Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Биологические свойства гемопоэтических стволовых клеток в трансплантационном материале из различных источников

ИБРАГИМОВ РЕВАН ШАХРАЗ ОГЛЫ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ТРАНСПЛАНТАЦИОННОМ МАТЕРИАЛЕ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

14.01.21 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

15 АВГ 2013

Москва -2013

005532089

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Румянцев Сергей Александрович

доктор биологических наук Осипова Елена Юрьевна

Официальные опноненты:

Директор Института детской гематологии и трансплантологии им. Р.М.Горбачевой Ст-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П.Павлова

доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Борис Владимирович

заведующий отделением ТГСК№1 ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России

доктор медицинских наук Балашов Дмитрий Николаевич

Ведущее учреждение: ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России

Защита диссертации состоится г. в 12 часов на заседании

(У

диссертационного совета Д 208.050.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологииим Дмитрия Рогачева» Минздрава России (117198, Москва, ул. Саморы Машела д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России и на сайте www.niidg.ru. ^

Автореферат разослан « ' »

¿¿¿оил 2013 года

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

В.М.Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Трансплантация аллогенных гемопоэтическнх стволовых клеток (ГСК) является важным компонентом терапнн при многих гематологических заболеваниях, врожденных нарушениях иммунной системы, наследственных анемиях, некоторых болезнях обмена и злокачественных новообразованиях (Thomas E.D., 1990; Афанасьев Б.В. и соавт. 1994; Bensinger W. et al., 1995; Schmitz N. et al., 1995; Савченко В.Г. и соавт. 1996; Румянцев А.Г., 1996; Птушкин В.В., 1997; Rubinstein Р., 1999; Gluckman Е., 2004). Успех трансплантации во многом зависит от достаточного количества ГСК и их биологических свойств, поэтому, важным вопросом при применении ПК в клинике является оценка трансплантата, в основе которой лежит определение количества и жизнеспособности ГСК, содержащихся в трансплантационном материале (BendeT J.G., 1994; Gonzalez В.Е., 1997; Traineau R„ 1998; Allan D.S., 2002; Cotta S.V. et al., 2002; Marino M.P. et al., 2002).

В течение последних 10 лет в качестве источника гемопоэтическнх стволовых клеток все чаще используют мобилизованную при помощи Г-КСФ периферическую кровь (Bensinger W. et al., 1995; Schmitz N. et al., 1995; Масчан A.A., 1995; Афанасьев Б.В. и соавт. 1996; Савченко В.Г. и соавт. 1996); в связи с чем, важно определить условия и механизмы воздействия Г-КСФ на систему гемопоэза, для получения наиболее эффективного трансплантационного материала (Asano S., 1991; Welte К,, et al., 1996; Kronenwett R., et al., 2000; Cutler С., et al., 2001; Maianski NA., et al., 2002).

Использование различных источников ГСК для трансплантации, а также использование множества технологических приемов для получения непосредственного трансплантационного материала из ПК и периферической крови требует тщательного описания и сравнения клеточного состава и характеристик ГСК в различных источниках и определение факторов, оказывающих на них влияние.

Таким образом, решение указанных вопросов позволит оптимизировать технологии заготовки, процессинга и модификации ГСК ПК и периферической крови для клинического использования.

Цель исследования:

Определить биологические свойства гемопоэтическнх стволовых клеток в трансплантационном материале из пуповинной, периферической крови и костного мозга.

Задачи исследования:

1. Определить количество коммитированных предшественников различных линий гемопоэза в периферической крови после мобилизации Г-КСФ и в трансплантационном материале мобилизованной периферической крови, в пуповинной крови и в материале ПК после прохождения процедуры лейкоконцентрации и в костном мозге.

2. Определить жизнеспособность предшественников различных линий гемопоэза в различных источниках.

3. Определить экспрессию факторов, способствующих реализации хоуминг-эффекта гемопоэтическими стволовыми клетками из различных источников.

4. Изучить профиль генов регулирующих пролиферацию и апоптоз в С034+клетках из разных источников.

5. Определить клинические особенности трансплантации гемопоэтических стволовых клеток из различных источников.

Научная новизна

Трансплантационный материал ПК содержит около 11х10б С034*к.1еток, что меньше, чем в Г-КСФ мобилизованной периферической крови здоровых доноров (104х10б С034+клеток); однако популяция ГСК ПК содержит статистически значимо большее количество более ранних СШ 33+ предшественников гемопоэза, мезенхимальных и эндотелиальных клеток-предшественников, по сравнению с трансплантационным материалом, полученным из мобилизованной Г-КСФ периферической крови (р<0,0001)

Условием получения наиболее эффективного трансплантационного материала служат обоснованные стандарты сбора и количественной и качественной оценки материала при помощи автоматического анализатора клеток крови, учитывающего наличие нормобластов, определение количества и состава ГСК с учетом количества С034+, СЭ133+, СЭЗ+, С016+56+ клеток, определения эффективности клонирования в 14 суточной культуре в метилцеллюлозе с учетом КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э, уровня спонтанного апоптоза (Р1+/Аппехт У+клетки).

Практическое значение Произведена оценка трансплантационного материала, полученного из периферической крови, мобилизованной Г-КСФ. При использовании препаратов Г-КСФ в периферической крови увеличивается количество всех субпопуляций лейкоцитов. Эффект мобилизующего действия Г-КСФ зависит от количества нейтрофилов перед началом мобилизации и связан со степенью повышения концентрации в сыворотке крови 1Ь 8 и ММР-9.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в работу ФГБУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им Дмитрия Рогачева Минздрава России, ФГБУ Российская детская клиническая больница Минздрава России. Основные положения и выводы диссертации используются в подготовке специалистов гематологов, онкологов и иммунологов на кафедре онкологии и лучевой терапии Педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Результаты работы доложены на X Съезде педиатров России, Москва, в феврале 2006, и Российском Съезде гематологов и трансфузиологов. Москва, в апреле 2006, Всероссийской конференции РНОИ, Курск, в мае 2006, Российском конгрессе «Новые технологии в перинатологии». Москва, в ноябре 2006, XII Съезде педиатров России, Москва, в феврале 2008, IV Всероссийском Съезде специалистов перинатальной медицины, Москва, в сентябре 2009.

Апробация диссертации

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников клинических и лабораторных отделов ФГБУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, кафедры онкологии и лучевой терапии Педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова, ФГБУ Российской детской клинической больницы Минздрава России 18 февраля 2013 г.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен в одном томе на _ страницах машинописного

текста, содержит_таблицу и проиллюстрирован_рисунками. Указатель литературы

включает источника отечественной и - зарубежной литературы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России (директор ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева - академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Румянцев А.Г.), на базе лаборатории физиологии и патологии стволовых клеток (зав. - д.б.н. Осипова Е Ю.) отдела молекулярной и экспериментальной медицины (зав. -д.м.н., профессор Румянцев С.А.)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Материалом исследования служили:

1. Пуповинная кровь 1095 доношенных новорожденных, родившихся на 37—41 неделе гестации (медиана составила 40 недель) в ЦПСиР ДЗ г. Москвы (гл. врач - д.м.н., проф. Курцер М.А.) и Родильном доме №10 Управления здравоохранения ЮЗАО г. Москвы (гл. врач - Оземковская Е.П.) за период с 2003 по 2008 год.

2. Концентрат ПК (п=1095), полученный при помощи седиментации эритроцитов раствором гидроксиэтшткрахмала (НЕ8) в ГУЗ «Банк стволовых клеток» ДЗ г. Москвы за период с 2003 по 2008 год.

3. Кровь и костный мозг 45 детей с различными онкологическими и онкогематологическими заболеваниями в стадии ремиссии, находившихся на лечении в клинике НИИ Детской гематологии МЗ РФ далее в ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Росздрава с 2000 по 2006 год. Из них 19 пациентов получали препараты Г-КСФ с целью мобилизации С034+клсюк в периферическую кровь для сбора и последующей аутологичной трансплантации, а 26 - с целью восстановления количества гранулоцитов при развитии медикаментозной цитопении.

4. Кровь 15 здоровых доноров ГСК, которые получали препараты Г-КСФ с целью мобилизации С034+клеток в периферическую кровь для сбора и последующей аллогенной трансплантации в ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Росздрава.

Получение пупоеинной крови Пуповинную кровь получали при физиологических и оперативных родах доношенных новорожденных (37^11 недель гестации (медиана - 40 недель)) с учетом информированного согласия матери и отсутствия стандартных противопоказаний. После пережатия и пересечения пуповины, производили пункцию сосудов пуповины специальной системой для забора ПК, содержащей 35,5 мл антикоагулянта СРЭА. Сбор крови осуществляли в течение 2-15 минут после родов (менее 5 минут — 847 случаев (84,4%), от 5 до 10 минут — 89 случаев (8,7%) и более 10 минут - 68 (6,9%)), до отделения плаценты (п=993 (98,5%)). В случае сбора крови после отделения плаценты (п=15 (1,5%)), плацента помещалась в специальную стерильную стойку и проводилась аналогичная процедура сбора ПК. Полученный материал хранили в темном месте при комнатной температуре и подвергали анализу не позднее 18 часов после процедуры сбора ПК.

Процедура выделения стволовых клеток Выделение клеточного концентрата, содержащего стволовые клетки, проводилось в асептических условиях, в «чистом» помещении класса Э двумя методами: методом

двойного центрифугирования и аппаратным методом с помощью аппарата «Sepax SI00», Biosafe, Switzerland (539 и 554 образца, соответственно). Все обработанные образцы были подвергнуты криокопсервации в роботизированном криокомплексе "BioArchive®", ThermoGenesis, USA. Непосредственно перед криоконсервацией, в каждый образец добавлялся криопротектор DMSO в смеси с декстраном-40 в количестве 20% от объема конечного продукта для предотвращения разрушения клеток концентрата ПК под воздействием сверхнизких температур.

Определение клеточного состава пуповинной крови Подсчет клеток крови производился двумя методами:

• все 1095 образцов ПК были подвергнуты анализу автоматическим счетчиком клеток крови АВХ Pentra 60 С+ в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров;

• для точной морфологической характеристики клеток ПК использовали мазки ПК, окрашенные по методу Паппенгейма-Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда и краской Романовского);

Количество нормобластов определяли при подсчете лейкоцитарной формулы на 200 последовательно встречающихся лейкоцитов с дальнейшим пересчетом на 100 (нормобласты/100 лейкоцитов).

Коррекция результатов автоматического анализа пуповинной крови Степень разведения образцов ПК антикоагулянтом была различна и зависела от объема собранной крови. Объем антикоагулянта в системе постоянный и составляет 35,5 мл, объем собранной крови колебался в пределах от 20,0 до 170,0 мл. Пересчет результатов автоматического анализа крови проводился с учетом степени разведения каждого образца для каждого показателя.

Определение количества субпопуляций лейкоцитов и стволовых клеток Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток определяли по экспрессии мембранных маркеров (CD - clusters of differentiation) в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD3, CD4, CD8, CD13, CD 14, CD16, CD19, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD56, CD61, CD62L, CD62E, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, HLA-DR «Becton Dickinson», США при помощи проточной цитометрии на приборе FACSCalibur «Becton Dickinson», США.

Определение колониеобразующей активности

Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции ПК определяли культивированием в течение 14 суток в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащая

факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества KOE-mix, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.

• Эффективность клонирования (ЭК) определяли как общее число КОЕ на 1х105 эксплантированных клеток.

• Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл ПК, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

Определение уровня спонтанного апоптоза и некроза клеток ПК

Исследование уровня некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов ПК проводили при помощи проточной цитофлюориметрии двумя методами: определение количества клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК при окрашивании Propidiura iodid (PI), и определение числа локусов связывания мембранного фосфатидил-серина в реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием Annexin V FITC ("Phar Mingen"), согласно инструкциям производителей.

Результаты реакции анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur ("Becton Dickinson", США). Обработку полученных данных производили при помощи программы WinMDI 2.8 for Windows. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов клеток ПК определяли как сумму PI+/Annexin V+ и РГ/Annexin V+ клеток, а уровень некроза, как количество Pl+/Annexin V клеток.

Получение CD34+ клеток периферической крови

Периферические С034+клстки получали с помощью процедуры цитафереза на гемосепараторе «Baxter CS-3000 Plus». Мононуклеарную фракцию клеток крови выделяли на градиенте гравитации. Процедуры цитафереза после периода мобилизации проводили ежедневно до тех пор, пока суммарное количество С034+клеток не достигало уровня, обеспечивающего наиболее быстрое приживление трансплантата.

Минимально допустимым количеством СБ34+клеток для трансплантации считали их число более 2х106/кг массы реципиента. Оптимальным считали количество С034+клеток более 5х106/кг массы тела реципиента. Для достижения такого уровня требовалось различное число процедур цитафереза (от 1 до 4). Ежедневное введение препаратов Г-КСФ продолжали и в дни проведения сеансов цитафереза.

Определение концентрации цитокинов и ферментов в сыворотке крови Для количественного определения концентрации G-CSF, IL-8, ММР-9, ММР-2, TIMP-1, TIMP-2 в сыворотке крови проводилась реакция ИФА «сэндвич» типа. В качестве ферментных меток использовалась пероксидаза. В настоящем исследовании

использовались следующие наборы реагентов: «Human ММР-9 (total)», «Human/mouse MMP-2(total)», «Human TIMP-2» («Quantikine®» R&D Systems Inc., USA), «Human TIMP-1» (Biosource International Inc., USA), «Human IL-8 ELISA Kit II» (BD OptEIA™ BD Biosciences Pharmingen, USA).

Статистическая обработка

Статистическую обработку данных производили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STAT1STIKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Иммунологическая характеристика лейкоцитов ПК показала следующие значения количества субпопуляций лимфоцитов в ПК (табл. 1).

Количество С034+клеток в ПК определялось с помощью проточной цитометрии и оценивалось как 2 параметра: процент от общего количества лейкоцитов и абсолютное количество СОЭ4+клеток в 1 мл ПК. Всего было изучено 618 образцов ПК в которых получено в среднем 0,827 + 0,023 % С034+клеток.

В работе оценивалось количество CD34+CD133+ клеток, как наиболее ранних предшественников гемопоэза. Количество CD133+ клеток и их субпопуляций: CD133+CD31+ - эндотелиальные предшественники, CD133+CD106+ — мезенхимальные стволовые клетки. Оценивалось количество пролиферирующих гемопоэтических предшественников по уровню экспрессии трансферринового рецептора (CD71) (табл. 6,7).

Колониеобразующая активность ПК оценивалась как эффективность клонирования (на 105 MNC) и абсолютное количество в 1 мл ПК. Также подсчитывался процент колоний каждого вида от их общего количества. В ПК показано преобладание наиболее ранних гемопоэтических клеток-предшественников — KOE-mix - 35%.

В практике трансплантации ГСК принято ориентироваться на количество С034+клеток, как определяющее пригодность трансплантационного материала для обеспечения донорского гемопоэза у реципиента. Однако, популяция С034+клеток гетерогенна (табл. 2) и содержит большое количество более дифференцированных клеток, не обеспечивающих пролиферацию и экспансию у реципиента.

Таблица 1. Иммунологическая характеристика лейкоцитов ПК доношенных новорожденных (% от всех лейкоцитов) (п=62)

Субстрат Маркеры Параметры 3+ 19+ 4+ 3+4+ 8+ 3+8+ 45+14+ НЬА-ОЛ СШ6+56+

ПК Среднее значение 18,83 4,84 9,41 13,45 2,68 5,66 7,37 13,03 6,05

Стандартная ошибка среднего 0,96 0,26 1,15 0,74 0,22 0,36 0,49 0,58 0,69

ПК (концентрат) Среднее значение 21,01 5,72 9,08 14,76 3,28 5,82 8,75 17,34 8,54

Стандартная ошибка среднего 1,02 0,31 0,46 0,79 0,23 0,4 0,58 3,05 0,92

Р 0,12 0,032 0,79 0,23 0,06 0,77 0,07 0,17 0,034

Таблица 2. Субпопуляции С034+ клеток ПК доношенных новорожденных (п=47)

Субстрат Субпопуляцни СШ4 К.1ПОК Параметры 34+133+ 34+133~ 34+38~ 34~38+ 34*61" 34"61+ 34+71+ 34"71+ 34+62Ь+ 34+44+ 34+И7+

ПК Среднее значение 0,46 0,31 0,77 36,86 0,45 14,99 0,96 23,8 0,59 0,82 0,49

Стандартная ошибка среднего 0,05 0,02 0,09 1,38 0,06 1,26 0,1 0,24 0,06 0,07 0,05

ПК (концентрат) Среднее значение 0,44 0,56 0,74 35,64 0,42 16,43 0,79 22,12 0,61 0,9 0,46

Стандартная ошибка среднего 0,05 0,16 0,08 1,57 0,05 0,68 0,09 1,07 0,06 0,08 0,04

Р 0,78 0,124 0,8 0,56 0,7 0,32 0,2 0,13 0,81 0,46 0,64

Таблица 3. Субпопуляции СР133+ клеток ПК доношенных новорожденных (п=47)

Субпопуляции СП 133" клеток Параметры 133+106+ 133+106- 133"106+ 133+31+ 133"31+ 31+62Е+

ПК Среднее значение 0,48 0,25 0,28 0,88 75,15 1,65

Стандартная ошибка среднего 0,07 0,02 0,03 0,11 2,13 0,3

ПК (концентрат) Среднее значение 0,46 0,23 0,54 0,8 68,55 2,46

Стандартная ошибка среднего 0,06 0,02 0,07 0,08 2,59 0,57

Р 0,83 0,48 0,1 0,55 0,052 0,21

При оценке взаимосвязи количества СБ34+клеток и колониеобразующей активности ПК получена зависимость колониеобразующей активности от количества С034+клеток, но полученные связи достаточно слабые.

При определении ЭК (на 105 наблюдаются практически те же тенденции,

однако, связи более слабые.

Технологические манипуляции с ПК в процессе сбора и процессинга предполагают увеличение количества погибших клеток и уровня спонтанного апоптоза. который определяет популяцию клеток, определяющихся иммунологическими методами как СВ34+клетки. которые, однако, не могут учитываться как функционально активные ГСК. В работе определен уровень некроза и спонтанного апоптоза клеток ПК после всех процедур сбора и процессинга перед криоконсервацией. Показано, что уровень некроза лейкоцитов ПК составил 3,49±0,28 %, при этом, уровень некроза лимфоцитов был ниже значений всех лейкоцитов (2.99±0,34 %) и статистически значимо отличался от уровня некроза моноцитов и гранулоцитов, составлявшего 5,59±0,72 % и 6,12±0,65 % соответственно (/?<0,0001) (рис. 5). Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов составил 9.18±1.19 %, при этом, уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов, был также ниже значений в общей группе (4,32±0,7 %). и также статистически значимо отличался от уровня спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов, составившего 15,35±2.02 % и 28,22±2,51 % соответственно (р<0,0001) (рис. I) и не отличался от показателей периферической крови здоровых доноров.

30 25 20 15 10 5 О

Рисунок 1. Уровень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов ПК.

Такое соотношение показателей позволяет предположить большую жизнеспособность лимфоцитов, что представляется позитивным результатом, учитывая тот факт, что популяция гемопоэтических стволовых клеток находится в пуле лимфоцитов. Это предположение подтверждается положительной корреляционной взаимосвязью количества лимфоцитов и колониеобразующей активности ПК.

Некроз (%) Апоптоз (%)

■ Лимфоциты В Моноциты □ Гранулоциты

Уровень спонтанного апоптоза и пролиферативный потенциал - это противоположные процессы, поддерживающие стабильность клеточного состава, и, как следствие, нормальное функционирование любой биологической системы. Следовательно, эти процессы, при адекватной способности организма реагировать на внешние и внутренние раздражители, предположительно, должны быть однонаправленными, чтобы обеспечить компенсацию повышения гибели клеток биологическая система должна усилить процессы деления и созревания клеток, напротив, при повышенной пролиферации клеток, необходимо обеспечить их адекватное «умирание», чтобы клеточная масса не вышла из-под контроля. Мы изучили взаимосвязь уровня спонтанного апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активности клеток ПК, и оказалось, что отмечается положительная корреляционная взаимосвязь между уровнем спонтанного апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активностью ПК, что доказывает однонаправленность процессов апоптоза и пролиферации.

В работе обнаружены различия клеточного состава ПК в зависимости от пола и массы тела новорожденного, совпадающие с данными литературы (Cairo M.S., 2005; Aravita S., 2005). Результаты исследования количества клеток и их основных параметров при помощи автоматического гематологического анализатора проанализированы в ПК 1004 доношенных новорожденных. При анализе половых различий отмечено, что у девочек уровень лейкоцитов выше (17,74±0,24х10%; М±гп), чем у мальчиков (16,8±0,23хх109/л; р=0,005). Преимущественно за счет нейтрофилов, которых у девочек больше, а лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов меньше. В абсолютных количествах у девочек также больше нейтрофилов, а меньше эозинофилов.

Количество эритроцитов (4,33±0,02х10|2/л) и содержание гемоглобина (155,1±0,7 г/л) у девочек меньше, чем у мальчиков (4,46±0,02х10|2/л; 159,5±0,6 г/л; /><0,0001). Гематокрит у девочек (31,79±0,2 %) также меньше, чем у мальчиков (32,76±0,19 %; р=0). Различий в эритроцитарных индексах (MCV, МСН, МСНС, RDW) в зависимости от пола новорожденного не обнаружено. Количество тромбоцитов у девочек (314,87±2,98х109/л) больше, чем у мальчиков (300,72±2,62x10%; /><0,0001). Средний размер тромбоцитов не имеет различий. Из 611 новорожденных, для которых были получены данные относительно количества С034+клеток в ПК, мальчиков было 314 (51,39%), девочек - 297 (48,61%). При сравнении полученных результатов выявлено, что у мальчиков CD34+KiieTOK больше в процентном (0,88±0,03 - мальчики; 0,77±0,03 - девочки; />=0,01) и в абсолютном количестве (0,106±0,005 - мальчики; 0,095±0,005 - девочки; р=0,002) (табл. 4).

Таблица 4. Количество СОЭ4+клеток в ПК доношенных новорожденных мальчиков

и девочек

Пол ребенка Параметры CD34 (%) CD34 (IOVmm»)

Девочки Количество наблюдений 297 297

М± m 0,769 ± 0,032 0,095 ± 0,005

Мальчики Количество наблюдений 314 314

М±ш 0,883 ± 0,032 0,106 ±0,005

Р 0,01 0,002

При анализе данных колониеобразующей активности ПК выявлено, что у мальчиков статистически значимо больше количество КОЕ-ГМ в 1 мл ПК (745,71±65,11 — девочки; 1216,7±185,45 - мальчики; р=0,022), и имеется тенденция к увеличению (статистически незначимо) количества КОЕ-М (691,64±78,6 - девочки; 1052,1±252,09 - мальчики; р=0,19) и общего количества колоний (4883,13±455 - девочки; 6070,8±691 - мальчики; /5=0,16) в 1 мл образца ПК. При анализе эффективности клонирования (на 105 MNC) у мальчиков также больше КОЕ-Г (18,44±1,31 - девочки; 22,42±1,6 - мальчики; р=0.058). В процентном соотношении имеется тенденция к увеличению количества КОЕ-mix (р=0,11) у девочек, и уменьшению у них КОЕ-ГМ (р=0,13) и КОЕ-Э (/5=0,14).

Связь клеточного состава с массой тела новорожденного очень слабая: статистически значимая положительная корреляция с массой тела ребенка обнаружена для нейтрофилов (1=0,12; /1=0,0002), эозинофилов (г=0,14; /5=0,0001), базофилов (г=0,12; /5=0,0002) и гематокрита (г=0,2; /><0,0001). Все новорожденные были разделены на группы согласно массе тела при рождении: <2500 г; 2500-3000 г; 3000-4000 г и >4000 г. При сравнении полученных данных отмечено, что с увеличением массы тела ребенка при рождении увеличивается количество лейкоцитов - от 15,52±0,59х109/л в группе с массой тела 2,5-3 кг до 17,51±0,44x10% в группе с массой тела >4 кг (/5=0.01). Также увеличивается абсолютное количество нейтрофилов и эозинофилов (/><0,0001 и />=0,004, соответственно), а количество моноцитов уменьшается (/><0,0001). В процентном соотношении у детей с большей массой тела нейтрофилов и эозинофилов больше, а лимфоцитов и моноцитов меньше. Концентрация гемоглобина и количество эритроцитов не менялись в зависимости от массы тела ребенка при рождении. Отмечено увеличение гематокрита с увеличением массы тела ребенка (от 28,48±2,47% при массе тела <2,5 кг до 33.86±0,39 % при массе тела >4 кг; /><0,0001). Отмечено также уменьшение МСНС (р<0,0001) и увеличение MPV (/>=0,025) с увеличением веса ребенка.

Можно предположить, что выявленные различия клеточного состава ПК в зависимости от пола новорожденного связаны с тем, что новорожденные мальчики крупнее новорожденных девочек. Действительно, средняя масса тела при рождении была

несколько выше у мальчиков (3629,24±18,25г; диапазон 2270-5000г), чем у девочек (3467,23±18,17г; диапазон 2300-4650г) (/?<0,0001). При разделении на группы по массе тела при рождении мальчиков было больше в группе с массой тела > 4000 г (р=0,001), а девочек в группе 2500-3000 г (/>=0,008). Однако, при исследовании групп сходных по массе тела при рождении, различия в параметрах крови между мальчиками и девочками сохранялись. Таким образом, различия в клеточном составе ПК в зависимости от пола не могут быть объяснены различной массой тела мальчиков и девочек при рождении.

Сравнительная характеристика клеточного состава ПК и Г-КСФ мобилизованной

периферической крови Известно, что ПК не может отождествляться с кровью новорожденного даже в первые часы жизни, поскольку особенности клеточного состава ПК являются бьгстропроходящими последствиями родового стресса, а сыворотка ПК обладает выраженной цитокиновой активностью (Bailie К.Е., et al„ 1994). Учитывая тот факт, что состав мобилизованной при помощи препаратов Г-КСФ крови в значительной степени отличается от физиологического состояния, что обусловлено действием множества вторичных посредников, многие из которых являются также естественными эффекторами стрессового состояния, представляется интересным сравнить клеточный состав ПК с кровью доноров после применения препаратов Г-КСФ. Сравнение клеточного состава ПК и крови доноров показало, что Г-КСФ мобилизованная периферическая кровь содержит статистически значимо большее количество лейкоцитов за счет статистически значимого большего количества нейтрофилов (табл. 5), в то время как количество эозинофилов и базофилов не различается, а количество лимфоцитов, напротив больше в ПК.

Таблица 5. Клеточный состав Г-КСФ мобилизованной н ПК (х109/л)

Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ Р

п=1013 п=23

Лейкоциты 17,24±0,16 32,8±2,2 <0,0001

Нейтрофилы 8,41 ±0,1 27,6±2,0 <0,0001

Лимфоциты 5,54±0,06 2,9±0,4 <0,0001

Моноциты 2,42±0,03 2,2±0,4 0,28

Эозинофилы 0,64±0,01 1,2±0.21 <0,0001

Базофилы 0,23±0,01 0,17±0,04 0,37

Мобилизованная при помощи Г-КСФ периферическая кровь содержит больше СОЗ+лимфоцитов и меньше СБ16+С056+ (ЫК) клеток (табл. 6).

Если рассматривать ПК с точки зрения идентичного механизма мобилизации при помощи того же набора цитокинов, концентрация которых в ПК повышается в ответ на

Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ Р

п=62 п=15

Доля (%) от лимфоцитов

СОЗ+ 56.03±1,67 67.8±3.04 0,002

СОЗ+СБ4+ 39,44±1,4 48,76±2,76 0,004

СЭЗ+С08+ 15,65±0,81 19,27±2,07 0,065

СЭ19+ 14.61±0,62 17,87±3.33 0,115

СБ16+С056+ 13,85±1,83 8,62±0,96 0,169

Абсолютное количество (х106/мл)

СРЗ' 2,07±0,15 2,94±0,08 0,002

СЭ19+ 0.55±0,06 0.56±0,05 0,928

СЭЗ+С04+ 1,44±0,1 1,89±0,07 0,016

СЭЗ+С08+ 0,68±0,07 0,78±0,08 0,453

СШ6+СБ56+ 0,76±0,11 0.36±0.05 0,048

родовой стресс, то, вероятно, такая картина может натолкнуть на мысль, что терапевтическая концентрация Г-КСФ в периферической крови выше, чем в пуповинной и, соответственно, выше уровень остальных цитокинов, участвующих в процессе мобилизации. Тем не менее, количество СЭ34+клеток в Г-КСФ мобилизованной крови статистически значимо ниже, чем в ПК, за счет всех исследованных субпопуляций (табл. 7), что дает возможность предположить, что аналог мобилизации в процессе родового стресса является не единственной причиной повышенного количества С034+клеток в ПК. Это предположение отчасти подтверждается тем, что эффективность клонирования Г-КСФ мобилизованной периферической крови также ниже, чем в ПК, а ГСК, в основном, представлены гранулоцитарно-макрофагальными предшественниками (табл. 8).

Уровень спонтанного апоптоза клеток Г-КСФ мобилизованной крови и ПК статистически значимо не различался, имея, однако, тенденцию к значительному снижению в Г-КСФ мобилизованной крови (табл. 9). Этот факт может быть связан с тем, что ПК перед началом тестирования проходила определенные технологические этапы сбора и транспортировки в БСК, тогда как периферическую кровь у доноров тестировали сразу после сбора, а Г-КСФ, известный как мощный антиапоптотический фактор (РЫ1роИ Ш. Е( а1., 1997; Ма1апБк1 NA., сЧ а\., 2002), приводит к выбросу в циркуляцию наиболее жизнеспособных клеток. При этом уровень спонтанного апоптоза СЭ34+клеток, подавляющая часть которых (96,6±1,2 %) находится в О0 фазе клеточного цикла, был наиболее низким и не различался (табл. 9).

При сравнении уровня Г-КСФ в периферической крови и в ПК оказалось, что в ПК уровень Г-КСФ составляет 14,8±2,2 пг/мл (п=45), что не превышает нормальный уровень сывороточного Г-КСФ в периферической крови.

Таблица 7. Количество субпопуляцнн СБ34+ и С0133+клеток Г-КСФ мобилизованной крови н ПК___

Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ Р

11=47 п=15

Доля (%) от лимфоцитов

СОЭ4+СШЗЗ+ 0,46±0,05 0,09±0.036 <0,0001

С034+С0133" 0,31±0,02 0,12±0,031 <0,0001

С034+С038~ 0,77±0,09 0,19±0,042 <0,0001

С034+СЭ71+ 0,96±0,1 0.22±0.065 <0,0001

С034*С062Ь+ 0,59±0,06 0,15±0,045 <0,0001

С034+С044+ 0,82±0,07 0,26±0,068 <0,0001

С034+С0117+ 0,49±0,05 0,16±0.026 <0,0001

С034+СЭ61+ 0,45±0,058 0,16±0,53 0,356

С034"С038+ 0,77±0,086 0,31±0,086 0,006

С0133+СШ06+ 0,48±0,07 0.1±0,042 0,004

С0133+С03Г 0,88±0,11 0,7±0,24 0,45

Абсолютное количество /мкл

С034+С0133+ 59±7 3±0,9 <0,0001

СБ34+С061+ 58±8 5±1,1 <0,0001

СБ34+СЭ38+ 103±16 9±1 0,002

С034+СБ7Г 131±20 6±0,9 <0,0001

СШЗЗ+СОЮ6+ 58±8 3±0,9 <0,0001

С0133+С031 + 116±17 20±2 0,002

Таблица 8. Эффективность клонирования Г-КСФ мобилизованной крови и ПК

Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ р

п=226 п=15

ЭК (х 105 эксплантированных мононуклеарных клеток)

Суммарное количество 116,8±4,47 19,2±3,6 <0,0001

КОЕ-ГЕММ 41,95±2,2 1,3±0,6 <0,0001

КОЕ-ГМ 23,22±1,38 7,1±1,2 0,003

КОЕ-Г 20,44±1,04 4,6±0,6 <0,0001

КОЕ-М 15,93±1,14 3,8±0,6 0,007

КОЕ-Эр 15,28±1,26 2,0±0,5 0,007

Количество клеток-предшественников в 1 мл

Суммарное количество 5490,2±419,3 478,6±112 0,002

КОЕ-ГЕММ 1789±121,9 38±6 <0,0001

КОЕ-ГМ 1144±117,1 181±24 0,036

КОЕ-Г 988,8±101,9 114±21 0,028

КОЕ-М 875,7±136 94±18 0,141

КОЕ-Эр 692,8±76,4 46±11 0,03

Соотношение клеток-предшественников

КОЕ-ГЕММ 35,33±1,35 7,9±1,2 <0,0001

КОЕ-ГМ 19,28±0,75 37,8±4,7 <0,0001

КОЕ-Г 18,72±0,77 24,5±3,8 0,067

КОЕ-М 13,69±0,87 20,2±3,7 0,065

КОЕ-Э 12,99±0,88 10,6±2,9 0,495

Таблица 9. Уровень спонтанного апоптоза клеток Г-КСФ мобилизованной крови н

ПК

Параметр ПК Периферическая кровь после Г-КСФ Р

п=440 п=15

Апоптоз лейкоцитов (%) 9,18±1,19 3,4±0,6 0,387

Лимфоцитов 4,32±0,7 3,6±0,15 0,855

Моноцитов 15,35±2,02 3,8±0,72 0,309

Гранулоцитов 28,22±2,51 2,51±0,67 0,069

СР34+ клеток 2.12±0,09 2.74±0.56 0,229

При клиническом использовании препаратов Г-КСФ в дозе 5-10 мкг/кг в сутки в течение 5 суток, уровень сывороточного Г-КСФ в крови у доноров возрастает приблизительно в 1000 раз. Таким образом, уровень Г-КСФ в сыворотке ПК доношенных новорожденных не отличается от нормального уровня Г-КСФ в сыворотке здоровых доноров, что в сочетании с данными, свидетельствующими об увеличении количества лейкоцитов и С034+клеток в ПК при наличии ряда осложнений беременности и родов, а также физиологических состояний при нормальном течении родов, удлиняющих родовой стресс, позволяет предположить изменение уровня других цитокинов и ферментов, участвующих в Г-КСФ индуцированной мобилизации лейкоцитов и СБ34+клеток. При изучении уровня 1Ь-8 в сыворотке ПК и Г-КСФ мобилизованной периферической крови было показано, что статистически значимое повышение концентрации 11.-8 после применения Г-КСФ было отмечено на всех клинических моделях, независимо от степени угнетения кроветворения. При этом, концентрация 1Ь 8 в сыворотке ПК была статистически значимо выше, чем у здоровых доноров до применения Г-КСФ, но меньше, чем после его отмены (табл. 10).

Концентрация ММР-9 в сыворотке крови также статистически значимо повышается в результате использования Г-КСФ во всех исследованных клинических моделях, в то время как концентрация ММР-9 в сыворотке ПК не отличалась от таковой в крови здоровых доноров до начала использования Г-КСФ (табл. 11).

Таблица 10. Концентрация 1Ь-8 в сыворотке ПК и крови до и после применения Г-

КСФ

Исследуемые г руппы N Концентрация 1Ь 8 в сыворотке Р

До Г-КСФ После Г-КСФ

Здоровые доноры 6 6,07 ±0.39 47,0 ±6.18 0,022

Мобилизация ГСК у детей с онкогематологическими заболеваниями 10 108,15 ±44,72 569,0 ± 159,0 0,013

Лечение медикаментозной цитопении 21 485.0 ± 158,0 1113.0 ±250,0 0,040

Пуповинная кровь 45 19,83 ±4,93 0,039*

*-р — сравнение с уровнем здоровых доноров до применения Г-КСФ.

Таблица 11. Концентрация ММР-9 в сыворотке ПК п крови до и после применения

Г-КСФ

Исследуемые группы N Концентрация ММР-9 в сыворотке Р

До Г-КСФ После Г-КСФ

Здоровые доноры 6 225,4 ± 33,6 3333,8 ± 608,2 < 0,0001

Мобилизация ГСК у детей с онкогематологическими заболеваниями 5 175,0 ±79.7 819,4 ±254,7 0,043

Лечение медикаментозной цитопении 10 24,2 ± 7,7 826,5 ± 180,3 < 0,0001

Пуповинная кровь 45 182,4 ±23,7 0.521*

*-р — сравнение с уровнем здоровых доноров до применения Г-КСФ.

Такое соотношение концентрации мобилизующих цитокинов в сочетании с количеством С034+клеток в результате мобилизации и в ПК позволяет предположить, что хотя родовой стресс и позволяет объяснить многие тенденции в изменениях клеточного состава ПК в зависимости от ряда анте- и интранатальных факторов, но, вероятно, не является единственной причиной особенностей ПК.

Биологические свойства CD34* клеток пуповинной крови: сравнение с CD34* клетками зрелого костного мозга

Сначала мы сравнили экспрессию CD34+ в мононуклеарных клетках (МНК) пуповинной крови (ПК) и зрелого костного мозга (КМ). Как показано в таблице 1, доля клеток CD34+ была ниже среди МНК ПК, чем среди МНК зрелого КМ (Р < 0.01). Тем не менее, незрелая субпопуляция клеток CD34+, CD34+ CD34- и CD34+ CD38- была представлена в большей степени в ПК, чем в зрелом КМ (Р < 0.05). Эти результаты предполагают, что CD34+ популяция клеток ПК содержит большее количество незрелых клеток.

Далее мы провели клональное культивирование CD34+ клеток, выделенных из ПК и зрелого КМ. При культивации фактором стволовых клеток (ФСК), ИЛ-3, ИЛ-6, Г-КСФ, ГМ-КСФ и эритропоэтином, 5*102 CD34+ клеток ПК и 5><102 CD34+ клеток зрелого КМ продуцировали одинаковое количество ГМ-колоний (КМ: 71.7 ± 2.1. ПК: 84.3 ± 3.5), но количество Е взрывов, вызываемое CD34+ клетками ПК было незначительно больше, чем вызываемое CD34+ клетками зрелого КМ (КМ: 53.7 ± 2.5, ПК: 73.3 ± 6.1) (рис.2). Кроме того, CD34+ клетки ПК производят больше MIX колоний и колоний, получаемых из CD34+ клеток ПК было больше. Те же результаты были выявлены в 4 независимых исследованиях. Эти результаты далее поддержали предположение о том, что клеточные популяции CD34+ ПК содержат большее количество незрелых (первичных) гемопоэтических клеток.

Профиль генов CD34+wiemoK из различных источников

В этом исследовании мы изучали профиль экспрессии генов CD34+ стволовых клеток и клеток-предшественников с использованием с-DNA чипа, содержащего 1185 одиночных генов. Высоко обогащенные CD34+ клетки (чистота между 90% и 99%) у 18 доноров мы получали из костного мозга в спокойном состоянии (п=8) и из периферической крови после мобилизации Г-КСФ (п=10). После экстракции РНК, мы проводили обратную транскрипцию с гено-специфическими праймерами вместо случайных праймеров, что сильно увеличило чувствительность. Эти экспериментальные условия представлены измерением профиля экспрессии С034+клеток, полученных из одного образца. Наш метод избегает объединения образцов от различных доноров или амплификации cDNA, приводя к увеличению воспроизводимости и достоверности данных экспрессии генов. Кроме того, наши данные позволили сравнить экспрессию генов CD34+ клеток, полученных из нестимулированного костного мозга и циркулирующих CD34+ клеток. Мы описываем полученные данные генной экспресс™ путем деления генов на функциональные группы.

После двойной иммуномагнитной селекции С034+клеток, клетки окрашивали FITC-антителами и проводили проточную цитометрию. Результаты репрезентативного эксперимента представлены. (А) Клетки, окрашенные FlTC-конъюгированныеми, изотип-идентичными контрольными антителами (IgGi FITC). (В) Клетки, окрашенные FITC-конъюгированными CD34 антителами (CD34 FITC). Процент клеток выше пороговой интенсивности указан на обоих графиках.

Профиль экспрессии генов: CD34+wiemKu костно-мозгового происхождения против CD34+K/iemoK периферической крови.

Значительная часть генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, значительно выше экспрессирована в С034+клетках КМ, чем в циркулирующих С034+клетках, по оценке 92 генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, в том числе циклинов, киназ и ингибиторов киназ. Мы обнаружили, что экспрессия 9 генов, управляющих прогрессией клеточного цикла, значительно увеличена в 2-6 раз в CD34+ клетках КМ, по сравнению с С034+клетками ПК. С другой стороны, экспрессия ингибитора клеточного цикла р57 в 1,7 раза выше в СЭ34+клетках ПК, чем в С034+клетках КМ.

Кроме того, экспрессия генов, участвующих в ДНК синтезе, также значительно выше в С034+клетках КМ, чем в С034+клетках ПК. В деталях, экспрессия 11 из 66 исследованных генов, вовлеченных в синтез ДНК и репликацию, была значимо, в 1,4-2,7 раза выше в С034+клетках КМ, чем в С034+клетках ПК.

Фокусируясь на 79 генов, связанных с аиоптозом - таких как death-рецепторы и ассоциированные белки, death-киназы, каспазы и белки семейста bel - мы обнаружили экспрессию каспаз 3,4 и 8, death-ассоциированной протеин киназы 1 и дезоксирибонуклеазы II значимо в 2-3 раза выше в Г-КСФ-мобилизованных С034+клетках ПК, что свидетельствует о повышении уровня апоптоза по сравнению с С034+клетками КМ в спокойном состоянии (Рис. 2). В соответствии с этим, экспрессия антиапоптотической цитоплазматической антипротеиназы 2 бьша в 2,4 раза выше в С034+клетках КМ.

Мы проанализировали 134 гена, связанных с транскрипцией и обнаружили дифференциальную экспрессию 10 из них в С034+клетках КМ и ПК. Большинство было экспрессировано в 2-3 раза чаще в С034+клетках ПК, чем в С034+клетках КМ. Только уровень мРНК транскрипционного фактора E2F-1, который как известно инициирует вхождение в клеточный цикл, был значимо выше в С034+клетках КМ.

Экспрессия 12 из 68 исследованных генов, кодирующих молекулы клеточной поверхности, вовлеченные в прорцессы адгезии, бьша обнаружена на С034+клетках. Только экспрессия CD44 различалась - была в 2 раза выше на С034+клетках ПК, чем на С034+клетках КМ.

При исследовании экспрессии 150 гормонов, ростовых факторов, цитокинов, хемокинов и их рецепторов, мы обнаружили экспрессию 38 из них. Рецптор макрофагального колониестимулирующего фактора (М-КСФ-Р), хемокинового рецептора типа 4 (CXCR4) и протеина 2, связывающего инсулиноподобный фактор роста (insulinlike growth factor-binding protein 2) были в 2-3,4 раза выше экспрессированы на С034+клетках КМ, чем на С034+клетках ПК. С другой стороны, экспрессия рецептора тромбина (PARI) и интерлейкина-ip бьша в 3,3 и 1,8 раза выше на CD34+ клетках ПК.

Мы также исследовали различную экспрессию генов внутриклеточной сигнальной транедукции, членов киназной сети, внутриклеточных протеин фосфатаз, G-протеинов, аденилат-гианилат циклаз, диэстераз и протеиназ. Мы обнаружили, что экспрессия гена семейства В ras, тирозин киназы 1уп, гианилат циклазы р 1, протеин киназы С и тирозин киназы tec была увеличена на С034+клетках ПК по сравнению с С034+клетками КМ. И наоборот, экспрессия MAP киназа-активированной протеин киназы 2 бьша выше на С034+клетках КМ.

Экспрессия лейкоцитарной протеиназы 3 была выраженной на С034+клетках КМ, но она не определялась совсем на CD34+ клетках ПК. Наоборот, экспрессия соответствующего антагониста, ингибитора протеазы 2, бьша значимо снижена на С034+клетках КМ.

Подтверждение данных c-DNA чипа

Для подтверждения данных, полученных с помощью технологии eDNA чипов, мы проанализировали экспрессию 8 генов путем количественной обратно-транскриптазной ПЦР в реальном времени (RT-PCR) и флюоресцентного анализа клеточной сепарации и провели исследование апоптоза для проверки функционального влияния.

Количественная RT-PCR в реальном времени подтвердила, что лейкоцитарная протеиназа 3 (LP3) и убиквитин-протеин лигаза (UBCH10) более явно экспрессируются на СЭ34+клетках КМ, чем на С034+клетках ПК, тогда как DAPK1 и каспаза 4 экспрессируются больше на С034+клетках ПК.

Считая амплификационную эффективность 1,9, экспрессия LP3 и UBCH10 была в 44 и 6,6 раз выше в С034+клстках КМ, а экспрессия DAPK1 и каспазы 4 была в 4.3 и 3,8 раз выше в С034+клетках ПК. Мы также проанализировали различную экспрессию генов путем проточной цитометрии с флюоресцирующими моноклональными антителами, направленными против 4 различных поверхностных молекул - рецептора тромбина, CD44, CD114 (рецептор Г-КСФ) и CD126 (рецептор ИЛ-6 а). Рецептор тромбина и CD44 экспрессировались в 2,7 и 7,4 раза выше на С034+клетках ПК (р=0,03 и р=0,02), тогда как не обнаружено значимых различий для CD114 и CD126. Все эти данные соответствуют данным cDNA чипа.

Представлены кривые RT-PCR в реальном времени для 4 различных генов (лейкоцитарная протеиназа 3, убиквитин-протеин лигаза [UBCH10], DAPKIh каспаза 4) с соответствующим GAPDH контролем. Репрезентативные образцы С034+клеток КМ показаны слева, а репрезентативные образцы С034+клсток ПК - справа. Анализ каждого образца предпринят дважды. Показаны различия CPs (ДСР) и GAPDH мишеней. Чем меньше ДСР, тем выше относительное содержание м-РНК.

ВЫВОДЫ

1. Количество лимфоцитов больше в МПК (32,8 х 109/л), чем в ПК (17,2 х 109/л) и КМ (8,0 х 109/л) преимущественно за счет нейтрофилов - 84% в МПК, 48,7 в ПК и 70% в КМ. Однако, количество лимфоцитов выше в ПК, чем в МПК и КМ (5,54 х 10%, 2,9 х 109/л и 2,1 х 109/л) соответственно.

2. Доля СЭЗ+лимфоцитов, в том числе CD3+CD4+ и CD3+CD8+, и С019+лимфоцитов выше в МПК, тогда как доля CD16+CD56+-NK-icieTOK выше в ПК.

3. Количество мезенхимальных стволовых клеток (CD133+CD106+) и предшественников эндотелиоцитов (CD133+CD31+) в ПК и КМ не различалось и было статистически значимо ниже в МПК.

4. Количество С034+клеток максимально в единице объема ПК и минимально в МПК. Это соотношение отражает все субпопуляции СЭ34+клеток: CD34+CD133+, CD34+CD61+, CD34+CD38+, С034+СЭ71+клетки.

5. Колониеобразующая активность ГСК не различалась в КМ и ПК и была статистически значимо ниже в МПК, при этом количество смешанных колоний в МПК было также значительно ниже, чем в КМ и ПК.

6. Интенсивность экспрессии Г-КСФ-рецептора (CD114) не различалась у С034+клеток ПК и КМ и была значительно ниже у С034+клеток МПК. Интенсивность экспрессии рецептора фактора стволовых клеток (CD117) была выше в МПК и КМ по сравнению с ПК, а интенсивность экспрессии рецепторов к пролиферационным цитокинам - 11-3 (CD123) и 1L-6 (CD126) не различалась во всех трех источниках.

7. Интенсивность экспрессии основных факторов, обеспечивающих хоуминг-эффект ГСк — рецепторов СХСЯ4-группы и CD49d была значимо ниже у СЭ34+клеток МПК и не различалась у СБ34+клеток ПК и КМ, тогда как интенсивность экспрессии CD44 не различалась во всех трех источниках.

8. Концентрация мобилизационных цитокинов (1L-8, G-CSF, ММР-9) в сыворотке ПК доношенных новорожденных статистически значимо выше, чем в сыворотке крови здоровых доноров, но статистически значимо ниже, чем при мобилизации ГСК Г-КСФ у пациентов с онкогематологическими заболеваниями и при лечении медикаментозной цитопении.

9. Экспрессия значительной части генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, и в синтезе ДНК значимо выше у С034+клеток КМ, чем у С034+клеток ПК и МПК, тогда как экспрессия ингибитора клеточного цикла — р57 в 1,7 раз выше в С034+клетках МПК, чем в СЭ34+клетках КМ и ПК. Экспрессия генов, связанных с апоптозом — таких как каспаза 3, 4 и 8 и дезоксирибонуклеазы 2 значимо выше в CD34 CD34+K.ieTKax МПК и ПК, чем в С034+клстках КМ, что свидетельствует о повышении уровня апоптоза по сравнению с С034+клеткалш КМ в спокойном состоянии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ибрагимов Р.Ш., Райкина Е.В., Осипова Е Ю., Зимина Н.Н., Майорова О.А., Яковлева М.В., Румянцев С.А. Сравнительная характеристика клеточного состава пуповинной крови здоровых новорожденных и мобилизованной гранулоцитарным

колониестимулнрующим фактором периферической крови здоровых доноров. Онкогематология, 2009, №4, стр. 45-51.

2. Ибрагимов Р.Ш., Райкина Е.В., Осипова ЕЮ., Майорова О.А., Яковлева М.В., Румянцев С.А. Клеточный состав трансплантационного материала пуповинной и Г-КСФ мобилизованной периферической крови. Медицинский вестник Юга России 2010;2:26-34.

3. Ибрагимов Р.Ш.. Райкина Е.В., Осипова Е Ю., Майорова О.А., Яковлева М.В., Румянцев С.А. Сравнительная характеристика клеточного состава пуповинной крови здоровых новорожденных и Г-КСФ мобилизованной периферической крови здоровых доноров. АГ-инфо, 2010, №3, с. 41-45.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BAS - (basophile) количество базофилов крови (х109/л) CD - (clasters of differentiations) кластер дифференцировки DMEM — модифицированная среда Дулбекко EOS — (eosinophile) количество эозинофилов крови (х109/л) НСТ (hematocrit) гематокрит

HES 200 — 6% гид роке иэти.т крахмал с молекулярной массой 200 000 дальтон HGB (hemoglobin) концентрация гемоглобина (г/л) ICAM - intracellular aghesion molecule. IL-8 - interleukine 8.

IRES - внутренний рибосомальный сайт проникновения

LFA - leukocyte function-associated molecule.

LTC-IC - long-term culture-initiating cells.

LYM - (lymphocyte) количество лимфоцитов крови (xl 09/л)

MCH (mean corpuscular hemoglobin) среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (иг) МСНС (mean corpuscular hemoglobin concentration) средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (г/л)

MCV (mean corpuscular volume) средний объем эритроцитов (фл/фемтолитры)

MNC - (mononuclear cells) моноиуклеарные клетки

MON (monocytes) количество моноцитов (х109/л; %)

MON - (monocyte) количество моноцитов крови (х109/л)

MPV (mean platelet volume) средний объем тромбоцитов (фл/фемтолитры)

NEU - (neutrophile) нейтрофилы

NK - (natural killer) натуральные киллеры

NOD/SCID - тяжелая комбинированная иммунная недостаточность NRBC (nuclear red blood cell) нормобласты (/ЮОлейкоцитов)

РСТ (platelet crit) тромбокрит (%), отражает долю объема цельной крови, занимаемой тромбоцитами

PDW (platelet distribution width) ширина распределения тромбоцитов по объему, характеризует

степень анизоцитоза (%)

PLT (platelet) количество тромбоцитов

RBC (red blood cells) количество эритроцитов крови (х101:/л)

RDW (red cells distribution width) показатель гетерогенности эритроцитов по объему,

характеризует степень анизоцитоза

SDF - stromal-derived factor.

VCAM - vascular cell adhesion molecule.

VLA - very late antigen.

WBC - (white blood cells) количество лейкоцитов крови (х109/л) YFP — желтый флуоресцирующий протеин АЧГ - абсолютное число гранулоцитов.

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

КОЕ-ппх - колониеобразующая единица смешанная

КОЕ-Г - колониеобразующая единица граиулоцитарная

КОЕ-ГМ — колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная

КОЕ-М - колониеобразующая единица макрофагальиая

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроцитарная

МАВК - метод автоматического вьщеления клеток

МДЦ — метод двойного центрифугирования

ММП-9 - матрикс-металлопротеиназа-9.

ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз.

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз.

ПК — пуповинная кровь

ПП - пролиферативный потенциал.

ПХТ — полихимиотерапия.

Подписано в печать 24.07.2013 г. Формат А5 Печать цифровая. Тираж ЮОэкз. Заказ № 153 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39