовых клетках и клетках-предшественниках человека. Выявлены ритмы в изменении суточной экспрессии трех ключевых clock генов: hPerl, hPer2 и hCry2. Полученные новые знания о системе формирования циркадных ритмов гемопоэза у человека создают предпосылки для дальнейшего развития и оптимизации методов использования стволовых клеток и клеток-предшественников с терапевтической целью.

Теоретическая и практическая значимость

Разработан новый методологический подход для изучения формирования суточных ритмов в редких популяциях кроветворных стволовых клеток, сочетающий использование высокоскоростной проточной цитометрической сортировки и метод количественной обратно-транскриптазной полимеразной

цепной реакцией в режиме реального времени. Показано, что высокоскоростная сортировка клеток не вызывает деградации РНК и не влияет на экспресиию генов. Использование данного подхода позволило впервые изучить организацию системы контроля суточных ритмов в кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга у мышей и человека. Обосновано применение разработанной методики для исследования стволовых клеток других видов.

Методика внедрена в лаборатории клинической иммунологии АНО «Институт иммунофизиологии» (г. Москва) и используется для исследования стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга.

Полученные в работе данные дают представление о молекулярных основах формирования ритмов в кроветворной ткани млекопитающих. Показаны особенности регуляции ритмов в изолированных популяциях стволовых клеток костного мозга. Установлено, что формирование циркадных ритмов в кроветворной ткани зависит от степени диффференцировки клеток. Обосновано, что регуляция суточных ритмов в кроветворной ткани отличается от других периферических тканей и органов. Новые данные о формировании ритмов кроветворения у человека вносят теоретический вклад в эту малоизученную область хронобиологии.

Результаты работы используются в лекционных курсах программы первичной специализации и сертификации кадров по специальности клинико-лабораторная диагностика на кафедре аллергологии и иммунологии ФПК МР ГОУ ВПО «Российский Университет Дружбы Народов».

Положения, выносимые на защиту

1. Высокоскоростная проточно-цитометрической сортировка в сочетании с количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени является оптимальным методом для изучения внутриклеточных циркадных ритмов в редких популяциях кроветворных стволовых клеток. Сортировка не вызывает деградацию выделяемой РНК и не

влияет на экспрессию генов. Предложенная методика может эффективно применяться для изучения стволовых клеток других видов.

2. В стволовых клетках костного мозга мышей экспрессируются все ключевые clock гены. Относительные уровни экспрессии этих генов в стволовых клетках отличаются от клеток общей популяции костного мозга, состоящей из более дифференцированных и зрелых клеток. Наиболее существенные различия установлены для mPerl и mCryl.

3. Формирования и регуляции ритмов в кроветворной ткани зависит от степени дифференцировки и зрелости клеток. В кроветворных стволовых клетках мышей не сформированы ритмы в изменении активности большинства clock генов (кроме тРег2).

4. У человека в кроветворных стволовых клетках и в клетках-предшественниках костного мозга суточные изменения активности hPerl, hPer2 и hCry2 подчиняются циркадным ритмам. Система формирования ритмов в кроветворной ткани мышей и человека характеризуется видовыми особенностями.

5. Изменения суточной активности Bmall, играющего важную роль в регуляции циркадных ритмов во многих периферических тканях, происходят неритмично в кроветворных клетках разной степени дифференцировки, т.е. на всех этапах гемопоза. Формирование ритмов процесса кроветворения происходит без участия Bmall.

6. Система формирования суточных ритмов в кроветворной ткани млекопитающих, в частности в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга, отличается от других периферических тканей и органов.

Апробация работы

Результаты исследований по диссертационной работе представлены на российских и международных конференциях и конгрессах: Международном конгрессе по иммунофизиологии (Дагомыс, 2003); International meeting on advanced flow cytometry (Paris, 2003); Danish meeting on flow cytometry

(Copenhagen, 2004); Norwegian Stem Cell Network meeting (Rosendal, 2005); Norwegian Stem Cell Network meeting (Oslo, 2006), International Congress on Stem Cells (Cancun, 2006), Объединенном иммунологическом форуме - 2008 (Санкт-Петербург, 2008); Международной конференции по физиологии и патологии иммунной системы (Москва, 2008); Royan International Twin Congress on Regenerative Biomedicine and Stem Cell Biology and Technology (Tehran, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ (из них 9 -в международной печати), включающих 1 монографию, 1 главу книги, 7 журнальных статей и 9 материалов российских и международных конференций.

Объем и структура диссертаци

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, четырех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 217 источников (из них 169 - зарубежных), и содержит 25 рисунков и 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты на мышах

Животные. В работе использовались мыши, самцы С57В1аск и B6D2F1 (Charles Rivers, L'Arbresle, France), которые в течение трех недель до начала опытов находились в стандартных световых условиях: 12 ч при свете (с 06:00 до 18:00)/12 ч в темноте (LD). Для подтверждения синхронизации основных ритмов организма к стандартному режиму у мышей с помощью цифровых датчиков Digital Thermometer 49А (YSI, Dayton, OH, USA) измерялась ректальная температура. В течение 24 ч до начала экспериментов животные находились в полной темноте (DD) во избежания стимулирующего влияния света, маскирующего эндогенные ритмы. В каждой из 3-х групп экспериментов использовали 28 мышей. Шесть раз в сутки через каждые 4 ч забивали 4

мышей для получения образцов костного мозга и печени и забора крови. Обозначение времени забора (circadian time, CT) соответствовало времени LD до начала экспериментов (например, 6 00 CT - 06:00). Седьмой забор производили через 24 ч после начала эксперимента, т.е. по времени этот забор совпадал с первым забором. Мышей усыпляли ингаляционным наркозом (СО2) и забивали путем быстрого смещения шейных позвонков. Для получение костного мозга кости бедра и голени растирали в форфоровой ступке в холодном растворе стандартного буфера. Клетки от всех животных смешивались, фильтровались и отмывались центрифугированием в течение 10 мин при 300 g при температуре +4° С, после чего лизировали эритроциты. При забивании у животных собирали кровь из сердечной полости для определения содержания кортикостерона и мелатонина методом радиоизотопного анализа (Claustrat В., 1984; Filipski Е., 2004). После отмывки клетки подсчитывали, разводили до концентрации 106 клеток/мл и оставляли в холодильнике (при 4° С) до окрашиванияли флуоресцентным красителем Hoechst 33342 (Hoechst). Одновременно окрашивали клетки всех 7 образцов костного мозга, взятых в течение суток.

Окрашивание Hoechst Подробное описание всех этапов окрашивания Hoechst, список необходимых реактивов, особенности анализа на проточном цитометре для обнаружения «side population» (SP) приведены на сайте лаборатории Goodell (http://www.bcm.edu/labs/goodell/). Нами использовался метод с минимальными модификациями (Цынкаловский О. Р., 2008). Конечная концентрация Hoechst составляла 5 мкг/мл, время инкубации - 90 мин. при 37°. В некоторых экспериментах образцы преинкубировали 15 мин при 37° С с веществами, тормозящими формирование SP: верапамилом (50 мМ), резерпином (5 мкМ) или фумитреморгином С (7 мкМ). Окрашивание останавливали перенесением пробирок на лед, добавлением холодного буферного раствора и центрифугированием при 300 g 10 мин при 4° С. В части экспериментов отмытые клетки дополнительно окрашивали антителами против поверхностных белков Sca-1 и C-kit, конъюгированными, соответственно, с

флуоресцином (FITC) или с R-фикоэретрином (RPE). Непосредственно перед анализом в образцы добавляли иодид пропидия, propidium iodide (конечная концентрация 2 мкг/мл), окрашивающий мертвые клетки.

Определение способности стволовых клеток мышей образовывать колонии in vitro. Клетки костного мозга культивировали в 35-мм чашках Петри в растворе метилцеллулозы MethoCult 3434 (Stem Cell Technologies, Canada), содержащим 3 U/мл эритропоэтина, 10 нг/мл интрлейкина 3, IL-3,10 нг/мл IL-6, и 50 нг/мл фактора стволовых клеток, stem cell factor. Способность производить колонии оценивали на 12 день культивирования по стандартным критериям (http://www.stemcell.com/technical/28405_methocult%20M.pdf).

Эксперименты на рыбах Danio rerio

Рыбы. Для экспериментов использовано 780 взрослых рыб Danio rerio TAB, которые были получены и содержались в аквариуме международного центра молекулярной биологии Sars (г. Берген, www.sars.no/manual.doc).

Цитология. Препараты приготавливали с применением цитоспинов 2-10 х 103 клеток в центрифуге Shandon Cytospin 3. Для световой микроскопии препараты окрашивали набором Diff-Quik kit (Dade-Behring AG, Switzerland), для конфокальной микроскопии (Leica TCS SP2 AOBS, Wetzlar, Germany) использовали неокрашенные препараты.

Миелосупрессивная терапия. Для получения миелосупрессивного эффекта рыбам 10-мкл шприцом для микроинъекций Hamilton вводили внутрибрюшинно 5-флуоурацил (Sigma-AIdrich) в концентрации 250 мкг/кг веса в 5 мкл физиологического раствора или физиологический раствора в качестве контроля.

Эксперименты на костном мозге человека

Доноры. Донорами костного мозга явились 10 мужчин-добровольцев в возрасте от 21 до 28 лет. Первая серия экспериментов (5 доноров) проведена в период с декабря 1999 года по яварь 2000 года, вторая (5 доноров) - в период с декабря 2003 года по январь 2004 года. От каждого донора получено

9

письменное согласие участвовать в исследовании. Все процедуры проведены соответственно с Инструкциями по этике биомедицинских исследований Совета международных организаций по медицинским наукам.

Выделение клеток костного мозга человека. Образцы костного мозга получали 6 раз в течение суток, пунктируя грудину и бедренные кости в 08:00, 12:30,17:00,21:30,02:00 и 07:00 ч. Под местным наркозом проводили пункцию, набирали 8 мл костного мозга в 20-мл шприц, который смешивали с 13 мл физиологического раствора, содержащего 2 мМ EDTA. Из полученного раствора 1 мл замораживали, небольшую часть использовали для анализа на проточном цитометре, а основной объем - для выделения стволовых клеток и клеток предшественников.

Заморозка. Перед замораживанием образцов лизировали эритроциты, клеточную взвесь фильтровали, распределяли в выдерживающие заморозку в жидком азоте, и центрифугировали (5 мин при 300 g при температуре +4° С) в 2-мл криопробирках (ТРР AG). Надосадочную жидкость удаляли, а пробирки с клетками быстро замораживали, погружая их на 40-60 с в жидкий азот (-1350 С), и храненили при температуре -80° С до анализа.

Получение сыворотки. Перед забором образцов костного мозга у добровольцев брали кровь из вены для подсчета общего количества лейкоцитов и определения лейкоцитарной формулы (только у доноров 6-10), и получения плазмы для определения содержания кортизола, гормона роста и тестостерона в лаборатории университетской клиники Хокеланда.

Проточная цитометрия: анализ и высокоскоростная сортировка клеток

Анализ кроветворных клеток мышей и рыб Dattio rerio. Для анализа и сортировки кроветворных клеток мышей и рыб использовали высокоэффективный проточный цитометр-сортировщик MoFlo (Cytomation, Fort Collins, USA), оборудованный лазероми с длиной волны 488 нм, 365 нм (ультрафиолетовый спектр) и 635 нм. Для анализа клеток, окрашенных Hoechst,

использовали лазер с длиной волны 365 нм, оптическое зеркало 610 DMSP и оптические фильтры 450/20 ВР и 675 EFLP. При анализе клеток исключали клеточные агрегаты, мертвые клетки и клеточные обломки.

Анализ кроветворных клеток человека. Для анализа чистоты популяции С034+-клсток, изолированных с помощью магнитных микрочастиц, использовали проточный цитометр FACS Calibur (BD Biosciences, USA). Клетки окрашивали aHTH-CD45-FITC и aHTH-CD34-RPE антителами, и добавляли 7-аминоактиномицин для исключения мертвых клеток из анализа. Чистота популяции С034+-клеток, изолированных с помощью магнитных микрочастиц MACS, колебалась от 70.3% to 95.6% (медиана: 82.3%).

Высокоскоростная сортировка клеток. Клетки сортировали в режиме "purify 1" со скоростью до 30000 событий (клеток)/с. Обычно чистота сортировки составляла 94 - 99% (в среднем - 97.3%). Основную часть клеток замораживали для последующего молекулярного анализа, а часть клеток использовали для оценки морфологии и способности образовывать колонии.

Выделение CD3f-клеток костного мозга человека. Кроветворные стволовые клетки и клетки-предшественники, экспрессирующие маркер CD34 (С034+клетки), выделяли из смешаной взвеси клеток костного мозга с помощью магитных частиц Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit и колонок MS+ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) согласно инстирукциям производителя. Предварительно изолировали мононуклеарные клетки путем фракционирования на Lymphoprep (Nycomed, Norway).

Выделение РНК и определение экспрессии генов

Выделение РНК. Суммарную клеточную РНК выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Germantown, MD, USA), затем образцы обрабатывали ДНазой с последующей экстракцией фенол-хлороформом (Promega, Madison, WI, USA). Для качественного контроля и определения количества выделенной РНК каждый образец (1 мкл) тестировали на биоанапизаторе Agilent 2100 и NanoLabChip согласно инструкции

производителя. В среднем из образцов неочищенной популяции клеток костного мозга выделяли 3.2 - 4.1 мкг общей РНК, а из образцов SP клеток - от 50 до 240 нг. Все образцы РНК хранили при -80° С.

Обратная транскрипция РНК. Обратную транскрипцию суммарной РНК проводили с помощью реактивов TaqMan RT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Компоненты реакционной смеси приведены в статье (Tsinkalovsky О., 2005). Полученные образцы комплементарной ДНК хранились при - 20° С.

Праймеры Для дизайна праймеров и флюоресцентно меченых проб использовали программу Primer Express (Applied Biosystems). Последовательности праймеров и проб, использованных в нашей работе, приведены в отдельных статьях для генов клеток мышей (Tsinkalovsky О. et al., 2005; Tsinkalovsky О., 2006), человека (Tsinkalovsky О., 2007) и рыб Danio rerio (Tsinkalovsky О., 2007). Праймеры и пробы для оценки экспрессии генов мышей и человека приобретали у MedProbe (Oslo, Norway), для генов рыб - у Sigma-Aldrich. Готовые праймеры для анализа экспресии 18S, GAPDH, hPO, hß-actin (для эндогенного контроля) приобретали у Applied Biosystems.

Постановка количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (К-О-ПЦР). Для оценки экспресии генов кДНК анализировали К-ОТ-ПЦР на оборудовании Applied Biosystems Sequence Detection System в 96-луночных планшетах на инструменте ABI PRISM 7700 (для клеток мышей и человека) или в 384-луночных планшетах на инструменте ABI PRISM 7900 (для клеток рыб). В каждую реакцию для построения стандартной кривой включали 6 (для клеток мышей) или 9 (для клеток человека) образцов кДНК, полученных с образцов контрольной РНК. Эти образцы приготавливали путем последовательного двухкратного разведения контрольной РНК, начиная с концентрации 250 нг для клеток мышей или с 500 нг для клеток человека. При проведения каждого теста включали также образец, содержащий реакционную смесь без кДНК. Каждый образец кДНК анализировали в триплетах. Все образцы, относящиеся к одной

популяции клеток (например, клетки SP) включали в одну реакцию (на одном планшете). Все образцы клеток рыб анализировались для каждого гена в одной реакции на одном планшете.

Состав реакционной смеси К-ОТ-ПЦР и параметры цикла реакций описаны отдельно для образцов клеток мышей (Tsinkalovsky О. et al., 2005), человека (Tsinkalovsky О. et al., 2007) и рыб Danio rerio ((Tsinkalovsky О. et al., 2007).

Стандартные кривые, полученные в результате анализа образцов контрольной кДНК, использовали для оценки эффективности проведенной реакции и для определения относительного количества каждого из тестируемых образцов. Величина наклона стандартных кривых составляла -3.1 - -3.3, что подтвердило эффективность поставленных К-ОТ-ПЦР. Оценку экспресии генов в клетках печени мышей производилась с некоторыми отличиями (Tsinkalovsky О. et al., 2006).

Обработка данных и статистический анализ

Нормализация данных. Анализ результатов реакций К-ОТ-ПЦР проводили с использованием метода стандартных калибровочных кривых, который позволил стандартизировать данные, полученнные в разных ПЦР (на разных планшетах). В хронобиологических экспериментах для уменьшения неточности вычислений экспрессии генов при нормализации данных использовали среднюю геометрическую величину от трех (мышиные клетки) или четырех (человеческие клетки) генов, выбранных в качестве эндогенного контроля (Vandesompele J., 2002). Экспрессия тестируемых генов определялась путем деления средней величины экспрессии гена в триплетах на среднюю геометрическую эндогенных контролей. В остальных экспериментах на клетках мышей в качестве эндогенного контроля использовали 36В4, а в опытах с клетками рыб - 18S. В каждой серии экспериментов на основе данных анализа всех образцов, вычисляли среднюю величину нормализованной

TIME (e.g . Local Clock Hour)

Рис.1. Основные характеристики ритма, которые получают при косинор-анализе данных. Рисунок Robert В. Sothern, публикуется с его разрешения.

экспрессии отдельного гена. Относительно этой величины, принятой за 100 %, выражали экспрессию этого гена (мРНК) в каждом отдельном образце и определяли стандартную ошибку средней (±SEM). Для анализа объединяли данные, соответствующие определенному времени забора (соответственно, данные трех экспериментов на мышах и у 10 доноров). Изменения концентрации гормонов и количества клеток крови также выражали в процентах от средней величины всех значений этих показателей (принятой за 100 %) в данной серии экспериментов.

Статистическая обработка результатов. В хронологических экспериментах на мышах и у доноров для выявления суточных ритмов данные изменения температуры тела, концентраций гормонов и экспрессии генов обрабатывались методом косинор-анализа (single cosinor), используя программу Chronolab (Mojon А., 1992). Этот метод, основанный на приближении экспериментальных данных определенного временного периода (24 ч в наших

экспериментах) косинусоидой, позволяет оценить ритм по следующим основным критериям: 1) уровня значимости р, 2) двойной амплитуде (2А), %, отражающей интенсивность колебаний - удвоенную разницу между пиком и спадом на кривой, и 3) акрофазе, моменту времени (часы и минуты), когда колебание достигает пика (Рис. 1). Кроме того, каждая серия данных подвергалась однофакторному дисперсионному анализу (one-way ANOVA).

В остальных экспериментах вычислялся t-критерий Стьюдента с помощью программы GraphPad Prism, версии 3 (GraphPad Software, USA). Эту же программу использовали для построения части графиков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Методический подход для анализа экспрессии clock генов в кроветворных клетках костного мозга мышей

Отсутствие данных об организации системы регуляции циркадных процессов в CK связано прежде всего с методическими сложностями изучения этих клеток. CK составляют очень небольшой процент клеток костного мозга (< 0.1 — 0.01 %), что вызывает методические трудности в выделении за короткий период времени достаточного числа клеток без потери качества РНК для детального молекулярного анализа. Поэтому первая задача нашей работы состояла в разработке методики анализа циркадных генов в высокоочищенных популяциях кроветворных стволовых клеток.

Основным методом для выделения стволовых клеток костного мозга мышей был выбран метод окраски Hoechst. Этот метод прост, обладает рядом серьезных преимуществ, и в Центре по исследованию стволовых клеток Бергенского университета были все условия для окрашивания и анализа клеток на проточном цитометре, оборудованном ультрафиолетовым лазером (365 нм). В наших экспериментах клетки SP составляли 0.05 - 0.07 % клеток костного мозга и были чувствительны к воздействию верапамила (Рис.2 А и Б). От 75 % до 85 % клеток SP экспрессировали поверхностные антигены Sca-1 и c-kit,

Hoechst Red

R2 (79,04%)

Sca-1

Рис. 2. Проточно-цитомметрический анализ клеток SP (R1) костного мозга. (А и В) Клетки костного мозга окрашивали Hoechst без (А) или с (В) 50 мкМ верапамила. В скобках указан процент клеток, относящихся к SP. (С) Анализ отсортированных клеток SP подтверждает высокую чистоту сортировки (97.04%). (D) Экспрессия поверхностных антигенов c-kit и sca-1 (R2) на клетках SP, включенных в R1 на гистограмме (А), свидетельствует о характерном для стволовых клеток фенотипе.

являющиеся маркерами кроветворных стволовых клеток костного мозга мышей (Spangrude G. J., 1990). Клетки SP также обладали значительно более высокой по сравнению с неочищенной популяцией клеток костного мозга способностью образовывать колонии кроветворных клеток in vitro и проявляли мультипотентность. Среднее соотношение количества колоний к количеству посеянных клеток для SP составляло 1/3.2, тогда как в клетках костного мозга это соотношение было 1/244.9. Таким образом, колониеобразующая способность клеток SP в 76.5 раз превышала таковую для смешаной популяции клеток костного мозга.

Для получения достаточного для последующих анализов количества материала клетки SP сортировались на проточном цитометре со скоростью до 30000 событий/с. Этот метод позволял за относительно короткий период времени получить чистую (> 94 - 97 %) популяцию стволовых клеток (Рис. 2 Г), из которой можно было выделить достаточно РНК для молекулярно-биологического анализа, в наших экспериментах — для анализа ключевых clock генов. Несмотря на то, что количество клеток, использованных для оценки экспрессии генов отличалось между популяциями костного мозга в несколько раз, выделенная мРНК во все образцах была высокого качества (Рис. 3 А).

г

Концентрация РНК - В

5.38 ш/MKji; рЖК

28SI8S - 1.71

1 2 . 3

I.

Рис. 3. Результаты анализа выделенной мРНК на Agilent 2100 и NanoLabChip свидетельствуют о высоком качестве продукта независимо от исходного количества клеток. Сверху на графиках приведены концентрация мРНК и соотношение рРНК 28S/18S для клеток смешаной популяции костного мозга (А) и клеток SP (В). Цифрами обозначены: 1 - образец со стандартами РНК, 2 - пик рРНК 18S, 3 - пик рРНК 28S.

Используя метод К-ОТ-ПЦР, мы впервые смогли оценить и сравнить активность ключевых clock генов в смешаной популяции клеток костного мозга и в популяции стволовых клеток. Все тестируемые clock гены экспрессировались в обеих популяциях кроветворных клеток, причем можно отметить как сходства, так и различия. Так, относительные уровни активности mPer2, mBmall и mClock были одинаковыми в обеих популяциях клеток. Вместе с тем, экспрессия mPerl в SP клетках оказалась почти в 3 раза выше относительно других генов, тогда как в смешанной популяции костного мозга она не отличалась от mPer2, mBmall и mClock (Рис. 4). Экспрессия mCryl в смешаной популяции клеток костного мозга оказалась самой высокой по отношению к другим clock генам, а в клетках SP не отличалась от экспрессии других генов (за исключением mPerl ).

При апробировании разработанного методического подхода необходимо было убедиться, что высокоскоростная сортировка не вызывает повреждение клеток и деградации РНК. В серии отдельных экспериментов мы сравнили качество выделенной РНК и экспрессию clock генов в двух видах образцов смешаной популяции клеток костного мозга: (1) взятых до сортировки и (2)

Рис. 4. Сравнение относительных уровней мРНК (%) ключевых clock генов отсортированных клеток SP (левый график) и клеток смешаной популяции костного мозга (правый график). Уровень экспрессии тестируемых генов (мРНК) выражен по отношению к экспрессии эндогенного контроля т36В4. Все величины - средние пяти экспериментов + стандартная ошибка средней (± SEM).

отсортированных с высокой скоростью (без исключения каких-либо клеточных популяций).

Оценка выделенной РНК на биоанализаторе Agilent 2100 с использованием NanoLabChip показала, что сортировка даже с высокой скоростью не вызывает деградацию РНК в изолированных клетках: все образцы РНК были высокого качества (Рис. 3 В).

Результаты К-ОТ-ПЦР продемонстрировали, что высокоскоростная сортировка также не отражается на экспрессии тестируемых генов. Как показано на Рис. 4 А, уровень экспрессии ключевых clock генов был практически одинаковым в обоих видах клеток костного мозга - взятых до или после сортировки на проточном цитометре.

Так как при исследовании циркадных изменений экспрессии clock генов забор образцов клеток производят последовательно через определенные интервалы времени (4 ч в наших экспериментах) в течение суток, окрашивание и анализ/сортировка некоторых образцов может происходить с задержкой. В связи с этим было важно определить, не может ли такая задержка отразиться

Рис. 5. Высокоскоростная сортировка и задержка окрашивания клеток костного мозга не влияют на экспрессию генов. (А) Относительный уровень мРНК (%) clock генов в клетках костного мозга до (левый столбик каждой пары) и после (правый столбик) сортировки. (В) Относительный уровень мРНК mPerl (%) в отсортированных клетках SP костного мозга, окрашенного сразу после выделения клеток (левый столбик), через 12 ч (средний столбик) или через 24 ч (правый столбик). Уровень экспрессии тестируемых генов (мРНК) выражен по отношению к экспрессии эндогенного контроля т36В4. Все величины - средние пяти экспериментов ± стандартная ошибка средней (± SEM).

на уровне экспрессии генов. Для проверки такой возможности мы провели отдельную серию экспериментов, в которых окрашивание клеток костного мозга Hoechst и сортировку SP клеток проводили следующим образом: (1) сразу после выделения клеток костного мозга, или с задержкой (2) в 12 ч или (3) в 24 ч. Результаты этих опытов показали, что задержка окрашивания и изолирования клеток до 24 ч не оказывает влияния на качество выделенной мРНК или на уровень экспрессии генов. На Рис.5 В показан относительный уровень экпрессии mPerl в соответствующих группах. Аналогичные результаты были получены для других исследованных clock генов.

Оценка эффективности и аккуратности метода К-ОТ-ПЦР

Из-за большого количества тестируемых образцов и генов необходимо было провести несколько десятков серий реакций К-ОТ-ПЦР. Для того, чтобы оценить, насколько сопоставими и воспроизводимы результаты, полученные в

разных реакциях, мы провели контрольные эксперименты определения экспрессии mPerl (тестируемый ген) и т36В4 (эндогенный контроль) в 10 одинаковых образцах РНК клеток костного мозга, которые анализировались на двух планшетах в двух отдельных реакциях К-ОТ-ПЦР. Вычисленный коэффициент вариации полученных значений оказался очень низким: для mPerl (п=30) он составил для реакций 1 и 2, соответственно, 0.43 % и 0.26 %, а для т36В4 (п=30) - соответственно, 0.43 % и 0.45 %. Приведенные данные свидетельствуют об исключительной аккуратности и надежности метода К-ОТ-ПЦР, что позволяет использовать его для сравнения экспрессии исследуемых генов в разных образцах клеток, полученных в разное время течение суток, а также в разных сериях экспериментов.

Обсуждение полученных результатов

В данной серии экспериментов мы впервые определили экспрессию ключевых clock генов mPerl, mPer2, mBmall,mCryl, mClock и mRev-erb в кроветворных стволовых клетках костного мозга мышей. Для получения этих результатов мы разработали методический подход, сочетающий высокоскоростную сортировку стволовых клеток и К-ОТ-ПЦР.

Немало данных свидетельствует о том, что, по крайней мере, часть этапов гемопоэза происходит ритмично (Smaaland R., 2002). Так, в костном мозге человека количество СБ34+-клеток, включающих стволовые клетки и клетки-предшественники, изменяется ритмично в течение суток (Abrahamsen J., 1998). Способность кроветворных клеток образовывать колонии и фазы клеточного цикла в этих клетках меняются с одинаковыми циркадными ритмами (Smaaland R., 1992). Различную степень устойчивости клеток костного мозга мышей в разное время суток к воздействию цитотоксических факторов (в одинаковой концентрации) также связывают с циркадными изменениями клеточного цикла (Wood Р., 1998). Образование гранулоцитарно-моноцитарных колоний клетками костного мозга мышей в течение нескольких суток in vitro происходит ритмично (Bourin Р., 2002). Более того, обнаружены устойчивые

24-часовые ритмы в способности клеток костного мозга мышей образовывать колонии in vivo при пересадке летально облученным рецепиентам (D'Hondt L., 2004).

Приведенные данные позволяют заключить, что в кроветворных клетках существуют механизмы, формирующие и регулирующие циркадные ритмы, которые в свою очередь влияют на проявление основных клеточных функций в костном мозге.

Из генов, ответственных за циркадные ритмы, в клетках костного мозга изучались mPerl и mPer2 (Chen Y.-G., 2000). В изменениях 24-часовой активности обоих генов были выявлены ритмы, причем ритм тРег2 в костном мозге по характеру отличался от описанного ритма в других тканях. Этот факт свидетельствует о том, что регуляция ритма в костном мозге может зависеть от локальных факторов. Костный мозг включает разнородные гетерогенные популяции стволовых клеток, клеток-предшественников, клеток, находящихся на разной степени дифференцировки, и зрелых клеток. В стволовых клетках активность clock генов до сих пор не изучалась. Это может объясняться прежде всего трудностями методического характера. Стволовые клетки составляют очень небольшой процент клеток костного мозга (<0.1 - 0.01 %), и выделить за короткий период времени достаточное количество клеток без потери качества РНК для детального молекулярного анализа достаточно сложно. Присутствие в образцах популяций более дифференцированных и зрелых клеток могут значительно изменить реальную молекулярную картину в стволовых клетках, так как активность многих генов в популяциях кроветворных клеток различных линий и разной степени дифференцировки неодинакова.

Нам удалось разработать методику анализа циркадных генов в высокоочищенных популяциях кроветворных стволовых клеток. Для выделения стволовых клеток мы использовали простой метод окраски кроветворных клеток флуоресцентным красителем Hoechst (Goodell М., 1996) и высокоэффективную проточно-цитометрическую сортировку. В окрашенном

Hoechst костном мозге мышей небольшая популяция клеток (SP), характеризующаяся низкой флуоресценцией, в значительной степени обогащена стволовыми клетками, которые способны полностью восстанавливать кроветворение у летально облученных мышей. Используя данный метод в наших исследовании, нам удалось получить стабильные воспроизводимые результаты: SP составляла 0.07 % клеток костного мозга, была чувствительна к воздействию верапамила, и большинство клеток этой популяции (около 80 %) экспрессировали поверхностные маркеры стволовых клеток C-kit и Sca-1. Мы показали, что клетки SP обладали значительно более высокой (> 75 раз) по сравнению с неочищенной популяцией клеток костного мозга способностью образовывать колонии кроветворных клеток in vitro. Приведенные результаты подтверждают, что использованный нами метод позволил получать SP, в значительной степени обогащенную кроветворными стволовыми клетками.

Высокоэффективная проточно-цитометрическая сортировка бесспорно является наиболее эффективным методом изолирования стволовых клеток. Возможность сортировать клетки с высокой скоростью дает безусловные преимущества при необходимости изолировать редкие клеточные популяции (< 0.1 %) для последующего молекулярно-генетического анализа, так как увеличение времени сортировки может приводить к снижению выживаемости клеток и повышает риск деградации РНК. Сортировка со скоростью до 30000 событий/с позволила нам получать за относительно короткий период времени достаточное количество РНК для последующего анализа активности clock генов в стволовых клетках методом К-ОТ-ПЦР. Как показали наши эксперименты с использование контрольных стандартных образцов РНК костного мозга коэффициент вариации реакций был крайне низким (< 0.5 %), что свидетельствует об аккуратности метода.

Так как эффективность метода К-ОТ-ПЦР во многом зависит от качества РНК, все образцы подвергались обработке ДН-азой, что позволило исключить примеси ДНК. Результаты анализа образцов на Agilent 2100 с использованием

Nano LabChip показали, что все полученные из стволовых клеток образцы РНК были высокого качества. Это свидетельствует о том, что высокоскоростная сортировка не вызывает деградации РНК.

Опыты с образцами клеток костного мозга, взятыми до или после сортировки показали, что высокоскоростная сортировка не влияет также и на экспрессию clock генов. Таким образом, сочетание проточно-цитометрической сортировки стволовых клеток после окраски Hoechst и метод К-ОТ-ПЦР можно считать оптимальным для проведения хронобиологических исследований.

Используя разработанную нами методику, мы смогли оценить активность ключевых генов, ответственных за формирование ритмов, в стволовых клетках в сравнении с общей популяцией клеток костного мозга. Полученные данные свидетельствуют о различиях в относительных уровнях экспрессии clock генов, особенно для mPerl и mCryl. Так, уровень экспрессии mPerl в стволовых клетках был самым высоким относительно других тестируемых генов, тогда как в клетках общей популяции костного мозга он находился на уровне тРег2, тВтаI и mClock. Активность mCryl в стволовых клетках не отличалась от экспрессии остальных clock генов (кроме mPerl), а в общей популяции клеток костного мозга относительный уровень экспрессии этого гена был самым высоким. Следует подчеркнуть, что мы сравнивали относительные, а не абсолютные значения активности генов. Так как каждый ген анализировался методом К-ОТ-ПЦР отдельно, нельзя полностью исключить возможность того, что эффективность разных реакций, проводимых для оценки различных генов, могла быть неодинаковой. Однако, полученные в каждой реакции стандартные кривые образцов контрольной кДНК, подтвердили стабильное качество и эффективность всех поставленных реакций. Даже если небольшая разница в эффективности каждой из К-ОТ-ПЦР может незначительно повлиять на сравнение абсолютных значений экспрессии генов, сравнение относительных уровней их активности позволяет избежать такую погрешность анализа.

Таким образом, разработанная нами методика комбинирования высокоскоростной сортировки на проточном цитометре клеток SP костного

мозга мышей с последующим выделением РНК и анализом экспрессии генов методом К-ОТ-ПЦР позволяет изучать изменения экспрессии ключевых clock генов в небольших популяциях стволовых клеток. Более того, как будет показано в следующей главе, данный методологический подход может с успехом применяться для исследований генов редких клеток организмов других видов.

II. Использование разработанного методического подхода для анализа кроветворных стволовых клеток рыб Danio rerio

Аквариумная рыбка Danio rerio является удобной моделью для генетических исследований, в том числе и для изучения гемопоэза, который у данного вида рыб очень похож на гемопоэз млекопитающих как видами клеток, так и ключевыми регуляторными генами (Davidson A. J., 2004). Кроме того, эта рыбка представляет собой удобную модель для хронобиологических экспериментов, и в частности, для исследования ритмов в экспрессии clock генов (Delaimay F., 2000). Однако, до недавнего времени не удавалось выделить кроветворные стволовых клеток этих рыб.

Для изучения стволовых клеток Danio rerio мы решили применить разработанный нами методический подход, который успешно был использован для исследований стволовых клеток мышей. Во-первых, апробирование методики на клетках другого вида могло подтвердить ее универсальность, а во-вторых, описание стволовых клеток рыб давало возможность использовать эту удобную модель для изучение общебиологических свойств стволовых клеток.

При проточно-цитометрическом анализе кроветворных клеток Danio rerio, окрашенных Hoechst, мы обнаружили SP, клетки которой характеризовались низкими показателями прямого и перпендикулярного светорассеивания. Морфологический анализ отсортированных клеток SP показал, что эти клетки отличались маленькими размерами и низким содержанием цитоплазмы (Рис. 6.).

Рис. 6. Окрашивание кроветворных клеток рыб Hoechst позволяет выявить SP (R1) и популяции других видов клеток (R2 - R4). Методом проточной цитометрии можно выделить 4 группы клеток, характеризующихся различной интенсивностью Hoechst флуоресценции (А) и разными свойствами светорассеивания (В и С). Анализ отсортированных клеточных популяций, соответственно, R1 - R4, с помощью световой (D) и конфокальной (Е) микроскопии демонстрирует разную морфологию этих групп клеток.

Hoechst Red

Рис. 7. SP чувствительна к действию ингибиторов транспортера ABCG2 и обогащена неделящимися клетками. Кроветворные клетки рыб окрашивали Hoechst без ингибиторов (А), в присутствие резерпина (В), фумитреморгина С (С) или на следующий день после инъкций 5-флуроурацила (D). SP ограничена овалом, и на каждом графике отмечен процент содержания SP. Приведены данные одного из 32 (А), 9 (В и С) и 4 (D) экспериментов.

Как показано на Рис. 7, содержание SP уменьшалось в присутствие ингибиторов транспортных насосов ABCG2 резерпина или фумитреморгина С. Этот факт указывает на то, что формирование популяции, как и в стволовых клетках костного мозга млекопитающих, связано с активностью белков группы ABC, ответственных за транспорт Hoechst из клеток.

Опыты с введением рыбам миелосупрессора показали, что клетки SP менее чувствительны к воздействию препарата - на следующий день после инъекций препарата относительное содержание SP в окрашенных Hoechst кроветворных клетках увеличивалось (Рис.7). Так как 5-флуоурацил токсичен для делящихся клеток, можно сделать вывод, что большинство клеток SP находились в стадии G0 клеточного цикла, что является характерным признаком стволовых клеток.

Для оценки экспрессии генов клеток SP были выбраны гены, которые являются маркерами кроветворных стволовых клеток Danio rerio - sel, 1то2, c-myb (Hsia N., 2005), аналогами генов, активно экспрессирующихся в неделящихся кроветворных стволовых клеток мышей - tobla, tiel, stat3 (Venezia et al., 2004) и tie2 (Arai et al., 2004) или человека - c-/c«(Oh I. H., 2000).

65 170

Hoechst Red

в 250:

200:

150 :

2 100 :

о>

Ф 50-

<

2

£

хз о N

<0 F 250

о

200 ■

>

iS 150 :

ос

100 ;

50 ■

0

Non-SP

оПийй.

4 ЧУ

SP

à

Рис. 8. Генетический анализ свидетельствует о значительно более высокой экспрессии генов, характерных для кроветворных стволовых клеток, и более низкой экспрессией генов, характерных для лимфоидных клеток, в клетках SP по сравнению с клетками non-SP. В отсортированных популяциях клеток SP и non-SP, ограниченных овалами на гистограмме (А), определили экспрессию генов (В) (по оси ординат - уровень мРНК в процентах по отношению к эндогенному контролю 18S), характерных для стволовых клеток (8 генов в левой части графиков) и лимфоидных клеток (3 гена в правой части графиков). Все величины - средние ± стандартная ошибка средней (± SEM) трех экспериментов с 50 - 100 рыбками каждый.

Кроме того, в анализ были также включены гены rag2, Ickl и ikaros, характерные для лимфоидных клеток рыб (Davidson A. J. et al., 2004), и c-mpl, экспрессирующийся на тромбоцитах (Lin H. F., 2005). Сравнительный молекулярный анализ выявил значительно более высокий уровень экспрессии генов, специчных для стволовых клеток млекопитающих, в клетках SP по сравнению с остальными тестируемыми клетками кроветворной ткани рыб (Рис. 8). Вместе с тем, экспрессия «лимфоидных» генов была очень низкой (Рис. 8), а «тромбоцитарный» c-mpl вообще не эекспрессировался (данные не иллюстрированы).

Обсуждение полученных результатов

Несмотря на то, что рыбы Danio rerio в течение уже нескольких лет используются в качестве удобной модели для генетических исследований кроветворения как в норме, так и при лейкозах, методы для изолирования клеток крови рыб предложены сравнительно недавно. Основываясь на разной способности клеток вызывать светорассевание при анализе методом проточной цитометрии, Traver с соавторами (2003) выделили основные линии в кроветворном мозге почек рыб. Путем трансплантации выделенных популяций летально облученным рыбам было показано, что способностью восстанавливать кроветворение обладает только лимфоидная фракция клеток, характеризующаяся низким светорассеиванием (Traver D., 2003) . Однако кроветворные стволовые клетки обнаружить не удалось. Традиционный подход анализа стволовых клеток с помощью поверхностных маркеров применить у Danio rerio невозможно из-за отсутствия специфических антител к клеткам рыб. Мы предположили, что для выделения стволовых клеток рыб можно использовать разработанный нами методический подход, описанный в предыдущей главе.

Нам удалось выявить SP в окрашенном Hoechst кроветворном мозге рыб, изучить свойства клеток этой популяции и провести анализ экспрессии генов, характерных для стволовых клеток млекопитающих, в отсортированных клетках SP. Следует сразу отметить, что в нашем исследовании не проводились эксперименты, которые бы смогли подтвердить in vivo наличие у клеток SP фунций стволовых клеток, например способность этих клеток восстанавливать кроветворение в организме летально облученных реципиентов. Поэтому мы не можем утверждать, что описанные нами клетки SP действительно представляют собой стволовые клетки. Однако, результаты наших экспериментов подтвердили наличие у клеток SP ряда свойств, характерных для кроветворных стволовых клеток млекопитающих.

В целом, результаты нашего исследования указывают на возможность обогащения кроветворных стволовых клеток рыб, а к также подтвержают

удобство и надежность использования разработанной нами методики комбинирования высокоскоростной сортировки с методом К-ОТ-ПЦР для изучения стволовых клеток разных видов. Применение описанного методического подхода для кроветворных клеток Danio rerio позволит использовать преимущества этой удобной модели для анализа регуляции циркадных ритмов в стволовых клетках на молекулярном уровне.

III. Изучение изменений экспрессии clock генов в кроветворных клетках костного мозга мышей в течение суток

Следующей задачей явилось определение изменений экспрессии ключевых clock генов в течение 24 ч в стволовых клетках и смешаной популяции клеток костного мозга.

Результаты анализа изменений трех основных показателей ритма -температуры тела, концентраций кортикостерона и мелатонина, подтвердили, что организм мышей B6D2F1 был синхронизован с суточными ритмами перед началом каждого из трех экспериментов. Ритмы изменений этих показателей были статистически достоверны по результатам ANOVA и косинор-анализа и характеризовались высокой амплитудой.

Относительные уровни экспрессии ключевых clock генов в популяциях кроветворных клеток костного мозга мышей B6D2F1 были в целом схожи с таковыми у мышей С57В1аск, однако у мышей каждой породы имели свои особенности. Независимо от породы использованных мышей заметно различалась экспрессия mPerl в отсортированных клетках SP по сравнению с клетками смешаной популяции костного мозга. В SP клетках уровень экспрессии mPerl примерно в 2 -2.5 раза превышал уровни других генов в любое время суток. В клетках смешаной популяции костного мозга уровень mPerl менялся от низкого к среднему в зависимости от времени суток и часто был ниже уровней других clock генов. Еще больше отличий было обнаружено в организации системы регуляции ритма в изменениях активности clock генов в течение суток.

03 07 11 15 19 23 03

15 19 23 03

Время (CT)

Рис. 9. Изменение экспрессии mPerl в течение суток в отдельных экспериментах (сверху вниз по рядам, соответственно А, В и С) и среднее всех трех (нижний ряд) в клетках SP (левая колонка) и смешаной популяции костного мозга (правая колонка). Уровень мРНК mPerl (%) выражен относительно средней геометрической уровней трех контрольных генов. На графиках в нижнем ряду приведены средние ± стандартная ошибка средней (± SEM) трех экспериментов и включены данные косинор-анализа - значение уровня значимости р и двойная амплитуда (2А).

Таблица 1. Циркадные изменения относительного уровня мРНК тестируемых генов в кроветворных клетках костного мозга и клетках печени мышей по данным косинор-анализа и дисперсионного анализа (А!ЧО\/А).

Ген Клетки АМСЛ/А (р) Косинор (р) 2А (%) Акрофаза

тРег1 ЭР 0.921 0.602 13 24:00

КМ < 0.001 <0.001 90 12:40 (11:16,14:12)

тРег2 ЭР 0.006 0.025 43 10:40 (08:00, 13:36)

КМ 0.190 0.021 28 13:30 (10:40, 16:44)

Печень < 0.001 <0.001 215 12:50 (11:12, 14:24)

тИвУ-егЬ а БР 0.130 0.206 52 06:20

КМ 0.011 < 0.001 63 09:10(07:36, 10:44)

Печень 0.098 0.024 226 07:30 (04:36, 10:28)

тВтаИ ЗР 0.730 0.522 25 17:10

КМ 0.845 0.605 14 18:50

Печень < 0.001 0.016 269 01:40 (22:56,04:24)

тСгу1 ЭР 0.740 0.560 14 01:20

КМ 0.824 0.350 17 18:10

тС1оск вР 0.740 0.791 11 01:00

КМ 0.769 0.175 25 14:10

т\Л/ее1 БР 0.747 0.441 10 16:40

КМ 0.975 0.720 5 05:40

тРЬр ЭР 0.110 0.257 46 20:00

КМ 0.167 0.119 22 12:20

Примечание. Для анализа использовались относительные уровни мРНК (%) трех экспериментов. КМ - смешаная популяция костного мозга, 2А - двойная амплитуда. Для акрофазы указаны часы : минуты и 95 % доверительный интервал, если по данным косинор-анализа уровень значимости р й 0.05.

Экспрессия тРег1 изменялась ритмично в клетках смешаной популяции костного мозга, но не в клетках 8Р. Активность тРег1 в этих клетках колебалась значительно в течение 24 часов. Однако характер изменений отличался между отдельными сериями в популяциях кроветворных клеток, и статистически достоверного ритма выявить не удалось (Рис. 9). Напротив, в клетках смешаной популяции костного мозга в каждой отдельной серии экспериментов отмечались схожие значительные изменения экспрессии тРег1, характеризующиеся высокой амплитудой (Таблица 1, Рис. 9). Достоверность суточного ритма тРег1 была подтверждена косинор анализом и А>ЮУА

03 07 11 15 19 23 03

03 07 11 15 19 23 03

03 07 11 15 19 23 03

Время (CT)

Рис. 10. Изменение экспрессии тРег2 (верхний ряд), mRev-erb а (средний ряд) и mBmall (нижний ряд) в течение суток в клетках SP (левая колонка), смешаной популяции костного мозга (средняя колонка) и печени (правая колонка). Уровень мРНК тестируемых генов выражен относительно средней геометрической уровней трех контрольных генов. На каждом графике приведены данные косинор- анализа - значение уровня значимости р и двойная амплитуда (2А). Все величины - средние ± стандартная ошибка средней (± SEM) трех экспериментов.

(Таблица 1).

Изменения экспрессии тРег2, тЯем-егЬ а и тВта11 различались между популяциями кроветворных клеток и клетками печени (Рис. 10). Во всех

1 о.

2

03 07 И 15

03 07 11 15

19 23 03

Время (CT)

Рис. 11. Экспрессия mDII1 (верхний ряд) и mHesl (нижний ряд) изменяется ритмично в течение суток в смешаной популяции клеток костного мозга (правая колонка), но не в клетках SP (левая колонка). Уровень мРНК тестируемых генов выражен относительно средней геометрической уровней трех эндогенных контрольных генов. Внизу на каждом графике приведено значение уровня значимости р по данным косинор анализа. Все величины - средние ± стандартная ошибка средней (± SEM) трех экспериментов.

тестируемых клетках был выявлен ритм в изменениях 24-часовой активности тРег2 (Рис. 10, Таблица 1). Пик экспрессии этого гена в клетках SP пришелся на окончание светового периода (10:40), т.е время отдыха у мышей. В клетках смешаной популяции костного мозга и печени экспрессия тРег2 была максимальной в начале периода темноты - периода активности у мышей (соответственно 13:30 и 12:50, Рис.10). Двойная амплитуда изменений активности тРег2 в кроветворных клетках SP (43%) экспрессии этого гена (р = 0.016), характеризующиеся высокой двойной амплитудой (2А = 169%). Пик экспрессии mBmall в клетках печени отмечался в 01:40, перед началом светового периода - периода отдыха у мышей (Рис. 10). Чтобы исключить возможность того, что отсутствие ритма mBmall в кроветворных клетках

связано с ошибочным подбором праймеров и проб для анализа этого гена в К-О-ПЦР, мы провели дополнительный анализ экспрессии mBmall в образцах клеток смешаной популяции костного мозга, используя другие праймеры (Tamaru Т., 2003). Эти эксперименты также не выявили ритма в 24-часовых изменениях активности mBmall в кроветворных клетках (р = 0.172). При этом результаты обоих анализов почти совпали. В обеих популяциях кроветворных клеток также отсутствовали ритмы в изменениях экспрессии mCrylи mClock (Таблица 1).

В дополнение к ключевым clock генам, мы исследовали изменение суточной активности mWeelи mDbp. Ранее были описаны ритмичные изменения экспрессии в клетках ЦНС и печени (Oishi К., 2003), что может свидетельствует о подконтрольности этих генов clock белкам в указанных тканях. Оба гена экспрессировались в клетках SP и смешаной популяции костного мозга, однако ритмы в 24-часовых изменениях их активности отсутствовали (Таблица 1). Не обнаружив ритмов в изменениях экспрессии генов, подконтрольных clock генам в других тканях, мы решили исследовать, не может ли ритмично изменяться активность генов, играющих важную роль в регуляции гемопоэза. Мы выбрали гены mDlll и mHesl сигнальной системы Notch, влияющей на самоподцержание, пролиферацию и выживаемость кроветворных стволовых клеток. По данным трех идентичных экспериментов была выявлена четкая ритмичность в 24-часовых изменениях экспрессии mDlll и mHesl в смешанной популяции клеток костного мозга (соответственно, р = 0.027, р = 0.031), но не в клетках SP (соответственно, р = 0.429, р = 0.194). Выявленное различие позволяет предположить, что экспрессия генов сигнальной системы Notch, участвующей в гемопоэзе, может регулироваться clock генами и зависит от степени зрелости кроветворных клеток.

Обсуждение полученных результатов

В представленной серии экспериментов мы впервые показали, что в кроветворных стволовых клетках (клетках SP) в изменении активности

ключевых clock генов, за исключением тРег2, отсутствуют суточные ритмы. При этом, в смешаной популяции клеток костного мозга, представленной в основном зрелыми клетками и клетками-предшественниками различной степени дифференцировки, наблюдаются ритмы в экспрессии трех генов: mPerl, тРег2 и mRev-erb а. Результаты наших исследований показывают, что изменения активности clock генов в кроветворных клетках костного мозга отличаются по фазе, амплитуде и ритмичности от изменений в клетках печени, поученных от тех же мышей в наших экспериментах, или от клеток других органов и тканей . Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют в пользу гипотезу о существовании ритмов, специфичных для определенных тканей или органов, и более того, специфичных для различных клеточных популяций в пределах одного вида ткани или органа. Так, ранее было показано, что циркадные ритмы отсутствуют в определенных популяциях клеток яичек и тимуса (Morse D., 2003; Alvarez J. D., 2005). Основываясь на этих данных, авторы выдвинули предположение, что экспрессия clock генов регулируется в зависимости от степени дифференцировки клеток, и в недифференцированных, незрелых клетках активность этих генов не проявляется (Morse D. et al., 2003). Эта концепция подтверждается результатами наших исследований об отсутствии ритмов в клетках SP костного мозга мышей. Как было показано во многих работах, SP в значительной степени обогащена стволовыми клетками, обладающими способностью при пересадке полностью восстанавливать кроветворение в организме летально облученных мышей (Goodell М. et al., 1996). Кроме того, большинство клеток SP находятся в стадии G0 клеточного цикла, то есть делятся редко или вообще не делятся (Venezia Т. А., 2004). Оба описанных свойства являются классическими характеристиками наименее дифференцированных, «примитивных» стволовых клеток. Выявленные нами различия в характере изменений clock генов в клетках SP и смешаной популяции клеток костного мозга свидетельствуют о том, что формирование ритмов на молекулярном уровне в кроветворной ткани происходит по-разному в незрелых стволовых клетках и более дифференцированых клетках костного

мозга. Так, пик 24-часовой активности тРег2, изменявшейся ритмично в обеих популяциях клеток, отличался примерно на 8 часов между популяциями (соответственно, 07 СТ в клетках SP и 15 СТ в смешаной популяции клеток костного мозга), а ритмичность mPerl и mRev-erb а, выявленная в клетках смешаной популяции костного мозга, отсутствовала в стволовых клетках (Таблица 1 и Рис.10). Отсносительные уровни экспрессии ключевых clock генов также значительно отличались между исследованными популяциями. В клетках SP костного мозга мышей B6D2F1 наиболее выраженная активность проявлялась у mPerl, экспрессия которого была в 2 — 2.5 раза выше относительно других генов в любое время суток, тогда как в клетках смешаной популяции костного мозга активность mPerl в течение суток сохранялась на уровне или была ниже экспрессии других clock генов. Такая закономерность не зависила от породы мышей - такой же результат относительной экспрессии clock генов был получен ранее на мышах линии С57 Black (Tsinkalovsky О. et al., 2005). Интересно отметить, что в клетках яичек относительный уровень экспрессии mPerl, в суточных изменениях которого отсутствовал ритм, был выше, чем максимальные уровни экспресии этого гена в клетках почек и мышц, в которых изменения активности этого гена в течение 24 часов происходили ритмично.

Ответ на вопрос, почему в клетках SP при отсутствии ритма в остальных clock генах ритмично изменялся тРег2, можно найти в работе Kornmann с соавторами (Kornmann В., 2007). Эти исследователи создали методом генной инженерии специальную линию мышей, в печени которых можно было принудительно изменять активность внутренних часов. Авторы показали, что при управляемом угнетении работы часов экспрессия некоторых генов, в том числе тРег2, продолжает изменяться ритмично. Был сделан вывод, что ритм тРег2 вероятно конролируется центральными, а не локальными факторами. Возможно такой же тип регуляции активности тРег2 присутствует в стволовых кроветворных клетках.

Логично предоложить, что регуляция ритмов в популяциях стволовых клеток, которые способны пролиферировать и дифференцироваться с разной частотой и скоростью в несколько линий зрелых клеток, выполняющих различные функции, должна быть более сложной, чем в клетках-предшественних, дифференцируемых по определенной линии, или в зрелых клетках. Такое предположение подкрепляется данными о различиях в геномах популяций стволовых и более дифференцированных клеток (Phillips R. L., 2000). Более того, активность транскрипционных факторов, специфичных для определенных линий дифференцировки клеток костного мозга, регулируется по-разному в зависимости от степени зрелости клеток (Akashi К., 2003).

При анализе изменений активности mPerl и тРег2 в смешаной популяции клеток костного мозга мы выявили по одному пику экспрессии обоих генов. Сходные результаты в кроветворных клетках мышей B6D2F1 получены также в другой лаборатории (Granda Т. G., 2004). Однако, наши данные расходятся с данными Chen с соавторами (Chen Y.-G. et al., 2000), которые описали 2 синхронных пика в 24-часовых изменениях активности mPerl и тРег2 в клетках костного мозга мышей Balb/C. Расхождение в результатах может объясняться разницей в условиях проведения экспериментов, в методике нормализации значений экспрессии clock генов и в методе оценки ритмов. В исследовании Chen и соавторов использовались более молодые мыши другой породы, которые не содержались сутки в темноте до начала экспериментов. В нашей работе мыши в течение 24 часов до начала опытов находились в полной темноте для исключения внешних стимулирующих влияний на эндогенные ритмы организма. Выраженные ритмы изменений температуры тела мышей и содержания кортизола и мелатонина плазмы крови свидетельствуют, что организм мышей к началу экспериментов был синхронизован с циркадными ритмами. При нормализации значений экспрессии тестируемых генов мы использовали среднее геометрическое значение экспрессии трех контрольных генов, что является наиболее надежным способом выражения активности генов (Vandesompele J. et al., 2002). Chen с

соавторами для нормализации использовали только один контрольный ген 18S, экспрессия которого, как было показано ранее, может меняться в клетках костного мозга человека. Кроме того, в работе Chen с соавторми при анализе данных оценивалась достоверность различий между уровнем экспрессии генов в определенные периоды времени, однако не был проведен косинор-анализ данных, что является оптимальным стандартом для оценки ритмов.

Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что молекулярный механизм формирования ритмов в клетках костного мозга отличается от такового в клетках печени. Отметим, что данные наших экспериментов о ритмических изменениях активности clock генов в клетках печени совпадали с данными, полученными в других работах, в том числе проведенных на мышах B6D2F1 (Filipski Е. et al., 2004). Амплитуда ритмичных изменений активности mPerl и mRev-erba в клетках костного мозга (и тРег2 в клетках SP) была в несколько раз ниже, чем в клетках печени. Колебания экспрессии mCryl в течение суток в кроветворных клетках были выражены незначительно, в то время как в клетках печени 24-часовые изменения этого гена были ритмичны. Более того, ни в стволовых клетках, ни в популяции более дифференцированных и зрелых клеток костного мозга не удалось выявить ритмы в изменениях активности mBmall, который является важным элементом в формировании и регуляции молекулярных часов.

Такой результат был неожиданным, поскольку согласно данным нескольких работ экспресиия mBmall изменяется ритмично, в противофазе к изменениям mPerl и тРег2 в клетках нескольких периферических тканей и органов млекопитающих, например, слизистой полости рта и печени (Bjarnason G. А., 2001). В наших экспериментах суточные изменения активности этого гены также были ритмичны в клетках печени. Выявленное нами отсутствие ритма в образцах клеток костного мозга не могло быть связано с ошибочным подбором праймеров и проб для анализа этого гена методом К-ОТ-ПЦР, так как мы получили идентичные результаты при использовании двух разных наборов праймеров (Tamaru T. et al., 2003). Транскрипция Bmall регулируется белками

REV-ERBa и RORa, конкурирующим между собой за связывание с промоутером этого гена (Guillaumond F., 2005). При этом REV-ERBa подавляет синтез BMAL1, а RORa - стимулирует. Так как было показано, что экспрессия RORa выражена в разных тканях по-разному, регуляция транскрипции Bmall может также зависеть от типа ткани.

По-видимому, в некоторых клетках, например в мононуклеарах периферической крови человека, ритм mBmall недостаточно стабилен (Teboul М., 2005). Необычный ритм mBmall с пиком экспрессии на 2 часа позже пика тРег2 был выявлен в клетках костного мозга мышей B6D2F1, которые не помещались в полную темноту за 24 часа до начала экспериментов (Granda Т. G. et al., 2004). Сравнивая приведенные данные и результаты нашего исследования, можно предположить, что ограничение стимулирующих световых воздействий на организм мышей в течение суток до начала опытов приводит к отмене ритма mBmall в клетках костного мозга, не влияя при этом на ритм изменений активности этого гена в клетках печени.

Полученные нами данные позволяют предположить, что тканевые особенности регуляции активности характерны не только для самих clock генов, но и для генов, ими контролируемых. Так, активность mWeel и mDbp, регулируемых clock генами в печени, изменялась в кроветворных клетках неритмично. Вместе с тем, в общей популяции клеток костного мозга нам удалось выявить ритмы в изменение экспресии mDlll и mHesl, которые относятся к системе Notch, играющей значительную роль в регуляции гемопоэза. Мы не можем утверждать, что указанные гены подконтрольны clock генам в кроветворных ткани, однако, подобное предположение выглядит логичным. Интересно, что в стволовых клетках SP ритмы в изменении активности mDlll и mHesl обнаружены не были. Можно предположить, что формирование ритмов в суточной экспрессии этих генов, как и clock генов, зависит от зрелости клеток.

Таким образом, нам удалось показать, что система формирования внутриклеточных ритмов в костном мозге отличается от других тканей и

органов. По-видимому, особенности молекулярной регуляции ритмов в каждой ткани связаны со спецификой выполняемых ею функций и степенью необходимости контроля этих функций во времени. Кроме того, полученные нами результаты свидетельствуют, что экспрессия большинства ключевых clock генов в стволовых клетках не зависит от эндогенных циркадных ритмов, т.е. формирование суточных ритмов в изменении суточной активности этих генов в кроветворных клетках костного мозга зависит от степени дифференцировки клеток.

IV. Изучение экспрессии clock генов в стволовых клетках и

клетках-предшественниках костного мозга человека

Для изучение ритмов ключевых clock генов в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека эти клетки изолировали с помощью магнитных микрочастиц. Анализ методом проточной цитометрии показал, что чистота популяции выделенных СБ34+-клеток составляла в среднем 82.3 % (70.3% - 95.6 %). Эти клетки отличались низким боковым светорассеиванием и невысокой экспрессией маркера кроветворных клеток CD45+, что соответствовало характеристикам CD34+ стволовых клеток и клеток-предшественников, описанных ранее (Handgretinger R., 1998).

В 24-часовых изменениях уровней содержания гормонов крови и количества лейкоцитов периферической крови методами косинор-анализа и дисперсионного анализа (ANOVA) были выявлены достоверные ритмы кортизола и тестостерона отмечался утром, а гормона роста ближе к полуночи, что совпадает с ранее опубликованными данными других исследований (Krieger et al., 1971). Общее количество лейкоцитов, как и отдельно нейтрофилов и лимфоцитов, также изменялось, как описано ранее (Smaaland et al., 1995), с пиком перед началом периода отдыха. Таким образом, организм каждого их доноров на момент начала экспериментов был синхронизован со стандартными суточными ритмами.

80-

60-

о^

ы 40-

X

CL

2

л 20 -

I

ф

т 00-

о

Q.

80 -

2

X

-0 60-

ц

CD

S 40 -

О

О

X н 20-

о

0-

<г

CD34+ Cells

24h Mean+SE

180 160140 120 100 80 60 40 20 0

Whole BM Cells

X

C^c/

Рис. 12. Сравнение уровней относительной мРНК ключевых clock генов в С034+-клетках (левый график) и смешаной популяции клеток костного мозга (правый график) здоровых доноров. Название генов приведено под осью абсцисс. Уровень мРНК выражен относительно средней геометрической уровней четырех контрольных генов. Все величины -средние ± стандартная ошибка средней (± SEM) данных трех экспериментов.

В образцах клеток, полученных от трех доноров мы сравнили относительные уровни экспрессии ключевых clock генов в популяции изолированных CD34 -клеток и в смешаной популяции клеток костного мозга (Рис. 12). Относительные уровни мРНК clock генов в обеих клеточных популяциях были схожи, за исключение hBmall. Относительная активность hPerl, hPer2,hCryl, hCry2, hRev-erb а и hClock находились примерно на одном уровне, а экспрессия hPerl была в несколько раз ниже (Рис. 12). Интересно, что экспрессии hBmall в CD34'-клетках соответствовала по уровню hPerl, тогда как в клетках смешаной популяции костного мозга она более, чем в 2 раза превышала относительную экспрессиию остальных генов (Рис. 12).

При изучении 24-часовых измененний активности ключевых clock генов в С034+-клетках достоверные ритмы были выявлены для экспрессии 3 из 7 генов: hPerl, hPer2 и hCry2 (Таблица 2). При этом характер ритмов суточной активности этих генов был схожим, с максимальной экспрессией в течение первой половины дня (Рис.13). Пики экспрессии генов следовали друг за

Таблица 2. Циркадные изменения относительного уровня мРНК тестируемых генов в С034+-кпетках костного мозга здоровых доноров по данным косинор-анализа и дисперсионного анализа (А1\Ю\/А).

Показатель ANOVA (p) Косинор 2A Акрофаза

(P) (%) (время)

hPerl < 0.001 < 0.001 66 08:39 (06:52, 10:24)

hPer2 0.015 0.027 22 10:52(07:32, 13:52)

hCryl 0.080 0.050 14 11:46 (08:00, 15:00)

hCry2 0.422 0.331 12 10:18

hRev-erb a 0.544 < 0.001 10 06:22

hBmall 0.742 0.338 17 21:52

hClock 0.173 0.890 5 14:11

Примечание. Для статистического анализа использовались относительные уровни мРНК генов (%). 2А - двойная амплитуда. Для акрофазы указаны часы : минуты и 95 % доверительный интервал, если по данным косинор-анализа уровень значимости р S 0.05.

другом: hPerl в 08:39, hPer2 в 10:52, и hCry2 в 11:46 (Таблица 2). Двойная амплитуда 24-часовых изменений активности была наиболее высокой для hPerl (66%) по сравнению с hPer2 (22%) и ИСгу2 (14%). Интересно, что в образцах от трех доноров был выявлен суточный ритм hPerl (ANOVA р = 0.004, косинор-анализ р = 0.03, Рис. 13). При этом пики экспрессии hPerl в обеих клеточных популяциях практически совпадали: 08:39 в смешаной популяции клеток костного мозга и в 08:53 в СБ34+-клетках (Таблица 2, Рис.13), и значения двойной амплитуды изменений бали также близки (соответственно, 81% и 66%). Мы не можем делать каких-либо заключений о характере изменений остальных clock генов в клетках смешаной популяции костного мозга (ритмы для них выявлены не были) из-за недостаточного количества образцов - только у трех доноров были взяты образцы смешаной популяции костного мозга.

Анализируя суточные изменения активности hCryl, hBmall, hRev-erba и hClock (Таблица 2), можно отметить, что колебания экспрессии hCryl и hRev-erb а достигали более высоких значенинй утром, a hBmall - вечером. Однако, для этих clock генов достоверных ритмов выявить не удалось ни методом косинор-анализа, ни методом дисперсионного анализа, ANOVA (Таблица 2).

Время (CT)

Рис. 13. Суточные изменение экспрессии ключевых clock генов в кроветворных клетках костного мозга доноров. По оси у - уровень мРНК тестируемых генов относительно средней геометрической уровней четырех контрольных генов. В верхнем ряду приведены последовательно графики hPerl, hPer2 и hCry2, изменявшихся ритмично, а в нижнем ряду - hCryl, hRev-erb а и hBmall, в изменении которых ритмов не было выявлено. На первом графике показано изменение hPerl в клетках смешаной популяции костного мозга (п = 3), на остальных - в CD34+-клетках (п = 10). На каждом графике приведены данные косинор- анализа - значение уровня значимости р и двойная амплитуда (2А). Все величины - соелние ± станлаотная ошибка соедней (± SEM) TDex экспеоиментов.

Обсуждение полученных результатов

В данной серии экспериментов нам удалось впервые оценить активность ключевых clock генов в кроветворных клетках костного мозга и изучить суточные изменения активности этих генов в изолированных СГ)34+-клетках, обогащенных стволовыми клетками и клетками-предшественниками. Мы показали, что 24-часовая активность трех генов - hPerl, hPer2, и hCry2 в этих клетках изменяется ритмично. Ритм был также обнаружен и для измененй

hPerl в смешаной популяции клеток костного мозга. Изменения hPerl характеризовались наиболее высокой по сравнению с другими clock генами амплитудой, а пик экспрессии этого гена отмечался утром, примерно в то же время, что и пик содержания кортизола плазмы крови. Вместе с тем, как нами было показано ранее, суточные изменения mPerl в стволовых клетках SP мышей выражены слабо и ритм отсутствует (Tsinkalovsky et al., 2006). Различаются также относительные уровни экспрессии Perl в исследованных популяциях кроветворных клеток костного мозга мышей и человека. В кроветворных клетках человека уровень относительной экспрессии hPerl был самым низким из тестируемых генов и в С034+-клетках, и в смешаной популяции клеток костного. В костном мозге мышей в стволовых клетках SP относительный уровень экспрессии mPerl по крайней мере в 2 раза превышал уровни остальных clock генов, а в смешаной популяции кроветворных клеток находился на уровне других тестированных генов. Связаны ли подобные различия с особенностями кроветворных клеток различных видов или с разницей в исследованных клеточных популяциях (стволовые клетки SP мышей по сравнению с С034+-клетками человека) неясно. Популяция СВ34+-клеток включает не только примитивные стволовые клетки, но и клетки-предшественники. Однако, выбор этой популяции для наших исследований был обусловлен тем, что изолируемые с помощью микромагнитных частиц CD34+-клетки используются в клинике для трансплантации (Handgretingeret al., 1998). Дальнейшее обогащение стволовых клеток (например, изолирование CD34+" СБ38"-клеток, не экспрессирующих маркеры дифференцированных клеток)

привело бы к значительному снижению количества выделяемых клеток. Так как забор костного мозга является болезненной процедурой и может сопровождаться кровотечением, мы решили сократить до минимума как количество заборов, так и объем костного мозга, получаемый при каждом заборе.

Мы показали, что 24-часовые изменение активности hBmall в CD34+-клетках происходят неритмично, хотя экспрессия этого гена повышалась в вечерние часы и ночью и была низкой утром и в течение дня. Ранее было показано, что экспрессия hBmall изменяется ритмично в течение суток в клетках слизистой ротовой полости и кожи человека, и пик экспрессии в обеих тканях приходится на вечерние часы (Bjarnason et al., 2001). Также для различных тканях разных видов описаны противофазные изменения генов Bmall and Per (Oishi et al., 1998a). Однако, данные об изменении hBmall в кроветворных клетках человека совпадают с результатами наших экспериментов на клетках костного мозга мышей, в которых суточные ритмы Bmall отсутствовали. Полученные данные свидетельствуют об особой регуляции суточных ритмов в кроветворной ткане, отличной от других тканей и органов, что может быть связано со спецификой выполняемой ею функции -гемопоэза.

В представленной работе мы не только впервые описали суточные ритмы в различных популяциях клеток костного мозга, но и показали, что формирование и регуляция ритмов в кроветворной ткани имеет свои характерные особенности. Дальнейшие исследования взаимосвязи системы контроля суточных ритмов в костном мозге и процесса гемопоэза могут дать возможность регулировать через эту систему пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток и клеток-предшественников при их использовании с терапевтической целью и в регенеративной медицине.

выводы

1. Методический подход, сочетающий использование высокоскоростной проточно-цитометрической сортировки и методов молекулярной биологии, позволяет изучать внутриклеточные суточные ритмы в редких популяциях кроветворных стволовых клеток. Этот подход также успешно использован для изучения кроветворных стволовых клеток рыб Danio rerio.

2. Впервые определена экспрессия ключевых clock генов и изучены изменения активности этих генов в течение суток в стволовых клетках в сравнение с общей популяцией клеток костного мозга. В этих популяциях выявлены различия в относительных уровнях экспрессии генов, наиболее выраженные для mPerl и mCryl.

3. Показано, что в отличие от клеток общей популяции костного мозга мышей в стволовых кроветворных клетках отсутствуют суточные ритмы в колебаниях активности большинства clock генов (кроме тРег2). Выявленные различия позволяют предположить, что регуляция ритмов в кроветворной ткани зависит от степени зрелости клеток.

4. Впервые определена активность ключевых clock генов в общей популяции клеток костного мозга человека и в изолированной популяции стволовых клеток и клеток-предшественников.

5. В кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека впервые выявлены достоверные суточные ритмы в изменении активности hPerl, hPer2 и hCry2.

6. Отсутствие циркадных ритмов в изменениях экспрессии Bmall в течение суток в разных популяциях кроветворных клеток мышей и человека, позволяет считать, что изменение активности этого гена в кроветворной ткани в отличие от других периферических тканей и органов происходит неритмично.

7. Формирование и регуляция ритмов в кроветворной ткани млекопитающих имеют характерные отличия от других периферических тканей и органов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Tsinkalovsky О., RosenlundВ., Laerum O.D., Eiken H.G. Clock gene expression in purified mouse hematopoietic stem cells.// Exp Hematol. -2005,- 33 (1). - P. 100-107.

2. Tsinkalovsky O., Filipski E„ Rosenlund В., Sothern R.B., Eiken H.G., Wu M.W., Claustrat В., Bayer J., Levi F., Laerum O.D. Orcadian expression of clock genes in purified hematopoietic stem cells is developmentally regulated in mouse bone marrow.// Exp Hematol. -2006,- 34 (9). - P. 1249-1261.

3. Costea D.E., Tsinkalovsky O., Vintermyr O.K., Johannessen A.C., Mackenzie I.C. Cancer stem cells - new and potentially important targets for the therapy of oral squamous cell carcinoma.// Oral Dis. -2006,-12 (5). - P. 443-454.

4. Tsinkalovsky O., Vik-Mo Л.О., Ferreira S., Laerum O.D., Fjose A. Fishing for stem cells: isolation of hematopoietic stem cells in zebrafish.// Stem Cells: Abstracts - Cancun, 2006. -P. 38.

5. Tsinkalovsky O., Vik-Mo A.O., Ferreira S„ Laerum O.D., Fjose A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties.// Differentiation. -2007,- 75 (3). - P. 175-183.

6. Tsinkalovsky 0., Smaaland R„ Rosenlund В., Sothern R.B., Hirt A., Steine S., Badiee A., AbrahamsenJ.F., Eiken H.G., Laerum O.D. Circadian variations in clock gene expression of human bone marrow CD34+ cells.// J Biol Rhythms. -2007,- 22 (2). - P. 140-150.

7. Цынкаловский O.P., Розенлюнд Б., Эйкен Х.Г., Лярум О.Д. Разработка методики оценки экспрессии циркадных генов, контролирующих суточные ритмы кроветворения, в стволовых клетках костного мозга.// Аллергология и иммунология. -2008,- 9(1). -С. 4.

8. Цынкаловский О.Р., Розенлюнд Б., Сотерн Р.Б., Смоланд Р., Хирт А., Лярум О.Д. Оценка изменений экспрессии генов, контролирующих суточные ритмы гемопоэза, в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека// Российский иммунологический журнал. -2008,- 2(11) (2-3). - С. 116.

9. Цынкаловский О.Р., Розенлюнд Б., Сотерн Р.Б., Смоланд Р., Хирт А., Лярум О.Д. Суточные ритмы в изменении экспрессии hBmall в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека отсуствуют // Аллергология и иммунология. -2008,- 9 (3). - С. 258.

10.Laerum O.D., Tsinkalovsky О., Huang T.-S. Cellular clocks and light effects on man.// Solar radiation and human health /Ed. E. Bjertness.- Oslo: The Norwegian Academy of Science and Letters, 2008. - P. 47-56.

11. Цынкаловский О.Р., Розенлюпд Б., Сотерн Р.Б., Лярум ОД. Изменение экспрессии mBmall, контролирующего циркадные ритмы, в кроветворных клетках костного мозга мышей происходит неритмично.// Аллергология и иммунология. -2008.- 9 (3). -С. 259.

12.Цынкаловский О.Р., Розенлюнд Б., Сотерн Р.Б., Лярум ОД. Суточная экспрессия mDlll и mHesl сигнальной системы Notch, участвующей в регуляции гемопоэза, зависит от степени зрелости кроветворных клеток.// Российский иммунологический журнал. -2008,-2(11)(2-3). -С. 117.

13. Цынкаловский О.Р., Розенлюнд Б., Сотерн Р.Б., Лярум ОД. Экспрессия генов, контролирующих суточные ритмы гемопоэза в костном мозге, зависит от степени зрелости кроветворных клеток.// Аллергология и иммунология. -2008.- 9 (1). - С. 175.

14. Цынкаловский О.Р., Вик-Мо А., Ферейра С., Лярум О.Д., Фьюсо А. Использование проточной цитометрии для определения кроветворных стволовых клеток рыб Danio rerio.// Российский иммунологический журнал. -2008.- 2 (11) (2-3). - С. 118.

15.Цынкаловский О.Р., Зайденов В.А., Пахотных А.С., Андрианов В.А. Использование "side population" для выделения стволовых клеток в нормальных и опухолевых тканях.// Медицинская иммунология. -2008,-10 (4-5). - С. 319-326.

16. Цынкаловский О.Р., Лярум О.Д., Зайденов В.А. Молекулярно-генетические основы формирования суточных ритмов клеток.// Аллергология и иммунология. -2008.- 9 (4). - С. 428-430.

17. Tsinkalovsky О., Vik-Mo А.О., Ferreira S., Laerum O.D., Fjose A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties.// Yakhteh (The Cell). -2008,- 10 (Suppl. 1). - P. 93.

Монография

18. Tsinkalovsky O.R. Time-dependent clock gene expression in mouse and human stem cells and progenitor cells. - Bergen: University of Bergen, 2007. - 82 p.

Список сокращений

• ABCG2 - ATP-binding cassette transporter G2 (белок-переносчик G2, использующий для транспортировки веществ энергию АТФ);

• К-ОТ-ПЦР - количественная обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени;

• СХЯ - супрахиазматические ядра гтпораламуса

• Hoechst - Hoechst 33342;

• SP - side population (популяция клеток, характеризующаяся низкой интенсивностью флуоресценции после окрашивания Hoechst 33342).

Подписано в печать 18.11.2008 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: (495) 785-00-38 www.autoref.webstolica.ru

Актуальность проблемыЦиркадные (суточные, с периодом около 24 часов) ритмы сформировались в процессе эволюции для синхронизации большинства важнейших функций организма при адаптации к воздействию факторов внешней среды [Губин Г. Д., Герловин Е. LLL, 1980]. Система формирования ритмов у млекопитающих представляется в иерархическом виде: формирование ритмов происходит в нейронах супрахиазматических ядер вентрального гипоталамуса - центральном пейсмейкере, который координируют ритмы в периферических тканях [Reppert S. М., Weaver D. R., 2001]. Однако все больше новых данных свидетельствует в пользу того, что регуляция ритмов специфична для каждой ткани, и во многом определяется особым набором функций, которые ткань выполняет [Cuninkova L., Brown S. А., 2008]. Исследования последних лет показали, что клетки периферических тканей и органов способны генерировать собственные самоподдерживающие ритмы и изменять их соответственно локальным потребностям [Stratmann М., Schibler U., 2006, Моисеева Н. И., 1978].

Молекулярной основой формирования клеточных ритмов являются так называемые «clock» гены, активность которых регулируется по принципу обратной связи самими генами и их продуктами [Toh К. L., 2008]. Clock гены выявлены не только в нейронах супрахиазматических ядер, но и в клетках большинства периферических тканей и органов. Белки, кодируемые этими генами, являются транскрипционными факторами, экспрессия которых координируется в соответствие с клеточными циркадными ритмами. При изменеиии активности транскрипционных факторов может ритмично меняться и экспрессия подконтрольных им генов (clock-controlled genes) и, соответственно, клеточные процессы, этими генами опосредуемые. Масштабный сравнительный анализ суточной экспрессии более 12000 геновв клетках печени и сердца показал, что активность около 10 % исследуемых генов меняется ритмично [Storch К., et al., 2002]. За счет влияние на активность подконтрольных генов clock гены непосредственно участвуют в регуляции многих процессов в клетках. Координация clock генами основных циркадных ритмов организма с локальиыми потребностями периферических тканей позволяет клеткам этих тканей и органов оптимально адаптироваться к местным изменениям окружающей среды [Катинас Г. С., Моисеева Н. И., 1980]. Таким образом, clock гены выполняют важную роль в поддержании клеточного и тканевого гомеостаза [Stokkan К.-А.; et al., 2001].

В кроветворной ткани костного мозга циркадные изменения экспрессии clock генов детально не исследовались. Гемопоэз представлет собой высокодинамичный процесс образования и дифференцировки клеток крови, которые после созревания выполняют разные функции, в том числе иммунную [Петров Р. В., 1987, Сепиашвили Р. И., Балмасова И. П., 2005, Хаитов Р. М., 2006]. Количество клеток каждого типа и скорость их образования при гемопоэзе контролируется индивидуально, в соответствии с меняющимися потребностями, и должны четко координироваться и регулироваться во времени. Изучение молекулярных механизмов формирования ритмов в клетках кроветворной ткани необходимо для понимания регуляции гемопоэза и может дать возможность управлять этим процессом, а потому представляется актуальным.

Из клеток костного мозга, наибольший интерес представляют кроветворные стволовые клетки, которые в течение многих лет являются объектом интенсивных исследований [Петров Р. В. и др., 1972]. Эти клетки, характеризующиеся способностями к самоподдержанию и к дифференцировке [Weissman I. L., et al., 2001], являются наиболее перспективными клетками для использования в терапевтических целях при лечение онкологических заболеваний, дистрофических состояний, и врегенеративной медицине [Cerletti М., et al., 2008]. Циркадные ритмы в стволовых клетках до сих пор не изучались.

Отсутствие работ в данной области связано прежде всего с методическими сложностями изучения этих клеток. Стволовые клетки составляют очень небольшой процент (<0.1 - 0.01 %) клеток костного мозга [Wcissman I. L., 2000], и выделить за короткий период времени достаточное количество клеток без потери качества РНК для детального молекулярного анализа весьма сложно. Поэтому разработка методики, позволяющей изучать изменения clock генов в высокоочищенных популяциях кроветворных стволовых клеток, является одной из актуальных задач.

Цель работы - изучить активность генов, контролирующих суточные ритмы кроветворения, в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга мышей и человека; сравнить особенности формирования ритмов в кроветворных клетках разной степени дифференцировки.

Основные задачи работы1. Разработать методический подход для исследования экспрессии генов в редких популяциях стволовых клеток лабораторных моделей и человека.

2. Определить экспрессию ключевых генов, контролирующих суточные ритмы (clock генов), в кроветворных стволовых клетках мышей. Сравнить относительные уровни экспрессии clock генов в популяции этих клеток и в общей популяции клеток костного мозга.

3. Изучить изменение активности clock генов в течение суток в общей популяции клеток костного мозга мышей и очищенной популяции стволовых клеток.

4. Провести сравнительный анализ особенностей формирования суточных ритмов в популяциях кроветворных клеток разной степени дифференцировки.

5. Оценить экспрессию ключевых clock генов в изолированной популяции стволовых клеток и клеток-предшественников и в общей популяции клеток костного мозга человека.

6. Изучить изменение активности clock генов в течение суток в изолированных кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека.

Научная новизнаВпервые выявлена активность ключевых clock генов mPerl, тРег2, mCryl, mBmall, mClock и mRev-erb а в кроветворных стволовых клетках костного мозга. Установлено, что изменения активности большинства clock генов в стволовых клетках не координируется циркадными ритмами. Полученные данные расширяют представления о биологии стволовых клеток.

Представлено экспериментальное подтверждение гипотезы о том, что формирование ритмов происходит в процессе дифферепцировки клеток. Выявленные достоверные различия в суточных изменениях активности clock генов в популяциях кроветворных клеток разной степени дифференцировки указывают на то, что регуляция ритмов в костном мозге зависит от степени зрелости клеток.

Показано, что регуляция ритмов в кроветворной ткани характеризуется особенностями, отличными от других тканей и органов. Установлено, что в кроветворных клетках отсутствует циркадные ритмы в изменениях активности Bmall, одного из ключевых регуляторов циркадных ритмов в периферических тканях. Полученные данные свидетельствуют об особом механизме формирования ритмов гемопоза и обосновывают необходимость его дальнейшего изучения.

Впервые определена экспрессия ключевых clock генов в кроветворных клетках костного мозга человека и изучены изменения активности этих геновв изолированных стволовых клетках и клетках-предшественниках человека. Выявлены ритмы в изменении суточной экспрессии трех ключевых clock генов: hPerl, hPer2 и hCry2. Полученные новые знания о системе формирования циркадных ритмов гемопоэза у человека создают предпосылки для дальнейшего развития и оптимизации методов использования стволовых клеток и клеток-предшественников с терапевтической целью.

Теоретическая и практическая значимостьРазработан новый методологический подход для изучения формирования суточных ритмов в редких популяциях кроветворных стволовых клеток, сочетающий использование высокоскоростной проточной цитометрической сортировки и метод количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени. Показано, что высокоскоростная сортировка клеток не вызывает деградации РНК и не влияет на экспресиию генов. Использование данного подхода позволило впервые изучить организацию системы контроля суточных ритмов в кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга у мышей и человека. Обосновано применение разработанной методики для исследования стволовых клеток других видов.

Методика внедрена в лаборатории клинической иммунологии АНО «Институт иммунофизиологии» (г. Москва) и используется для исследования стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга.

Полученные в работе данные дают представление о молекулярных основах формирования ритмов в кроветворной ткани млекопитающих. Показаны особенности регуляции ритмов в изолированных популяциях стволовых клеток костного мозга. Установлено, что формирование циркадных ритмов в кроветворной ткани зависит от степенидиффференцировки клеток. Обосновано, что регуляция суточных ритмов в кроветворной ткани отличается от других периферических тканей и органов. Новые данные о формировании ритмов кроветворения у человека вносят теоретический вклад в эту малоизученную область хронобиологии.

Результаты работы используются в лекционных курсах программы первичной специализации и сертификации кадров по специальности клинико-лабораторная диагностика на кафедре аллергологии и иммунологии ФПК MP ГОУ ВПО «Российский Университет Дружбы Народов».

Положения, выносимые на защиту1. Высокоскоростная проточно-цитометрическая сортировка в сочетании с количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени является оптимальным методом для изучения внутриклеточных циркадных ритмов в редких популяциях кроветворных стволовых клеток. Сортировка не вызывает деградацию выделяемой РНК и не влияет на экспрессию генов. Предложенная методика может эффективно применяться для изучения стволовых клеток других видов.

2. В стволовых клетках костного мозга мышей экспрессируются все ключевые clock гены. Относительные уровни экспрессии этих генов в стволовых клетках отличаются от клеток общей популяции костного мозга, состоящей из более дифференцированных и зрелых клеток. Наиболее существенные различия установлены для mPerl и mCryl.

3. Формирования и регуляции ритмов в кроветворной ткани зависит от степени дифференцировки и зрелости клеток. В кроветворных стволовых клетках мышей не сформированы ритмы в изменении активности большинства clock генов (кроме mPerl).

4. У человека в кроветворных стволовых клетках и в клетках-предшественниках костного мозга суточные изменения активности hPerl, hPer2 и hCry2 подчиняются циркадным ритмам. Система формированияритмов в кроветворной ткани мышей и человека характеризуется видовыми особенностями.

5. Изменения суточной активности Bmall, играющего важную роль в регуляции циркадных ритмов во многих периферических тканях, происходят неритмично в кроветворных клетках разной степени дифференцировки, т.е. на всех этапах гемопоза. Формирование ритмов процесса кроветворения происходит без участия Bmall.

6. Система формирования суточных ритмов в кроветворной ткани млекопитающих, в частности в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга, отличается от других периферических тканей и органов.

Апробация работыРезультаты исследований по диссертационной работе представлены на российских и международных конференциях и конгрессах: Международном конгрессе по иммунофизиологии (Дагомыс, 2003); International meeting on advanced flow cytometry (Paris, 2003); Danish meeting on flow cytometry (Copenhagen, 2004); Norwegian Stem Cell Network meeting (Rosendal, 2005); Norwegian Stem Cell Network meeting (Oslo, 2006), International Congress on Stem Cells (Cancun, 2006), Объединенном иммунологическом форуме - 2008 (Санкт-Петербург, 2008); Международной конференции по физиологии и патологии иммунной системы (Москва, 2008); Royan International Twin Congress on Regenerative Biomedicine and Stem Cell Biology and Technology (Tehran, 2008).

ПубликацииПо материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ (из них 9 - в международной печати), включающих 1 монографию, 1 главу книги, 7журнальных статей и 9 материалов российских и международных конференций.

ФОРМИРОВАНИЕ ЦИРКАДНЫХ РИТМОВ (обзор литературы)Время является фундаментальной составляющей биологических процессов. В процессе эволюции у клеток и многоклеточных организмов развивались механизмы адаптации к циклическим изменениям окружающей среды [Агаджанян Н. А., 1967, Виру А. Л., 1980, Гаркави Д. X. и др., 1990, Павлов И. П., 1951]. Формирование системы, способной регулировать во времени, синхронизировать с действием факторов внешней среды (света, температуры и др.) различные функции организма, создало значительные преимущества при естественном отборе [Казначеев В. П., 1980, Катинас Г. С., Моисеева Н. И., 1980, Комаров Ф. И., Моисеева Н. И., 1983, Моисеева Н. И., 1978, Моисеева Н. И., Сысуев В. М., 1981].

До недавнего времени изучение ритмичных процессов, происходящих на разных уровнях организации живого, в основном сводилось к их описанию [Агаджанян Н. А., 1967, Голиков А. П., Голиков П. П., 1973, Емельянов И. П., 1976]. Однако, значительный прогресс в развитии науки в последние десятилетия позволил получить представление об устройстве внутренних часов, определить их функции и выявить механизмы, регулирующие биологические ритмы [Koukkari W. L., Sothern R. В., 2006, Алпатов А. М., 2000, Губин Г. Д., Герловин Е. Ш., 1980, Деряпа Н. Р. и др., 1985, Дубинины. П., 1976].

Были обнаружены ключевые гены, ответственные за циркадные внутриклеточные ритмы - clock гены, и предложена простая модель, описывающая, как эти гены и кодируемые ими белки формируют и поддерживают внутриклеточные циркадные ритмы [Albrecht U., Eichele G., 2003, Balsalobre A., 2002, Reppert S. M., Weaver D. R., 2001, Reppert S. M., Weaver D. R., 2002]. Результаты исследований последних лет свидельствуют, что система формирования циркадных ритмов организована значительно более сложно, чем считалось ранее [Takahashi J. S., 2004, Виноградова И. А.,2005]. Несколько новых генов рассматриваются в качестве кандидатов clock генов. Показано, что контроль внутриклеточных ритмов может осуществляться на посттрансляционном уровне путем модификации clock белков, что стало объектом интенсивного изучения в последние годы [Okamura Н., 2004, Richter Н. G., et al., 2004, Rutter J., et al., 2002]. Более того, накапливаются данные, связывающие активность ключевых clock генов с состоянием хроматина, что добавляет новый уровень в регуляцию циркадных ритмов.

В данном обзоре изложены современные представления о системе формирования ритмов на уровне многоклеточного организма, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях, обсуждаются механизмы регуляции ритмов и влияние ритмов на различные клеточные процессы [Цынкаловский О. Р. и др., 2008].

Общие сведения о циркадных ритмахБольшинство процессов в живых организмах контролируются во времени и происходят ритмично [Голиков А. П., Голиков П. П., 1973, Деряпа Н. Р. и др., 1985, Ефимов М. Л., 1981, Катинас Г. С., Моисеева Н. И., 1980, Комаров Ф. И., Рапопорт С. И., 2000, Моисеева Н. И., Сысуев В. М., 1981]. Биологические ритмы - циклические колебания интенсивности и характера биологических процессов с различным периодом [Агаджанян II. А., 1967, Голиков А. П., Голиков П. П., 1973, Емельянов И. П., 1976]. Чаще всего биологические ритмы принято разделять по длине периода - длительности одного полного цикла ритмических колебаний в единицу времени. Соответственно различают ультрадианные (с периодом менее 20 часов), циркадианные или циркадные (с периодом от 20 до 30 часов) и инфрадианные (с периодом более 30 часов) [Koukkari W. L., Sothern R. В., 2006, Сорокин А. А., 1981]. Наиболее важное значение в биологии имеют циркадные ритмы (от лат. circa - около, dies — день). Термин «циркадные» обычно используют для обозначения ритмов с периодом, стремящимся к 24 часам, т.е. суточных ритмов [Деряпа Н. Р. и др., 1985, Ефимов М. JI. и др., 1985, Комаров Ф. И., Рапопорт С. И., 2000]. Именно с циркадными ритмами сиихронизуется большинство важнейших физиологических функций живых систем [Albrecht U., Eichele G., 2003, Комаров Ф. И., Моисеева Н. И., 1983, Кузьмин В. И., Жирмунский А. В., 1980, Моисеева Н. И., 1978].

Биологический ритм характеризуют несколько основных параметров: период (частота), мезор, акрофаза, амплитуда и фаза [Катинас Г. С., Моисеева Н. И., 1980]. Периодом обозначается длительность одного полного цикла ритмических колебаний в единицу времени. Частота - величина, обратная периоду, число полных колебаний в единицу времени. Мезор — уровень среднего значения показателей. Акрофаза - точка времени в периоде, когда отмечается максимальное значение (пик) показателя, максимальное отклонение от мезора. Амплитуда ритма - разность междумаксимальным (или минимальным) значением процесса и его средним уровнем. Нередко приводят величину двойной амплитуды (2А). Фаза -величина, характеризующая состояние колебательного процесса в определенный момент времени, определяется отрезком времени от какой-либо точки отсчета до условного момента - начала ритма.

Систему, образующую и контролирующие циркадные ритмы, -внутренние часы, можно обнаружить практически в любых светочувствительных организма — от цианобактсрий до человека. Этот факт свидетельствует о том, что наличие таких часов давало организму определенные преимущества при естественном отборе в процессе эволюции [Гаркави JI. X. и др., 1990, Голиков А. П., Голиков П. П., 1973, Ефимов М. Д., 1981, Казначеев В. П., 1980, Катинас Г. С., Моисеева Н. И., 1980]. Так как эволюция происходила в условиях ритмичности, обусловленной вращением Земли, формирование генетически закрепленной ритмичной организации жизнедеятельности, например, поведенческих реакций или физиологических функций, способствовало лучшей адаптации организма к условиям внешней среды [Алпатов А. М., 2000, Виру А. А., 1980, Гаркави JI. X. и др., 1990, Казначеев В. П., 1980, Романов Ю. А., 2000, Саркисов Д. С. и др., 1975].

Согласно недавно сформулированной гипотезе [Gchring W., Rosbash М., 2003] эволюция внутренних часов организма, появившихся более 500 миллионов лет назад, стимулировалась необходимостью ограничивать воздействие ультрафиолетового света, токсичного для генома. Примитивные микроорганизмы, относящиеся к морскому зоопланктону, могли использоватьь рецепторы к голубому свету (например, криптохромы -будующие гены Cry) для того, чтобы во избежание действие ультрафиолета ежедневно перемещаться на большую глубину. Эти рецепторы позже могли свзаться с циркадным оссцилятором, что способствовало более адекватной координации во времени этой приспособительной поведенческой реакции.

Такой механизм давал преимущества при естественном отборе и мог закрепиться генетически.

Ключевым свойством внутренних часов является способность генерировать самоподдерживающиеся, т.е. существующие даже при отсутствие внешних стимулов, эндогенные ритмы [Cuninkova L., Brown S. А., 2008, Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006]. Причем многие процессы в организме чаще координируются с эндогенными ритмами, задаваемыми внутренними часами, а не внешними стимулами при смене дня и ночи. Например, лабораторные мыши в стандартных световых условиях (12 часов свет/ 12 часов темнота) основную активность проявляют в период темноты. При помещении этих животных в условия постоянной темноты начинают преобладать так называемые «свободные» ритмы, задаваемые внутренними часами. Животные сохраняют «ночную» активность, но период регестрируемых ритмов начинает отличаться от 24-часового. Например, у мышей линии C57BL/6J этот период составляет ровно 23.6 часа.

Под действием факторов внешней среды внутренние часы легко подстраиваются под 24-часовой ритм (более подробно обсуждается в последующих главах). Здесь можно отметить, что высокая чувствительность внутренних часов и генерируемых ими ритмов к внешним воздействиям делают изучение хронобиологических процессов у человека крайне сложным, так как требуют создания достаточно строгих условий для исследуемых объектов [Романов Ю. А., 2000, Саркисов Д. С. и др., 1975, Смирнов К. М., 1980, Чиркова Э. Н. и др., 1990, Шабатура Н. Н., 1984]. В экспериментах на лабораторных животных эту проблему решить легче, так как их можно содержать в условиях котролируемого светового и пищевого режимов при постоянной температуре окружающей среды [Казначеев В. П. и др., 1978]. Перед началом экспериментов для исключения сильных световых влияний животных нередко на 1-2 суток помещают в условия постоянной темноты.

На внутриклеточном уровне циркадные ритмы формируются за счет взамодействействия между собой молекул, содержание которых меняется циклично в течение суток, и «точное время» зависит от концентрации этих молекул в ядре и цитоплазме. Механизмы этих процессов обсуждаются в следующей главе.

Молекулярные компоненты внутренних часов. Современная модель формирования внутриклеточных ритмовНа молекулярно-генетическом уровне циркадные ритмы начали изучаться около 30 лет назад. Существование генов, контролирующих циклические процессы и получивших название «clock генов», было впервые показано на Drosophila melanogaster, Chlamydomonas reinhardi и Neurospora crassa путем изолирования организмов с мутировавшими генами [Dunlap J. С., et al., 1996, Loros J. J., 1998]. Позже, мутации в clock генах были обнаружены у млекопитающих [Ките К., et al., 1999]. Первый clock ген period (per) был клонирован у Drosophila в 1984 году, а в последующие годы были клонированы все известные на настоящий момент clock гены млекопитающих [Вае К., et al., 1998]. Ген обычно относят к группе clock генов, если его продукт необходим для возникновения и/или поддержания циркадных ритмов [Okamura Н., 2004]. Последовательность clock генов практически одинакова у различных видов животных [Bell-Pedersen D., et al., 2005].

Клонирование clock генов сыграло решающую роль в понимании механизмов формирования и регуляции ритмов на внутриклеточном уровне [Meyer-Bernstein Е. L., Sehgal А., 2001]. Было показано, что регуляция ритмов происходит примерно одинаково в разных типах клеток, включая клетки прокариотов, растений, низших и высших животных [Takahashi J. S., 2004]. Современная модель внутриклеточных часов млекопитающих (Рис.1), базируется на экспериментальных данных, полученных в исследованиях па мышах и крысах [Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006, Reppert S. M., Weaver D. R., 2001].

Рис.1. Современная модель формирования внутриклеточных циркадных ритмов. Ритм устанавливается за счет взаимодействия позитивных и негативных элементов петлей отрицательных обратных связей, формируемых самими генами и их продуктами. Обозначенния: "+" -стимулирующие влияния, "-"-тормозящие влияния.

К ключевым генам, контролирующим циркадные ритмы, относятся Clock (в некоторых тканях его функцию возможно выполняет Npas2), Brual 1, гены Period Perl и Рег2 и Cryptochrome Cry J и Сгу2. Транскрипция в ядре с clock генов приводит к образованию мРНК, которая перемещается в цитоплазму, где в результате трансляции происходит синтез clock белков [Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006]. В цитоплазме происходит опосредованное киназами фосфорилирование, которое влият на стабильность белков [Toh К. L., 2008]. Постепенно увеличивается концентрация белков и формируются белковые гетеродимеры, которые перемещаются обратно в ядро, где онирегулируют экспрессию генов по механизму положительных и отрицательных обратных связей (Рис. 1).

Гетеродимер CLOCK-BMAL1 представляет собой транскрипционный фактор, который распознает последовательность CACGTG (так называемую «E-box») и, связываясь с ней, запускает транскрипцию с генов Рег/Рег2 и Cryl/Cry2. Продукты этих генов образуют гетеродимер PER:CRY, который переносится обратно в ядро и тормозит собственную транскрипцию за счет подавления активности комплекса CLOCK:BMALl, - то есть замыкается петля отрицательной обратной связи (Рис.1). Через определенное время происходит деградация гетеродимера PER:CRY, и комплекс CLOCK-BMAL1 может снова запускать новый цикл транскрипции.

Полный цикл завершается в течение примерно 24 часов, формирую тем самым внутриклеточный циркадный ритм. О кинетике отдельных реакций известно крайне мало.

Существует еще одна регуляторная петля, которая запускается при активации комплексом CLOCK:BMALl транскрипции ядерных рецепторов Rev-erb и Ror [Preitner N., et al., 2002]. REV-ERB и ROR регулируют транкрипцию Bmall, конкурируя между собой за связывание с так называемой «RORE последовательностью» (AAAGTAGGTCA) промоутера этого гена [Guillaumond F., et al., 2005]. При этом ROR стимулирует синтез BMAL1, a REV-ERB - подавляет, замыкая тем самым петлю отрицательной обратной связи [Triqueneaux G., et al., 2004]. Данный механизм не является основным в регуляции ритма, но, по-видимому, его наличие добавляет надежности в работу внутриклеточных часов, в частности способствует стабильности ритмов.

Кроме того, транскрипция Bmall может активироваться PER2 через неизученный механизм [Takahashi J. S., 2004].

Активность большинства ключевых clock генов (уровень мРНК) и содержание кодируемых ими белков изменяется ритмично в течение суток, спериодом около 24 часов [Albrecht U., Eichele G., 2003]. Исключение составляют CLOCK и казеин-киназы е и 8 [Balsalobre А., 2002]. Содержание PER и CRY, формирующих петлю отрицательной обратной связи и являющихся ингибиторами осцилляций, достигает максимума в конце дня -начале ночи [Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006]. Содержание REV-ERB и ROR достигает максимума между пиками BMAL1 и PER:CRY, а гетеродимер CLOCK:BMALl, поддерживающий оссциляции, — в течение светового дня [Balsalobre А., 2002, Cuninkova L., Brown S. А., 2008, Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006, Reppert S. M., Weaver D. R., 2001].

Для четкой работы внутриклеточных часов необходимо, чтобы максимально точно контролировалось время задержки перемещения белков из цитоплазмы в ядро. Как осуществляется контроль этого процесса остается до конца не изученным. Однако, показано, что регуляция перемещения белковых комплексов осуществляется на посттрансляционном уровне, например, как указывалось выше, за счет фосфорилирования белков. Этот процесс, влияя на стабильность ключевых циркадных белков, поддерживают точность работы часов. Например, фосфорилирование PER изменяет его стабильность [Kawamoto Т., et al., 2004] и тормозит скорость перемещения как этого белка, так и CRY в ядро клетки (для попадания в ядро CRY должен связаться с PER). Основными ферментами, ответственными за фосфорилирование этих белков, являются казеин-киназы е и 8 (Рис.1). Показано, что их мутации могут вызывать значительные изменения суточных ритмов.

Предполагается, что кроме описанных выше, ряд других генов могут являться потенциальными clock генами, например Npas, Мор4, Arnt2, Мор9, Fbxl3, однако их роль в формировании циркадных внутриклеточных ритмов до сих пор не доказана [Takahashi J. S., 2004]. Заметим, что связь с хронобиологическими нарушениями обнаружена только для нескольких генов, например, для Рег2 и Clock [Iwase Т., et al., 2002] и для казеин-киназ sи 5 [Lawson D. A., et al., 2005], поэтому неясно, насколько важным для формирования нормальных ритмов является проявление активности всех компонентов внутренних часов клетки.

Следует отметить, что изложенная выше традиционная модель организации системы циркадных часов млекопитающих в основном базируется на данных, полученных в экспериментах на различных моделях и на лабораторных животных, и прямых доказательств правильности этой теории для человека немного. Более того, в одном из недавних исследований было показано, что экспрессия Clock, одного из ключевых циркадных генов, не является необходимой для формирования суточных ритмов [Debruyne J. P., et al., 2006]. Хотя у мышей, лишенных CLOCK, изменялась реакция на свет, четкие циркадные ритмы полностью сохранялись. Подробное обсуждение фактов, противоречащих транскрипционной-трансляционной модели, приводится в одном из критических обзоров [Lakin-Thomas P. L., 2006]. Весьма вероятно, что традиционная модель формирования циркадных ритмов может притерпеть некоторые изменения, по крайней мере для клеток млекопитающих.

Можно предположить, что механизмы формирования и регуляции ритмов в клетках СХЯ (в центральном пейсмейксре) и периферических тканей (в периферических пейсмейкерах) не полностью идентичны, и, кроме того, могут различаться между разными тканями [Balsalobre А., 2002, OkamuraH., 2004].

Более того, циркадные ритмы могут различаться в разных клетках одной ткани. В частности, показано, что в тимусе и ткани яичек изменение экспрессии clock генов различается в клетках разной степени зрелости [Alvarez J. D., et al., 2003, Alvarez J. D., Sehgal A., 2005, Morse D., et al., 2003]. Была сформулирована гипотеза о том, что формирование ритмов зависит от степени дифференцировки клеток [Morse D., et al., 2003]. Эта гипотеза получила экпериментальное подтверждение в работах нашей лаборатории.

Изучение 24-часовых изменений активности clock генов в клетках кроветворной ткани мышей выявило значительные различия в формировании и регуляции циркадных ритмов в стволовых клетках и более дифференцированных и зрелых клетках костного мозга [Tsinkalovsky О., et al., 2006]. Полученные результаты позволи сделать вывод о том, что в кроветворных стволовых клетках мышей не сформированы циркадные ритмы в изменении активности большинства clock генов.

Механизмы формирования циркадных ритмов в организмеРабота внутренних часов зависит от нескольких составляющих, которые формируют ритмы и опосредуют их влияние на основные функции организма. К компонентам, стимулирующим осцилляции в центральном и периферических пейсмейкерах организма, относятся прежде всего факторы внешней среды [Van Gelder R. N., Herzog E. D., 2003]. Среди них основным стимулятором (Zeitgeber) безусловно является свет, а другими важными факторами - пища и температура (Рис. 2). Осцилляции пейсмейкеров запускают ряд механизмов, с помощью которых внутренние часы могут регулировать различные физиологические процессы в организме.

Центральный пейсмейкерСвет стимулирует центральный пейсмейкер (водитель ритма), функцию которого выполняют билатеральные супрахиазматические ядра (СХЯ) гипоталамуса, каждое из которых включает 10000-16000 нейронов [Yamaguchi S., et al., 2003]. Электрический потенциал этих нейронов изменяется ритмично с периодом примерно 24 часа. У человека период свободных ритмов в СХЯ несколько больше, но под действием внешних возбудителей, в основном световых, они легко подстраивается под 24-часовой период.

Световой сигнал воспринимается высокочувствительными ганглиозными клетками сетчатки [Brown Т. М., Piggins Н. D., 2007, Yamazaki S., et al., 2002], которые посредством фотопигмента меланопсина [Dkhissi-Benyahya О., et al., 2006] вызывают возбуждение в сетчатке и через ретиногипоталамичсский тракт проводят его к СХЯ [Challet Е., 2007, Tosini G., et al., 2008]. Нейроны СХЯ функционируют автономно, споптанно генерируя электрические потенциалы. Синхронизация нейронов СХЯ осуществляется через синапсы и за счет паракриновых влияний. В частности, медиатором, опосредующим синхронизацию работы клетко, являетсяРис. 2. Схема формирования ритма внутренними часами организма под действием внешних стимулов (факторов внешней среды) и локальных факторов.вазоактивный интерстициальный полипептид, активирующий соответствующий ему рецептор.

При возбуждении в нейронах СХЯ происходит резкий сдвиг концентрации основных компонентов внутриклеточных часов [Yamaguchi S., et al., 2003, Yan L., et al., 2007], изменяется активность clock генов и стабильность кодируемых ими белков [Aton S. J., Herzog Е. D., 2005]. В клетках происходит активация clock генов Perl и Per2 [Quintero J. Е., et al.,2003] (без необходимого предварительного синтеза стимулирующих белков) и запускаются связанные с этими генами реакции, описанные выше. На транскрипцию генов в нейронах СХЯ могут влиять изменения концентраций многих факторов: митоген-активированного протеина, киназ [Takahashi J. S.,2004], внутриклеточного кальция [Kononenko N. I., et al., 2008], кальмодулина [Agostino P. V., et al., 2004], c-Fos протеина [van der Veen D. R., et al., 2008] и оксида азота [Plano S. A., et al., 2007].

СХЯ посредством нервных и гуморальных сигналов в другие отделы головного мозга и в периферические ткани координируют во времени различные функции организма [Hastings М., et al., 2007]. Влияниями через субпаравентрикулярную зону и медиальный преоптический отдел контролируется терморегуляция, циркадные изменения температуры тела [Scheer F. A., et al., 2005], через латеральный гипоталамус и вентролатеральное преоптическое ядро - циклы сна-бодрствования [Moore R. Y., 2007], через дорсомедиальное и паравентрикулярное ядра гипоталамуса регулируется выделение гормонов [Hastings М., et al., 2007]. Особенно важным представляется стимуляция выработка глюкокортикоидов, опосредующих влияние1 центрального пейсмейкера на многие метаболические процессы [Maywood Е. S., et al., 2007, Дедов И. И., Дедов В. И., 1992]. Эти гормоны регулируют метаболизм глюкозы, жиров и белков, обладают противовоспалительным действием и другими достаточно хорошо изученными эффектами.

Безусловно важную роль в передаче сигналов от СХЯ играют выделяемые нейронами гуморальные факторы, например, трансформирующий фатор роста a (TGFa), кардиотрофин-подобный цитокин и прокинетицин-2 [Zhang С., et al., 2007]. Доказательством важности гуморальных влияний являются результаты работы Silver с соавторами, которые обнаружили, что пересадка СХЯ, инкапсулированных в пористый материал, может приводить к восстановлению циркадных локомоторных ритмов у реципиентов с поврежденным СХЯ [Yan L., et al., 2007].

Формирование ритмов в периферических тканях и органахХотя наиболее детально молекулярно-генетические основы циркадных ритмов изучены в центральном пейсмейкере - СХЯ гипоталамуса [Reppert S. М., Weaver D. R., 2002], за последние десять лет опубликовано большое количество исследований, описавших циркадные изменения активности clock генов в клетках различных органах и периферических тканей: печени, сердца, легких, поджелудочной железы, скелетных мышц, гладкомышечной мускулатуры, слизистной оболочки ротовой полости, кожи, в лейкоцитах периферической крови и других [Balsalobre А., 2002, Cuninkova L., Brown S. А., 2008, Gachón F., et al., 2004, Hastings M., et al., 2007]. Интересно отметить, что только небольшая часть работ выполнены на клетках человека [Bjarnason G. A., et al., 2001].

Более того, элегантными исследованиями с регистрацией экспрессии Рег2 в отдельных клетках, было доказано, что угасание ритма в культуре не связано с затуханием внутриклеточных осцилляторов - индивидуальные ритмы в клетках сохраняются в течение нескольких недель [Welsh D. К., et al., 2004]. Авторы доказали, что в условиях in vitro нарушается координация ритмов между отдельными клетками. Воздействия различных стимуляторов, описанных выше, могут восстанавливать и поддерживать синхронизацию ритмов.

Важным вопросом, который продолжает активно дискутироваться, является вопрос о механизмах координации периферических часов. Долгое время было считалось, что влияние центральный пейсмейкера являются абсолютно доминирующими. В настоящее время, хотя иерархическая схема организации внутренних часов (по крайней мере у млекопитающих) не ставится под сомнение, принято считать, что периферические часы обладают определенной автономностью. В ествественных условиях периферические осцилляторы координируются сигналами, поступающими от нейронов СХЯ, однако, при изменении условий внешней среды, мобилизующих адаптационные процессы, связь между осцилляторами может прерываться. Например, в экспериментах с моделированием синдрома смены часового пояса («jetlag»), вызывающим 6-часовой сдвиг циркадного периода, было показано, что при возвращении к привычному периоду синхронизация СХЯ наступает достаточно быстро, но восстановление ритмов на перифериизанимает более недели. Воздействие на периферические осцилляторы таких сильных (и более адекватных Zeitgeber для периферических тканей, чем свет) стимулов, как пища, изменение концентрации гормонов (особенно глюкокортикоидов), сдвиги температуры, может перекрывать влияние центрального пейсмейкера - СХЯ. В таких случаях, именно локальные стимуляторы осуществляют синхронизацию ритма между отдельными клетками [Balsalobre А., 2002].

Интересное исследование об участии периферических осцилляторов в формировании ритмов в клетках печени провели Kornmann с коллегами [Kornmann В., et al., 2007]. Они изучали изменения активности clock генов в клетках печени мышей при искусственном угнетении одного из ключевых компонентов внутриклеточных часов - mBmall за счет постоянной экспрессии mRev-erb а. Исследователи показали, что локальное выключение mBmall in vivo приводит к потери ритмов в изменениях суточной экспрессия большинства clock генов, однако небольшая часть генов, в частности тРег2, продолжает изменяться ритмично. Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что при формировании ритмов активности большинства генов в периферических тканях (по крайней мере в печени) доминируют периферические осцилляторы, однако некоторые гены могут оставаться под контролем центрального пейсмейкера.

Регуляция clock генами различных клеточных функцийБольшое количество исследований посвящено выяснению функций внутренних часов, их роли в регуляции различных физиологических процессов в организме. Использование высокопродуктивных методов анализа транскриптомов в различных тканях показали, что активность до 10% генов изменяется в течение суток ритмично [Oishi К., et al., 2003, Storch К., et al., 2002]. Значительная часть этих генов (и их продуктов) была связана с метаболизмом питательных веществ. В частности, циркадные ритмы были выявлены в изменении активности многих ферментов, участвующих в метаболизме белков, жиров и углеводов. Было высказано предположение, что внутренние часы в печени регулируют разобщение процессов синтеза и расщепления гликогена и могут координировать детоксикацию различных продуктов метаболизма, например ксенобиотиков, способных генерировать реактивные метаболиты кислорода [Balsalobre А., 2002]. Таким образом, наличие внутренних часов в тканях, участвующих в пищеварении (желудочно-кишечном тракте, печени, поджелудочной железе), позволяет адекватно координировать метаболические процессы.

Глобальные генетические исследованиия позволили сделать два важных заключения. Во-первых, было выявлено, что ритмические изменения активности генов в разных группах клеток в пределах ткани различаются по фазе ритмов. Это по-видимому может объясняться тем, что разные популяции клеток участвуют в биохимически разнонаправленных процессах, например, в синтезе и расщеплении гликогена в печени.

Во-вторых, было обнаружено, что набор генов, координирующих активность с циркадными ритмами, специфичен для каждой ткани. Например, при сравнении ритмично экспреесирующихся генов в печени и сердце был выявлен очень небольшой процент одинаковых генов. На основании данных анализов был сделан вывод, что циркадная активность генов в периферических тканях и органах преимущественно регулируетсялокальными факторами. Подобная организация периферических часов представляется биологически оправданной. Основные процессы, происходящие в различных тканях должны координировться во времени соответственно специфическим для данной ткани стимулам. Например, в печени изменяется метаболизм питательных веществ координирование с поступлением пищи, в почках эфффективно изменяется фильтрация и реабсорбция воды и электролитов соответственно циклам сна-бодрствования и т.д.

Следует отметить, что кроме метаболических процессов, участие внутренних часов в регуляции многих других функций остаются крайне мало изученным. Например, получено немало данных о том, что процесс кроветворения координируется во времени [8таа1апс1 II., е1 а1., 2002]. Циркадные ритмы выявлены в изменениях количества стволовых клеток и клеток-предшественников, выделяемых в течение суток из костного мозга добровольцев [АЬгаЬашзеп.Г., е1 а1., 1998], в синтезе ДНК и уровнях пролиферации клеток-предшественников костного мозга различных линий [8таа1апс1 II., е1 а1., 1992, 8таа1апс1 II., е1 а1., 1995] и в способности клеток костного мозга образовывать колонии в организме летально облученных рецепиентов [О'Нопск Ь., еЬ а1., 2004]. Однако, до сих пор не исследовано, как происходит координация во времени гемопоэза в костном мозге.

Описательный характер носят и хронобиологические исследования системы иммунитета. Показано, что многие составляющие системы клеточного и гуморального иммунитета [Петров Р. В., 1987, Хаитов Р. М., 2006] (количество Т- и В-лимфоцитов, концентрации иммуноглобулинов и интерлейкинов, изменения количества фагоцитов и их функциональной активности, общее количества лейкоцитов периферической крови) регулируются циркадными ритмами [Бородин Ю. И. и др., 1992]. Однако, данные о механизмах такой регуляции иммунной системы отсутствуют.

Механизмы регуляции физиологических процессов внутренними часамиНаиболее изученный механизм регуляции клеточных функций clock генами заключается в изменении активности контролируемых ими генов (так называемых «clock controlled genes») [Albrecht U., Eichele G., 2003].

Белки, кодируемые clock генами, и образуемые белковые гетеродимеры являются транскрипционными факторами, экспрессия которых меняется в соответствие с клеточными циркадными ритмами [Gachón F., et al., 2004]. За счет измепеппия активности транскрипционных факторов может ритмично меняться и экспрессия подконтрольных им генов и, соответственно, клеточные процессы, этими генами опосредуемые [Balsalobre А., 2002]. Такой механизм позволяет клеткам периферических тканей и органов быстрее и лучше адаптироваться к местным изменениям окружающей среды.

Одним из примеров регуляции клеточных процессов внутриклеточными часами через подконтрольные транскрипционные факторы является изменение clock генами суточной экспрессии Dbp в клетках печени [Lavery D. J., et al., 1999]. В частности, показано, что циркадные изменения активности этого гена в клетках печени контролируются непосредственно гетеродимером CLOCK:BMALl через последовательность E-box. Dbp является транскрипционным фактором, кодирующим экспрессию несколько ключевых ферментов в печени, и регулируя экспрессию Dbp, CLOCKrBMALl может соответственно регулировать активность печеночных ферментов. Весьма вероятно, что такой механизм регуляции характерен для многих тканей [Balsalobre А., 2002]. Подобный контроль выглядит биологически рациональным: несколько ключевых clock генов способны регулировать значительное количество подконтрольных генов и соответственно связанных с ними процессов за счет воздействие на относительно небольшое число транскрипционных факторов. При этом набор генов, подконтрольных clock генам, и набортранскрипционных факторов зависит от типа тканей и выполняемых ею функций. Учитывая специфичность генного репертуара в разных тканях, можно предположить, что механизмы регуляции ритмов в этих генах также имеют свои особенности.

В свою очередь, внутриклеточные часы в периферических тканях и органах настраиваются не только при получении координирующих сигналов от центральногт пейсмейкера, по и при локальном воздействии внутренних факторов, например, метаболических, которые могут действовать непосредственно на clock гены и белки [Hastings М., et al., 2007, Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006]. Так, было показано, что способность гетеродимера CLOCK-.BMAL1 связываться с ДНК напрямую зависит от соотношения восстановленной и окисленной форм никотинамиддинуклеотида [Rutter J., et al., 2002]. Поскольку это соотношение определяется уровнем клеточного метаболизма, ограничение поступления в клетки питательных веществ может перенастраивать клеточные часы.

Приведенные примеры дают представление об механизмах координации clock генами различных физиологических процессов в клетках и демонстрируют важную роль внутренних часов в поддержании клеточного и тканевого гомеостаза. Можно ожидать, что интенсивные исследования системы формирования циркадных ритмов достаточно скоро приведут к раскрытию новых механизмов, опосредующих функции этой системы в различных тканях [Takahashi J. S., 2004].

Настоящая работа посвящена изучению внутриклеточных ритмов в системе кроветворения млекопитающих. Кроветворная ткань является динамичной, быстро обновляющейся тканью, состоящей из многих типов клеток, которые находятся на разных стадиях диффсренцировки [Петров Р. В., 1987, Хаитов Р. М., 2001, Хаитов Р. М., 2006]. Основные типы клеток (лейкоциты, эритроциты и тромбоциты), образующиеся в процессе кроветворения, выполняют разные функции: иммунную, обеспеченияорганизма кислородом, поддержания гемостаза, поэтому механизмы регуляции гемопоэза достаточно сложные. При этом безусловно важным в регуляции гемопоэза является поддержание ритмичности процессов, его составляющих. В данной работе основное внимание было уделено характеристике молекулярных часов в кроветворных клетках различной степени зрелости и дифференцировки и обсуждению особенностей системы формирования циркадных ритмов в костном мозге в сравнении с другими тканями и между различными видами организмов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперименты на мышахЖивотныеДля проведения экспериментов на лабораторных животных мною был окончен курс «Методы работы с лабораторными животными» при Бергенском университете и получен соответствующий сертификат. На все эксперименты с животными было получено разрешение комиссии вивариев Института им. Гаде Бергенского университета и университетской клиники Хокеланд.

Для хронологических экспериментов по оценке изменения активности clock генов исользовались мыши B6D2F1, в возрасте 5-6 недель (Charles Rivers,L'Arbresle, France), которые в течение трех педель до начала опытов находились в стандартных световых условиях 12 часов при свете (с 06:00 до 18:00)/12 часов в темноте, LD 12:12). Для подтверждения синхронизации основных ритмов организма к указанному режиму у 28 мышей с помощью цифровых датчиков Digital Thermometer 49А (YSI, Dayton, OH, USA) измерялась ректальная температура. В течение 24 ч до начала экспериментов животные находились в полной темноте во избежания стимулирующего маскирующего влияния света на эндогенные ритмы животных. В каждой из 3-х групп экспериментов использовали по 28 мышей. Шесть раз в сутки через каждые 4 ч забивали 4 мышей для получения образцов костного мозга и печени и забора крови. Обозначение времени забора (circadian time, СТ) соответствовало времени LD до начала экспериментов (например, 6 00 СТ -06:00). Седьмой забор проводили через 24 ч после начала эксперимента, то есть по времени (СТ) этот забор совпадал с первым забором. Мышей усыпляли ингаляционным наркозом (СОг) и забивали путем быстрого смещения шейных позвонков, а затем извлекали кости бедра и голени и печень. При забивании у животных собирали кровь из сердечной полости, которая после обработки эфиром использовалась для определения концентраций кортикостерона и мелатонина методом радиоизотопного анализа [Claustrat В., et al., 1984, Filipski Е., et al., 2004]. Для оценки концентрации кортикостерона образцы растворяли в стандартном буфере для радиоиммунного анализа, а затем инкубировали с 1,2,6,7-ЗНкортикостероном (Amersham, Orsay, France) и кроличьими антителами к кортикоетерону (Valbiolech, París). Для определения мелатонина использовали меченную сыворотку с антителами к мелатонину, для экстракции использовали эфир. Чувствительность метода составляла 5 пг мелатонина/мл плазмы.

Определение способности кроветворных клеток мышей образовывать колонии in vitroСмешаиую популяцию кроветворных клеток костного мозга и SP клетки культивировали в 35-мм чашках Петри в растворе метилцеллулозы MethoCult 3434 (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada), содержащим 3 U/мл эритропоэтина, 10 нг/mji интрлейкина 3, IL-3, 10 нг/мл IL-6, и 50 нг/мл фактора стволовых клеток (Stem cell factor). Способность образовывать колонии оценивали на 12 день культивирования по стандартным критериям (http://www.stemcell.com/technical/28405methocult%20M.pdi), подсчитывая колонии, которые содержали более 50 клеток [Петров Р. В., et al., 1974, Петров Р. В., 1987]. В тестах со смешаной популяцией кроветворных клеток костного мозга концентрация клеток при посеве составляла 2 х 104 клеток/мл (2.2 х 104 клеток в одной чашке Петри). Так как оптимальная концентрация SP клеток для подобного анализа была неизвестна, мы провели предварительные тесты с концентрациями от 20 до 1000 SP клеток/мл. На основании результатов этих экспериментов в качестве оптимальной для теста была выбрана концентрация 100 клеток/мл, использование которой приводило к наилучшему соотношению индекса колониеобразования (количество колоний/количество посеянных клеток).

Эксперименты на рыбах Danio rerioРыбыДля экспериментов использовано 780 взрослых рыб Danio rerio TAB, которые были получены и содержались в аквариуме международного центра молекулярной биологии Sars (г. Берген, Норвегия) согласно соответствующим инструкциям этого центра по работе с лабораторными рыбами (www.sars.no/manual.doc). На все эксперименты с рыбами было получено разрешение Комиссии по этике биомедицинских исследований Sars центра.

ЦитологияДля приготовления препаратов с применением цитоспинов 2-10 х 103 отсортированных клеток осаждали в центрифуге Shandon Cytospin 3 (Thermo Electron Corporation, Pittsburgh) при скорости 1000 ротаций/мин в течение 5 мин на полилизиновые стекла для микроскопирования (Menzel GmbH & Co., KG, Braunschweig, Germany). Затем часть препаратов окрашивалась набором Diff-Quik kit (Dade-Behring AG, Switzerland) для анализа в световом микроскопе. Неокрашенные препараты использовали для полученния снимков в режиме интерференционного контраста с помощью детектора проходящего света на конфокальном сканирующем микроскопе Leica TCSSP2 AOBS (Wetzlar, Germany), объектив НС х PL АРО 63 х 1.4 NA.1Миелосупрессивная терапияДля получения миелосупрессивного эффекта рыбам 10-мкл шприцом для микроинъекций Hamilton вводили внутрибрюшинно 5-флуоурацил (Sigma-Aldrich) в концентрации 250 мкг/кг веса в 5 мкл физиологического раствора [Arai F., et al., 2004, Venezia Т., et al., 2004]. Аналогичный объем физиологического раствора без препарата использовался в качестве контроля. Влияние миелосупрессивной терапии на кроветворные клеткиоценивали на следующий день после инъекций методом проточной цитометрии после окраски клеток Hoechst.

Эксперименты на костном мозге человекаДонорыДонорами костного мозга явились 10 мужчин-добровольцев в возрасте от 21 до 28 лет. Первая серия экспериментов (5 доноров) проведена в период с декабря 1999 года по январь 2000 года, вторая (5 доноров) - в период с декабря 2003 года по январь 2004 года. Все доноры были подробно проинформированы о цели и задачах экспериментов, и от всех доноров получено письменное согласие участвовать в исследовании. Для проведения этих экспериментов было получено разрешение Комитета по медицинской этике Бергенского университета. Все процедуры проведены соответственно Инструкциям по этике биомедицинских исследований Совета международных организаций по медицинским наукам.

Все доноры соблюдали обычное расписание с подъемом утром между 7:00 и 9:00 и отходом ко сну между 23:00 и 00:30 по меньшей мере в течение недели, предшествующей экспериментам. Никто из доноров в течение месяца до начала экспериментов не работал ночью. Пищевой режим включал четырехразовое питание ' (соответственно норвежским стандартам) с завтраком утром, ланчем между 11:30 и 12:00, обедом между 16:00 и 17:00 и легким ужином между 19:00 и 20:00.

Выделение клеток костного мозга человекаОбразцы костного мозга получали 6 раз в течение суток, пунктируя грудину и бедренные кости в 08:00, 12:30, 17:00, 21:30, 02:00 и 07:00 ч. Для исключения методических погрешностей последовательность взятия образцов из разных анатомических участков меняли у разных доноров.

Кроме того, у половины доноров забор костного мозга начинали в 08:00, а у другой половины - в 12:30. Для обезболивания место пункции предварительно обкалывали 8 мл раствора лидокаина, 10 мг/мл (Astra, Sweden). Для дезинфекции использовали хлоргексидин. Около 8 мл костного мозга набирали в 20-мл шприц, предварительно смоченный 100 1Е/мл раствором гепарина (Leo Pharma AS, Norway), и сразу смешивали в 50-мл пробирках (ТРР, Trasadingen, Switzerland) с 13 мл физиологического раствора, содержащего 2 мМ EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО). Из полученного раствора 1 мл замораживали (см. описание процедуры ниже) для последующих исследований, а остальной объем (примерно 20 мл) использовали для выделения мононуклеарных клеток на градиенте плотности Lymphoprep (Nycomed, Norway).

Проточная цитометрия: анализ и высокоскоростная сортировка клетокАнализ кроветворных клеток мышейДля анализа и сортировки кроветворных клеток мышей и рыб использовали высокоэффективный проточный цитометр-сортировщик MoFlo (Cytomation, Fort Collins, USA), оборудованный лазером Coherent Enterprise 621 с излучением в двух спектрах: с длиной волны 488 нм, мощностью 1000 мВ, и 365 нм (ультрафиолетовый спектр), с мощностью 60 мВ, а также диодом, мощностью 25 мВ, с длиной волны 635 нм. Для анализа клеток, которые были окрашенны антителами, коиъюгированными с FITC или RPE, использовали соответственно фильтры 530/40 и 580/30 (все оптические фильтры/зеркала - от Omega Optical, USA), и 488 нм лазер [Shapiro H. H. M., 2001, Shapiro H. M., 2003]. Для анализа клеток, окрашенных Hoechst,использовали лазер с длиной волны 365 нм, а флуорисценцию Hoechst, проходящую через оптическое зеркало 610 DMSP, за счет использования оптических фильтров регистрировали в голубом (450/20 BP) и красном (675 EFLP) спектрах [Goodell M., et al., 1996]. При анализе клеток исключали клеточные агрегаты, мертвые клетки и клеточные обломки [Nolan J. Р., Yang L., 2007]. На Рис. 3 представлен пример логической последовательности анализа клеток для выявления SP [Tsinkalovsky О., et al., 2007, Цынкаловский О. Р. и др., 2008].

Анализ кроветворных клеток рыб Danio rerioПроточно-цитометрический анализ клеток рыб проводили, как описано выше для клеток мышей. Для оценки экспрессии DiD [Gregory M., Jagadeeswaran P., 2002, Lin H. F., et al., 2005] использовали 635-нм лазер и фильтр 670/30 BP. Интенсивность флуорисценции DiD (в логарифмическом режиме) в клетках, окрашенных Hoechst, оценивали на гистограмме SSC и FL6 после исключения клеточных агрегатов и мертвых клеток. Клетки, неокрашенные DiD, использовали в качестве контроля.

Высокоскоростная сортировка клетокКлетки сортировали на проточном сортировщике MoFlo в режиме "purify 1" со скоростью до 30000 событий (клеток)/с в 5-мл полипропиленовые пробирки с холодным раствором буфера, содержащим 10 % телячей сыворотки [van den Engh G., 2000]. Небольшую объем из частиотсортированных образцов использовали для оценки качества сортировки. Обычно, чистота сортировки составляла 94 - 99% (в среднем - 97.3%), выживаемость клеток, которая определялась после окраски трипановым синим, - более 90% для кроветворных клеток мышей и более 70% для клеток рыб, а потери клеток из выбранной для сортировки популяции не привышали 30%.

При сортировке образцов смешаной популяции костного мозга мышей клеточные агрегаты, мертвые клетки и клеточные обломки исключались на следующих гистограммах: прямого свсторасссивания, forward seatter (FSC) и пульсовой ширины (pulse width); FSC и флуоресценции иодида пропидия (PI) и FSC и бокового светорассеивания, side scatter (SSC). Отсортированные таким образом клетки подсчитывались, 2 х 105 клеток использовали для оценки способности клеток образовывать колонии, а 25 х 105 клеток распределялись в 2-мл пробирки (по 5 х 105 клеток/пробирку), выдерживающие заморозку в жидком азоте (ТРР AG, Trasadingen, Switzerland), и пробирки замораживались, как описано выше.

Выделение РНК и определение экспрессии генов методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипциейВыделение РНКСуммарную клеточную РНК клеток мышей и человека выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Germantown, MD, USA), aиз клеток рыб - с помощью набора GenElute Mammalian Total RNA extraction kit (Sigma-Aldrich). Во избежание примесей клеточной ДНК, которые могут влиять на результат ПЦР [Bustin S., 2002], все образцы обрабатывали ДНазой с последующей экстракцией фенол-хлороформом (Promega, Madison, WI, USA). Полученнную РНК растворяли в 10 мкл раствора для сохранения РНК (Ambion, Houston, ТХ, USA). Для качественного контроля и определения количества выделенной РНК каждый образец (1 мкл) тестировали на биоанализаторе Agilent 2100 и NanoLabChip согласно инструкции производителя. В каждую реакцию в качестве стандарта включали образец (Ambion, Houston, ТХ, USA), состоящий из 6 фрагментов РНК, который позволял определить количество РНК в образцах. В среднем из образцов неочищенной популяции клеток костного мозга выделяли 3.2-4.1 мкг общей РНК, а из образцов SP клеток - от 50 до 240 нг.

Суммарную клеточную РНК клеток рыб выделяли с помощью набора GenElute Mammalian Total RNA extraction kit (Sigma-Aldrich). Количество выделенной РНК оценивали с помощью анализатора NanoDrop-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Из образцов отсортированных кроветворных клеток рыб обычно выделяли от 10 до 90 нг суммарной РНК.

ПраймерыДля дизайна праймеров и флюоресцентно меченых проб (способных присоединяться к внутреннему сегменту ДНК-мишени) для всех реакций использовали программу Primer Express (Applied Biosystems). Последовательности праймеров и проб, использованных в пашей работе, приведены в отдельно для генов кроветворных клеток мышей (Таблица 1), рыб Danio rerio (Таблица 2) и человека (Таблица 3). Праймеры для генов клеток печени опубликованы отдельно [Tsinkalovsky О., et al., 2006]. Для дополнительного контроля экспрессии помеченные на 5'-конце флюоресцентным красителем-репортером FAM (reporter dye), а на 3'- конце -блокатором TAMRA (quencher dye). Праймеры и пробы для реакций по оценке экспрессии clock генов в клетках мышей (mPerl, mPer2, mBmall, mCryl, mClock, mRev-erb а) и человека (hPerl, hPer2, hCryl, hCry2, hBmall, hRev-erb а и hClock), а также m36B4, m Wee I, mDbp, mDlll и mHesl приобретали y MedProbe (Oslo, Norway). Гены 18S, GAPDH, hPO, hfi-cictin, которые характеризуются выраженной постоянной экспрессией в клетках, использовались в качестве эндогенного контроля. Готовые праймеры для анализа экспресии этих генов приобретали у Applied Biosystems.

Праймеры для генов рыб Danio rerio (1то2, tie I, c-myb, scl, tie2, c-fos, tobla, stat3, Ickl, ikaros, rag2, и c-mpl) приобретали y Sigma-Aldrich. В качестве эндогенного контроля в клетках рыб использовали 18S.

Таблица 1. Праймеры и пробы для тестируемых генов в клетках мышей.

Ген Праймер/проба Последовательность (5> 3')тРег1 Прямой ТСАСАССАССААСАСТАСАААСТСАОбратный СТСССАСТСАССАСССТСТАСПроба АСАСС С САТСС С САС С САС САСтРег2 Прямой СТССАССТСССТССАСАСААОбратный ТСАТТАСССТТСАССТССТТСАСПроба СТСССААСССТСААСТАТССССТССmRev-егЬ а Прямой САТАССТССССТТСТТСТАСАТСАТСОбратный ТТССАТССССАСТТСТАСАСТТСПроба ТСАТС СТСТТСАТС СТССТС СТССТТСТАТААССтВта11 Прямой АС АС СТС СС АС С ААС С С АТАОбратный ТСАСААТТАССЮТТТСАСТТСАТСАТПроба С АС АС ААС С АААСТАСААС С С ААС АТТТСТАТС АСтСгу1 Прямой СТССССТСАССАССТТТТСТТОбратный САСТТССТСТАСССАСАССТТСААПроба ААСССССССТСАТААСССАСАССТтС1оск Прямой С ААААТСТС АСС АС С АСТТААТС СОбратный АТАТС С АСТС СТС С С СТТТС СПроба ТСАССААТСТАТАСТААСАССАТТТСССТТТТССАТАТТт\Л/ее1 Прямой СССАСАСТСССААСАСТТТСОбратный АТС ААТАС АС ААСТАСС С С С С АСТТТПроба АСАСССССААТСААТААСТСССССТТТтйЬр Прямой СССТСАССААСАСААССАТСАС;Обратный ТСТТССАТСТСТССАССТСТТСПроба ТТСАТТСТТСТТСТАССТСССССТССАтОН1 Прямой САСТСТСТТАТАСССАСТСАССТСТААОбратный С С С СТАТАТС СТТС С ААТТТТАТТТААС АПроба ТСС С ААТТТТС С С АС АТС С СТТС СтНез1 Прямой ССТСТСАССАСАСАААСТСАТСАОбратный СТСТТТТСАСТТСССТТАСАСТТТСАТПроба ТТАТТСТТССССТТССССТСТТСТССАТт36В4 Прямой СССАССАТТСАААТТСТСАСТСАОбратный АТСТТСАССАТСТТСАССАСТСТПроба ТСССТСССАССТТСТСТССАСТСТТТАТСТаблица 2. Праймеры для тестируемых генов в клетках рыб Danio rerío.

Ген Праймер Последовательность (5'—► 3')1то2 Прямой AAATGAGGAGCCGGTGGATОбратный GCTCGATGGCCTTCAGAAAtiel Прямой CTGGCGAGATAGACCTTAОбратный CCTCTTCAGCGGTAGCATc-myb Прямой GGTGATTGAGTTGGTGCAGAAGОбратный TCGCCCCTTTAAATGCTTTGsel Прямой AAAGGAGGTGGCGGTGATОбратный AGCGGGCGGACTCAAtie2 Прямой TGGCGGAGGGCGAGTCTGОбратный AGCTGGTATCCGGTGTTGc-fos (srf) Прямой TACG G ACCCTTCAACAG АССОбратный TGGAGCAAAATTGTGCAGAGtobla Прямой AATTTGGCTCCACGAAAATGОбратный CCTGGAGATTGGGAAAGACAstat3 Прямой CAGTTGGAGACGCGGTATОбратный GACCAGCGTGGCGTGAGAIck1 Прямой ACCAGTGTAACTGCCCCAAGОбратный TCACTGTGGGCTGGATCATAikaros Прямой AG G С С АТС ААС AGTG С ААТТАОбратный AAGGTGCTCTGCGGCGCTGTCrag2 Прямой CGAGATCAGCCACAGTCGTAОбратный AAGGTGCAGAGTCCTCGAAALc-mpl Прямой CGCCAACCAAAGCCAGAGTTAОбратный ACTTTTCAACAGGTGCATCCCAДля оценки экспресии генов кДНК анализировали К-ОТ-ПЦР на оборудовании Applied Biosystems Sequence Detection System в 96-луночныхТаблица 3. Праймеры для тестируемых генов в клетках здоровых доноров.

Ген Праймер Последовательность (5'—► 3')hPerl Прямой ACACACTTCAGAACCAGGATACCTTОбратный TGCTCCGAAATGTAGACGATTChPer2 Прямой GTCCACCTCCCTGCAGACAAОбратный CTGGTAATACTCTTCATTGGCTTTCAhCryl Прямой GCCAGGCGGAGAAACTGAAОбратный AAAATTTG С С АСС С AAG СТТТhCry2 Прямой CCTACCTGCGCTTTGGTTGTОбратный TGCTGTTCCGCTTCACCTTThRev-erb a Прямой CCATGAACCTGGCCAACAAОбратный GTGCTGGGTGGGTGAAGTCThBmall Прямой GAAATCATGGAAATCCACAGGATAAОбратный GAGGCGTACTCGTGATGTTCAAThClock Прямой CTACACCTCAGTTCATCAAGGAAATGОбратный ATATCCACTGCTGGCCTTTGGпланшетах на инструменте ABI PRISM 7700 (для клеток мышей и человека) и в 384-луночных планшетах на инструменте ABI PRISM 7900 (для клеток рыб). В каждую реакцию включали 6 (для клеток мышей) или 9 (для клеток человека) образцов кДНК (полученных с контрольной РНК) для построения стандартной кривой.

Образцы приготавливали путем последовательного двухкратного разведения контрольной РНК, начиная с концентрации 250 нг для клеток мышей или с 500 нг для клеток человека. При проведения каждого теста включали также образец, содержащий реакционную смесь без кДНК. Каждый образец кДНК анализировали в триплетах. Все образцы, относящиеся к одной популяции клеток (SP клетки, смешанная популяция костного мозга, СБ34+-клетки) включали в одну реакцию (на одномпланшете). Все образцы клеток рыб анализировались для каждого гена в одной реакции на одном планшете.

Реакционная смесь К-ОТ-ПЦР кДНК образцов клеток рыб Danio rerio содержала 5 мкл 2 х SYBR Green Universal PCR Master Mix (для оценки экспрессии генов-мишеней) или 0.5 мкл 2 х TaqMans Gene Expression Assays и 5 мкл 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (для определения экспрессии 18S), по 300 нМ (по 0.25 мкл) каждого праймера, 2 мкл кДНК и дистиллированную воду до конечного объема 10 мкл.

Стандартные кривые, полученные в результате анализа образцов контрольной кДНК использовали для оценки качества и эффективности проведенной реакции и для определения относительного количества каждого из тестируемых образцов. Величина наклона стандартных кривых составляла -3.1 - -3.3, что подтвердило эффективность поставленных К-ОТ-ПЦР.

Обработка данных и статистический анализНормализация данныхАнализ результатов реакций К-ОТ-ПЦР проводили с использованием метода калибровочных кривых. Стандартные кривые, построенные по данным показателей разведений контрольных РНК, использовали для вычисления экспрессии генов [Bender J. G., et al., 1992, Bustin S., 2002]. Такой метод позволял стандартизировать данные, полученнные при анализе генов в разных К-ОТ-ПЦР (на разных планшетах). В хронобиологических экспериментах для уменьшения неточности вычислений экспрессии генов при нормализации данных вместо одного контрольного гена (эндогенного контроля) использовали среднюю геометрическую величину от трех (мышиные клетки) или четырех (человеческие клетки) генов, выбранных вкачестве эндогенного контроля [Уапёезошре1е I., е1 а1., 2002]. При этом экспрессию каждого из контрольных генов определяли как среднюю от показателей триплетов, полученных в отдельной К-ОТ-ПЦР. Экспрессия тестируемых генов определялась путем деления средней величины экспресии гена в триплетах (количество определялось по данным стандартных кривых) на среднюю геометрическую величину экспресии трех или четырех эндогенных контролей. В остальных экспериментах экспрессия генов определялась таким же методом, но в качестве величины эндогенного контроля использовалась средняя величина (значений в триплетах) экспрессии одного контрольного гена - 36В4 в опытах с кроветворными клетками и клетками печени мышей, и 18Б - в опытах с клетками рыб.

В каждой серии экспериментов на основании данных экспресии всех образцов, предварительно нормализованных к экспрессии эндогенных контролей (как описано выше), вычисляли среднюю величину экспрессии отдельного гена. Эту величину принимали за 100 %, и относительно этой величины в процентах выражали экспрессию каждого отдельного образца -относительный уровень экспрессии гена, или точнее - мРНК. Данные, соответствующие определенному времени забора клеток (СТ) в разных сериях экспериментов, объединялись для окончательного статистического анализа, т. е. при анализе хронобиологических экспериментов на мышах объединялись 3 значения, а у доноров - 10 значений. Кроме того, определяли стандартную ошибку средней (± 8ЕМ).

Изменения концентрации гормонов и количества клеток крови также выражали в процентах от средней величины всех значений этих показателей (принятой за 100 %) в данной серии экспериментов.

Статистическая обработка результатовВ хронологических экспериментах на мышах и у доноров для выявления суточных ритмов данные изменения температуры тела, концентраций/Icroplias«ipesK of fitted towne) ->i• 'Amplitude(tfiSiSrt« from Щ50Г to peak or trough of cosine)/II11 lllVpliaS*ffoiresi poinf ofco5i'ieJBpst-fming cosine curve by least-squares methodIWiud ofBesl-Шпд Conn« f« 36Q'jHlcnp/Kfistera0306 Oil 12 15 18 TIME <e.g. Local Clock Hour)-1— 12Awaked Activity——iT15Moan(tfntfimefie eve rag»)Mes or(ib ythmadiusled avarao» « nuddte of fitted coainejI2124Рис. 4. Основные характеристики ритма, которые получают при косинор-анализе данных. Рисунок Robert В. Sothern, публикуется с его разрешения.гормонов и экспрессии генов в исследуемых клетках обрабатывались методом косинор-аиализа (single cosinor), используя программу Chronolab [Mojon A., et al., 1992]. Этот метод, основанный на приближении временного ряда определенного периода (24 ч в наших экспериментах) косинусоидой (Рис. 4), позволяет оценить ритм по нескольким основным критериям [Bjarnason G. A., et al., 2001, Nelson W., et al., 1979, Емельянов И. П., 1976, Комаров Ф. И., Рапопорт С. И., 2000, Смирнов К. М, 1980, Сорокин А. А., 1981, Хетагурова JI. Г., 2000]. Наиболее значимыми параметрами, выбранными для оценки ритмов, являлись (Рис. 4): 1) значение уровня значимости р; 2) двойная амплитуда (2А), %, отражающая интенсивность колебаний - разницу между пиком и спадом на кривой, и 3) акрофаза, момент времени (часы и минуты), когда колебание достигает своего максимального значения - высшей точке на кривой [Rjarnason G. A., et al., 2001. Koukkari W. L., Sothern R. BM 2006, Tsinkalovsky O., et al., 2006, Tsinkalovsky O., et aLt2007, Ефимов M. Л. и др., 1985, Казначеев В. П. и др., 1978, Карп В. П., Катинас Г. С., 1997, Комаров Ф. И., Рапопорт С. И., 2000, Чиркова Э. Н. и др., 1990]. Кроме того, каждая серия данных подвергалась однофакторному дисперсионному анализу (one-way ANOVA) [Bjarnason G. A., et al., 2001, Koukkari W. L., Sothern R. В., 2006, Tsinkalovsky O., et al., 2006, Tsinkalovsky O., et al., 2007].

В остальных экспериментах вычислялся t-критерий Стьюдента с помощью программы GraphPad Prism, версия 3 (GraphPad Software, San Diego, CA). Эту же программу использовали для построения части графиков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

1. Методический подход, сочетающий использование высокоскоростной проточно-цитометрической сортировки и методы молекулярной биологии, позволяет изучать внутриклеточные суточные ритмы в редких популяциях кроветворных стволовых клеток. Этот подход также успешно использован для изучения кроветворных стволовых клеток рыб Danio rerio.

2. Впервые определена экспрессия ключевых clock генов и изучены изменения активности этих генов в течение суток в стволовых клетках в сравнение с общей популяцией клеток костного мозга. В этих популяциях выявлены различия в относительных уровнях экспрессии генов, наиболее выраженные для mPerl и mCryl.

3. Показано, что в отличие от клеток общей популяции костного мозга мышей в стволовых кроветворных клетках отсутствуют суточные ритмы в колебаниях активности большинства clock генов (кроме тРег2). Выявленные различия позволяют предположить, что регуляция ритмов в кроветворной ткани зависит от степени зрелости клеток.

4. Впервые определена активность ключевых clock генов в общей популяции клеток костного мозга человека и в изолированной популяции стволовых клеток и клеток-предшественников.

5. В кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека впервые выявлены достоверные суточные ритмы в изменение активности hPerl, hPer2 и hCry2.

6. Отсутствие циркадных ритмов в изменениях экспрессии В mall в течение суток в разных популяциях кроветворных клетках мышей и человека, позволяет считать, что изменение активности этого гена в кроветворной ткани в отличие от других периферических тканей и органов происходит неритмично.

7. Формирование и регуляция ритмов в кроветворной ткани млекопитающих имеют характерные отличия от других периферических тканей и органов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы благодаря успехам молекулярной биологии удалось охарактеризовать систему формирования циркадных ритмов на внуриклеточном (молекулярном) уровне. Clock гены, являющиеся основными компонентами этой системы, были описаны не только в центральном осцилляторе - нейронах СХЯ гипоталамуса, но и в клетках многих периферических тканей и органов. Более того, накопилось большое количество данных, свидетельствующих об участии периферических часов в адаптационных реакциях организма посредством регуляции его многих жизненно важных функций.

Вместе с тем, не во всех периферических тканях и функциональных системах организма процессы регуляции циркадных ритмов изучены одинаково хорошо. Так, несмотря на наличие достаточного количества фактов, свидетельствующих о том, что процесс гемопоэза происходит ритмично, система координации ритмов в кроветворной ткани, в иммунной, системе изучена крайне мало. До сих пор не исследовались кроветворные и иммунные клетки человека, отсутствовали данные о процессах формирования ритмов в стволовых клетках. Представленная работа, относящаяся к двум наукам - иммунологии и хронобиологии, планировалась для восполнения этих пробелов, и этим определяется ее актуальность. Целью данного диссертационного исследования явилось изучение clock генов в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга мышей и чнловека.

Научные задачи работы можно обобщить в две основные группы: (1) определить экспрессию clock генов в кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках мышей и человека и (2) изучить изменение активности clock генов в течение суток в стволовых клетках и клеткахпредшественниках костного мозга мышей и человека. Однако, для выполнения указанных задач прежде всего было нужно найти решение методологической задачи — разработать адекватный современный методический подход для изучения clock генов в очищенных популяциях стволовых клеток. Эту задачу удалось решить, объединив два современных метода — высокоскоростной проточно-цитометрической сортировки и К-ОТ-ПЦР (в режиме реального времени). Результаты тестовых экспериментов на кроветворных клетках мышей показали, что сортировка не вызывает изменения качества выделяемой РНК, не влияет на экспрессию тестируемых генов (clock генов) и не отражается на способности клеток костного мозга образовывать колонии клеток in vitro. Более того, разработанный методический подход был апробирован на кроветворных клетках рыб Danio rerio, что позволило впервые описать стволовые клетки у данного вида. Внедрение методики в нескольких лабораториях и ее успешное использование для анализа редких популяций стволовых клеток и клеток-предшественников, подтверждает ее универсальность.

Использование данного подхода позволило прежде всего определить экспрессию ключевых clock генов в разных популяциях кроветворных клеткок: стволовых клетках и клетках смешаной популяции костного мозга, включающей клетки, находящиеся на разной стадии дифференцирови, и зрелые клетки, в том числе клетки иммунной системы. Были выявлены различия в относительном уровне экспрессии clock генов как между тестируемыми популяциями кроветворных клекок (в частности, mPerl у мышей и hBmall у человека), так и между клетками разных видов (человека и мышей).

Впервые были изучены суточные изменения активности clock генов в кроветворных стволовых клетках мышей в сравнении со смешаной популяцией клеток костного мозга. В противоположность более зрелым клеткам в стволовых клетках циркадные ритмы в изменении экспрессии большинства тестируемых генов (кроме mPerl) отсутствовали. Полученные в этих экспериментах данные подтвердили гипотезу о том, что формирование ритмов в кроветворной ткани зависит от степени дифференцировки клеток.

В представленном диссертационном исследовании впервые проведена оценка экспрессии основных clock генов в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека. При изучении изменении активности clock генов были выявлены циркадные ритмы в трех ключевых генах. Полученные результаты свидетельствуют о наличие молекулярных механизмов регуляции циркадных ритмов в системе кроветворения у человека, которые могут быть использованы для регуляции гемопоэза с лечебной целью в клинической онкологии, гематологии и иммунологии.

Эсперименты на клетках костного мозга мышей и человека показали, что изменение активности одного из ключевых clock генов Bmall, играющего ключевую роль в формировании циркадных ритмов во многих периферических тканях, в кроветворных клетках происходят неритмично. Интересно отметить, что отсутствие циркадных ритмов в изменении активности этого гена было выявлено во всех тестируемых популяциях кроветворных клеток — от стволовых до дифференцированных и зрелых клеток, то есть на всех этапах гемопоза. Полученные данные указывают на то, что система формирования ритмов в кроветворной ткани отличается от других периферических тканей и органов. Можно предположить, что выявленные особенности регуляции циркадных ритмов в клетках костного мозга связаны с их специальной функцией - гемопоэзом.

Таким образом, полученные в исследовании данные позволяют сформировать представление о молекулярных основах формирования ритмов в кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках мышей и человека и обосновывают возможность разработки хронобиологически-обоснованной регуляции гемопоэза для терапевтических целей.